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Auf der Suche nach dem am besten geeigneten und praktikabelsten Tiermodell zur Erforschung unbeantworteter Fragen der Kehlkopftransplantation beim Menschen werden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Tiermodelle der letzten 40 Jahre anhand der publizierten Daten mit ihren Vor- und Nachteilen vorgestellt und insbesondere die Frage behandelt, ob das Meerschweinchen in der Verwendung für die experimentelle Kehlkopftransplantation Vorteile gegenüber der im Tiermodell bereits umfangreich erprobten Ratte bietet. Es wurden bei jeweils 10 Ratten und 10 Meerschweinchen Strukturen im kehlkopfnahen Halsbereich im Größenvergleich und unter Berücksichtigung topographischer Besonderheiten anatomisch untersucht, sowie die Vor- und Nachteile bezüglich ihrer Eignung für ein Tiermodell gegenübergestellt. Im Ergebnisvergleich erweist sich das Rattenmodell einem Meerschweinchenmodell überlegen. Den deutlichen Vorteilen der Ratte hinsichtlich Beschaffungskosten, günstigeren Zuchtbedingungen und geringerem postoperativem Pflegeaufwand, stehen die nur geringen körpervolumenbedingten Vorteile des Meerschweinchens bezüglich der Strukturgrößen gegenüber, ohne dass dadurch ein Nutzen im Tiermodell gezogen werden kann. Die Ratte bleibt unter Berücksichtigung aller Untersuchungsergebnisse das Versuchstier erster Wahl für die experimentelle Kehlkopftransplantation und mikrogefäßchirurgische Übungen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung regulatorischer CD4+ CD25+ T-Lymphozyten (Treg) der Ratte und dem Nachweis ihrer Suppressor-Funktion in vitro. Als erstes wurde die Verteilung dieser Zellen in den lymphatischen Organen untersucht. Dabei waren sie sowohl in den parailiacalen, cervicalen und mesenterialen Lymphknoten (zwischen 4,5 und 6,1%) als auch im Thymus mit 1,3% und in der Milz mit 4,5% nachzuweisen. Ihr CD45Rlow Phänotyp entspricht dem humaner und muriner Treg. Alle Treg der Ratte exprimieren den  T-Zellrezeptor, und sie sind zu 40% für einen weiteren Aktivierungsmarker, nämlich CD134, positiv. Um die Vitalität frisch isolierter Treg in vitro erfolgreich zu erhalten, ist es notwendig, sie zu stimulieren; entweder mit den beiden Antikörpern R73 (anti-TCR) und JJ319 (anti-CD28) oder mit allogenen dendritischen Zellen und/oder IL-2. Ein weiteres wesentliches Ergebnis dieser Arbeit war, dass stimulierte Treg sowohl IL-2 als IL-10 produzierten. Während der dreitägigen Kultivierung sezernierten 100.000 Treg mit 1.200 pg/ml dreimal soviel IL-10 wie IL-2 (402 pg/ml) in den Kulturüberstand. Die Suppressor-Funktion von Treg der Ratte wurde in Inhibitionsassays bestätigt. Gemessen wurde ihre Fähigkeit, in Abhängigkeit ihrer Zellzahl die polyklonale Aktivierung von CD25neg zu hemmen. Wurden Treg und CD25neg zu gleichen Anteilen kultiviert, so war eine nahezu vollständige Hemmung der Aktivierung von CD25neg nachweisbar. Je geringer der Anteil aktivierter Treg im Inhibitionsassay war, desto geringer war auch der von ihnen übertragende suppressive Effekt. Zudem wurde gezeigt, dass die Suppression umso stärker war, je größer der Anteil blastoider FSCbright Zellen an den im Inhibitionsassay eingesetzten Treg war. Die Charakterisierung von Treg der Ratte hat somit gezeigt, dass sie über eindeutige Suppressor-Eigenschaften verfügen. Dieser Nachweis stellt die wesentliche Voraussetzung für künftige in vivo Untersuchungen dar.
Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des Körpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellulärer Ebene über eine Familie von fünf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abhängiger Weise oder vermutlich auch über andere interagierende intrazelluläre Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellulär mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei mögli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinitätschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid präzipitiert, das die neun C-terminalen Aminosäuren des SSTR4 enthält. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren näher charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Domäne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpräzipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische Nähe zu bestimmten Zielproteinen gebracht, über die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So ermöglicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion ausüben kann.
Nach dem heutigen Wissenstand wird die Hämoxygenase-1 unter pathologischen Bedingunge der Niere, z.B. Ischämie, expremiert. Man nimmt an, dass die Hämoxygenase-1 eine Schutzfunktion für die Niere besitzt. Um dies zu bestätigen, führten wir eine tierexperimentelle Arbeit mit Ratten (n=101) durch in der wir durch Clamping der Nierenarterie ein reproduzierbares akutes ischämisches Nierenversagen induzierten. Bei einem Teil der Tiere wurde anschließend die Hämoxygenase durch injektion von SnMP gehemmt. Die Ratten wurden in 5 Gruppen randomisiert (Tag-0, Clamping+SnMP, Clamping+NaCl, Sham+SnMP, Sham+NaCl). In der Inulin/PAH-Clearance zeigte sich am ersten postoperativen Tag eine signifikante Verschlechterung bei den Clamping+SnMP-Tieren im Vergleich zu den Clamping+NaCl-Tieren. Die Ergebnisse wurden durch die erhöhten Retentionswerte und die erniedrigte PAH-Nettosekretion der Clamping+SnMP-Tiere unterstüzt. Die Gabe von SnMP hatte auf die nicht geclampte Niere bei den Sham-Tieren keinen Einfluss auf die Nierenfunktion. Dies zeigt, dass die Hämoxygenase-1 eine Schutzfunktion der Niere darstellt.
Ratten sind in urbanen Räumen allgegenwärtig. Sie leben hier zumeist im Untergrund oder doch gut verborgen vor menschlichem Blick. Von hier aus gestalten sie ohne bewusstes menschliches Zutun oder gar Akzeptanz bereits seit Jahrhunderten Stadträume eifrig mit. Dies Zusammenspiel von Ratten und Menschen wird in der vorliegenden Studie ausgehend von der unterfränkischen Stadt Würzburg untersucht. Die Autorin fragt nach Aushandlungsprozessen innerhalb alltäglicher Begegnungen von Menschen und Ratten, den damit verbundenen historischen Bezügen, Kontinuitäten und Brüchen sowie nach den hier wirksamen Narrationen. Mit den Multispecies Studies werden dabei Ratten als wirk- und handlungsmächtige Akteur*innen gesehen, die durch ihre Agency unter anderem Missstände in menschlichen Gesellschaften offenbaren.
