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Mutationen im Glycintransporter 2 (GlyT2) stellen die präsynaptische Komponente der neurologischen Erkrankung Hyperekplexie oder Startle Disease dar. Der neuronale Na+/Cl- -abhängige GlyT2 ist für das Recycling von Glycin verantwortlich und bildet an inhibitorischen glycinergen Synapsen die Hauptquelle des freigesetzten Transmitters. Dominante, rezessive und zusammengesetzte heterozygote Mutationen wurden bereits identifiziert, von denen die meisten zu einer beeinträchtigten Glycinaufnahme führen. In dieser Arbeit konnten wir eine neue pathogene Mutation innerhalb des neuronalen Glycintransporter-2-Gens (SLC6A5, OMIM604159) in einer Familie identifizieren, in der beide Elternteile heterozygote Träger waren. Ein homozygotes Kind litt an schweren neuromotorischen Defiziten, wohingegen Heterozygote keine Symptome aufwiesen. Die neue rezessive Mutation c.1286C>T erzeugte einen missense Aminosäureaustausch von Prolin gegen Leucin an Position 429 (pP429L) in der Transmembrandomäne 5. Wir haben die GlyT2P429L-Variante mittels Homologiemodellierung, immuncytochemischer Färbungen, Western Blot Analysen, Biotinylierung und funktioneller Glycinaufnahmetests charakterisiert. Der mutierte GlyT2 zeigte beim Proteintransport durch verschiedene intrazelluläre Kompartimente zur Zelloberfläche keine Defizite. Die gesamte Proteinexpression war jedoch signifikant verringert. Obwohl GlyT2P429L an der Zelloberfläche vorhanden ist, zeigte er einen Verlust der Proteinfunktion. Die Co-Expression der Mutante mit dem Wildtyp-Protein, die die Situation der Eltern widerspiegelte, hatte keinen Einfluss auf die Transporterfunktion und erklärte somit ihren nicht symptomatischen Phänotyp. Wenn jedoch die Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Protein im Überschuss exprimiert wurde, war die Glycinaufnahme signifikant verringert. Die Strukturanalyse ergab, dass der eingeführte Leucinrest an Position 429 zu Konformationsänderungen in der α-Helix 5 führt, die in unmittelbarer Nähe zur Natriumbindungsstelle des Transporters lokalisiert sind. Dies deutet darauf hin, dass die Zugangsmechanismen des GlyT2 gestört sein könnten und einen vollständigen Verlust der Transportaktivität verursachen. Unsere Ergebnisse belegen, dass P429 in GlyT2 ein strukturell wichtiger Aminosäurerest ist, der eine wichtige funktionelle Rolle beim Glycintransport spielt.
Es gibt viele Hinweise, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bei ihrer Aktivierung durch einen Agonisten ligandenselektive Konformationen eingehen. Ein tatsächlichen Beleg hierfür konnte bisher in lebenden Zellen noch nicht erbracht werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Ansatz gewählt, um ligandenselektive Konformationen in der dritten intrazellulären Schleife des α2a-adrenergen Rezeptors (α2a-AR) in lebenden Zellen darzustellen. Dazu wurden Rezeptorsensoren erstellt, welche jeweils ein CFP am Ende des C-Terminus trugen und in der dritten intrazellulären Schleife an verschiedenen Stellen mit einem Tetracysteinmotiv versehen wurden. Drei Konstrukte wurden verglichen, die das Tetracysteinmotiv N-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne V (I3-N), in der Mitte der dritten intrazellulären Schleife (I3-M) beziehungsweise C-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne VI (I3-C) trugen. Die drei Rezeptorsensoren unterschieden sich hinsichtlich ihrer Ligandenbindung sowie ihrer G-Proteinaktivierung nicht vom Wildtyp α2a-AR. Durch das Tetracysteinmotiv ist es möglich, den Rezeptor spezifisch mit dem niedermolekularen Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) zu markieren, welcher als Akzeptor für den Donor CFP in FRET-Experimenten dient. Die Änderung des FRET-Signals