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Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom“) handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivität einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schlüsselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren für diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolekülen an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Moleküls pro Enzym-Monomer: überraschenderweise hatten bis zu vier Moleküle MH211A bzw. zwei Moleküle UK-VI-1g an ein Proteasemolekül gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminosäuren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der Nähe der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimtsäure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei mögliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer Röntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass früher veröffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal überdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und früheren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.
Als Vorlage für diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgeführten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1‘ mit eingefügten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingefügt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbonsäure durch die günstigere Verbindung Cyclohexancarbonsäure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die fähig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu können. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verläuft. Um diese Berechnungen zu bestätigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem Überschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilität der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und bestätigen damit die QM-Berechnungen.
Einen möglichen Ansatzpunkt für eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese übernehmen die Polyprotein-Spaltung während der Virusreplikation und sind damit essentiell für das Überleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivitäten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgeführt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enthält Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigsäure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbonsäure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigsäure-Derivate mit einer zusätzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1‘- bzw. S2‘-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinität zum Enzym erhöhen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbonsäuren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verknüpft wurden. In den übrigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von Säure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einführung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgeführten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 %, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 % bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigsäure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal größere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 führte die Einführung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den größten Einfluss auf die Aktivität zeigte jedoch die Einführung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.