Refine
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Keywords
- Insulinresistenz (3) (remove)
Institute
Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disease of the brain, which is characterized by a progressive loss of memory and spatial orientation. Only less than 5-10% of AD sufferers are familial cases due to genetic mutations in the amyloid precursor protein (APP) gene or presenilin (PS) 1 and 2 genes. The cause of sporadic AD (sAD) which covers > 95% of AD patients is still unknown. Current research found interactions between aging, diabetes and cognitive decline including dementia in general and in AD in particular. Disturbances of brain glucose uptake, glucose tolerance and utilization and impairment of the insulin/insulin receptor (IR) signaling cascade are thought to be key targets for the development of sAD.
In the brain of AD patients, neural plasticity is impaired indicated by synaptic and neuronal loss. Adult neurogenesis (AN), the generation of functional neurons in the adult brain, may be able to restore neurological function deficits through the integration of newborn neurons into existing neural networks. The dentate gyrus of the hippocampus is one out of few brain regions where life-long AN exists. However, there is a big controversy in literature regarding the involvement of AN in AD pathology. Most animal studies used transgenic mice based on the Amyloid ß (Aß) hypothesis which primarily act as models for the familial form of AD. Findings from human post mortem AN studies were also inconstistent. In this thesis, we focused on the possible involvement of AN in the pathogenesis of the sporadic form of AD. Streptozotocin intracerebroventricularily (STZ icv) treated rats, which develop an insulin-resistant brain state and learning and memory deficits preceding Aß pathology act as an appropriate animal model for sAD. We used STZ treatment for both parts of my work, for the in vivo and in vitro study.
In the first part of my thesis, my coworkers and I investigated STZ icv treatment effects on different stages of AN in an in vivo approach. Even if STZ icv treatment does not seem to considerably influence stem cell proliferation over a short-term (1 month after STZ icv treatment) as well as in a long-term (3 months after STZ icv treatment) period, it results in significantly less immature and newborn mature neurons 3 months after STZ icv treatment. This reduction detected after 3 months was specific for the septal hippocampus, discussed to be important for spatial learning. Subsequently we performed co-localization studies with antibodies detecting BrdU (applied appr. 27 days before sacrifice) and cell-type specific markers such as NeuN, and GFAP, we found that STZ treatment does not affect the differentiation fate of newly generated cells. Phenotype analysis of BrdU-positive cells in the hilus and molecular layer revealed that some of the BrdU-positive cells are newborn oligodendrocytes but not newborn microglia.
In the second part of my thesis I worked with cultured neural stem cells (NSCs) isolated from the adult rat hippocampus to reveal STZ effects on the proliferation of of NSCs, and on the survival and differentiation of their progeny. Furthermore, this in vitro approach enabled me to study cellular mechanisms underlying the observed impaired neurogenesis in the hippocampus of STZ-treated rats. In contrast to our findings of the STZ icv in vivo study we revealed that STZ supplied with the cell culture medium inhibits the proliferation of NSCs in a dose-dependent and time-dependent manner. Moreover, performing immunofluorescence studies with antibodies detecting cell-type specific markers after triggering NSCs to differentiate, we could show that STZ treatment affects the number of newly generated neurons but not of astrocytes. Analyzing newborn cells starting to differentiate and migrate I was able to demonstrate that STZ has no effect on the migration of newborn cells. Trying to reveal cellular mechanisms underlying the negative influence of STZ on hippocampal AN, we performed qRT-PCR and immunofluorescence staining and thus could show that in NSCs the expression of glucose transporter (GLUT)3 mRNA as well as IR and GLUT3 protein levels are reduced after STZ treatment. Therefore, the inhibition of the proliferation of NSCs may be (at least partially) caused by these two molecules. Interestingly, the effect of STZ on differentiating cells was shown to be different, as IR protein expression was not significantly changed but GLUT3 protein levels were decreased in consequence of STZ treatment.
