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Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein.
Die BMPs (Bone morphogenetic proteins) sind Zytokine, die in fast allen Tieren exprimiert werden und zur TGF-β Superfamilie gehören. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Knochenentwicklung, unter anderem auf Grund ihrer Fähigkeit, die Neubildung von Knochen auszulösen. Eine weitere Aufgabe der BMPs liegt in der Beeinflussung der Embryogenese. Hier tragen sie zur Differenzierung der einzelnen Keimblätter bei und werden während der Organogenese in vielen Organanlagen exprimiert. Ep45, ein Protein aus Xenopus laevis, gehört zur Familie der Serinproteaseinhibitoren und ist ein extrazellulärer Ligand von BMP4, ohne jedoch dessen Rezeptorbindung bzw. dessen Aktivität zu beeinflussen. Ep45, auch bekannt unter dem Namen pNiXa, wird in der Embryogenese von Xenopus laevis wirksam: Es induziert die Reifung von Oozyten, kann im weiteren Verlauf in verschiedenen Organanlagen nachgewiesen werden und wird in Zusammenhang gebracht mit Teratogenität, die durch Ni2+ hervorgerufen wird. Um auf die aufwendige Isolierung von Ep45 aus Xenopus-Oozyten bzw. –Embryonen verzichten zu können, sollte in dieser Arbeit eine Methode zur rekombinanten Expression und Isolierung von aktivem Ep45 entwickelt werden. Zunächst wurde die Expression von Ep45 in E. coli als lösliches Einzelprotein mit dem Vektor pET25b(+) angestrebt. Da sich jedoch zeigte, dass das Protein zum Großteil als unslösliche Aggregate in Form von inclusion bodies vorlag, wurden diese präpariert, denaturiert und eine Isolierung von Ep45 durch verschiedene Chromatographie-Verfahren (Kationenaustauschersäule, Gelchromatographie) unternommen. Durch die nachfolgenden Renaturierungsversuche konnte jedoch kein aktives Protein gewonnen werden. Zum Nachweis von aktivem Ep45 dienten ein Enzymassay, der auf der Serinproteaseinhibitor-Funktion von Ep45 beruht, sowie ein Bindungsassay. Dieser weist den Ep45-Chymotrypsin-Komplex nach, der bei der Inhibition von Chymotrypsin durch Ep45 entsteht. Als alternatives Expressionssystem kam deshalb das pMal™-Fusionsprotein-System zur Anwendung. Dazu wurde Ep45 an MBP gekoppelt, so dass eine Aufreinigung mittels Chromatographie an einer Amylosesäule möglich werden sollte. Nach Spaltung durch Faktor Xa sollten die beiden Proteine durch Chromatographie voneinander getrennt werden, so dass schließlich Ep45 als reines aktives Protein vorliegt. Trotz des Einsatzes diverser Chromatographie-Verfahren (Ionentauschersäule, hydrophobe Säule, Nickelsäule) gelang keine Isolierung von Ep45. Da in E. coli zwar eine Expression jedoch keine Aufreinigung von aktivem Ep45 gelang, wurde ein Expressionssystem unter Verwendung von Sf9-Zellen (Insektenzellen) eingesetzt. Nach Herstellung des Plasmids pIZT/V5-xEp45 wurden Versuche zur transienten Expression von Ep45 in Sf9-Zellen mittels des InsectSelect™ Systems durchgeführt, die bis zum Abschluss meiner praktischen Arbeit nicht zum Erfolg führten, aber innerhalb der Arbeitsgruppe weiter bearbeitet werden.