Die Multiple Sklerose (MS) und ihr Tiermodell, die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), sind Autoimmunerkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Neben myelinspezifischen CD4+ T-Zellen tragen auch CD8+ T-Zellen zur Pathogenese dieser Erkrankungen bei. Allerdings ist die Rolle der CD8+ T-Zellen während der Induktionsphase der Erkrankung außerhalb des ZNS noch unklar. In dieser Arbeit wurde daher der Beitrag der CD8+ T-Zellen in der EAE der Lewis-Ratte näher untersucht.
Dazu wurde die Krankheitsaktivität der aktiven EAE in normalen Lewis-Ratten mit Tieren verglichen, in denen die CD8+ T-Zellen durch CD8-spezifische monoklonale Antikörper depletiert wurden. Die CD8-depletierten Tiere zeigten dabei eine verminderte Krankheitsaktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Ebenso entwickelten CD8 knockout Ratten, die durch die Abwesenheit funktionsfähiger CD8+ T-Zellen gekennzeichnet sind, deutlich reduzierte Krankheitssymptome im Vergleich zu wildtypischen Tieren. Die reduzierte Krankheitsaktivität in den CD8-defizienten Tieren war von einer verminderten Infiltration von T-Zellen und Makrophagen in das ZNS begleitet. Zwar konnten aktivierte gpMBP-spezifische CD4+ T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten von CD8-depletierten Ratten detektiert werden, diese produzierten jedoch in deutlich reduziertem Umfang pro-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise Interferon-. Offensichtlich können in der aktiven EAE myelinspezifische CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von CD8+ T-Zellen nicht vollständig zu Effektorzellen differenzieren und infolgedessen das ZNS nicht infiltrieren. Umgekehrt konnten nach adoptivem Transfer von voll ausdifferenzierten enzephalitogenen CD4+ Effektorzellen sowohl in normalen als auch CD8-defizienten Empfängertieren gleich starke Symptome einer AT-EAE beobachtet werden. Die Entfaltung des pathogenen Potentials voll ausgereifter CD4+ Effektorzellen scheint somit nicht von der Präsenz von CD8+ T-Zellen abzuhängen.
Mit Hilfe eines Ratten-IFN- ELISpots gelang erstmals die Detektion Interferon--produzierender gpMBP-spezifischer CD8+ T-Zellen in Tieren, die zuvor mit gpMBP immunisiert wurden. Zum direkten Nachweis von gpMBP-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden RT1.Al-Ig Dimere generiert und mit verschiedenen gpMBP-Peptiden beladen. Tatsächlich konnten in den drainierenden Lymphknotenzellen von Ratten, die zuvor mit gpMBP in CFA immunisiert wurden, CD8+ T-Zellen detektiert werden, die gpMBP125-133-beladene RT1.Al-Ig Dimere erkennen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit legen insgesamt den Schluss nahe, dass bei der EAE der Lewis-Ratte Interferon--produzierende CD8+ T-Zellen in der Peripherie mit myelinspezifischen CD4+ T-Zellen interagieren und damit deren Differenzierung zu ZNS-infiltrierenden Effektorzellen ermöglichen.
Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Natürliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen ermöglicht, wohingegen ‚klassische‘ T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Molekülen und Peptiden binden. Die während der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen ermöglicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen können: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bekämpfung von Krebs und Infektionen bei.
Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene für iNKT Zellen dar. Die Präsentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Moleküle, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molekülen ähneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschränkte Nutzung der Antigenspezifität bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der höchsten Variabilität dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schwächerer Antigene. Natürlich auftretende Variabilität innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR.
Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten ähnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zusätzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an natürlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivität zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht.
Durch in dieser Arbeit durchgeführte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivität des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgeprägt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation ermöglichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente ähnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden hauptsächlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- türlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette bestätigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine stärkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten.
In dieser Arbeit wurden im Versuchstier Ratte die Transmission von T.gondii über die Muttermilch und deren immunologische Konsequenzen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich Rattenmilch als labordiagnostisches Medium eignet, wobei der direkte visuelle Parasitennachweis mit dem Lichtmikroskop, trotz verschiedender Aufbereitungsmethoden erfolglos blieb. Auch die PCR eignete sich für unsere Versuche nicht als Nachweismethode. Als geeignte und sensitive Methode für den Parasitennachweis in Rattenmilch stellte sich die Anzucht auf humanen Vorhautfibroblasten (HFF-Zellkultur)dar, wobei bereits zwei Tachyzoiten, die in vitro zu Milch nicht infizierter Tiere gegeben wurden, ausreichten, um eine HFF-Zelle zu infizieren. Immunisierungsexperimente wurden durchgeführt, um die Frage zu klären, ob die im Serum von Jungtieren nachgewiesenen Toxoplasma-spezifischen Immunglobulinen über die Muttermilch aufgenommen worden sein könnten. Es gelang in Milch und Serum der Ammen, sowie im Serum der Jungtiere, T. gondii spezifische Immunglobuline nachzuweisen. Die Transmission des Parasiten als freier Tachyzoit wurde in dieser Arbeit simuliert. Tachyzoiten von T. gondii wurden in verschiedener Dosierung in Rattenmilch angereichert und 48 Stunden alten Ratten verabreicht. Die humorale und zelluläre Immunantwort wurde getestet. Tachyzoiten, die über die Milch aufgenommen wurden, können eine Infektion auslösen. Ratten wurden schließlich auf natürlichem Wege über Milch mit T. gondii infiziert, die humorale Immunantwort bestimmt und der Gehalt der infizierten Rattenmilch an Immunglobulinen überprüft. Die Antikörperkonzentration in Serum und Milch der Ammen zeigte eine deutliche Korrelation und im Serum der Nachkommen ließen sich ebenfalls Antikörper nachweisen. Zeichen einer Infektion fanden sich jedoch nicht. Die Rattenmilch kann also T. gondii und toxoplasmaspezifische Immunglobuline enthalten, die von Nachkommen aufgenommen werden. Den Mechanismus der Parasitenübertragung und die Rolle maternaler parasitenspezifischer Immunglobuline für Infektion und parasitenspezifische Immunantwort der Nachkommen gilt es jedoch noch zu klären.
