@phdthesis{Nesper2000,
  author    = {Nesper, Jutta M.},
  title     = {Charakterisierung von spontan phagenresistenten Vibrio cholerae O1 El Tor Mutanten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberfl{\"a}chenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zus{\"a}tzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Molek{\"u}le synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unver{\"a}ndertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgew{\"a}hlte spontan phagenresistente St{\"a}mme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen St{\"a}mme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit ver{\"a}ndertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das f{\"u}r die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich f{\"u}r die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber ver{\"a}ndertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeintr{\"a}chtigt waren. Zus{\"a}tzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zus{\"a}tzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Ph{\"a}notyp an abiotischen Oberfl{\"a}chen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose f{\"u}r die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen M{\"a}usen ergaben, daß O-Antigen negative St{\"a}mme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im D{\"u}nndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte f{\"u}r den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zus{\"a}tzlich wurde die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen D{\"u}nndarm vorkommen, unter „in vitro" Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegen{\"u}ber schwachen organischen S{\"a}uren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallens{\"a}uren. O-Antigen negative St{\"a}mme waren dagegen weiterhin resistent gegen{\"u}ber Gallens{\"a}uren und schwachen organischen S{\"a}uren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde f{\"u}r keine der LPS-Mutanten eine gr{\"o}ßere Beeintr{\"a}chtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilit{\"a}t, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der {\"a}ußeren Membran war offensichtlich nicht beeintr{\"a}chtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verst{\"a}rktem Maße periplasmatische Proteine in den {\"U}berstand diffundieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur f{\"u}r eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund daf{\"u}r ist h{\"o}chstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen {\"a}ußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des D{\"u}nndarms erm{\"o}glicht.},
  subject      = {Vibrio cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Koehler2000,
  author    = {K{\"o}hler, Rolf},
  title     = {Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Das fakultativ intrazellul{\"a}re Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und erm{\"o}glicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abh{\"a}ngigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zus{\"a}tzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-St{\"a}mme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Gr{\"u}nfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalit{\"a}t von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die St{\"a}mme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellul{\"a}ren Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validit{\"a}t des GFP-Reportersystems in Legionella best{\"a}tigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivit{\"a}t belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivit{\"a}t zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Dar{\"u}ber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abh{\"a}ngiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin best{\"a}tigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend {\"u}ber Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zus{\"a}tzliche M{\"o}glichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verf{\"u}gung. Diese Ergebnisse best{\"a}tigen die postulierte Heterogenit{\"a}t der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierf{\"u}r wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle erm{\"o}glicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht {\"u}ber die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivit{\"a}t des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminos{\"a}ure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufkl{\"a}rung der Sequenz urs{\"a}chlich verhindert. Wie in fr{\"u}heren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivit{\"a}t des Legionella Mip-Proteins f{\"u}r die Invasion und das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-{\"a}hnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der {\"a}ußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Dom{\"a}ne (AS 4-79) ein verk{\"u}rztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminos{\"a}uren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouart{\"a}rstruktur auf die Pathogenit{\"a}t wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivit{\"a}t f{\"u}r die Infektion von monozellul{\"a}ren Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivit{\"a}t an der Pathogenit{\"a}t von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivit{\"a}t wirkt sich, verglichen mit dem monozellul{\"a}ren System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazellul{\"a}re {\"U}berleben aus. Mit site-spezifisch ver{\"a}ndertem Mip-Protein komplementierte Legionella-St{\"a}mme zeigten eine intrazellul{\"a}re Vermehrung in Abh{\"a}ngigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivit{\"a}t. