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Die Aktivierung des HGF/c-Met-Signalweges wird unter anderem seit längerer Zeit als verantwortlicher Mechanismus für die Entwicklung von Resistenzen gegen den EGF-Rezeptor gerichteter Medikamente diskutiert. In verschiedenen Studien konnte die klinische Bedeutung des HGF/c-Met-Signalwegs belegt werden.
In der jüngeren Vergangenheit konzentriert sich die Forschung immer mehr auf das Tumormikromilieu und dessen Einfluss auf die Tumorprogression. So konnte gezeigt werden, dass erhöhte Laktatwerte, resultierend aus einer gesteigerten Glykolyse, zytotoxische T-Zellen inhibieren.
Es wurden vier etablierte Zelllinien des oralen Plattenepithelkarzinoms sowie eine Zelllinie eines Mukoepidermoidkarzinom verwendet, um den Einfluss von HGF und des Tyrosinkinaseinhibitors Foretinib auf den Glukosemetabolismus zu prüfen.
Bei allen Zelllinien konnte der c-Met-Rezeptor nachgewiesen werden. Ebenso konnte in einem ELISA belegt werden, dass die Zelllinien selbst kein HFG produzieren.
Es wurden proliferationsfördernde Effekte für HGF sowie zytotoxische Effekte durch Foretinib aufgezeigt. Ferner konnte der proliferationsfördernde Effekt durch HGF durch die Behandlung mit Foretinib aufgehoben werden.
Im RT-PCR-Verfahren wurden die Auswirkungen auf die Transkription verschiedener Gene, die für wichtige Enzyme des Glukosemetabolismus kodieren, nach der Stimulation mit HGF sowie der Inhibition mit Foretinib untersucht. Es konnten substanzielle Veränderungen in der Expression einzelner Gene nachgewiesen werden. Zelllinienübergreifend konnte allerdings keine verstärkte bzw. verminderte Transkription durch die Behandlung mit HGF bzw. Foretinib nachgewiesen werden. Die Ergebnisse lassen auf die Komplexität der Regulierung des Glukosemetabolismus schließen.
In der Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit HGF nicht zu einer Zunahme des GLUT1 in der Zellmembran führt, wohingegen eine Behandlung mit Foretinib mit einer gesteigerten Menge von GLUT1 einhergeht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen einen Einfluss des HGF/c-Met-Signalwegs auf den Glukosemetabolismus bei Zelllinien des oralen Plattenepithelkarzinoms.
Die Krebserkrankung ist bis zum heutigen Zeitpunkt eine große Belastung in unserer Gesellschaft. Obwohl es stets Fortschritte in der Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten gibt, stellt die Behandlung auch in der modernen Medizin eine enorme Herausforderung dar. Darum besteht bis heute ein hoher Bedarf an neuen und weiterentwickelten Behandlungsmöglichkeiten.
Um die Proliferation einer neoplastischen Zelle zu beeinflussen, stellen die Biomasse und die Energie einen grundlegenden Ansatz dar. Hier bieten sich vor allem die Aminosäuren als wesentlicher Baustein der Zellmasse und der Energieträger „Glukose“ an, wodurch sich die beiden Ansätze einer Protein- bzw. Aminosäure-Restriktion und einer Glukose-Restriktion ergeben. Ziel ist es durch eine veränderte Stoffwechsellage einen Low-Energy-Metabolismus (LEM) zu induzieren, welcher die Zelle in einen sich selbst regenerierenden, antiproliferativen Zustand versetzt.
Zusätzlich sollte untersucht werden, ob sich die beiden Ansätze grundsätzlich als Therapieform gegen das Plattenepithelkarzinom (HNSCC) eignen. Zudem sollte ein Modell einer humanen Zelllinie erstellt werden, mit Hilfe dessen sich ein LEM auf metaboler Ebene charakterisieren lässt.
Die Ergebnisse zeigen, dass Zellen unter konstanter Glukose-Restriktion teils sensitiver auf Todesliganden reagieren. Außerdem wirken Kalorien-Restriktions-Mimetika antiproliferativ auf HNSCC Zellen. Hinzu kommt, dass eine Methionin-Restriktion Einfluss auf die Genexpression jener Gene hat, die mit der LEM-Signalkaskade in Zusammenhang stehen. Zuletzt lieferte die massenspektrometrische Analyse von mehr als 150 Metaboliten der humanen Zelllinie HeLa ein detailliertes Bild ihres Metabolismus unter Methionin-Restriktion. Durch die Definition eines charakteristischen Fingerabdrucks nach 72 h und eines kleinen Fußabdrucks aus wenigen Metaboliten, konnte ein humanes Modellsystem etabliert werden, dass zukünftig u.a. die schnelle Analyse von Kalorien-Restriktions-Mimetika ermöglicht.
Der HGF/c-Met-Signalweg wurde bereits seit vielen Jahren als ein wesentlicher Faktor in der Tumorgenese von Kopf-Hals-Karzinomen diskutiert. Allerdings lag der Fokus bisher nur auf den Tumorzellen selbst. In letzter Zeit wurde jedoch mehr über das umgebende Tumormikromilieu und seine bedeutende Rolle in der Tumorprogression bekannt. In anderen Tumormodellen wurde bereits gezeigt, dass der HGF/c-Met-Signalweg eine immunologische und metabolische Wirkung auf das Tumormikromilieu hat. Eine Signal-Aktivierung führte zu einer Zunahme des Immun-Checkpoint-Proteins PD-L1 auf der Tumorzelloberfläche. PD-L1 bewirkt wiederum eine Hemmung des Immunsystems, indem es die T-Zell-Aktivierung im Mikromilieu verhindert und somit die Tumorzellen nicht vom Immunsystem erkannt und beseitigt werden können.
Außerdem wurde gezeigt, dass HGF/c-Met eine Glykolyse-steigernde Wirkung auf Tumorzellen hat und durch die Energiezufuhr indirekt zu einer hohen Proliferationsrate beiträgt. Ein Nebeneffekt ist hier, dass das durch die hochregulierte Glykolyse anfallende Laktat im Tumormikromilieu akkumuliert und dadurch die T-Zellen der Immunabwehr zusätzlich schädigt.
Um auch den Einfluss von HGF/c-Met auf das Tumormikromilieu von Kopf-Hals-Karzinomen zu prüfen, wurden zwei etablierte Zelllinien (Detroit562 und FaDu), aus humanen Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region, für die Versuchsreihen in der vorliegenden Arbeit herangezogen.
Die Durchflusszytometrie ergab, dass nach HGF-Stimulation die Menge an
PD-L1 auf der Zelloberfläche beider Tumorzelllinien im Vergleich zur unbehandelten Probe zunahm. Bei Detroit562 war die Zunahme signifikant. Als Kontrolle wurde zusätzlich mit zwei verschiedenen Hemmprinzipien (PHA-665752 und c-Met-siRNA) das HGF-Signal unterbunden. Zusammen konnte damit bestätigt werden, dass die Zunahme von PD-L1 durch die Zugabe von HGF ausgelöst wurde. Mit Hilfe eines Verfahrens zur Messung des Glykolyse-bedingten Protonenausstroms, konnte festgestellt werden, dass eine Behandlung mit HGF in Detroit562 und FaDu zu einer gesteigerten Glykolyse führt.
Auffällig war, dass sowohl beim durchflusszytometrischen Nachweis von
PD-L1, als auch bei der Messung der Glykolyse, nach HGF-Stimulation bei Detroit562 im Vergleich zu FaDu ein deutlich größerer Effekt zu sehen war. Ein Zusammenhang könnte darin bestehen, dass die Detroit562-Tumorzellen aus Metastasen stammen. Aus anderen Vorarbeiten ist bekannt, dass Metastasen eine höhere Expression des HGF-Rezeptors c-Met zeigen. Eine im Vergleich zu FaDu höhere c-Met-Expression in Detroit562 kann zu einem stärkeren HGF-Signal und damit zu einem stärkeren Effekt auf nachfolgende Prozesse führen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern unser Verständnis bezüglich des HGF/c-Met-Signalwegs und zeigen, dass eine simultane Hemmung der
PD-1/PD-L1-Achse und des HGF/c-Met-Signalwegs synergistische Effekte haben könnte.
