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In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.
Ziel dieser retrospektiven, monozentrischen Studie war es, die virale Ätiologie und die klinischen Charakteristika bei hospitalisierten Kindern und Jugendlichen unter 17 Jahren mit ARE an der Universitäts-Kinderklinik Würzburg im Zeitraum Juni 2012 – Juni 2014 zu untersuchen. Die Virusdiagnostik erfolgte dabei aus respiratorischen Sekreten mittels Multiplex-RT-PCR für 18 respiratorische Viren. Es wurden insgesamt 960 Kinder mit ARE und Multiplex-PCR-Testung auf respiratorische Viren in die Untersuchung eingeschlossen. 566 Kinder (59%) waren männlich. Der Altersmedian betrug 1,9 Jahre (IQR 1,0-4,4). Die Patienten befanden sich im Median 3 Tage (IQR 2-5) in stationärer Behandlung. Die häufigsten mit ARE assoziierten Symptome waren Fieber (n=538, 56%), Husten (n=527, 55%) und Nahrungs-/ Trinkverweigerung (n=382, 40%). Bei 52% der Patienten (n=502) lag eine URTI und bei 48% (n=458) eine LRTI vor. Ca. 50% der Kinder (n=481) hatten eine oder mehrere Vorerkrankungen, wobei eine bestehende chronische Lungenerkrankung mit 18% (n=176) und Frühgeburtlichkeit (n=100, 10%) die häufigsten prädisponierenden Faktoren darstellten. 13 Kinder (1,4%) benötigten eine intensivstationäre Betreuung. 460 Kinder (48%) erhielten initial eine antibiotische Therapie. 168 Kinder (18%) benötigten eine Sauerstofftherapie. Zwei Kinder (0,2%) starben bei vorher bestehender Grunderkrankung. Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation gezeigt werden, dass hospitalisierte Kinder mit LRTI, mit positivem Virusnachweis oder mit einer viralen Koinfektion wesentlich jünger waren als Kinder mit URTI, negativem Virusnachweis oder viraler Monoinfektion. Zudem wurde vor allem bei Kindern mit hMPV- oder RSV-Nachweis ein schwererer klinischer Verlauf verzeichnet, wobei sich insbesondere hMPV als häufigster Erreger bei Kindern mit viraler Pneumonie herausstellte. Insgesamt spiegeln die Studienergebnisse die hohe Krankheitslast der viral bedingten ARE im Kindesalter wieder, welche trotz vielseitiger Bestrebungen zu konsequenten Hygienemaßnahmen nur begrenzt reduziert werden können. Obwohl eine symptomatische Therapie mehrheitlich zu einer raschen Genese der Kinder führt, wäre der differenziertere und folglich reduzierte Einsatz einer Antibiotikatherapie unter Einbezug einer standardisierten Virusdiagnostik wünschenswert.
Hintergrund: In den letzten Jahren werden in der virologischen Routinediagnostik herkömmliche Methoden, wie der Immunfluoreszenztest (IFT), zunehmend durch neue molekulare Detektionsmethoden ersetzt. Auf der Suche nach einem für das Kinderklinik-Kollektiv geeigneten alternativen Screeningtest war im Vorfeld das Resplex Panel im Vergleich zum aktuellen Standard (IFT) getestet worden. Die Ergebnisse für ADV und RSV waren dabei deutlich diskrepant.
Studiendesign: Zur weiteren Abklärung der diskrepanten Ergebnisse zwischen IFT und Resplex wurden respiratorische Proben aus dem Zeitraum Mai 2004 bis Februar 2008 von Patienten aus Würzburger Kinderkliniken verwendet. Dies umfasste 71 Proben, die im IFT positiv für Adenovirus-Antigen vorgetestet waren, und 68 Proben, die im IFT positiv für RSV-Antigen vorgetestet waren. Für alle Proben lagen Resplex-Ergebnisse vor. Mittels Sequenzierung aus Restmaterial wurden Adenovirus-Typen und RSV-Subtypen bestimmt. IFT-, Resplex- und Typisierungs-Ergebnisse wurden verglichen. Zusätzlich erfolgte eine epidemiologische Auswertung.
Ergebnisse: Das Resplex Panel zeigt sich im vorliegenden pädiatrischen Kollektiv zur Detektion von ADV und RSV aufgrund unterschiedlicher Ursachen als ungeeignet: Für ADV ist sein auf zwei Spezies (ADV B und E) beschränktes Spektrum unzureichend, wodurch es die im Kollektiv häufige ADV C-Spezies (43%) nicht erfasst. Für RSV bedürfen die Primer bzw. Sonden einer Überarbeitung, da das Resplex Panel, verglichen mit dem IFT, wesentlich weniger Proben (41%) als RSV-positiv erkennt.