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell best{\"a}tigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivit{\"a}t f{\"u}r die Infektion monozellul{\"a}rer Systeme und h{\"o}herer Organismen unterschiedlich ist.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kemmer2001,
  author    = {Kemmer, Gabriele},
  title     = {Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien f{\"u}r H{\"a}min unter aeroben Bedingungen und f{\"u}r Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es k{\"o}nnen zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten St{\"a}mme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren St{\"a}mme, die f{\"u}r Oberfl{\"a}cheninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig {\"u}ber die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des H{\"a}minaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der H{\"a}min-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) f{\"u}r die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht f{\"a}hig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, w{\"a}hrend die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu kl{\"a}ren, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig f{\"u}r die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivit{\"a}t. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivit{\"a}t die einzige f{\"u}r die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminos{\"a}ureaustausch die Phosphatase-Aktivit{\"a}t verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Ph{\"a}notypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die F{\"a}higkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Ph{\"a}notypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die f{\"a}hig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivit{\"a}t nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN f{\"u}r die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht f{\"a}hig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschr{\"a}nkt, w{\"a}hrend mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR {\"u}ber einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der {\"a}ußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren.},
  subject      = {Haemophilus influenzae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Maldeghem2001,
  author    = {Maldeghem, Jeannette ¬von¬},
  title     = {Charakterisierung und Antibiotika-Resistenzprofil von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli Isolaten von Patienten und Ausscheidern},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181990},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Einhundertvierundvierzig STEC-St{\"a}mme von Patienten mit h{\"a}molytisch-ur{\"a}mischem Syndrom (68 St{\"a}mme), von Durchfallpatienten (42 St{\"a}mme) und von asymptomatischen Ausscheidern (44 St{\"a}mme) wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Antibiotika-empfindlichkeit hin untersucht. Zu den insgesamt 13 getesteten Antibiotika z{\"a}hlten die ß-Laktam Antibiotika Ampicillin, Piperacillin, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefotiam und Imipenem, die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin, die Gyrasehemmer Ofloxacin und Ciprofloxacin sowie Tetracyclin, Chlorampenicol und die Sulfamethoxazol/Trimethoprim-Kombination Cotrimoxazol. Alle E. coli O157 St{\"a}mme, die von Patienten mit HUS isoliert wurden, waren sensibel gegen die getesteten Antibiotika. Lediglich ein E. coli O157 Stamm, der von einem Durchfall-Patienten isoliert wurde, zeigte eine Resistenz gegen Tetracyclin. Allgemein h{\"a}ufiger wurden Antibiotikaresistenzen bei non-O157 St{\"a}mmen gefunden. F{\"u}nf von 22 non-O157 St{\"a}mmen, die von HUS-Patienten isolierten wurden, zeigten mindestens eine Resistenz gegen die getesteten Antibiotika. Vierzehn von f{\"u}nfunddreißig non-O157 E. coli St{\"a}mmen, die sowohl von Durchfall-Patienten als auch von asymptomatischen Ausscheidern stammten, konnten sowohl Einfachresistenzen als auch Multiresistenzen aufweisen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zeigte, daß alle resistente St{\"a}mme einen extrem hohen Resistenzstatus besitzen. Sowohl ß-Laktam als auch Tetracyclin Resistenzen konnten mittels Konjugation auf einen E. coli-Laborstamm {\"u}bertragen werden. Dies l{\"a}ßt die Anwesenheit von R-Plasmiden vermuten. Die Tatsache, daß {\"u}ber 12 Prozent Shigatoxin produzierender E. coli St{\"a}mme aus humanen Stuhlproben Antibiotikaresistenzen aufweisen, hat klinische und epidemiologische Bedeutung. Resistente STEC-St{\"a}mme h{\"a}tten einen selektiven Vorteil gegen{\"u}ber anderen koliformen Bakterien in Mastbetrieben, die Antibiotika dem Futtermittel beimengen. Hieraus wiederum steigt die Gefahr einer potentiellen {\"U}bertragung resistenter Pathogene auf den Menschen. Auf der anderen Seite k{\"o}nnte die ansteigende Anzahl Antibiotika-resistenter St{\"a}mme zu einer rasch durchf{\"u}hrbaren epidemiologischen Nachweismethode f{\"u}hren.