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The Hey protein family, comprising Hey1, Hey2 and HeyL in mammals, conveys Notch signals in many cell types. The helix-loop-helix (HLH) domain as well as the Orange domain, mediate homo- and heterodimerization of these transcription factors. Although distinct interaction partners have been identified so far, their physiological relevance for Hey functions is still largely unclear. Using a tandem affinity purification approach and mass spectrometry analysis we identified members of an ubiquitin E3-ligase complex consisting of FBXO45, PAM and SKP1 as novel Hey1 associated proteins. There is a direct interaction between Hey1 and FBXO45, whereas FBXO45 is needed to mediate indirect Hey1 binding to SKP1. Expression of Hey1 induces translocation of FBXO45 and PAM into the nucleus. Hey1 is a short-lived protein that is degraded by the proteasome, but there is no evidence for FBXO45-dependent ubiquitination of Hey1. On the contrary, Hey1 mediated nuclear translocation of FBXO45 and its associated ubiquitin ligase complex may extend its spectrum to additional nuclear targets triggering their ubiquitination. This suggests a novel mechanism of action for Hey bHLH factors.
Deregulated expression of MYC is a driver of colorectal carcinogenesis, necessitating novel strategies to inhibit MYC function. The ubiquitin ligase HUWE1 (HECTH9, ARF-BP1, MULE) associates with both MYC and the MYC-associated protein MIZ1. We show here that HUWE1 is required for growth of colorectal cancer cells in culture and in orthotopic xenograft models. Using high-throughput screening, we identify small molecule inhibitors of HUWE1, which inhibit MYC-dependent transactivation in colorectal cancer cells, but not in stem and normal colon epithelial cells. Inhibition of HUWE1 stabilizes MIZ1. MIZ1 globally accumulates on MYC target genes and contributes to repression of MYC-activated target genes upon HUWE1 inhibition. Our data show that transcriptional activation by MYC in colon cancer cells requires the continuous degradation of MIZ1 and identify a novel principle that allows for inhibition of MYC function in tumor cells.
Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist.