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Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden.
DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden.
In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind.
Die Enzyme TNSALP (Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase), ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1) und ANKH (Ankylosis, progressive human homolog) bilden zusammen eine zentrale Regulierungseinheit für den Pyrophosphat (PPi)-Stoffwechsel der Zelle [1, 2].
Störungen dieses genau geregelten Prozesses resultieren in schwerwiegenden Erkrankungen, wie z.B. bei der Hypophosphatasie [3]. Dieser meist autosomal rezessiv vererbten Erkrankung liegt eine durch genetische Mutationen beeinträchtigte Funktion der TNSALP zugrunde, wodurch sich die PPi- Konzentration im Microenvironment der Zelle erhöht. Diese kann im Knochengewebe zu schweren Mineralisierungsstörungen führen [1, 2].
Andere Krankheiten, mit erniedrigten PPi- Konzentrationen, werden mit pathologischen Verkalkungen in verschiedensten Geweben in Verbindung gebracht [4, 5]. Diese gehen unter anderem auf genetische Defekte von ENPP1 zurück[4].
Auch der Mevalonat-Pathway trägt zur Komposition des Microenvironments bezüglich der Homöostase von Phosphaten bei [6, 7]. Hier bestehen auch medizinisch relevante Einflussmöglichkeiten, zum Beispiel durch Bisphosphonate, bei der sogenannten Volkskrankheit Osteoporose.
In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer PPi-Belastung auf die in vitro Mineralisierung von Mesenchymalen Stammzellen untersucht, wobei Modulatoren der Enzymaktivität für ALP und ENPP1 und der Aktivität des PPi-Kanals ANKH sowie des Mevalonatstoffwechsels zum Einsatz kamen (PPi, Pyridoxalphosphat (PLP), Probenecid, Vitamin D, PPADS (Pyridoxalphosphat-6-azophenyl-2‘,4‘-disulfid Säure) und ß-γmeATP (ß-γ Methylentriphosphat)).
Die Resultate zeigen, dass die Modulation der PPi-Konzentration bei der osteogenen Differenzierung von hMSCs in vitro keine eindeutigen Effekte bewirkt. Geringe Änderungen des Genexpressionsmusters sind letztlich nicht auszuschliessen, blieben jedoch aufgrund der hohen Spendervariabilität durch eine erhöhte Anzahl von Experimenten zu beweisen.
Diese Arbeit zeigt insgesamt eine unerwartet geringe Auswirkung einer exogenen und endogenen Modulation der PPi-Konzentration sowohl mit Blick auf die rein physikalischen Phänomene der Mineralisierung, als auch mit Blick auf die untersuchte Genregulation der wichtigsten beteiligten Proteine, was möglicherweise die hohe Kompensationskapazität der Systeme unter physiologischen Bedingungen reflektiert. Untersuchungen auf proteomischer Ebene, besonders mit Blick auf die Prozessierung von Polypeptiden mit Mineralisierungs-modulierender Wirkung würden möglicherweise genaueren Einblick vermitteln.
Eine genauere Untersuchung der Einflüsse von ENPP1 erscheint für die Zukunft vielversprechend. Allerdings treten hier, besonders auch durch die verwendeten Hemmstoffe der ENPP1, die Phänomene der Vernetzung des Stoffwechsels der Phosphate (inklusive ATP und seiner Metabolite) mit dem Purinergen Signalling deutlich zutage. Diese Vernetzung generiert durch ihre Komplexität sowohl klinisch als auch zellbiologisch/biochemisch erhebliche Interpretationsprobleme, die zukünftige Arbeiten auflösen müssen. Dabei sollte besondere Aufmerksamkeit auf zwei für HPP-PatientInnen klinisch in Zukunft potentiell bedeutsame Ergebnisse gelegt werden, die möglicherweise ungünstigen Auswirkungen einer Therapie mit Probenecid auf die ALPL Expression und die Steigerung der ALPL Expression unter Hemmstoffen des Enzyms ENPP1.
1. Dympna Harmey, L.H., Sonoko Narisawa, Kirsten A. Johnson, Robert Terkeltaub, José Luis Millán, Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and osteopontin by Akp2, Enpp1 and Ank. American Journal of Pathology, 2003. 164, No. 4: p. 1199-1209.
2. Manisha C Yadav, A.M.S.S., Sonoko Narisawa, Carmen Huesa, Marc D McKee, Colin Farquharson, José Luis Millán, Loss of Skeletal Mineralization by the Simultaneous Ablation of PHOSPHO1 and Alkaline Phosphatase Function: A Unified Model of the Mechanisms od Initiation of Skeletal Calcification. Journal of Bone and Mineral Research, 2011. 26, No2: p. 286-297.
3. Beck, C., Hypophosphatasia. Klin Padiatr, 2009: p. 219-226.
4. Harmey, D.e.a., Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and Osteopontin by Akp2, Enpp1, and Ank. American Journal of Pathology, 2004. 164: p. 1199-1209.
5. Peter Nürnberg, H.T., David Chandler et all, Heterozygous mutations in ANKH, the human ortholog of the mouse progressive ankylosis gene, result in craniometaphyseal dysplasia. Nature Genetics, May 2001. 28: p. 37-41.
6. Löffler, P., Heinrich, ed. Biochemie & Pathobiochemie. Vol. 8. 2007, Springer Verlag.
7. Joseph L. Goldstein, M.S.B., Regulation of the mevalonate Pathway. Nature Genetics, 1990. 343: p. 425-430.