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Grimm2000,
  author    = {Grimm, Dorothee},
  title     = {Entwicklung von neuen Nachweismethoden f{\"u}r Legionellen und Am{\"o}ben und ihre Anwendung in {\"o}kologischen Studien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1351},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentz{\"u}ndung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellul{\"a}r in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. F{\"u}r die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl f{\"u}r die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch f{\"u}r eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplement{\"a}re Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde f{\"u}r die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist f{\"u}r L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifit{\"a}t und Sensitivit{\"a}t der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-St{\"a}mme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzst{\"a}mme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war f{\"u}r diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Am{\"o}ben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Unterschiedliche, intrazellul{\"a}r vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit m{\"o}glich. Durch die meist fakultativ intrazellul{\"a}re Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsam{\"o}ben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzst{\"a}mmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Am{\"o}ben anhand morphologischer Merkmale best{\"a}tigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Am{\"o}ben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabh{\"a}ngige und hochaufl{\"o}sende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, m{\"o}gliche Pr{\"a}ferenzen der Legionellen f{\"u}r bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitf{\"a}higkeit, Str{\"o}mungsverh{\"a}ltnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegen{\"u}ber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gew{\"a}ssern zu finden und ließen sich unabh{\"a}ngig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gew{\"a}ssern wurde außerdem das Vorkommen von Am{\"o}ben untersucht. Es konnten insgesamt acht Am{\"o}bengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren St{\"a}mme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Am{\"o}ben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Am{\"o}ben best{\"a}tigt werden. Auch die Am{\"o}ben zeigten keine Pr{\"a}ferenzen bez{\"u}glich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Bioz{\"o}nosen, erm{\"o}glicht aber keine Aussage {\"u}ber die speziellen Aktivit{\"a}ten der nachgewiesenen Bakterien. Eine L{\"o}sung hierf{\"u}r k{\"o}nnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molek{\"u}len darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molek{\"u}len wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten F{\"a}llen eine Signalamplifikation n{\"o}tig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die f{\"u}r das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gew{\"u}nschte Spezifit{\"a}t. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage f{\"u}r zuk{\"u}nftige Experimente dar.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Goebel2000,
  author    = {Goebel, Stefan},
  title     = {Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1325},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Als obligat intrazellul{\"a}rer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier d{\"u}rfte Toxoplasma gondii von der Integrit{\"a}t seiner Wirtszelle in besonderem Maße abh{\"a}ngig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren k{\"o}nnen. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das f{\"u}hrt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen k{\"o}nnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazellul{\"a}res {\"U}berleben sichern.},
  subject      = {Toxoplasmase gondii},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fuchs2000,
  author    = {Fuchs, Sibylle Maria},
