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CCR6 kontrolliert selektiv die Monozyten-vermittelte Entzündungsreaktion in der Atherosklerose
(2019)
Der Chemokinrezeptor CCR6 wird von einer Vielzahl unterschiedener Zelltypen exprimiert,
wie zum Beispiel Monozyten, Th17-Zellen und regulatorische T-Zellen,
die im Zusammenhang mit der Entstehung von Atherosklerose stehen. Um die
Bedeutung von CCR6 in der Pathogenese der Atherosklerose bestimmen zu können,
wurden CCR6-defiziente (Ccr6-/- ) Mäuse mit low-density lipoprotein receptordefizienten
(Ldlr-/-) Mäusen gekreuzt, um Tiere zu erhalten, die anfällig für Atherosklerose
und zudem CCR6-defizient sind. Nach acht Wochen pro-atherogener, fettreicher
western-type diet war die Ausprägung der atherosklerotischen Läsionen im
Aortensinus und der gesamten Aorta, sowie deren Gehalt an Plaquemakrophagen in
den Ccr6-/-Ldlr-/- Tieren im Vergleich zu den Ldlr-/- Kontrolltieren signifikant vermindert.
Die lokale und die systemische Verteilung von T-Zellen sowie die Häufigkeit
von Th1-, Th17-Zellen und regulatorischen T-Zellen blieb hingegen unverändert. Im
Gegensatz dazu reduzierte sich die Zahl der im Blut zirkulierenden Gr-1high und
Gr-1low Monozyten in den Ccr6-/-Ldlr-/- Tieren deutlich. Weiter konnte gezeigt werden,
dass über CCR6 in vitro die Adhäsion von Monozyten an inflammatorisch
verändertem Endothel und in vivo die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel
der Karotiden vermittelt wird. Des Weiteren wurden in einem air pouch-Modell für
akute Entzündungsreaktionen mittels CCR6 spezifisch Monozyten, aber keine TZellen
rekrutiert.
Summa summarum konnte die Bedeutung von CCR6 auf verschiedenen Ebenen
der Pathogenese der Atherosklerose gezeigt werden: Während CCR6 für die Hypercholesterinämie
assoziierte adaptive Immunantwort entbehrlich ist, reguliert es
die Mobilisierung, Adhäsion und Rekrutierung von Monozyten und kontrolliert über
diese Mechanismen die Akkumulation von Makrophagen und Genese atherosklerotischer
Läsionen. CCR6 und sein Ligand CCL20 könnten somit vielversprechende
Ziele neuer pharmakologischer Therapieansätze sein, um auch die Atherogenese im
Menschen zu unterbinden.
Die Ergebnisse der Dissertation wurden im Dezember 2013 im Journal Thrombosis
and Haematostasis unter dem Titel “CCR6 selectively promotes monocyte mediated
inflammation and atherogenesis in mice“ in geteilter Erstautorenschaft von
Helga Manthey, Clément Cochain und Stefanie Barnsteiner veröffentlicht (PMID:
24114205).
Das Konzept, Insulin-produzierende Zellen als Ersatz für zerstörte Beta-Zellen beim Diabetes mellitus Typ I einzusetzen, ist auch weiterhin hoch attraktiv. Eine Alternative zur Herstellung Insulin-produzierender Zellen aus embryonalen oder adulten Stammzellen könnten in vitro modifizierte, Insulin-positive Monozyten sein. Seit längerem ist bekannt, dass sich Monozyten in Makrophagen und Dendritische Zellen differenzieren. Weniger bekannt ist, dass sich Monozyten auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen differenzieren können. Hierzu gehören auch Insulin-positive Zellen. Für die optimale Zelltherapie ist zu fordern, dass die Zellen nicht nur ihre Funktion im Patienten beibehalten, sondern dass von ihnen auch kein immu-nologisches Risiko ausgeht. Blutmonozyten lassen sich einfach gewinnen und stünden somit als autologer Zellersatz für eine mögliche Zelltherapie zur Verfügung. Monozyten von zwölf gesunden Spendern im Alter zwischen 23 und 57 Jahren wurden untersucht. Die Monozyten wurden durch Adhärenz angereichert und für sechs Tage in X-Medium mit den Cytokinen M-CSF und IL-3 und für weitere vier Tage in Y-Medium mit den Cytokinen HGF und EGF inkubiert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich Insulin-positive Monozyten routine-mäßig aus peripheren Blutmonozyten