In summary, this project delivered further insights into the interrelation between AN the sporadic form of sAD and thus provides a basis of new therapeutic approaches in sAD treatment through intervening AN. Discrepancies between the results of the two parts of my thesis, the in vivo and in vitro part, were certainly caused to a certain extent by the missing microenvironment in the in vitro approach with cultured NSCs. Future studies e.g. using co-culture systems could at least minimize the effect of a missing natural microenvironment of cultured NSCs, so that the use of an in vitro approach for the investigation of STZ treatment underlying cellular mechanisms can be improved.
Epidemiologische Studien sagen einen starken Anstieg der Prävalenz des Diabetes mellitus voraus. Da der Diabetes mellitus Typ 2 mit einem Anteil von 90-95% die weitaus häufigste Entität dieser Erkrankungsgruppe darstellt, ist es von entscheidender Bedeutung, die molekularen Mechanismen zu erforschen, die zu diesem Krankheitsbild beitragen. Die Insulinresistenz stellt ein sehr frühes Ereignis in der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 dar und kann nachgewiesen werden, lange bevor das Krankheitsbild in Erscheinung tritt. Tribbles Pseudokinase 3 (TRIB3) steht in der Diskussion eine Insulinresistenz zu erzeugten. Es soll durch direkte Protein-Protein-Interaktion den intrazellulären Insulinsignalweg blockieren, indem es die Phosphorylierung des Schlüsselpro-teins AKT verhindert. Da die Rolle von TRIB3 bei der Entstehung einer Insulinresistenz allerdings kontrovers diskutiert wird, sollte in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des TRIB3 Expressionsniveaus bezüglich einer hepatischen Insulinresistenz besser charakterisiert werden.
In der Leber diabetischer Mäuse und insulinresistenter Menschen wurde eine TRIB3 Überexpression bis auf das 10-fache gegenüber den Kontrollen nachgewiesen. Aus diesem Grund wurde zunächst untersucht, ob eine isolierte TRIB3 Überexpression in unserem Zellmodell eine Insulinresistenz schaffen kann. Hierfür wurden die HepG2 Zellen mit einem TRIB3 Plasmid chemisch transfiziert und anschließend mit Insulin stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass eine selektive Überexpression von TRIB3 zu einer verminderten Phosphorylierung von AKT und damit zu einer Insulinresistenz führt.
Im Umkehrschluss sollte anschließend untersucht werden, ob ein Knockdown von TRIB3 die Insulinsensibilität weiter verbessern kann. Hierfür wurde TRIB3-siRNA mittels Elektroporation in die HepG2 Zellen transfiziert und diese im Anschluss mit Insulin stimuliert. Es zeigte sich, dass ein TRIB3 Knockdown keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von AKT nach Insulinstimulation hat und die Insulinempfindlichkeit von insulinsensiblen Zellen demnach nicht weiter steigern kann.
Da die intrazellulären Mechanismen in einer insulinresistenten Stoffwechsellage jedoch auf andere Weise reguliert werden, ist dieses Ergebnis klar von einer diabetischen Stoffwechsellage abzugrenzen. Um diese zu simulieren, wurde ein neues Zellmodell etabliert. Wir inkubierten HepG2 Zellen mit Palmitinsäure und konnten nachweisen, dass anschließend sowohl eine TRIB3 Überexpression als auch eine Insulinresistenz (verminderte Phosphorylierung von AKT) vorliegt. Um zu überprüfen, ob ein Knockdown von TRIB3 die Palmitinsäure vermittelte Insulinresistenz verbessern kann, wurde TRIB3 mittels Einsatz von siRNA herabreguliert, die Zellen anschließend mit Palmitinsäure inkubiert und letztlich mit Insulin stimuliert. Es zeigte sich, dass ein TRIB3 Knockdown nicht zu einer vermehrten Phosphorylierung von AKT und damit zu einer besseren Insulinsensibilität führt. TRIB3 scheint demnach die Palmitinsäure vermittelte Insulinresistenz nicht zu vermitteln. Nichtsdestoweniger konnten wir nachweisen, dass durch die Palmitinsäureinkubation die Expression von CHOP, einem proapoptotischem Protein des Endoplasmatischen Retikulum Stresses, steigt. In der Literatur ist beschrieben, dass TRIB3 durch CHOP induziert werden kann und so lässt sich diskutieren, ob TRIB3 möglicherweise in diesem Zusammenhang induziert wird und in unserem Zellmodell zur Apoptose beiträgt. Die Rolle von TRIB3 in Stresssituationen bedarf aber noch weiterer Erforschung, da ihm sowohl zytoprotektive als auch zytotoxische Eigenschaften nachgesagt werden.