Der neuartige (18)F-markierte Tracer, LMI1195 (N-[3-bromo-4-(3-(18)F-fluoro-propoxy)-benzyl]-guanidine) wurde für die Bildgebung des sympathischen Nervensystems entwickelt; die hohe Spezifität dieses Tracers für den neuralen Uptake-1 Mechanismus wurde bereits gezeigt in Zell-Versuchen, sowie in Studien mit Kaninchen- und nicht menschlichen Primaten zur Bestimmung des kardialen Tracer-Uptakes. Das Ziel dieser Studie war es, die Mechanismen des kardialen (18)F-LMI1195-Uptakes in der Ratte zu untersuchen, von der bekannt ist, dass es neben dem Uptake-1 Mechanismus weitere Arten der Noradrenalin-Aufnahme im Herzen gibt.
Laut statistischem Bundesamt ergibt sich eine Zahl von über 1000 Patienten, die pro Jahr an einer Nebenschilddrüsenunterfunktion erkranken. Aufgrund der komplexen Funktion des Parathormons sowie der schwierigen und aufwendigen Therapie besteht nach wie vor Bedarf an einer kausalen Therapie dieser Mangelerscheinung. Diese Arbeit soll ein Transplantationsmodell in der Ratte etablieren und den Einfluss der Histokompatibilitätsantigene MHC I und II auf die Transplantatfunktion untersuchen.
Einfluss des VEGFRezeptor-2 spezifischen RTK-Inhibitors PTK 787/ ZK 222584 auf Angiogenese und somit Wachstum maligner Gliome in einem Tiermodell. Verwendet wurden hierbei C6-Rattengliomzellen aus denen durch retrovirale Transfektion von VEGF cDNA in sense Richtung ein stark VEGF exprimierender Zellklon generiert wurde.
Die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zentraler Mechanismus im NO/sGC/cGMP-Signalweg. Beim Syndrom der chronischen Herzinsuffizienz ist die Signalübertragung durch NO jedoch gestört. Daher untersuchten wir die Effekte des NO-unabhängigen sGC-Aktivators Ataciguat-Natrium (vormals HMR1766) auf Hämodynamik und linksventrikuläres Remodeling in der Postinfarktphase bei Ratten, alleine und in Kombination mit dem ACE-Hemmer Ramipril. 10 Tage nach experimentellem Myokardinfarkt wurden die Tiere für 9 Wochen über eine Sonde entweder mit Placebo, Ataciguat (10 mg/kg, zweimal täglich), Ramipril (1 mg/kg/Tag) oder einer Kombination aus beidem gefüttert. Die Infarktgröße war in allen Gruppen vergleichbar. Die Monotherapie mit Ataciguat bzw. Ramipril verbesserte die linksventrikuläre Funktion und führte zu einem geringeren Anstieg des linksventrikulären Füllungsdruckes (LVEDP) und –volumens (LVEDV) im Vergleich zu Placebo. Die Kombinationstherapie war den Monotherapien überlegen. Weiterhin konnten sowohl die Ventrikelkontraktilität (LV dP/dtmax/IP), als auch -relaxationsfähigkeit (LV dP/dtmin) verbessert werden und die Lungenflüssigkeit sowie die rechtsventrikuläre Hypertrophie signifikant durch die Monotherapien, bzw. noch weiter durch die Kombination gesenkt werden. Die in der Placebo-Gruppe erhöhten Werte für Myozytenquerschnitt und interstitielle Fibrose waren in der Ramipril- und Ataciguat-Gruppe signifikant und in der Kombination noch weiter vermindert. Zusätzlich konnte auch der Superoxidanionenspiegel im kardialen Gewebe am besten durch die Kombinationstherapie gesenkt werden. Dabei zeigte sich eine Beeinflussung der NADPH-Oxidase-Untereinheit gp91phox und des mitochondrialen Enzyms UCP3. Eine Langzeitbehandlung mit Ataciguat verbesserte also die linksventrikuläre Dysfunktion und das kardiale Remodeling bei Ratten nach Myokardinfarkt in vergleichbarem Ausmaß wie die Therapie mit Ramipril. Die Kombination aus Ataciguat und ACE-Hemmer war jedoch wesentlich effektiver. Folglich stellt die sGC-Aktivierung einen vielversprechenden Therapieansatz zur Prävention von kardialem Remodeling und Herzinsuffizienz nach Herzinfarkt dar.
Bei Ratten mit chronischen Myokardinfarkt wurde der Einfluss des Mineralokortikoidrezeptor (MR)-Anta¬gonisten Spironolacton alleine und in Kombination mit einem Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE)-Hemmer oder einem Angiotensin II Typ 1 (AT1)-Antagonisten, bzw. der Kombination aller drei Medikamente auf das kardiale Remodeling untersucht. Ab dem zehnten Tag nach Koronarligatur wurden die Tiere für neun Wochen mit Placebo (P), Spironolacton (S, 10mg/kg/d), den Kombi¬na¬tionen aus Spironolacton und Trandolapril (S+T; T:0,3mg/kg/d), Spirono¬lacton und Irbesartan (S+I, I: 50mg/kg/d) bzw. der Dreifach¬kombination aus Spironolacton, Irbesartan und Trandolapril (S+I+T) behandelt. Die Infarktgröße war in allen Behandlungsgruppen vergleichbar. Eine intensivierte Blockade des Renin–Angiotensin–Aldo¬steron–Systems (RAAS) mittels Dreifachkombination (S+I+T) verbesserte die linksventrikuläre Dilatation und Fibrose am effektivsten. Die Kollagen Typ I RNA–Expression und die Expression des atrialen natriuretischen Faktors war bei S+I+T signifi¬kant niedriger als bei P (p<0,001) oder als bei S (p<0,05). Auch die sarcoplasmatische retikuläre Calcium-ATPase- und die ACE-Expression ver¬besserten sich unter S+I+T mehr als unter Mono- oder Zweifachtherapie. Diese positiven Effekte zeigten sich auch in einem verbesserten linksventrikulären systolischen und enddia¬stolischen Druck (P 23,6±2,7 vs. S+I+T 12,7±2,3mmHg), einer höheren maximalen Druckanstiegsgeschwindigkeit bzw. maximalen Druckabfallsge¬schwindigkeit des linken Ventrikels bei S+I+T. Das rechtsventrikuläre Gewicht konnte durch S+I+T gegenüber der P-Gruppe (p<0,001) sowie der S-Gruppe (p<0,05) hochsignifikant ge¬senkt werden. Die vorliegende Studie analysiert erstmals systematisch eine Dreifachinhibition des RAAS im Rattenmodell der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt. Das kardiale Remodeling konnte am effektivsten durch die Kombination aus ACE-Hemmer, AT1-Antagonist und MR-Blocker verhindert werden. Systematische klinische Untersuchungen hierzu stehen allerdings noch aus.