gesunder Spender mittels Leukapharese gewinnen lassen. Frisch isolierte periphere Blutmonozyten waren vor ihrer Kultivierung negativ für Insulin und C-Peptid. Nach zehntägiger Kultur wurden 77±16% Insulin-positive und 49±30% C-Peptid-positive Monozyten nachgewiesen. Weiterhin exprimierten 60±4% der Zellen den Monozytenmarker CD14. Auch wurde gezeigt, dass die Kulturbedingungen die Ausbeute an Insulin-positiven Monozyten beeinflussen. Aus jeweils drei Millionen Insulin-positiven Monozyten wurde das Insulin isoliert und diabetischen Mäusen mit einem Blutzuckerspiegel von 300-600 mg/dL subkutan injiziert (n=8). Daraufhin sank der Blutzuckerspiegel um 51%±12% innerhalb einer Stunde. Auch Insulin-positive Monozyten, die diabetischen Mäusen subkutan injiziert wurden, waren in der Lage, den Blutzuckerspiegel bis zum Zeitpunkt Ihrer Abstoßung aktiv zu regulieren (n=4). In einem Pilotversuch wurde zudem gezeigt, dass transplantierte Insulin-positive Monozyten langfristig (> 100 Tage) den Blutzuckerspiegel einer diabetischen immuninkompetenten Maus regulieren. In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich gezeigt, dass in vitro modifizierte Monozyten biologisch aktives Insulin enthalten.
Die Koronare Herzkrankheit (KHK) zählt zu den häufigsten Todesursachen in Deutschland und weltweit. Die Atherosklerose der Herzkranzgefäße gilt als pathophysiologisches Korrelat der KHK. Die manifeste KHK geht mit Myokardhypoxie einher, persistierende Myokardhypoxie resultiert im Myokardinfarkt. Atherosklerose ist ein multifaktorieller, sich selbst verstärkender Inflammationsprozess, an dem multiple Zellen und Moleküle beteiligt sind. Hierzu zählen zum Beispiel das monozytär-phagozytäre System (MPS) und Chemokine sowie Chemokinrezeptoren. Auch im Regenerationsprozess nach Myokardinfarkt spielt die MPS-Chemokinrezeptor-Interaktion eine bedeutsame Rolle. Die perkutane Koronarintervention mit Stentimplantation (PCI) hat sich als geeignete Behandlungsmöglichkeit der manifesten KHK etabliert. Häufigste Komplikationsfolge der Implantation von Bare-Metal-Stents stellt die In-Stent-Restenose aufgrund einer überschießenden Inflammationsreaktion dar. Konsekutiv entwickelte Drug-Eluting-Stents sondern Immunmodulatoren zu Eindämmung der Inflammationsreaktion ab. Dadurch kommt es auch zu Eindämmung der gewollten Reendothelialisierung des Stents mit Zunahme gefürchteter Stent-Thrombosen. Ideal wäre demnach eine selektivere Hemmung der Inflammationsreaktion, die die gewünschte Reendothelialisierung nicht beeinträchtigt. Hierzu müssen die molekularbiologischen Zusammenhänge am Gefäßbett nach Stenting beleuchtet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Expressionsverhalten der Chemokinrezeptoren CXCR4, CX3CR1 und CCR2 auf Monozyten vor und nach PCI im humanen Modell untersucht, alle untersuchten Probanden litten an Atherosklerose, circa die Hälfte hatte bereits vormalig einen Myokardinfarkt erlitten. 24 Stunden nach Stenting zeigte sich eine signifikant geringere CXCR4-Expression und Positivität auf Monozyten der Gesamtpopulation. Dies ist vermutlich Korrelat einer Achsenaktivierung mittels CXCR4-typischer Rezeptorinternalisierung und mittels Abwanderung CXCR4-positiver Monozyten ins Gefäßbett und spricht für eine grundlegende Rolle der CXCR4-MPS-Interaktion nach PCI. Patienten, die bereits einen Myokardinfarkt erlitten hatten, konnten eine signifikant niedrigere CXCR4-Expression auf Monozyten aufweisen als die Vergleichsgruppe. Weiterhin zeigten Patienten mit pectanginösen Beschwerden einen signifikant höheren Rezeptorverlust an der Oberfläche der Monozyten nach Stenting. Dies deutet auf eine grundlegende Rolle der CXCR4-MPS-Interaktion bei Myokardhypoxie hin und liefert einen Einblick in das komplexe Geschehen der Infarktheilung und Hypoxiekompensation.