Grundsätzlich sollte in dieser Arbeit der Einfluss der Glutamin-Restriktion als eine Form der Aminosäure-Restriktion auf das Proliferationsverhalten, den Stoffwechsel sowie die Morphologie der murinen Fibroblastenzelllinie L929 untersucht werden. Es sollte dabei auch gezeigt werden, ob sich Indizien für die Induktion eines LEM finden lassen. Weiterhin sollten die Polyamine Spermidin, Spermin, Putrescin und N-Acetylputrescin als CRMs diskutiert und ihr Einfluss auf das Proliferationsverhalten an sieben Zelllinien herausgestellt werden. Der antiproliferative Effekt der Polyamine Spermidin und Spermin auf das Wachstum der untersuchten Zelllinien konnte in dieser Arbeit bestätigt werden, wobei sich Spermin als potenter erwies als Spermidin. Eine durch Spermidin/Spermin induzierte Autophagie konnte in den Western Blots nicht signifikant nachgewiesen werden. Putrescin und N-Acetylputrescin zeigten nur leichte Wirkungen bei hoher Dosis (10 mM). Während Putrescin einen leicht antiproliferativen Effekt hatte, zeigte N-Acetylputrescin eine leicht proliferationssteigernde Wirkung. Die Autophagie-Induktion durch Methionin-Restriktion konnte durch den Nachweis Autophagie-assoziierter Proteine in den durchgeführten Western Blots bestätigt werden. Um regelmäßig von den positiven Effekten der Autophagie zu profitieren, wäre eine pflanzenbasierte Ernährungsweise sinnvoll und gut durchführbar, da Methionin hauptsächlich in tierischen Lebensmitteln und nur geringfügig in pflanzlichen Nahrungsmitteln vorkommt. Ein völliger Verzicht auf Methionin ist nicht empfehlenswert, da die Aminosäure essentiell ist und somit über die Nahrung aufgenommen werden muss. Um das Methionin-Level konstant, aber niedrig zu halten, erscheint eine Bedarfsdeckung über pflanzliche Nahrung als ideal. Die an den Zelllinien L929 und HeLa durchgeführten Proliferationsstudien zeigten, dass die Zellen selbst nach fünftägiger Glutamin- Restriktion geringfügig weiter proliferierten und keinerlei Merkmale des Zelltodes aufwiesen. Die massenspektrometrische Analyse der Modellzelllinie L929, welche über einen Zeitraum von fünf Tagen einer Glutamin-Restriktion ausgesetzt war, zeigte deutliche metabolische Veränderungen bei den über 150 untersuchten Metaboliten, die auf die Induktion eines LEM schließen lassen. Es konnte ein metabolischer Fingerabdruck nach 48 h für die Zelllinie L929 unter Glutamin-Restriktion definiert werden, der zukünftig als Referenz bei der Testung potentieller CRMs herangezogen werden kann.
Entzündliche Prozesse stellen einen zentralen Aspekt der Karzinogenese dar und können sowohl zur Induktion als auch zum Progress von Tumoren beitragen. Der NF-kB-Signalweg ist einer der wichtigsten Signaltransduktionswege der In- flammation und Tumorpromotion, was ihn zur plausiblen Zielstruktur für die pros- pektive klinische Tumortherapie machen könnte. In der vorliegenden Arbeit wur- den die Eigenschaften von vier unterschiedlich targetierenden NF-kB-pathway- Inhibitoren – Cortisol, MLN4924, QNZ und TPCA1 – auf die Inflammation, Zell- proliferation und proapoptotische Sensitivierung am in vitro Modell des HNSCC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Auswahl des Inhi- bitors bzw. seines targets entscheidend für den wirkungsvollen Einsatz dieser Wirkstoffgruppe in der antiproliferativen Therapie des HNSCC zu sein scheint. Beispielsweise vermittelte MLN4924 die Freisetzung von IL-8. Cortisol bewirkte die Resistenz der FasL-induzierten Apoptose von HNSCC-Zellen. QNZ wirkte in einigen Zelllinien antiproliferativ und sensitivierend für den FasL-induzierten Zell- tod, beeinflusste jedoch in diesem Zusammenhang kontraproduktiv die IL-8-Sek- retion. Dies disqualifizierte diese Wirkstoffe für die Anwendung in der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Dahingegen qualifizierte sich TPCA-1 aufgrund folgen- der Eigenschaften als geeigneter Wirkstoff für den prospektiven klinischen Ein- satz:
1) TPCA-1 wirkte antiproliferativ,
2) hemmte die TNF-a-induzierte Inflammation,
3) regulierte die IL-8-Expression herab,
4) wirkte sensitivierend für den TNF-a-induzierten Zelltod,
5) interferierte kaum mit der FasL-vermittelten Apoptose und 6) induzierte Apoptose.
Durch ihren Tumortropismus haben mesenchymale Stammzellen (MSCs) das Interesse der onkologischen Forschung geweckt. Sie werden als potenzielles Vehikel für die zielgerichtete Tumortherapie diskutiert. Ihre Wirkung auf Tumore ist jedoch nach wie vor unklar: Es werden sowohl tumorfördernde als auch tumorhemmende Eigenschaften in der Literatur beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von nativen und andifferenzierten MSCs aus dem Knochenmark auf Proliferation und Vitalität von Kopf-Hals-Tumorzellen in vitro systematisch untersucht.
Entsprechend der Ergebnisse des durchgeführten Proliferationsassay und des Dot Blot Assay muss von einer protumorigenen Wirkung der MSCs auf HNSCC ausgegangen werden. Mit Hilfe von ELISA und Western Blot konnte gezeigt werden, dass der IL-6 vermittelte Aktivierung von ERK1/2 und STAT3 eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen MSC und HNSCC zukommt.
Angesichts dieser Ergebnisse müssen hinsichtlich eines Einsatzes von MSC in der Tumortherapie Bedenken geäußert werden. Weitere Untersuchungen zum besseren Verständnis der Interaktion sind notwendig.