Erkrankungen der Nebenschilddrüsen stellen sich pathophysiologisch als Hyper- oder Hypoparathyreoidismus dar. Beim Hypoparathyreoidismus, der auf einer Nebenschilddrüsenunterfunktion basiert, wird zu wenig oder kein Parathormon gebildet. Infolgedessen kommt es pathophysiologisch zu einer Hypokalzämie und Hyperphosphatämie. Das Blut ist übersäuert, und die Betroffenen leiden unter Tetanie mit Stimmritzenkrampf und Pfötchenstellung aufgrund einer erhöhten neuromuskulären Erregbarkeit der Skelettmuskulatur. Längerfristige Folgen können eine gestörte Zahnentwicklung, trockene Haut, Katarakt („Tetaniestar“) und Haarausfall sein. Seltener wird eine Verkalkung der Stammganglien mit einhergehender geistiger Retardierung beobachtet. Diese Symptome unterstreichen, dass es sich bei einem un¬behandelten Hypoparathyreoidismus um eine schwerwiegende, in einigen Fällen sogar lebensbedrohliche Erkrankung handelt. Ursache einer solchen Nebenschilddrüsenunterfunktion sind oft medizinische Eingriffe, so z. B. Bestrahlungen oder Schilddrüsenoperationen, wie die radikale Thyreoidektomie aufgrund maligner Neoplasmen. Gerade in den Staaten der ehemaligen Sowjetunion, hauptsächlich in Russland, Weißrussland und der Ukraine, sind derzeit zahlreiche Fälle des Hypoparathyreoidismus bekannt. Ursache hierfür war die verheerende Reaktorkatastrophe in Tschernobyl im Jahre 1986. Die durch die hohe Strahlenexposition induzierten Schilddrüsentumore mussten oftmals radikal chirurgisch entfernt werden, wobei häufig die Nebenschilddrüsen nicht erhalten wurden. Die vorliegende Arbeit befasst sich im Wesentlichen mit der Frage, ob eine kurzfristige immunsuppressive Behandlung die Abstoßung von primär nicht-vaskularisierten Nebenschilddrüsentransplantaten verhindert. Nach aktuellen Erkenntnissen führt eine kurzfristige, d.h. eine weniger als drei Monate dauernde niedrigdosierte immunsuppressive Therapie nicht zu den gefürchteten Nebenwirkungen. Diese Strategie ist zwar für vaskularisierte Großorgane wie Niere, Leber oder Herz nicht anwendbar, doch sind gegenwärtig keine Informationen vorhanden, ob nicht-vaskularisierte allogene Nebenschilddrüsentransplantate durch ein solches immunsuppressives Regime vor der Ab¬stoßung geschützt werden. Um dies zu untersuchen, wurden Therapieansätze an transplantierten hypokalzämischen Lewis-Ratten getestet, die zuvor allogene Nebenschilddrüsentransplantate erhalten hatten. Darüber hinaus sollte für das Experimentalmodell Ratte die Frage geklärt werden, inwieweit der Transplantationsort, Glutaeusmuskel oder Nierenkapsel, die Wirkung der Immunsuppression beeinflusst.
Glutamat spielt in der Entwicklung des ZNS eine besondere Rolle (z.B. Steuerung der Migration von Proneuronen, Einfluß auf die Ausbildung von Synapsen und Differenzierung von Pyramidenzelldendriten und Proliferation glialer Vorläuferzellen). Durch Regulation der extrazellulären Glutamatkonzentration kommt den Glutamattransportern dabei eine besondere Bedeutung zu. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, die postnatale zelluläre und regionale Expression der Glutamattransporter GLT1 und GLAST im Hippocampus der Ratte zu untersuchen, um Rückschlüsse auf ihre Funktion während der postnatalen Ontogenese (Postnataltag 1-60, P1-60) zu ziehen. Dazu wurde nichtradioaktive In-situ-Hybridisierung (ISH) mit Digoxigenin-markierten cRNA-Sonden eingesetzt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass beide Transporter vor allem in Gliazellen (besonders Astroblasten/Astrozyten) nachweisbar sind und dass die Expression von GLT1 und GLAST während der Ontogenese der Ratte im Hippocampus unterschiedlich erfolgt. Aus unseren Ergebnissen kann geschlossen werden, dass GLAST und GLT1 eine unterschiedliche Bedeutung während der Ausbildung der hippocampalen Verbindungen haben dürften. Der trisynaptische hippocampale Verbindungsweg entwickelt sich hauptsächlich in der ersten postnatalen Woche. Während dieser Zeit verlagert sich die exzitatorische Funktion in Hippocampusneuronen von GABA auf Glutamat. Diese Transmitterumstellung korreliert zeitlich mit der deutlichen Zunahme der GLT1-Expression im Hippocampus, was auf eine entscheidende Rolle von GLT1 bei der Bildung hippocampaler Verbindungen durch Regulation der extrazellulären Glutamatkonzentration hinweist. Demgegenüber ist kein offensichtlicher Zusammenhang zwischen GLAST-Expression und Transmitterumstellung zu erkennen. Wie in adulten Stadien kommt dem Transporter unter physiologischen Bedingungen auch in der Ontogenese wohl vor allem eine Reservefunktion zu.
L-Glutamat ist der hauptsächliche exzitatorische Transmitter in der Vertebratenretina und spielt eine zentrale Rolle bei der Transmission wesentlicher Neurone in der Retina (z.B. Photorezeptor-, Bipolar- und Ganglienzellen). Das bei der Transmission freigesetzte Glutamat wird aus dem Extrazellularraum durch mindestens fünf verschiedene Glutamattransporter entfernt (zur Beendigung des Transmittersignals und zur Vermeidung einer neurotoxischen Anreicherung von Glutamat), die unterschiedlich verteilt in Neuronen und Gliazellen (vor allem Müller-Zellen) vorkommen. Die zelluläre Verteilung dieser Transporter wurde bisher hauptsächlich nur mit immuncytochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde nicht-radioaktive in situ Hybridisierung (ISH) unter Verwendung komplementärer RNA-Sonden eingesetzt, um die Zelltypen in der Retina und zusätzlich im N. opticus der Ratte zu identifizieren, welche die Glutamattransporter GLT1, GLT1-Variante (GLT1v), GLAST und EAAC1 exprimieren. Die Ergebnisse der ISH wurden mit immuncytochemischen Daten verglichen, wobei affinitätsgereinigte Antikörper gegen Transporterpeptide verwendet wurden. Bei den immuncytochemischen Untersuchungen wurde aus Vergleichsgründen die menschliche Retina einbezogen. Die Untersuchungen haben ergeben, dass in der Retina der Ratte GLT1v und EAAC1 in verschiedenen Zelltypen (Photorezeptor-, Bipolar-, Horizontal-, Amakrin-, Ganglien- und Müller-Zellen) gleichzeitig exprimiert werden, während GLAST nur in Müller-Zellen und Astrozyten vorkommt. Im N. opticus der Ratte werden GLT1v und EAAC1 vor allem in Oligodendrozyten und GLAST hauptsächlich in Astrozyten exprimiert. GLT1 konnte weder in der Retina, noch im N. opticus nachgewiesen werden. Die Untersuchungen an der menschlichen Retina ergaben eine der Rattenretina ähnliche zelluläre Verteilung der Glutamattransporter.
