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Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazelluläre Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antikörper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden dafür erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellulär an Vesikeln sowie an einem perinukleären Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukleären Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde überwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erhöht und gegenläufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit früher gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schlüssigen Konzept zusammenführt.
Asthma bronchiale gehört weltweit zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des Menschen. In verschiedenen Leitlinien zur Asthmatherapie sind Sport bzw. regelmäßige körperliche Aktivität als nicht-medikamentöse Maßnahmen mittlerweile ein integrativer Bestandteil. Etliche Studien haben gezeigt, dass regelmäßige körperliche Aktivität sowohl die Lebensqualität als auch den Krankheitsverlauf bei Asthmatikern positiv beeinflussen kann. Welche Mechanismen genau die positiven Effekte von Sport bei dieser Erkrankung vermitteln, ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. Die Erklärungsansätze reichen dabei von einer Zunahme der kardiopulmonalen Fitness sowie Verbesserung der Lungenfunktion über eine immunologisch vermittelte Reduzierung der Atemwegsinflammation bis hin zu einer Verbesserung körpereigener Reparaturmechanismen. Letztere ist in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus wissenschaftlicher Arbeiten gerückt, wobei man vermutet, dass dabei insbesondere CD34+ Progenitorzellen und MSCs eine bedeutende Rolle spielen könnten.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit sich körperliche Belastung auf die Anzahl zirkulierender CD34+ Progenitorzellen und MSCs bei Patienten mit einem allergischen Asthma bronchiale gegen Hausstaubmilben der Art Dermatophagoides pteronyssinus verglichen mit gesunden Kontroll-Probanden auswirkt. Hierfür unterzogen sich sieben Patienten und zwölf Gesunde einem spiroergometrischen Ausdauerleistungstest bis zur subjektiven körperlichen Ausbelastung. Vor und nach der Spiroergometrie erfolgten Blutentnahmen. Neben einer Bestimmung von Entzündungsparametern wurde jeweils ein Blutbild inklusive Differenzierung angefertigt und die Anzahl zirkulierender CD34+ Progenitorzellen und MSCs mittels FACS-Analyse bestimmt. Weiterhin wurde überprüft, ob sich mithilfe einer gängigen Methode zur Kultivierung von MSCs aus Knochenmark diese auch aus peripherem Blut isolieren und kultivieren lassen.
Bezüglich der CD34+ Progenitorzellen und der MSCs kam es dabei nach Belastung bei getrennter Berechnung für die beiden Studiengruppen zu keiner signifikanten Veränderung. Die Gesamtheit der Studienteilnehmer wurde daher nochmals in einer Gesamtgruppe zusammengefasst, für die ebenfalls durch Belastung hervorgerufene Veränderungen berechnet wurden. Hier ließ sich ein signifikanter Anstieg von CD34+ Progenitorzellen feststellen, wohingegen bei den MSCs weiterhin keine Veränderung zu beobachten war. In den Versuchen zur Kultivierung von MSCs aus peripherem Blut ließen sich keine nennenswerten Mengen dieser Zellen kultivieren, wenngleich die Kulturen doch möglicherweise zu Beginn einige dieser Zellen enthielten. Im Gegensatz dazu war die Kultivierung von MSCs aus Knochenmark erfolgreich.
Dass es nach körperlicher Aktivität bzw. Sport zu einem Anstieg CD34+ Progenitorzellen im peripheren Blut kommt, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben. Es wird vermutet, dass diese Zellen an körpereigenen Reparaturvorgängen beteiligt sind. Dieser Mechanismus könnte eine mögliche Erklärung für die positiven Effekte von Sport bei Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellen. Auch bei Lungenerkrankungen wird CD34+ Progenitorzellen eine Rolle bei Reparaturvorgängen zugeschrieben. Obwohl es zunehmend Hinweise dafür gibt, dass auch MSCs für diese Vorgänge von Bedeutung sind, ist die Frage, welche spezifische Rolle diesen Zellen im zirkulierenden peripheren Blut zukommt, weiterhin nicht hinreichend geklärt. Bei Untersuchungen zu diesem Thema kommt erschwerend hinzu, dass MSCs im peripheren Blut nur in sehr geringer Frequenz nachweisbar sind und die Gruppe dieser Zellen eine sehr große Heterogenität aufweist. Auch eine Kultivierung von MSCs aus peripherem Blut scheint nicht so ohne weiteres möglich zu sein. All dies bereitet Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizie-rung und Charakterisierung dieser Zellen. Auch wenn es in dieser Studie nicht gelang einen Effekt körperlicher Belastung auf die Anzahl zirkulierender MSCs nachzuweisen, sollten dennoch weitere Untersuchungen zu den durch Sport vermittelten Effekten auf diese Zellen folgen. Der Fokus sollte dabei insbesondere auf die Untersuchung von Einflüssen körperlicher Aktivität auf die für das Homing dieser Zellen verantwortlichen Mechanismen gelegt werden. Auch weitere Untersuchungen zur Isolation und Expansion von MSCs aus peripherem Blut scheinen notwendig zu sein, um diesbezüglich langfristig eine sichere, erfolgsversprechende Kulturmethodik entwickeln zu können. Besonders vielversprechend scheint hier der Einsatz vorselektierter Zellen aus mobilisiertem Blut zu sein. Zusammenfassend könnte all dies einen wichtigen Beitrag dazu leisten, die Mechanismen körpereigener Reparaturvorgänge besser zu verstehen. Diese Erkenntnisse wiederum könnten dann zur Entwicklung neuer Strategien zur Therapie diverser Lungenerkrankungen wie auch Asthma beitragen.