Hypothetisch denkbar wäre eine protektive Rolle der CXCR4-Achse nach Ischämie, mit Hypoxie-vermittelter Präkonditionierung humaner Monozyten nach stattgehabtem Myokardinfarkt und konsekutiv basal gesteigerter CXCR4-Expression, die nach erneutem Hypoxie-Ereignis einen schnelleren Zugriff auf CXCR4-vermittelte, protektive Signalwege erlauben könnte. Patienten, die sich bereits vormals einem Stenting unterzogen hatten, konnten eine signifikant niedrigere CX3CR1-Expression auf Monozyten aufweisen. Dies steht in Kongruenz mit Ergebnissen von Tierstudien, die eine grundlegende Rolle von CX3CR1 im chronischen Monozytenrecruitment nach Gefäßverletzung beschrieben hatten. Für CCR2 ergaben sich keine relevanten Ergebnisse. Die Rolle der Interaktion der Chemokinrezeptoren CXCR4, CX3CR1 und CCR2 mit humanen Monozyten in Neointimagenese, Atherosklerose und Myokardheilung nach Infarkt ist nicht eindeutig beschrieben und wird zum Teil kontrovers diskutiert. Unsere Studie liefert interessante neue Erkenntnisse bezüglich der Beteiligung der untersuchten Rezeptoren und dem MPS bei den beschriebenen pathogenetischen Prozessen. Die erstmalig beschriebene CXCR4-MPS-Interaktion nach Stenting sowie die Hinweise auf eine Beteiligung von CX3CR1 im chronischen Monozytenrecruitment der humanen Neointimagenese liefern einen interessanten Anhaltspunkt für die Entwicklung neuer, selektiver Antagonisten im Kampf gegen die In-Stent-Restenose.
Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen
(2012)
Um die Grundlagen für die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellulären Ebene aufzuklären, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entzündlichen Vorgängen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gefäß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Gedächtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgeführten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabhängige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entzündungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enthält, und Hydrocortison zeigte M1 zusätzlich einen stärkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entzündungsreiz. Die Zytotoxizität von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalfängereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabhängiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine mögliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, primären Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise für eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranständige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ansätze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren über die Testzeiträume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl über kurze (≤ 45 min) als auch über längere Zeiträume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivität der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabhängige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazelluläre NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in jüngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universitätsklinikum Zürich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 wöchiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gefäßerweiterungskapazität (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 führte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur möglichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgewählten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich höheren Verteilung ins Gehirn für die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechusäure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankengängig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den höchsten logBB-Wert und somit die höchste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu überwinden. Im Kontext einer möglichen Anwendung bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen wurde zusätzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem primären Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entzündungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverdünnungen deutliche konzentrationsabhängige Hemmeffekte um bis zu ~50 % der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beiträge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verständnis der möglichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden.
Das Secosterid Vitamin D3 wird durch die Nahrung aufgenommen oder im Organismus synthetisiert, wobei eine Reaktion in der Haut durch einen photochemischen Prozess katalysiert wird.Durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere wird Vitamin D3 über 25(OH) Vitamin D3 zum aktiven 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon. 1,25(OH)2 Vitamin D3 hat eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel, es reguliert die Ca2+-Resorption im Dünndarm. Die 1,25(OH)2 Vitamin D3-Synthese in der Niere wird durch Parathormon (PTH) kontrolliert. Ist die Serum Ca2+-Konzentration niedrig, wird PTH ausgeschüttet und die 1a-Hydroxylase, das 25(OH) Vitamin D3-aktivierende Enzym, stimuliert. Das Prinzip der (Seco)steroid-Aktivierung und -Inaktivierung in glandulären Organen, wie Leber und Niere mit anschließender