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Erscheinungsjahr
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Schlagworte
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Institut
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Die Histidin-Kinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems gehört zu den unorthodoxen Histidin-Kinasen, die im Gegensatz zu den klassischen Sensorkinasen durch eine komplexere Domänen-Struktur gekennzeichnet ist. Schon seit längerem ist bekannt, dass BvgS durch niedrige Temperaturen oder die Anwesenheit von chemischen Substanzen, wie Sulfationen oder Nikotinsäure inaktiviert wird. Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass die Autophosphorylierungs-Aktivität der BvgS Histidin-Kinase nach Inkubation mit oxidiertem Ubichinon inhibiert wird (Bock & Gross, 2002). Bislang ist weitgehend unklar, welche Bedeutung die zusätzlichen Domänen, wie die periplasmatische-, PAS- bzw. HPt-Domäne für die Signalwahrnehmung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb nach Erstellung einer B. bronchiseptica spezifischen Genbank mit Hilfe des GAL4-Yeast Two-Hybrid (YTH) Systems nach Interaktionspartnern der einzelnen BvgS-Domänen gesucht. Nach dem Ausschluss von falsch-positiven Klonen und dem Durchlauf entsprechender Kontrollen konnten im YTH-System für die periplasmatische und die PAS-Domäne von BvgS insgesamt vier Interaktionspartner identifiziert werden. Für die HPt-Domäne konnte mit Hilfe des YTH-Systems kein möglicher Interaktionspartner gefunden werden. Als ein putativer Interaktionspartner der BvgS-PAS-Domäne wurde das BB0602-Protein identifiziert, das ein ATP-Bindeprotein darstellt, welches als Bestandteil eines ABC-Transport-System für den Transport von verzweigten Aminosäuren verantwortlich gemacht wird. Diese Interaktion konnte mittels eines GST-Pulldownassays bestätigt werden. Der biochemische Nachweis der übrigen identifizierten Protein-Interaktionen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erbracht werden. Die Ergebnisse des YTH-Screenings deuten darauf hin, dass die Aktivität der BvgS Histidin-Kinase und damit die Virulenzgenexpression durch die An- bzw. Abwesenheit von verzweigten Aminosäuren beeinflusst werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Relevanz der Interaktion zwischen der PAS-Domäne und dem ATP-Bindeprotein BB0602 nicht näher charakterisiert werden, so dass in Zukunft unter anderem die Konstruktion einer B. bronschiseptica bb0602-Deletionsmutante geplant ist, um somit mögliche Auswirkungen auf die Expression von bvg-abhängigen Genen zu beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulators BvgA aus B. holmesii (BvgABH). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass trotz der umfangreichen Sequenzkonservierung der BvgA-Proteine aus B. holmesii und B. pertussis, eine B. pertussis bvgA-Mutante nicht durch den bvgA-Lokus aus B. holmesii komplementiert werden konnte (Gerlach et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein hybrider Response Regulator BvgAfus konstruiert, der aus der Receiver- und Linker-Domäne des BvgABH-Proteins und der Output-Domäne von BvgABP zusammengesetzt ist. Voraussetzung hierfür war die Kenntnis der einzelnen Domänengrenzen und die Sequenz des Linker-Bereiches des Response Regulators BvgA aus B. pertussis (BvgABP), welche durch limitierte Proteolyse und massenspektrometrische Methoden identifiziert wurden (Bantscheff et al., 2000). Im Falle des hybriden Proteins konnte im Gegensatz zu BvgABH eine Bindung an BvgABP-abhängige Promotorsequenzen beobachtet werden. Zudem war BvgAfus in der Lage, die Expression BvgABP-abhängiger Gene in vivo zu induzieren. Allerdings war es in seiner Phosphorylierungseffizienz im Vergleich zum wildtypischen Response Regulator-Protein aus B. holmesii eingeschränkt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wenigen Abweichungen zwischen den Aminosäuresequenzen der Output-Domänen dafür verantwortlich sind, dass das BvgABH-Protein die Funktion von BvgABP in vivo und in vitro nicht übernehmen kann. So unterscheiden sich die Output-Domänen der Response Regulatoren aus B. pertussis und B. holmesii in zehn Aminosäureaustauschen, wobei davon vier Aminosäuren innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives verändert sind. Um zu untersuchen, ob die unterschiedlichen DNA-Binde- und transkriptionsaktivierenden Eigenschaften von BvgABH im Besonderen auf diese Aminosäureunterschiede zurückzuführen sind, wurden mittels ortspezifischer Mutagenese die Aminosäuresequenz innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives an die Sequenz aus B. pertussis angeglichen. Das resultierende Protein BvgABH* zeigte eine dem wildtypischen BvgABH-Protein ähnliche Phosphorylierungseffizienz, war aber nicht in der Lage, BvgABP-abhängige Zielsequenzen spezifisch zu erkennen bzw. die Funktion des BvgABP-Proteins in vivo zu ersetzen. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die wenigen Aminosäureunterschiede der Output-Domäne außerhalb der DNA-Binderegion zwar nicht im Zusammenhang mit der Phosphorylierungseffizienz stehen, jedoch die DNA-Bindeeigenschaften beeinflussen.