  title     = {Untersuchungen zur Regulation von Shiga-Toxin 2 und zur Attenuierung von enteroh{\"a}morrhagischen Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1303},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Enteroh{\"a}morrhagische Escherichia coli (EHEC) geh{\"o}ren zu den wichtigsten der sich in j{\"u}ngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrh{\"o} bis zu h{\"a}morrhagischer Kolitis, oftmals unter Auspr{\"a}gung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem h{\"a}molytisch-ur{\"a}mischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Auspr{\"a}gung der sog. "attaching and effacing"-L{\"a}sionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und {\"a}ltere Menschen sind von den Infektionen, die h{\"a}ufig in Form von Ausbr{\"u}chen auftreten, betroffen. Die {\"U}bertragung erfolgt meist {\"u}ber f{\"a}kal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verst{\"a}rken kann, w{\"a}re die Impfung gef{\"a}hrdeter Personen der beste Weg f{\"u}r die Bek{\"a}mpfung dieser Erreger. Eine weitere M{\"o}glichkeit der Pr{\"a}vention w{\"a}re die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, {\"u}ber die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen k{\"o}nnen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen f{\"u}r einen Lebendvakzinstamm zur Pr{\"a}vention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie f{\"u}r EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminos{\"a}uren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminos{\"a}uren von StxB2 f{\"u}hrte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivit{\"a}t zwar vollst{\"a}ndig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell f{\"u}r die Impfung gegen Stx2-spezifische Sch{\"a}digungen verwendet werden k{\"o}nnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-St{\"a}mmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenit{\"a}tsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die F{\"a}higkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit ver{\"a}nderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsver{\"a}nderung korrelierte nur bedingt mit der Ver{\"a}nderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am st{\"a}rksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Ph{\"a}notyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein k{\"o}nnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen w{\"u}rde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken k{\"o}nnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen m{\"o}glichen Kandidaten f{\"u}r den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators k{\"o}nnte durch die St{\"o}rung der regul{\"a}ren Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. M{\"u}hldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-St{\"a}mme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen M{\"a}usemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der St{\"a}mme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden. Im Gegensatz dazu ver{\"a}nderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme f{\"u}r eine Pr{\"a}vention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit f{\"u}r die Verhinderung der Reversion dieser St{\"a}mme zur Pathogenit{\"a}t. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das f{\"u}r die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 f{\"u}hrt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeintr{\"a}chtigt war. Zus{\"a}tzlich war die H{\"a}minverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der {\"a}ußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in M{\"a}usen nicht beeinflußt. Die Enteroh{\"a}molyse sowie die Expression von Intimin waren verst{\"a}rkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschr{\"a}nkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden.},
  subject      = {EHEC},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fluegel1999,
  author    = {Fl{\"u}gel, Manfred},
  title     = {Molekularbiologische Studien zur Pathogenit{\"a}t und {\"O}kologie von Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1178},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {1999},
  abstract  = {Legionella pneumophila, der Erreger der Legion{\"a}rskrankheit, ist ein Umweltkeim mit Verbreitung in aquatischen Habitaten. Die Keime sind in der Lage, sich intrazellul{\"a}r in eukaryontischen Zellen, wie Makrophagen, Monozyten und Protozoen zu vermehren. Die erfolgreiche Besiedlung {\"o}kologischer Nischen, aber auch das Virulenzpotential des Keimes k{\"o}nnen dabei von Umweltfaktoren abh{\"a}ngen. Die Erforschung {\"o}kologischer Zusammenh{\"a}nge kann daher f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der bakteriellen Virulenz von großer Bedeutung sein. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die in der sp{\"a}ten station{\"a}ren Phase des Bakterienwachstums von L. pneumophila zu beobachtende intensive Pigmentierung des Kulturmediums. F{\"u}r diesen Ph{\"a}notyp ist das Legiolysin (Lly) verantwortlich. Es ist eines der wenigen bekannten Genprodukte von L. pneumophila, die einen Einfluß auf das {\"U}berleben des Keimes in der Umwelt haben. Legiolysin kann daher als Fitnessfaktor bezeichnet werden. Um die {\"o}kologischen Zusammenh{\"a}nge der Pigmentgenerierung n{\"a}her zu untersuchen, wurde das lly-positive Plasmid pEWL 1 subkloniert und sequenziert. Neben lly konnten in diesem Genabschnitt durch Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenzen sechs weitere Leseraster detektiert werden. Die drei unmittelbar benachbarten Gene von lly kodieren dabei f{\"u}r Proteine mit Funktionalit{\"a}t in Bezug zur lly-Determinante, w{\"a}hrend die drei upstream von lly liegenden Leseraster Homologien zu Proteinen aufweisen, die an Transportprozessen beteiligt sind. Die L{\"a}nge des RNA-Transkripts von lly konnte im Northern-Blot mit ungef{\"a}hr 1,8 kb bestimmt werden und l{\"a}ßt damit auf die gemeinsame Transkription des lly-Gens mit dem unmittelbar upstream liegenden Leseraster schließen. Durch Sequenzanalysen konnte aufgezeigt werden, daß das f{\"u}r diesen Ph{\"a}notyp verantwortliche Legiolysin-Gen f{\"u}r eine p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) kodiert. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von p-Hydroxyphenylpyruvat zu Homogentisat (HGA). In Zusammenarbeit mit Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, W{\"u}rzburg) konnte im Vergleich zu lly-negativen L. pneumophila- und rekombinanten E. coli-St{\"a}mmen in den Kultur{\"u}berst{\"a}nden von lly-positiven St{\"a}mmen auf Basis einer Hochdruck-Fl{\"u}ssigkeits-Chromatographie (HPLC) HGA nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, daß das Legiolysin-Gen f{\"u}r ein Protein mit HPPD- Aktivit{\"a}t kodiert, und in die Degradation der aromatischen Aminos{\"a}uren Phenylalanin und Tyrosin involviert ist. Des weiteren wurden chromosomale Integrationsmutationen der aus L. pneumophila stammenden Gene lly und mip ("macrophage infectivity potentiator") in E. coli K-12 St{\"a}mmen erstellt. Diese wurden nachfolgend in {\"o}kologisch ausgerichteten Langzeitstudien eingesetzt. Die chromosomale Integration von lly erfolgte als ortsspezifische Rekombination in die l att - site von E. coli WM 2269. Die Integration von mip erfolgte in die fim-Region des E. coli K-12-Stammes AAEC 160. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befaßt sich mit {\"o}kologischen Studien zur Persistenz von L. pneumophila in der Umwelt. Durch die Bestrahlung mit Licht {\"u}ber einen Verlauf von sieben Tagen konnte gezeigt werden, daß die Exprimierung von lly zu einer Persistenz unter Lichtstreß f{\"u}hrt. Dieser Lichtschutz k{\"o}nnte in der Umwelt, aber auch bei der Sanierung von Wasserleitungssystemen mittels UV-Licht Relevanz aufweisen. Die Assoziation von L. pneumophila JR32 und JR32-1 (lly-negativ) mit dem Cyanobakterium Fischerella wurde in Mikrokosmen {\"u}ber einen Verlauf von sieben Tagen beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, daß Legionella in Assoziation mit Fischerella bzw. in dessen {\"U}berstand zu persistieren vermag, w{\"a}hrend dies den Bakterien in frischem Fischerella-Medium nicht m{\"o}glich war. Wie die Coinkubation der Fischerellen mit L. pneumophila JR32-1 zeigte, spielt die Expression von lly dabei keine Rolle. Ein Wachstum der Bakterienkulturen konnte weder im Fischerella-{\"U}berstand, noch in Fischerella-Medium beobachtet werden. Durch Rasterelektronenmikroskopie konnte der adh{\"a}sive Charakter der Assoziation von L. pneumophila zu Fischerella dokumentiert werden. Durch Persistenzstudien von L. pneumophila und E. coli in Boden wurde die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit der Mikroorganismen in suboptimaler Umgebung getestet. F{\"u}r Legionella ist eine rapide Abnahme der Zellzahl schon nach kurzer Zeit zu detektieren. Nach sechs Tagen konnten keine Zellen mehr kultiviert werden. Die Defizienz der Pathogenit{\"a}ts- und Umweltfaktoren Mip, Fla (Flagellin) und Lly hatte dabei keinen Einfluß auf die Persistenz der Bakterien im Boden. Zudem sind die zuvor generierten rekombinanten E. coli-Klone AAEC 160-1 und WM 2269-1 mit genomischer mip- bzw. lly-Integration eingesetzt worden. Innerhalb von vier Wochen konnte f{\"u}r diese St{\"a}mme eine kontinuierliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet werden. Somit erwies sich keiner der Organismen als erfolgreicher Besiedler der Bodenprobe. Die Studien zum Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila und E. coli erfolgten in autoklaviertem Leitungswasser bzw. PBS und zwei unterschiedlich behandelten Varianten von Mainwasser. Neben sterilfiltriertem Mainwasser fand die Inokulierung der Organismen auch in einem Ansatz mit autoklaviertem Mainwasser statt. Es konnte gezeigt werden, daß L. pneumophila in Leitungswasser und Mainwasser außerordentlich gut zu persistieren vermochte. Zudem konnte dokumentiert werden, daß auch E. coli DH5a in ein lebensf{\"a}higes, aber nicht mehr kultivierbares Ruhestadium (viable but nonculturable, VBNC) eintreten kann. Parallel zur Ermittlung der CFU-Werte wurden w{\"a}hrend des Verlaufs der Experimente die Lebendzellzahlen durch Fluoreszenzf{\"a}rbungen bestimmt. Der {\"U}bergang von L. pneumophila in das VBNC-Ruhestadium wurde zudem durch in situ - Hybridisierungen mit fluoreszenzmarkierten 16 S rRNA-Oligonukleotidsonden dokumentiert. Im Naturhaushalt spielt dieser {\"U}bergang zu VBNC-Stadien bei Umweltbakterien zur {\"U}berwindung ung{\"u}nstiger Phasen eine große Rolle. Schließlich erfolgten Experimente zur Reaktivierung der VBNC-Ruhestadien. Diese Reaktivierung ist abh{\"a}ngig von speziesspezifischen Triggern und kann bei L. pneumophila durch Coinkubation mit Acanthamoeba castellanii erfolgen.