Bezüglich der Prävalenz der Typen wurde eine für ADV typische Verteilung in Kinderkollektiven (54% ADV 3, 26% ADV 2, 12% ADV 1) nachgewiesen. Betroffen waren vor allem Kinder im Alter von sechs Monaten bis fünf Jahren. Kinder mit ADV C-Infektionen waren signifikant jünger als Kinder mit ADV B-Infektionen. Für RSV zeigte sich in der respiratorischen Saison 2006/2007 und in den Wintermonaten 1 – 2/2008 eine Dominanz von RSV Subtyp B. Betroffen waren vor allem Kinder im ersten Lebensjahr.
Resumé: Die vorliegende Studie bestätigt die unzureichende Detektion von ADV und RSV durch das Resplex Panel, wobei bezüglich ADV ein unzureichendes Spektrum, für RSV unzureichend optimierte Primer und Sonden vermutlich ursächlich sind. Die epidemiologischen Daten stehen mit denen aus anderen Studien an ähnlichen Kollektiven in Einklang.
In dieser Dissertation wurden die Häufigkeit und das klinische Erscheinungsbild von Kindern mit schwerer RSV-assoziierten akuten Atemwegserkrankung (ARE) auf pädiatrischen Intensivstationen untersucht. Die Daten stammen aus einer prospektiven multizentrischen Studie zu intensivstationär behandelten viralen ARE bei Kindern, die im Studienzeitraum von Oktober 2010 – September 2013 durchgeführt wurde und an der bayernweit 23 von 30 Kliniken (77%) mit pädiatrischen Intensivstationen teilnahmen.
RSV war mit 31% aller Erregernachweise in der Multiplex-PCR und mit 28% aller untersuchten PICU-ARE-Patienten der häufigste virale respiratorische Erreger auf pädiatrischen Intensivstationen. Die Hälfte der Patienten war männlich und das mediane Alter der betroffenen Kinder lag bei 2,5 Monaten mit einem (IQR von 1,5 bis 19,2 Monaten, min. 0,6 Monate alt, max. 193 Monate ~ 16,1 Jahre). Die hohe Bedeutung schwerer RSV-Infektionen im ersten Lebensjahr wurde dadurch belegt, dass 70% aller Patienten Säuglinge waren. Das häufigste Symptom bei Aufnahme auf die Intensivstation war Atemnot (93%). Es folgten an zweiter und dritter Stelle die Symptome Husten (78%) und Trink- und Nahrungsverweigerung (63%). Pathologische röntgenologische Befunde des Thorax wurden bei 85% der Kinder erhoben. In der Schweregradbeurteilung mittels SIC-Score wurden von den behandelnden Ärzten 17% der Kinder bei Aufnahme als lebensbedrohlich erkrankt eingestuft. Die häufigsten Diagnosen bei intensivstationär behandelten Kindern mit RSV-assoziierter ARE waren mit 86% Bronchiolitis, Infektionen der oberen Atemwege (76%) und Pneumonie (58%). Von den erkrankten Kindern hatten 46% mindestens eine Grunderkrankung. Die häufigsten waren Frühgeburtlichkeit (23%), neurologische Vorerkrankungen (17%) und pulmonologische Vorerkrankungen (14%). Die häufigste Behandlungsmaßnahme war die Sauerstoffgabe (88%) für eine mediane Dauer von 4 Tagen (IQR 3-7 Tage). Eine CPAP-Behandlung erhielten 36% (mediane Dauer 3 Tage; IQR 2-5 Tage) und eine mechanische endotracheale Beatmung 14% der Patienten (mediane Dauer 7 Tage; IQR 5-10 Tage). Eine orale oder intravenöse Antibiotikagabe erhielten 80% aller Patienten. Die mediane Verweildauer im Krankenhaus betrug acht Tage (IQR 6 bis 11 Tage), darauf entfielen vier Tage (IQR von 2 bis 7 Tagen) auf die intensivstationäre Betreuung. Von allen Kindern mit RSV-assoziierter ARE konnten 97% das Krankenhaus ohne Krankheitsfolgen verlassen, bei drei (2%) Patienten konnten mögliche Folgeschäden nicht ausgeschlossen werden, und zwei Kinder (1%) mit vorbestehender schwerer Grunderkrankung (eine weibliche Patientin, Alter 1 Jahr mit spinaler Muskelatrophie und progredienter respiratorischer Insuffizienz; sowie ein männlicher Patient, Alter 5 Jahre mit spastischer Tetraparese bei Z.n. Asphyxie und hypoxisch-ischämischer Enzephalopathie) verstarben während des intensivstationären Aufenthalts.
