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Erscheinungsjahr
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Dokumenttyp
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Sprache
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Schlagworte
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Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.
Neue künstliche Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren zur Komplexierung von Oxo-Anionen in Wasser
(2008)
Ziel der Dissertation „Neue künstliche Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren zur Komplexierung von Oxo-Anionen in Wasser“ war die Weiterentwicklung dieser Rezeptoren nach Schmuck für die Komplexierung insbesondere von Carboxylaten, um sie hinsichtlich Bindungsaffinität und Substratspezifität zu optimieren. Dazu wurde zunächst die Synthese zweier wichtiger Grundbausteine in einzelnen Schritten vollständig überarbeitet, wobei veränderte Reaktionsbedingungen und Aufarbeitungsschritte zu gesteigerten Ausbeuten führten. Dadurch ist es nun möglich, diese Bausteine effizienter zu synthetisieren und im Multigramm-Maßstab für die Darstellung von Rezeptoren zur Oxo-Anionen-Erkennung einzusetzen. Weiterhin wurde die Verbesserung der Komplexierungseigenschaften gegenüber Carboxylaten auf zwei Arten untersucht: zum einen durch das Anbringen eines zusätzlichen Seitenarms an der Guanidinio-Einheit zur Bildung von Guanidiniocarbonylpyrrol-Tweezer-Rezeptoren, zum anderen durch das Einführen einer zweiten positiven Ladung neben der Carboxylat-Bindungsstelle (CBS) zur Darstellung biskationischer Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren. Zur Darstellung von Tweezer-Rezeptoren wurde ein zusätzlicher Seitenarm an der N’-Position der Guanidinio-Einheit angebracht. Die beiden Arme sollten ein Substrat pinzettenartig von zwei Seiten, mit der CBS als Kopfgruppe, komplexieren können. Durch zusätzliche Wechselwirkungen des neuen Seitenarms sollte neben einer stärkeren Komplexierung vor allem eine höhere Substratspezifität erzielt werden. Die experimentell ermittelten Bindungskonstanten lagen allerdings im Bereich der N’-unsubstituierten Rezeptoren. Somit stellen die Tweezer-Modifikationen daher keine Verbesserung der Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren dar. In einem weiteren Projekt zur Rezeptor-Optimierung wurden, durch Einführung einer zweiten positiven Ladung in Form einer terminalen Ammonium-Gruppe, biskationische Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren erfolgreich synthetisiert. Die Komplexierungseigenschaften dieser biskationischen Rezeptoren wurden in Bindungsstudien vornehmlich mit Aminosäurecarboxylaten mittels UV- und Fluoreszenz-Spektroskopie, Massenspektrometrie, NMR-Spektroskopie, ITC und Molecular Modeling Berechnungen untersucht. Anhand der Substratspezifität der biskationischen Rezeptoren wurde deutlich, dass die Spacerlänge, an der die zusätzliche positive Ladung angebracht ist, eine entscheidende Rolle bei der Komplexierung spielte. Galten eigentlich starre, präorganisierte, kurze Linker als vorteilhaft hinsichtlich der Entropie, so ist hier zu erkennen, dass längere, flexiblere Linker zu einer besseren Komplexierung führen können, wenn geeignete zusätzliche nichtkovalente Wechselwirkungen möglich sind. Die biskationischen Rezeptoren stellen damit eine Optimierung des Carboxylat-Bindungsmotivs der Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren nach Schmuck in der Anionen-Erkennung dar.