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dietrich2000,
  author    = {Dietrich, Claudia},
  title     = {Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle f{\"u}r die Virulenz von Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila, der Erreger der Legion{\"a}rskrankheit, ist ein fakultativ intrazellul{\"a}res, ubiquit{\"a}r vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilit{\"a}t der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen k{\"o}nnen, ist bisher noch nicht gekl{\"a}rt. Um etwas {\"u}ber noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region n{\"a}her charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst k{\"u}rzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide"-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen best{\"a}tigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adh{\"a}renz, Invasion, intrazellul{\"a}rer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle f{\"u}r das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilit{\"a}tsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gew{\"a}hlten Versuchsbedingungen bez{\"u}glich des Adh{\"a}renzverm{\"o}gens der St{\"a}mme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz f{\"u}r die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgepr{\"a}gt. Hinsichtlich der intrazellul{\"a}ren Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings f{\"u}hrte vermutlich die Reduktion der Invasivit{\"a}t zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream"-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp {\"u}berlappend, das Gen motB an, welches f{\"u}r den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen best{\"a}tigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilit{\"a}t an Vorg{\"a}ngen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adh{\"a}renz und die intrazellul{\"a}re Vermehrung nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst k{\"u}rzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream" auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabh{\"a}ngig reguliert werden.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Cho2001,
  author    = {Cho, Seung-Hak},
  title     = {Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181296},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis geh{\"o}ren zu den h{\"a}ufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig dar{\"u}ber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die F{\"a}higkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und h{\"a}ngt von der genetischen Ausstattung der St{\"a}mme mit dem f{\"u}r die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon h{\"a}ufiger in klinischen als in kommensalen St{\"a}mmen vorkommt. Der {\"u}berwiegende Teil dieser ica-positiven St{\"a}mme bildete ph{\"a}notypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-St{\"a}mme, unabh{\"a}ngig von ihrer Herkunft, das vollst{\"a}ndige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser St{\"a}mme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-St{\"a}mme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-St{\"a}mmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant h{\"a}ufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-St{\"a}mmen nachweisbar, w{\"a}hrend es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophyt{\"a}ren Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-St{\"a}mme wiesen {\"u}berdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Ph{\"a}notyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante f{\"u}hrte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollst{\"a}ndige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollst{\"a}ndig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen {\"u}berein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo w{\"a}hrend einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Ph{\"a}notyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten St{\"a}mmen zu gr{\"o}ßeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilit{\"a}t unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus aus{\"u}bt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der ver{\"a}nderten SigB-Expression in Zusammenhang steht.},
  subject      = {Staphylococcus aureus},
  language  = {de}
}