Interessanterweise war die stationäre Aufenthaltsdauer von älteren Kindern (> 3-17 Jahre) signifikant länger (2 Tage im Median) als die jüngerer Kinder (≤ 3 Jahre) (p-Wert=0,044). Dies könnte auf eine höhere Prävalenz von Grunderkrankungen bei den älteren Patienten (96% versus 37%; p-Wert=<0,001) zurückzuführen sein. Hier wurden v.a. deutliche Unterschiede bei neurologischen (57% versus 9% p-Wert=<0,001) und pulmonologischen (39% versus 9%; p-Wert=0,001) Grunderkrankungen beobachtet. Eine respiratorische Partialinsuffizienz war ein häufigeres Symptom bei den älteren Kindern (87% versus 58%; p-Wert=0,009), bei denen die Diagnose Pneumonie in der Tendenz (74% versus 56; p=0,113) und ARDS (22% versus 5%; p-Wert=0,013) signifikant häufiger vorkam. Eine Trink- und Nahrungsverweigerung kam, nicht überraschend, bei den jüngeren Kindern häufiger (68% versus 35%; p-Wert=0,004) vor, ebenso die Diagnosen Bronchitis/Bronchiolitis (92% versus 52%; p-Wert=<0,001) und Infektion der oberen Atemwege (80% versus 57%; p-Wert=0,030). Die Inzidenz schwerer RSV-assoziierter ARE bei Kindern auf Intensivstationen lag für die erste Saison bei 31/100.000/Jahr, für die zweite Saison bei 27/100000/Jahr und für die dritte Saison bei 29/100.000/Jahr. In der prospektiven Studie von Forster et al. mussten 1117/100000 aufgrund einer RSV-Infektion hospitalisiert werden [24], eine Inzidenzabschätzung zu intensivstationär behandelten Kindern mit RSV in Deutschland gibt es in dieser Form noch nicht.
Bei 24% der Kinder mit RSV-assoziierter ARE konnte parallel in der durchgeführten Multiplex-PCR Untersuchung, die insgesamt 19 virale Erreger nachweisen kann, ein weiterer viraler Erreger nachgewiesen werden. Bei RSV waren 34% Mehrfachinfektionen (30% waren Doppelinfektionen, 4% waren Dreifachinfektionen). Das CoV war mit 9% der häufigste zusätzlich nachgewiesene Erreger, darauf folgten RV mit 7% und hBoV mit 4%. Kinder mit viraler Mehrfachinfektion waren im Median 4,4 Monate älter als Kinder mit RSV-Monoinfektion (p-Wert=0,030). Die Symptome Atemnot (97% versus 83%; p-Wert=0,017) und Trink- und Nahrungsverweigerung (73% versus 42%; p-Wert=0,003) kamen bei Kindern mit RSV-Monoinfektion häufiger vor. Bezüglich des Schweregrades der Erkrankung gab es keinen Unterschied zwischen Kindern mit Mono- oder Mehrfachinfektion. Neurologische Vorerkrankungen waren jedoch häufiger bei Kindern mit viralen Mehrfachinfektionen (31% versus 9%; p-Wert=0,005) Prädisponierende Faktoren/chronische Vorerkrankungen kamen bei den viralen Mehrfachinfektionen häufiger vor (61% versus 31%; p-Wert=0,004). Insgesamt waren virale Mehrfachinfektionen mit einem Drittel aller RSV-ARE häufig.
Die vorliegende Dissertation bestätigt die Bedeutung von RSV als häufigen Erreger akuter respiratorischer Infektionen der Winter- und Frühlingsmonate in Deutschland und als häufige Ursache für Hospitalisationen, v.a. im frühen Kindesalter. In dieser Dissertation konnte die besondere Bedeutung von RSV als Ursache für intensivstationär behandlungspflichtige Atemwegserkrankungen im Kindesalter hervorgehoben werden. Es ist bemerkenswert, dass RSV mit fast 30% der häufigste Erreger bei Kindern mit respiratorischen Infektionen auf Intensivstationen war, die Letalität mit einem Prozent jedoch vergleichsweise gering war. Bei fast einem Viertel aller Patienten wurde zusätzlich zu RSV mindestens ein weiterer viraler Erreger nachgewiesen. In weiteren Untersuchungen ist zu klären, ob die parallel nachgewiesenen Erreger gemeinsam pathophysiologisch an der untersuchten schweren Atemwegserkrankung beteiligt sind oder ob sich bei Kleinkindern noch über zuvor abgelaufene virale Infektionserkrankungen Virus-DNA nachweisen lässt, die dann im Rahmen der nächsten Erkrankung weiterhin nachweisbar ist.