rOCT1 und hOCT2 sind zwei homologe Transportproteine für organische Kationen, die in Niere und Leber den ersten Schritt der transepithelialen Sekretion von Metaboliten und Xenobiotika vermitteln. Eines ihrer wesentlichen Charakteristika ist neben der Potentialabhängigkeit die Polyspezifität hinsichtlich Transportsubstraten und Hemmstoffen. Beide Transporter können als Uniporter klassifiziert werden, d.h. sie besitzen keine obligate Kopplung an ein Austausch- oder Cosubstrat wie z.B. Natrium, Protonen oder andere organische Kationen. Darüberhinaus zeigen sie das für Transportproteine typische und von Kanälen distinkte Charakteristikum der trans-Stimulierbarkeit. Mit rOCT1 konnten erstmals für einen Prototypen der Transportersuperfamilie SLC22 nähere Aufschlüsse über den Transportmechanismus erhalten werden. Zum einen wurde nachgewiesen, daß rOCT1 eine direktionale Asymmetrie besitzt, d.h. unter Sättigungsbedingungen besteht eine kinetische Bevorzugung der Transportrichtung von extra- nach intrazellulär um den Faktor zwei bis fünf. Zum anderen wurden anhand von rOCT1 neue Erkenntnisse zum Bindungs- und Interaktionsverhalten von Hemmstoffen und Transportsubstraten in Abhängigkeit von der Transportrichtung gewonnen. Hierbei erscheint das bisherige Modell von topologisch festgelegter kompetitiver und allosterischer Hemmung zu stark vereinfacht und nicht zutreffend. Die Bindung von Transportsubstraten und die dadurch induzierten Konformationsänderungen scheinen selbst die Bindungseigenschaften von Hemmstoffen in mehreren Zuständen zu beeinflussen. Auch scheinen Transport- und Ionenleitfähigkeit von OCT zu differenzieren zu sein. Zur Klärung der Fragestellungen wurde das Expressionsmodell Xenopus-Oozyte durch die Etablierung der sogenannten Effluxmethodik funktionell und methodisch wesentlich erweitert.
In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob sich sham-operierte Versuchsratten und gesunde Vergleichsratten in via Cine-Herz-MRT zu erfassenden Parametern signifkant unterscheiden. Hierzu wurden an einem Bruker 7 Tesla-Magnetresonanztomografen drei verschiedene Tiergruppen à 6 Tiere untersucht. Der erste Vergleich fand statt zwischen der gesunden Vergleichsgruppe und einer ähnlich schweren Shamtiergruppe, die sich in der 8. postoperativen Woche befand. Nachdem hier keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festzustellen waren, wurde der Vergleich ausgeweitet: Die Shamgruppe wurde zu einem frühen postoperativen Zeitpunkt (7-14 Tage postoperativ) ein zweites Mal mit der gesunden Gruppe verglichen.
Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gründemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminosäure in der 11. Transmembrandomäne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminosäuren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels“ aller 12 hypothetischen Transmembrandomänen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminosäuren in der vierten Transmembrandomäne auf einer Seite. Bei diesen Aminosäuren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingeführt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminosäuren bei den flankieren Aminosäuren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport führte. Weiterhin schien an Position 218 für den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminosäure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls Änderungen bei den Transportraten und Affinitäten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinität der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegenüber dem Wildtyp erhöht. Weiterführende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinitäten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls Änderungen in Affinität und Selektivität. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum verändert war, hingegen wurden sehr starke Änderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminosäurepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies könnte der Grund für die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch bestätigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte.
Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.
Lamin C2
(2000)
In der Kernlamina von Spermatozyten von Nagetieren sind die Lamin A-Genprodukte, Lamin A und C, durch eine meiosespezifische Splicingvariante ersetzt. Dieses Lamin C2 unterscheidet sich auffallend von den somatischen Varianten in Struktur, Menge und Verhalten. Durch eine ektopische Expression von Lamin C2 als EGFP-Lamin C2-Fusionsprotein in einer somatischen Zellinie zeigte sich, daß eine neuartige Hexapeptidsequenz (GNAEGR) am N-terminalen Ende des Proteins anstelle der C-terminal gelegenen CaaX-Box somatischer Lamine für die Interaktion mit der Kernhülle verantwortlich ist. So ermöglicht eine posttranslationelle Myristylierung des ersten Glycins ein Membrantargeting, bei dem der hydrophobe Myristinsäurerest vergleichbar dem hydrophoben Farnesylrest am Cystein der Caax-Box mit den Fettsäureresten der Kernmembran interagiert. Die Deletion des Hexapeptids im Fusionsprotein EGFP-Lamin C2 und die seine N-terminale Insertion in das Fusionsprotein EGFP-Lamin C - es besitzt keine Caax-Box - bestätigt, daß allein das Hexapeptid das Membrantargeting steuert: Die Deletionsmutante EGFP-Lamin C2 bleibt diffus im Kern verteilt, während sich die Insertionsmutante EGFP-Lamin C im Bereich der Kernperipherie anreichert. Eine weitere Besonderheit stellt die Verteilung von Lamin C2 innerhalb der Kernhülle dar, denn es verteilt sich nicht gleichmäßig wie alle bisher bekannten Lamine, sondern bildet zahlreiche Aggregate. Nicht nur in der Kernhülle von Spermatozyten, sondern auch als Fusionsprotein in somatischen Zellen exprimiert, zeigt Lamin C2 diese Akkumulationen. Überraschenderweise treten die Synaptonemal-komplexenden nur im Bereich dieser Lamin C2-Aggregate mit der Kernhülle in Kontakt. Es wird daher postuliert, daß die Lamin C2-Aggregate der lokalen Verstärkung der Kernhülle dienen und wichtig für die auf die Prophase beschränkte Anheftung der SC an die Kernhülle sind. Da zudem in einer Kurzzeitkultur von Pachytänspermatozyten, in der die Prophase künstlich beschleunigt wird, gezeigt werden konnte, daß Lamin C2 mit Ende der Prophase I noch vor dem Auflösen der eigentlichen Kernhülle nicht mehr nachweisbar ist, scheint ein Zusammenhang zwischen Lamin C2 in der Kernhülle und der Umorganisation des genetischen Materials zu bestehen.