zwischen den beiden Fluorophoren, das durch den vollen Agonist Norepinephrin ausgelöst wurde, war bei allen drei Rezeptorsensoren vergleichbar. Der starke partielle Agonist Clonidin war ebenfalls in der Lage, in allen drei Konstrukten ein ähnliches FRET-Signal hervorzurufen. Dagegen zeigte der partielle Agonist Dopamin an dem Konstrukt I3-N ein signifikant schwächeres Signal, als an I3-C. Die schwachen partiellen Agonisten Octopamin und Norphenephrin konnten an den Konstrukten I3-N und I3-M keine Änderung des FRET-Signals bewirken, wobei an I3-C eine deutliche Signaländerung detektiert wurde. Dies legt nahe, dass die Transmembrandomäne V bei der Aktivierung des Rezeptors eine kleinere Bewegung eingeht als die Transmembrandomäne VI, und bestätigt damit ein auf Röntgenstrukturanlysen basierendes Modell der Rezeptorbewegung. Außerdem wurden die Aktivierungskinetiken für die Agonisten Norepinephrin und Dopamin verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die durch Norepinephrin ausgelöste Bewegung an allen beobachteten Punkten gleich schnell war. Im Gegensatz dazu aktivierte Dopamin I3-C und I3-M ca. 1,5-mal langsamer, als Norepinephrin. Für das I3-N Konstrukt wurde sogar eine 3-mal langsamere Aktivierung gemessen. Diese Daten zeigen, dass unterschiedliche Agonisten in der dritten intrazellulären Schleife spezifische Konformationen auslösen können. Die Untersuchungen zur Rezeptorbewegung im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem kleinen Fluorophor FlAsH in Kombination mit einer großen GFP-Variante durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der es möglich ist Proteine spezifisch mit beiden kleinen Fluorophoren FlAsH und ReAsH in einer lebenden Zelle zu markieren. Hierfür wurden zwei Tetracysteinmotive, CCPGCC und FLNCCPGCCMEP, gewählt, an die beide kleine Fluorophore kovalent binden. Durch Verdrängungsexperimente mit BAL konnte gezeigt werden, dass FlAsH für beide Motive eine dreifach höhere Affinität besitzt, als ReAsH. Dabei besitzt das FLNCCPGCCMEP-Motiv jedoch eine dreifach höhere Affinität zu dem jeweiligen Fluorophor besitzt als CCPGCC. Durch Ausnutzung dieser Affinitätsunterschiede konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem es möglich ist, beide Motive in einer Zelle zu markieren. Dabei werden zunächst beide Motive mit ReAsH markiert. Durch anschließendes Waschen mit einer geeigneten Konzentration von BAL wird das ReAsH ausschließlich von der CCPGCC-Sequenz verdrängt, wohingegen die FLNCCPGCCMEP-Sequenz mit ReAsH markiert bleibt. Die nun unbesetzte CCPGCC-Sequenz kann dann anschließend mit FlAsH markiert werden, ohne dabei die Bindung des ReAsH an die FLNCCPGCCMEP-Sequenz zu beeinflussen. Um die Funktionalität dieses Protokolls zu überprüfen, sollten zwei verschiedene Proteine mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisation in einer lebenden Zelle spezifisch mit jeweils einem kleinen Fluorophor markiert werden. Hierzu wurden ein PTH-Rezeptor, in dem im C-Terminus die FLNCCPGCCMEP-Sequenz eingebracht wurde, mit ReAsH und ein β-Arrestin-2, dem die CCPGCC-Sequenz eingebracht wurde, in Zellen co-exprimiert und gemäß dem Protokoll mit FlAsH und ReAsH markiert. Beide Proteine konnten spezifisch markiert werden, wobei der mit ReAsH markierte PTH-Rezeptor eine deutliche Lokalisation in der Zellmembran zeigte. Durch sequentielle Exzitation konnte in der gleichen Zelle das zytosolisch lokalisierte, mit FlAsH markierte β-Arrestin-2 detektiert werden. Wurden die so markierten Zellen mir 1 µM PTH stimuliert, wurde das FlAsH-markierte β-Arrestin-2 an die Zellmembran rekrutiert. Somit konnte durch die Entwicklung dieses Protokolls eine duale spezifische Markierung von Proteinen mit zwei kleinen Fluorophoren zu innerhalb einer Zelle erreicht werden.