Freisetzung der aktiven Hormone und Transport zu den jeweiligen Zielgeweben gilt heute nicht mehr uneingeschränkt. Auch Einzelzellen sind in der Lage Steroid-modifizierende Enzyme, die Hydroxylasen und Dehydrogenasen, zu exprimieren. Monozytäre Zellen exprimieren das 1,25(OH)2 Vitamin D3-aktivierende und das -inaktivierende Enzym, die 1a-Hydroxylase und die 24-Hydroxylase. Sie sind somit in der Lage, 1,25(OH)2 Vitamin D3 zu sezernieren, welches parakrin auf Nachbarzellen wirken kann. In diesem Zusammenhang wurde die Expression und Regulation der 1a-Hydroxylase in peripheren Blutmonozyten (PBM) und monozytären THP1-Zellen untersucht. Durch Supplementation der Zellen mit dem Substrat 25(OH) Vitamin D3 konnte die Produktion an aktivem 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon in PBM signifikant gesteigert werden. In PBM konnte im Gegensatz zum systemischen Ca2+-Stoffwechsel nur ein geringer Einfluss auf die 1a-Hydroxylase-Aktivität beobachtet werden. Durch RT-PCR-Amplifikation konnte eine Expression des PTH Rezeptors Typ 1 (PTHR1) in PBM und Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Ein weiterer Ligand des PTHR1 ist PTH related Protein (PTHrP), ein Faktor der die Tumorhyperkalzämie propagiert. Durch Markierungsexperimente mit fluoreszenz-markiertem PTHrP konnte gezeigt werden, dass PTHrP an die Zellmembran von PBM und Dendritischen Zellen bindet und in den Zellkern von Dendritischen Zellen transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsive Gene in Monozyten/Makrophagen untersucht. Die Expression der 24-Hydroxylase wird innerhalb der Differenzierung von myeloischen THP1-Zellen zu Makrophagen- bzw. Osteoklasten-ähnlichen Zellen transient induziert. Als weiteres 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsives Gen wurde die Expression von Osteopontin (OPN) untersucht. OPN ist ein vor allem in Knochen vorkommendes Matrixprotein, das wesentlich an der Zelladhäsion beteiligt ist. OPN wird in THP1-Zellen im Zuge der Differenzierung zunehmend exprimiert. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte OPN in Granulomen von Morbus Crohn- und Leberschnitten detektiert werden. Es spielt hier eine wesentliche Rolle bei der Granulomentstehung. Die Thioredoxin Reduktase 1 (TR1) ist ein Selenoenzym, welches maßgeblich an der Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen beteiligt ist. Es moduliert Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen wie die Bindung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB an DNA-responsive Elemente. Die Expression der TR1 wird in THP1-Zellen im Rahmen der Differenzierung induziert und ist in differenzierten Zellen maximal. Aktivitätsmessungen deckten sich mit dieser Beobachtung. In peripheren Blutmonozyten steigt die TR-Aktivität alleine durch Adhäsion der Zellen an das Kulturgefäß und nach Behandlung mit 1,25(OH)2 Vitamin D3. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine Abhängigkeit der TR-Aktivität vom Differenzierungsgrad der Zellen und der Supplementation des Mediums mit dem Spurenelement Selen. Die Expression weiterer Selenoproteine in monozytären Zellen wurde nachgewiesen. So konnten durch 75Selenit-Markierungsexperimente neun Selenoproteine in THP1-Zellen detektiert werden, von denen fünf sezerniert werden. Ein weiteres, in monozytären Zellen charakterisiertes Selenoprotein ist die zelluläre Glutathionperoxidase. Ihre Aktivität konnte in Selenit-supplementierten Zellen um das 70fache gesteigert werden. Die Kultivierung monozytärer Zellen unter Selenit-Supplementation beeinflusst die Funktion dieser Zellen wesentlich. So konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an phagozytierenden, zu Makrophagen differenzierten THP1-Zellen nach Selenit-Supplementation abnahm, während die Phagozytoserate der einzelnen Zellen anstieg. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass monozytäre Zellen mit Komponenten des 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon produzieren, sezernieren und inaktivieren können. Die lokale Kontrolle der 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsiver Gene, wie die Expression des Selenoproteins TR1, das einen direkten Einfluss auf den Redoxstatus und den Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen in diesen und Nachbarzellen ausübt.
Schmerz ist eine klassische Komponente von Entzündungsreaktionen. Im Rahmen des Entzündungsgeschehens werden Zytokine und Chemokine freigesetzt, die Leukozyten zum Entzündungsort rekrutieren. Über die Freisetzung weiterer proalgetischer Mediatoren tragen diese zur Aktivierung und Sensitivierung von Nozizeptoren und damit zur Schmerzentstehung bei. Das Monozyten-rekrutierende Chemokin CCL2 verursachte in Verhaltensexperimenten eine Hyperalgesie bei Ratten. Die Hyperalgesie war durch den Cox-2 Inhibitor Parecoxib vollständig reversibel. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle von Monozyten und Prostaglandinen in der Entstehung dieser Hyperalgesie untersucht. Dazu wurde in vitro die Cox-2 Expression und die Prostaglandin-Bildung in humanen Monozyten und Peritonealmakrophagen der Ratte nach CCL2 Stimulation bestimmt. Zudem wurde in vivo die Cox-2 Expression im Rückenmark und in der Rattenpfote nach CCL2 Injektion in die Pfote untersucht.