Gegenstand dieser Doktorarbeit war die Beschreibung des Urokinaseplaminaktivators uPA im C6-Sphäroidmodell der Ratte und dessen Lokalisation in Bezug auf den Primärtumor. Das hierbei verwendete Tiermodell basiert auf der C6-Tumorzellreihe, welche durch Transfektion von Rattengliomzellen mit dem Vaskularisierungsfaktor VEGF entwickelt wurde. Die gesteigerte Expression von VEGF resultiert in einer stärkeren Vaskularisierung und einer erhöhten Wachstumsrate des Tumors. Im Vorfeld der Tumorimplantation konnte die Expression von uPA durch die C6-Tumorzellen mittels reverser RNA-Transkription und Polymerasekettenreaktion nachgewiesen werden. In vitro gelang der Nachweis von uPA im C6-Sphäroiden mittels Fluoreszenz-Färbung. Im Rahmen des Tierversuches wurden aus den Tumorzellen ca. 300µm große Sphäroide hergestellt, welche den Ratten in den Kortex des linken Frontallappens implantiert wurden und dort solide Hirntumoren bildeten. Die Versuchstiere wurden anschließend in zwei Gruppen aufgeteilt. Der Positivgruppe wurde täglich über einen Zeitraum von 19 bzw. 21 Tagen der Proteasehemmer WX-UK1 in die Bauchhöhle injiziert, die Kontrollgruppe erhielt ein Placebo. Nach Ablauf des Behandlungszeitraumes konnte an den explantierten Gehirnen mittels histochemischer Peroxidasefärbung die Protease uPA im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die Konzentration von uPA war besonders im invasionsaktiven Bereich des Tumors erhöht. Dieser entspricht der Randzone des soliden Tumors, sowie den distanzierten Zellnestern im gesunden Hirngewebe, welche als so genannte Invasionszone zusammengefasst werden. Die tragende Rolle von uPA bei der Invasion der Tumorzellen in das gesunde Hirngewebe konnte somit bestätigt werden. Die Messung von erhöhten uPA-Konzentrationen an der Basalmembran von Hirngefäßen korreliert mit Beobachtungen, dass die Tumorzellen entlang von Gefäßen und Plexus migrieren, aber nicht in der Lage sind, in das Gefäßlumen einzudringen. Der Nachweis der erfolgreichen orthotopen Sphäroidimplantation mittels MRT-Bildgebung der Hirntumoren unterstreicht den Vorteil der offenen Implantationstechnik gegenüber der Zellinjektion. Die peritoneale Verabreichung des Proteasehemmers WX-UK1 führte im Rahmen dieser Untersuchungen zu keiner signifikanten Reduktion des Tumorwachstums, welches mittels Volumenmessung im MRT dokumentiert wurde. Des Weiteren konnte keine Minderung der uPA-Konzentration in den Tumoren der Positivgruppe gegenüber der Kontrollgruppe gemessen werden. Neben der fehlenden Biodistribution des Wirkstoffes kommt hierfür auch eine mangelnde Spezifität von WX-UK1 für uPA oder ein alternativer Aktivierungsweg der Proteolyse innerhalb der Tumorzellen in Betracht. Diese Arbeit führt zur Weiterentwicklung des C6-Sphäroidmodells und unterstützt die zukünftige Entwicklung von Wirkstoffen gegen das Tumorwachstum auf Basis der anti-invasiven Therapie.
Spannungsabhängige Natriumkanäle bestehen aus einer α-Untereinheit und zugehörigen β-Untereinheiten und sind verantwortlich für die schnelle Aufstrichphase eines Aktionspotenzials. Die α-Untereinheit bildet unter anderem die Pore, während die assoziierten β-Untereinheiten Zelladhäsionsaufgaben erfüllen und verantwortlich für Modulation der Kinetik und die Kommunikation mit dem Extrazellular-raum sind. In Vorarbeiten an Herzen von Säugetieren konnte gezeigt werden, dass sowohl die eigentliche kardiale Isoform Nav1.5, als auch die TTX-sensitiven, neuronalen Isoformen Nav1.1, Nav1.3 und Nav1.6 vorkom-men. Diesen Untersuchungen lagen adulte Kardiomyozyten zugrunde. Unklar war allerdings die Lokalisation und Expression von Natrium-kanälen an neonatalen Herzmuskelzellen. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Isolation ventrikulärer Kardio-myozyten von Herzen neonataler, ein bis zwei Tage alter Ratten. Diese wurden nach zwei Tagen in Kultur mit spezifischen Antikörpern gegen α-und β-Untereinheiten mithilfe immunzytochemischer Unter-suchungsmethoden gefärbt. Zusätzlich wurden Connexin 43 und α-Actinin als Marker für Disci intercalares und intrazelluläre Sarkomere im Sinne einer Doppelfärbung dargestellt. Die Auswertung erfolgte mittels konfokaler Mikroskopie. Die Ergebnisse zeigten eine Darstellung sowohl der kardialen (Nav1.5), als auch der neuronalen, TTX-sensitiven α-Natriumkanalisoformen (Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3 und Nav1.6). Ebenso ließen sich alle vier bekannten β-Untereinheiten detektieren. Im Unterschied zu adulten Kardiomyozyten zeigte sich kein iso-formenspezifisches Verteilungsmuster, sondern eine gleichmäßige Ver-teilung aller Natriumkanaluntereinheiten über die Zellmembran. Es konnte für die dargestellten Isoformen eine Kolokalisation mit Connexin 43 an den Disci intercalares detektiert werden. Dies weist auf eine wichtige Rolle bei der Erregungsfortleitung von Zelle zu Zelle hin.
Mechanismen der TZR-abhängigen und -unabhängigen Aktivierung primärer T-Zellen der Ratte durch CD 28
(2000)
Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt.