Die derzeitig verfügbare passive Immunisierung mit einem monoklonalen Antikörper kommt aufgrund der begrenzten Wirksamkeit und der hohen Kosten nur für eine kleine Zahl an Hochrisikopatienten in Frage. Ein geeigneter, möglichst im frühen Säuglingsalter zu applizierender aktiver Impfstoff gegen RSV oder eine maternale Impfung in der Schwangerschaft könnten theoretisch die RSV-Morbidität insgesamt und insbesondere auch die Zahl schwerer RSV-assoziierter ARE senken.
Das humane Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) gilt als wichtiger Krankheitserreger für Säuglinge und Kleinkinder sowie für ältere Personen und immunsupprimierte Patienten. Krankheitssymptome und teils schwerwiegende Verläufe werden dabei eher einer Immunpathogenese zugeschrieben als der Virusvermehrung selbst. Aus Ermangelung eines adäquaten Tiermodells wird häufig das RSV-verwandte Pneumonievirus der Maus (PVM) als Ersatzmodell für schwere Pneumovirusinfektionen verwendet.
In dieser Dissertation wurde zum einen die spatiotemporale Rekrutierung von zellulären Komponenten der angeborenen und adaptiven Immunantwort im Verhältnis zum Verlauf einer PVM-Infektion in immunkompetenten und immunsupprimierten Wirten untersucht. Zum anderen wurde die Pathogenese einer Pneumovirusinfektion anhand des PVM-Modells in Mauslinien mit definierten Immundefizienzen analysiert.
Wie bereits in einer früheren Untersuchung ermittelt, korrelierte die Rekrutierung von CD8+ T-Lymphozyten mit der Viruseliminierung (Frey et al., 2008). B-Lymphozyten wurden aktiv in das Lungengewebe PVM infizierter C57BL/6-Mäuse rekrutiert, wobei sie perivaskuläre und peribronchiale Foki, die ebenfalls CD4+ T-Zellen enthielten, bildeten. Dies könnte auf die Bildung tertiärer lymphoider Gewebe hindeuten. Die Rekrutierung von Zellen der angeborenen Immunantwort (NK-Zellen, neutrophile Granulozyten) geschah parallel bzw. verzögert zur Virusvermehrung und damit eher spät während der Infektion. Die Rekrutierung von eosinophilen Granulozyten erfolgte erst in der Eliminationsphase der PVM-Infektion zusammen mit CD4+-T-Zellen. Zusätzlich wurde ermittelt, dass Alveolarmakrophagen (AMΦ) in vivo mit PVM infiziert und dabei transient depletiert wurden. Die Depletion der AMΦ schien dabei nicht durch Lymphozytenpopulationen zu erfolgen.
Die Charakterisierung der PVM-Infektion bei Mäusen mit definierten Immundefizienzen ergab, dass B-Lymphozyten zur partiellen Viruskontrolle in T-Zell-defizienten Mäusen beitragen und dadurch zur Protektion vor letalen Verläufen bei diesen Mäusen führen. Die Letalität bei diesen Mäusen, insbesondere in Abwesenheit von funktionellen B-Zellen, war mit Kontrollverlust über die Virusvermehrung assoziiert. B-Lymphozyten
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wurden effizient in das infizierte Lungengewebe von T-Zell-defizienten Mäusen rekrutiert. Das Serum T-Zell-defizienter Mäuse wies eine PVM-neutralisierende Aktivität auf, die mit dem Erscheinen PVM-spezifischer IgM-Antikörper, T-Zell-unabhängig synthetisiert, korrelierte. IgG-Antikörper waren jedoch zu diesen Zeitpunkten (14 d.p.i.) nicht nachweisbar. Dies wurde möglicherweise durch unvollständigen oder verzögerten Reifungsprozess von B-Lymphozyten in T-Zell-defizienten Mäusen reflektiert, da verschiedene Antikörperklassen, wie IgM- und IgG-Antikörper zeitgleich exprimiert wurden.
Eine hohe Heterogenität bzgl. der klinischen Symptome und dem Ausgang der Infektion schien außerdem ein Kennzeichen von PVM-Infektionen unter bestimmten Immundefizienzen zu sein. Der adoptive B-Zell-Transfer in B6.Rag1-/--Mäuse verändert die Krankheitsverläufe nach PVM-Infektion, da einige B-Zell-transplantierte Mäuse ohne klinische Symptome zu zeigen überlebten und andere zwar Gewicht verloren und die Versuchsabbruchkriterien erreichten, aber die Heterogenität der Krankheitsverläufe reduziert war. Adoptiv transferierte B-Lymphozyten wurden außerdem in lymphatische Organe und in infiziertes Lungengewebe rekrutiert und waren in der Lage zu Plasmazellen zu reifen. Es gibt somit erste Indizien, dass B-Zellen zu einem Schutz bei einer akuten PVM-Infektion beitragen.