Schmerzen sind ein Hauptsymptom der Entzündung. Während der Entzündungsreaktion führt die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen zur Einwanderung von Leukozyten in das entzündete Gewebe. Durch die Freisetzung weiterer proalgetischer Mediatoren tragen Leukozyten zur Sensitivierung des Nozizeptors bei und verursachen damit die Schmerzentstehung.
In Verhaltensexperimenten verursacht intraplantare Injektion des Monozyten-rekrutierenden Chemokins CCL2 bei Wistar Ratten eine Hyperalgesie. Gleichzeitige Injektion von CCL2 mit dem Enzym Katalase oder dem Superoxiddismutasemimetikum TEMPOL verhindert die Entwicklung der CCL2-induzierten Hyperalgesie. Dark Agouti Ratten mit einer verringerten Aktivität der NADPH-Oxidase, aufgrund eines Polymorphimus im Gen ncf1, entwickeln keine CCL2-induzierte Hyperalgesie.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von Monozyten/Makropagen und reaktiven Sauerstoffradikalen für die Entstehung der CCL2-induzierten Hyperalgesie untersucht. In vitro wurde die Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen in humanen Monozyten und Peritonealmakrophagen aus Wistar und Dark Agouti Ratten nach Stimulation mit CCL2 untersucht. In vivo wurde die Bildung des Lipidperoxidationsproduktes 4-HNE im Pfotengewebe von Wistar und Dark Agouti Ratten nach CCL2 Injektion untersucht.
Monozyten lassen sich in vitro nicht nur zu Makrophagen und Dendritischen Zellen differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen. Monozyten scheinen somit über pluripotente Eigenschaften zu verfügen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich kultivierte Monozyten tatsächlich in Insulin-exprimierende Zellen differenzieren lassen. Monozyten von gesunden Spendern im Alter zwischen 20 und 26 Jahren wurden untersucht. Die über eine Leukozytenapherese gewonnenen Mono- zyten wurden über Adhärenz angereichert und für sechs Tage in X-Medium mit den Cytokinen M-CSF und IL-3 und für weitere 15 Tage in Y-Medium mit den Cytokinen HGF und EGF inkubiert. Die Zellen wurden immunhistochemisch und funktionell untersucht. Frisch isolierte Blutmonozyten waren vor ihrer Kultivierung negativ für Insulin, C-Peptid und Glukagon. Am 4. Kulturtag wurden Insulin und C-Peptid in den kultivierten Monozyten nachgewiesen. Die Expression von Insulin war jedoch nicht stabil: während am Tag 11 der Anteil Insulin-positiver Zellen bei ca. 80% lag, waren am Tag 14 nur noch ca. 30% der kultivierten Zellen Insulin-positiv. Dies wurde ebenfalls für den Nachweis von C-Peptid beobachtet. Auch die Expression von Glukagon war nicht stabil. Diese Beobachtung wird darauf zurückgeführt, dass sich die Monozyten zu Makrophagen differenzierten und diese eindeutig kein Insulin produzieren. Da Zellen Insulin aufnehmen und speichern können, sollte in dieser Arbeit die Frage geklärt werden, ob immunhistochemisch zu unterscheiden ist, ob Zellen Insulin gebildet (de novo Insulin) oder unspezifisch aufgenommen haben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass zum eindeutigen Nachweis von de novo Insulin der Nachweis von C-Peptid unbedingt zu fordern ist. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente mit aufgereinigtem Insulin belegen, dass für aufgenommenes Insulin – im Gegensatz zu de novo Insulin – C-Peptid immun- histochemisch nicht nachzuweisen ist. Das aus in vitro kultivierten Monozyten isolierte Insulin war in diabetischen Mäusen biologisch aktiv, d.h. es senkte den Blutzuckerspiegel kurzfristig. Hierzu wurden geerntete Monozyten der Kulturtage 6-12 im Ultraschallbad aufgeschlossen und der zellfreie Überstand diabetischen Mäusen injiziert. Insgesamt senkten 11 der 31 (35,5%) in dieser Arbeit getesteten Überstände den Blutzuckerspiegel dieser Tiere um mehr als 15%. Bezogen auf die 18 Proben, die einen Effekt zeigten, sind dies sogar 61%. In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich gezeigt, dass in vitro modifizierte Monozyten Insulin exprimieren, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse senkt.