Makrophagen spielen als Zellen der angeborenen Abwehr eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr. Ziel dieser Arbeit war die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Alveolarmakrophagen der Ratte. Hierzu wurden die durch eine bronchoalveoläre Lavage gewonnenen Alveolarmakrophagen immunhistologisch und durchflusszytometrisch untersucht. Zusätzlich wurden sie in vitro mit LPS und IFN-g stimuliert. Die Produktion von Stickstoffmonoxid wurde mit dem Griess Reagenz bestimmt und die Expression von iNOS im Immunoblot nachgewiesen. Zudem wurde die Interaktion mit naiven T-Lymphozyten untersucht. Als Vergleichszellen wurden Peritonealmakrophagen verwendet. Bei den aus bronchoalveolären Lavagen gewonnenen Zellen handelte es sich eindeutig um CD68- und CD11b-positive Alveolarmakrophagen. Vollständig aktivierte Alveolarmakrophagen exprimierten zum Teil andere Oberflächenmoleküle als nicht-aktivierte. So stieg nach Stimulierung der Anteil der Makrophagen, die die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 exprimierten, auf ca. 80 Prozent an. Ebenso bildeten sie große Mengen an Stickstoffmonoxid (380 μmol/L NO nach 48 Stunden bei 1 μg/mL LPS) und exprimierten auch das Enzym iNOS. Die aktivierten Alveolarmakrophagen waren nicht in der Lage, naive T-Lymphozyten zu aktivieren. Die Stimulierung der Alveolarmakrophagen in vitro hat gezeigt, dass LPS und IFN-g in den getesteten Konzentrationen in der Lage waren, Makrophagen vollständig zu aktivieren. Die zweistufige Aktivierung von Makrophagen durch ein Priming mit IFN-g und eine darauf folgende vollständige Aktivierung mit LPS, ist bei hohen lokalen Konzentrationen auch nur mit LPS bzw. IFN- g möglich. Dies unterstreicht die besondere Bedeutung der beiden Mediatoren für die Aktivierung von Makrophagen.
Die maligne Hyperthermie ist eine metabolische Muskelerkrankung, die durch eine unkontrollierte Kalzium-Freisetzung in das Zytosol der Muskelzelle zu einer Aktivierung des kontraktilen Apparates und zu einer Beschleunigung des Zellstoffwechsels führen kann. Der in-vitro-Kontraktur-Test am Skelettmuskel ist zur Zeit das einzige zuverlässige Verfahren zur Erkennung einer MH-Veranlagung. In dieser Arbeit sollte untersucht werden inwieweit die lokale Laktatkonzentration durch die Applikation von Kalzium und Koffein mit Hilfe einer Mikrodialysesonde beziehungsweise durch die systemische Infusion von Ryanodin und Dantrolen beeinflusst wird. Mit Tierschutz-Genehmigung wurden 61 Sprague-Dawley Ratten anästhesiert und post exitum über die Aorta die Hinterbeine mit Ringer-, Ryanodin- (0,25 µM, 1 µM) oder Dantrolenlösung (1 µM) perfundiert (30 ml h-1, 19-20oC). Über Mikrodialysesonden (1 µl min-1) in den Mm. adductores wurde Ringer, Sorbitol (80 mM), Kalzium (20 mM, 40 mM, 80 mM) oder Koffein (40 mM, 80 mM) appliziert und im Dialysat Laktat spektrometrisch gemessen. Bei einer relativen recovery von 77 ± 2% für Laktat in-vitro stieg die Laktatkonzentration unter Perfusion mit 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalziumlösung auf 466 ± 31%, 632 ± 48% beziehungsweise 635 ± 81%, während unter Perfusion mit 40 mM und 80 mM Koffein eine relative Zunahme auf 270 ± 21% und 377 ± 21% beobachtet wurde. Unter systemischer Organperfusion mit 0,25 µM und 1 µM Ryanodinlösung und lokaler Applikation von 40 mM Koffein wurden relative Laktatanstiege von 279 ± 23% und 331 ± 19% gemessen. Dagegen stieg die relative Laktatkonzentration bei systemischer Infusion von 1 µM Dantrolenlösung und lokaler Perfusion mit 40 mM Koffein nur bis auf 193 ± 13% an. Diese methodische Untersuchung beweist, dass durch die lokale Perfusion von Kalzium und Koffein sowie die systemische Infusion von Ryanodin ein Anstieg der lokalen Laktatkonzentration induziert, beziehungsweise durch systemische Applikation von Dantrolen dieser Anstieg inhibiert werden kann. Systemische Effekte müssen allerdings im in-vivo Tierversuch ausgeschlossen werden, um die Mikrodialysetechnik für die Entwicklung eines minimal-invasiven Verfahrens zur Diagnostik der malignen Hyperthermie nutzbar machen zu können.