Um realistische Risikoabschätzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu können, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung loslöst. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizität einer Kombination in ihrer Stärke vom erwarteten Effekt der normalen Additivität abweicht, wenn die Kurven der Dosis – Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verläufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander ähnlichen oder unabhängigen Wirkmechanismus verfolgen. Für nicht lineare Dosis – Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverläufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen möglichen Bereich der Additivität zwischen ihnen (auch: „Hülle der Additivität“). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, dürfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese Überlegungen wurden überprüft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus – Lymphom – Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis – Wirkungsbeziehungen. Für die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei binären Mixturen miteinander gemischt. Für MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant höher als der vorkalkulierte Effekt der Netto – Wirkung. Für MMS + GEN lag der gemessene Effekt über der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. Für MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis – Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen wäre ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN fälschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN wäre mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen könnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA – Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearität von Dosis – Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend für die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen über tiefere mechanistische Vorgänge hilfreich für eine Vorhersage von ähnlichen oder unabhängigen Wirkprozessen.
Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.
Die in vitro-Langzeitkultivierung von Zellen in einer Drei-Dimensionalen Matrix (3D-Matrix) stellt nach wie vor eine Herausforderung im Tissue engineering dar. Die Kultivierung von Zellen auf/in komplexen 3D-Trägern erfordert hohe Zellzahlen und lange Kulturzeiten. Um die Probleme des schnellen Mediumverbrauches und der limitierten Zellzahl bzw. Zelldichte in konventionellen Kulturmethoden zu umgehen, wurde ein „Zweikreis-Perfusionssystem“ entwickelt. Hierzu wurde ein Cell-Pharm System (Cell-Pharm System 100®-Basisgerät) modifi-ziert. Das Grundprinzip des Systems besteht darin, dass ein kleinvolumiger (50-70 ml) „Zellkultur-Kreislauf“ über einen Bioreaktor (semipermeable Hohlfasermembran) durch einen großvolumigen (1000 ml) „Regenerations-Kreislauf“ kontinuierlich im Gegenstromprinzip regeneriert wird. Die Regulation des ph-Wertes und der Sauerstoffsättigung des Kulturmediums geschieht über einen integrierten, Druckluft-CO2-begasten Oxygenator. Während die Zirkulationsgeschwindigkeit (Durchflussrate) und Temperatur (37°C) im Regenerations-Kreislauf konstant gehalten werden, lassen sich diese Parameter im „Zellkultur-Kreislauf“ beliebig variieren. Es hat sich gezeigt, dass sich auf diese Weise kontinuierlich über einen langen Zeitraum ohne Mediumwechsel konstante und optimale Milieuverhältnisse in beiden Mediumkompartments einstellen lassen. Zur Untersuchung der Wachstumseigenschaften von Zellen in diesem Perfusions-system wurden humane osteoblastenähnliche Zellen oder Ratten-Knochenmarkszellen auf eine Matrix aus demineralisierter, GuHCl-extrahierter Rinderspongiosa unterschiedlicher Größe (Zylinder zwischen 5x3 mm und 5x10 mm) aufgetragen. Unter intermittierender Perfusion der Kulturkammern (z.B. Minucells cell container®) mit 50-70 ml/d kam es zu einem gleichmäßigen, intertrabekulären Wachstum der Zellen innerhalb des gesamten Trägers. Nach 6-8 Wochen konnte immer noch ein dichtes Netz interdigitierender ALP-positiver osteoblastenähnlicher Zellen innerhalb der gesamten Matrix beobachtet werden. Dabei scheint die physikalisch-mechanische Komponente der „Umspülung“ der Zellen mit dem kontinuierlich regenerierten Nährmedium einen positiven Einfluss auf das Anwachsverhalten und Proliferation der Zellen zu haben. Somit erlaubt das modifizierten „Zweikreisperfusionssystem“ eine gute Möglichkeit für die Langzeitperfusionskultur in einem geschlossenen System mit indi-viduell steuerbaren Strömungsverhältnissen im Zellkompartment bei einer kontinuierlichen Regeneration des Mediums.