@phdthesis{Goehler2012,
  author    = {G{\"o}hler, Antonia},
  title     = {Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und r{\"a}umlicher Aufl{\"o}sung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Das menschliche Genom verschl{\"u}sselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten tr{\"a}gt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenw{\"a}rtige Bestandteile der extrazellul{\"a}ren Matrix von Zelloberfl{\"a}chen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, k{\"o}nnen bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilit{\"a}t erh{\"o}hen oder Immunantworten regulieren. Die Ausl{\"o}sung von biologischen Prozesse erfordert aber {\"U}bersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle {\"U}bereinstimmungen in der Aminos{\"a}uresequenz ihrer Zuckererkennungsdom{\"a}nen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll"-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltbl{\"a}ttern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen pr{\"a}sentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verkn{\"u}pfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Dom{\"a}ne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs {\"u}ber ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen {\"u}ber die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamili{\"a}ren Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und r{\"a}umlicher Aufl{\"o}sung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen n{\"a}her untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Daf{\"u}r skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgef{\"u}hrt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken f{\"u}r den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe m{\"o}glichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zur{\"u}ckgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle {\"A}hnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen k{\"o}nnen, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden k{\"o}nnen so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die {\"U}bertragbarkeit auf andere Glykoproteine gew{\"a}hrleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfl{\"a}che Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die r{\"a}umliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberfl{\"a}chen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochaufl{\"o}sende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker f{\"u}r hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfl{\"a}che best{\"a}tigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabh{\"a}ngig von der Konzentration, w{\"a}hrend die Anzahl der Cluster davon abh{\"a}ngt. F{\"u}r die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Molek{\"u}le, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdr{\"u}ckt und die Spezifit{\"a}t der CRDs gegen{\"u}ber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht m{\"o}glich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollst{\"a}ndigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. M{\"o}glicherweise wird der Zelltod induziert. Hochaufl{\"o}sende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie er{\"o}ffnet jedoch neue M{\"o}glichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolek{\"u}len, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermolek{\"u}le in die Zellmembranen eingebaut, {\"u}ber eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermolek{\"u}le in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchf{\"u}hrbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschl{\"u}sselt und eine Diffusionskonstante f{\"u}r Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher r{\"a}umlicher und zeitlicher Aufl{\"o}sung dar und erm{\"o}glicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine.},
  subject      = {Fluoreszenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klagge2001,
  author    = {Klagge, Ingo M.},
  title     = {Interaktion von Masernviren mit humanen Dendritischen Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180982},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erh{\"a}ltlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die j{\"a}hrlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer w{\"a}hrend der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer St{\"o}rung der zellul{\"a}ren Immunantwort f{\"u}hrt. Diese Immunsuppression beg{\"u}nstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten L{\"a}ndern begleitet von mangelhafter {\"a}rztlicher Versorgung und Untern{\"a}hrung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion f{\"u}hrt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Ausl{\"o}sung einer prim{\"a}ren, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und k{\"o}nnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tats{\"a}chlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-St{\"a}mme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypst{\"a}mme im Vergleich mit Vakzinest{\"a}mmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem st{\"a}rkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen f{\"u}hrte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}ls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schl{\"u}sselzytokin f{\"u}r die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) f{\"u}hrten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verst{\"a}rkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytoh{\"a}magglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten.},
  subject      = {Dendritische Zelle},
  language  = {de}
}