CD8 wird von thymisch gereiften a/b T Zellen als CD8ab-Heterodimer exprimiert und dient als Korezeptor bei der MHC Klasse I (MHC I) restringierten Antigenerkennung. In dieser Funktion stabilisiert CD8 die Bindung des T Zellrezeptors (TCR) an seinen Liganden (MHC I mit antigenem Peptid) und vermittelt darüber hinaus kostimulatorische Signale an die T Zelle. Die Antigene der g/d T Zellen sind bis auf einige Ausnahmen unbekannt, aber g/d T Zellen von Maus und Mensch weisen im allgemeinen höchstwahrscheinlich keine MHC-restringierte Antigenerkennung auf. Dementsprechend findet man auf den meisten g/d T Zellen dieser Spezies keinen der MHC-spezifischen Korezeptoren CD4 oder CD8. In auffälligem Gegensatz dazu exprimieren in der Milz der Ratte bis zu 80 Prozent der g/d T Zellen das CD8ab-Heterodimer. Um die mögliche Funktion von CD8ab auf g/d T Zellen besser zu verstehen, wurden zunächst die CD8-vermittelten Signale untersucht. Eine Schlüsselrolle bei der Initiierung der TCR-Signalkaskade kommt der mit CD8a assoziierten Proteintyrosinkinase p56lck zu. Diese ist, wie durch Kopräzipitationsexperimente gezeigt wurde, bei a/b und g/d T Zellen gleichermaßen mit CD8 assoziiert und zeigt dieselbe Kinaseaktivität. Weiterhin konnte in vitro ein kostimulatorisches Potential von CD8-spezifischen Antikörpern für a/b und g/d T Zellen gezeigt werden. Demnach besitzt CD8 auf a/b und g/d T Zellen prinzipiell eine vergleichbare Fähigkeit zur Übertragung kostimulatorischer Signale. Es war folglich naheliegend, einen Zusammenhang zwischen der CD8ab-Expression der g/d T Zellen mit einer möglichen MHC I estringierten Antigenerkennung zu prüfen. Da bisher keine Antigene für g/d T Zellen der Ratte bekannt sind, wurden die Antigen bindenden Regionen des g/d TCR analysiert. Bei Antigenrezeptoren von Mensch und Maus bestehen nämlich charakteristische Längenunterschiede zwischen den mit dem Antigen interagierenden CDR3-Proteinschleifen (englisch: complementarity determining regions), die in der Verknüfungsregion der V-, D- und J-Gensegmente codiert sind. Bei Maus und Mensch sind die CDR3-Längen der TCRd-Kette ähnlich variabel und etwa so lang wie bei der schweren Kette des B Zellrezeptors. Dagegen sind die CDR3-Regionen der TCRb-Kette sehr kurz, was wahrscheinlich durch die notwendige Interaktion des MHC-Peptid-Komplexes mit allen drei CDR-Schleifen bedingt wird. Daraus wurde geschlossen, daß die Bestimmung der CDR3d-Längen Aussagen über eine mögliche MHC-Restriktion von g/d T Zellen der Ratte erlauben sollte. Zur Durchführung der CDR3d-Längenanalysen wurde die Methode des Spektratyping etabliert. Hierfür wurden in der Milz häufig vorkommende TCRd V-Gensegmente (DV105 und fünf Mitglieder der ADV7-Familie) partiell kloniert und sequenziert. In CD8 positiven und negativen g/d T Zellen wurden sowohl DV105 als auch Mitglieder der ADV7-Familie jeweils etwa gleich häufig exprimiert. Spektratyp-Analysen ergaben in g/d T Zellen der Ratte für beide V-Genfamilien etwas längere CDR3d-Schleifen als bei der Maus; CD8ab positive, CD8aa positive und CD8 negative g/d T Zellen der Ratte besaßen identische Längenspektren. Demnach kann man die CD8ab-Expression von g/d T Zellen der Ratte nicht als Hinweis auf eine der klassischen MHC-Restriktion ähnliche Antigenerkennung werten. Als spezifische Eigenschaft von g/d T Zellen der Ratte wurde eine Modulation der CD8b-Genexpression nachgewiesen, die mit der Stärke des Aktivierungssignals zunahm. Nach Aktivierung in vitro exprimierte ein großer Teil zuvor CD8ab positiver g/d T Zellen nur noch das CD8aa-Homodimer, das auf MHC I restringierten a/b T Zellen deutlich schlechtere Korezeptoreigenschaften aufweist als das CD8ab-Heterodimer. Die Modulation war irreversibel, fand prätranslational statt und zeigte keine Einflüsse auf Effektorfunktionen der g/d T Zellen wie Interferon-g-Produktion oder zytotoxische Fähigkeiten. Über die physiologische Bedeutung dieser Modulation kann nur spekuliert werden, doch könnte sie ein Mechanismus sein, um den Schwellenwert für Signale einer erneuten T Zellaktivierung zu erhöhen. Darüber hinaus limitiert sie den Nutzen der CD8ab-Expression als Marker für die thymisch gereifte Linie von g/d T Zellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die in-vivo-Effekte eines „superagonistischen“ mAks mit Spezifität für den kostimulierenden Rezeptor CD28 der Ratte untersucht. Dieser Antikörper unterscheidet sich von konventionellen CD28-spezifischen mAk durch seine Fähigkeit, T Zellen auch ohne Ligation des TZR und damit polyklonal zu aktivieren. Die so ausgelöste Expansion der T Zellen verläuft so schnell und effizient wie eine durch Antigen gesteuerte Proliferation; die überproportionale Vermehrung anti-inflammatorischer regulatorischer T Zellen während der initialen Expansionsphase ist vermutlich für das Ausbleiben toxischer Effekte im Zuge der polyklonalen TZellvermehrung verantwortlich.
Va8.2+ CD8 T-Zellen von LEW.1F Ratten (MHC-Haplotyp f) werden während der Reifung im Thymus zehnfach überselektioniert: 14 Prozent der reifen LEW.1F CD8 T-Zellen exprimieren Va8.2; CD8 T-Zellen von MHC kongenen RT1f- Stämme sind nur zu 1-2 Prozent Va8.2+. Gleichzeitig führt die RT1f-spezifische allogene Stimulation reifer LEW (MHC Haplotyp l) CD8 T-Zellen zu einer bevorzugten Expansion von Va8.2+ T-Zellen. Dies überrascht, da die positive Selektion unreifer Thymozyten eine niedrigere Avidität zwischen T-Zelle und Antigen-präsentierender Zelle erfordern soll als Alloreaktivität. Ein bevorzugter Vb-Gebrauch wurde weder bei RT1f-spezifischer positiver Selektion noch Alloreaktion gefunden. Das Ja-Repertoire von RT1f-alloreaktiven Va8.2 TCR ist restringiert, ihre CDR3a Schleifen sind kurz, homogen und besitzen wenig N-Nukleotidinsertionen; ein hydrophob/amphiphatisches Motiv erhöht wahrscheinlich die Peptidpromiskuität. Va8.2+ LEW.1F T-Zellen besitzen ein weniger restringiertes Ja-Repertoire; ein hydrophobes Motiv der CDR3a-Schleife wurde seltener gefunden; weitere Restriktionen der CDR3a-Schleife fanden wir nicht. Nicht-alloreaktive LEW CD8 T-Zellen zeigten keine Restriktionen im Bereich Ja/CDR3a. Va8.2 vermittelt MHC-spezifische positive Selektion und Alloreaktivität. Alloreaktionen erfordern einen zusätzlichen Beitrag der CDR3a-Schleife, deren Gestaltung wahrscheinlich Kontakte mit einem hochdiversen Peptidsatz und zusätzliche MHC-Molekül-Kontakte ermöglicht. Unsere Ergebnisse sind vereinbar mit Röntgenstrukturanalysen des T-Zellrezeptor (TCR)/pMHC-Komplexes und dem "differential-avidity model" der TCR-vermittelten Antigenerkennung bei thymischer Selektion und Aktivierung reifer T-Zellen. Sie dokumentieren die Bedeutung der Erkennung polymorpher MHC-Strukturen durch keimbahnkodierte TCR-Segmente und sprechen gegen eine ausschließliche Peptidspezifität von positiver Selektion und Alloreaktivität.