Die Pseudoproteinkinase TRIB3 wurde als ein wichtiger Mediator der Insulinresistenz bei Typ 2 Diabetikern erkannt. Ein TRIB3 Knockdown führte in verschiedenen Zell- und Tiermodellen zu einer Verbesserung der Insulinsensitivität. Zudem wurde in einem Tierexperiment mit insulinresistenten Ratten gesehen, dass ein TRIB3 Knockdown zu einem Anstieg von SREBP-2 und HDL und somit zu einer Verbesserung der diabetischen Dyslipidämie führt.
In HepG2 Zellen wurde der Einfluss von TRIB3 auf die SREBP-2 Expression und weitere zentrale Regulatoren des reversen Cholesterintransportes untersucht.
Wir konnten zeigen, dass SREBP-2 durch einen TRIB3 Knockdown in insulinsensiblen Zellen induziert wird. Passend hierzu zeigte sich auch eine Modifikation von SREBP-1c, welches ebenfalls durch einen TRIB3 Knockdown induziert wird. Als weitere Möglichkeit der Beeinflussung der diabetischen Dyslipidämie haben wir Marker der Cholesterinsynthese, sowie des Cholesterin-Importes und –Exportes untersucht. Hierbei zeigte sich infolge eines TRIB3 Knockdowns ein Anstieg von SR-B1 und Apo-A1. Die Induktion von SR-B1 und Apo-A1 könnte über eine Förderung des reversen Cholesterintransportes und über eine vermehrte Ausscheidung von Cholesterin aus dem Körper zu einer Verbesserung der diabetischen Dyslipidämie und zu einer Reduktion der Atherosklerose beitragen.
Zur Induktion einer Insulinresistenz wurden HepG2 Zellen mit Palmitinsäure inkubiert. Hier zeigte sich sowohl ein Anstieg von TRIB3 wie auch von SREBP-2. Hingegen hatte eine alleinige Überexpression von TRIB3 keinen signifikanten Einfluss auf die SREBP-2 Expression.
Es konnte gezeigt werden, dass Palmitinsäure eine Insulinresistenz vor allem über ER-Stress induziert und in diesem Modell somit ein anderer molekularer Mechanismus der Insulinresistenz zugrunde liegt, als für die alimentäre Insulinresistenz postuliert wird. Die Inkubation mit Palmitinsäure führt zu einer Induktion von TRIB3, welche mit siRNA nicht antagonisiert werden konnte. Methodisch war es somit nicht möglich einen stabilen TRIB3 Knockdown in insulinresistenten HepG2 Zellen nach Palmitinsäure-Inkubation zu generieren, so dass eine Aussage über den Einfluss von TRIB3 auf die SREBP-2 Expression in diesem Modell nicht möglich ist.
Zusammenfassend kann man sagen, dass ein TRIB3 Knockdown in insulinsensiblen Zellen zu einer Induktion von SREBP-2, SREBP-1c, SR-B1 und Apo-A1 führt und somit Einfluss auf den Cholesterinstoffwechsel haben könnte. In den eingesetzten in vitro Modellen für eine Insulinresistenz haben wir jedoch keinen Hinweis auf einen günstigen Effekt eines TRIB3 Knockdowns finden können.