@phdthesis{Winkler2015,
  author    = {Winkler, Ann-Cathrin Nicole},
  title     = {Identification of human host cell factors involved in \(Staphylococcus\) \(aureus\) 6850 infection},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-114300},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Staphylococcus aureus is both a human commensal and a pathogen. 20\%-30\% of all individuals are permanently or occasionally carriers of S. aureus without any symptoms. In contrast to this, S. aureus can cause life-threatening diseases e.g. endocarditis, osteomyelitis or sepsis. Here, the increase in antibiotic resistances makes it more and more difficult to treat these infections and hence the number of fatalities rises constantly. Since the pharmaceutical industry has no fundamentally new antibiotics in their pipeline, it is essential to better understand the interplay between S. aureus and the human host cell in order to find new, innovative treatment options. In this study, a RNA interference based whole genome pool screen was performed to identify human proteins, which play a role during S. aureus infections. Since 1,600 invasion and 2,271 cell death linked factors were enriched at least 2 fold, the big challenge was to filter out the important ones. Here, a STRING pathway analysis proved to be the best option. Subsequently, the identified hits were validated with the help of inhibitors and a second, individualised small interfering RNA-based screen. In the course of this work two important steps were identified, that are critical for host cell death: the first is bacterial invasion, the second phagosomal escape. The second step is obligatory for intracellular bacterial replication and subsequent host cell death. Invasion in turn is determining for all following events. Accordingly, the effect of the identified factors towards these two crucial steps was determined. Under screening conditions, escape was indirectly measured via intracellular replication. Three inhibitors (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) could be identified for the invasion process. In addition, siRNAs targeted against 16 different genes (including CAPN2, CAPN4 and PIK3CG), could significantly reduce bacterial invasion. Seven siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) were able to inhibit intracellular replication significantly. Further studies showed that the IP3 receptor inhibitor 2-APB, the calpain inhibitor calpeptin and the proteasome inhibitor MG-132 are able to prevent phagosomal escape and as a consequence intracellular replication and host cell death. In this context the role of calpains, calcium, the proteasome and the mitochondrial membrane potential was further investigated in cell culture. Here, an antagonistic behaviour of calpain 1 and 2 during bacterial invasion was observed. Intracellular calcium signalling plays a major role, since its inhibition protects host cells from death. Beside this, the loss of mitochondrial membrane potential is characteristic for S. aureus infection but not responsible for host cell death. The reduction of membrane potential can be significantly diminished by the inhibition of the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger. All together, this work shows that human host cells massively contribute to different steps in S. aureus infection rather than being simply killed by bacterial pore-forming toxins. Various individual host cell factors were identified, which contribute either to invasion or to phagosomal escape and therefore to S. aureus induced cytotoxicity. Finally, several inhibitors of S. aureus infection were identified. One of them, 2-APB, was already tested in a sepsis mouse model and reduced bacterial load of kidneys. Thus, this study shows valuable evidence for novel treatment options against S. aureus infections, based on the manipulation of host cell signalling cascades.},
  subject      = {Staphylococcus aureus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Maier2015,
  author    = {Maier, Eduard},
  title     = {Molekulare Analyse des IKK-Komplexes als Zielstruktur f{\"u}r potentielle Therapieoptionen im Multiplen Myelom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127198},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {ZUSAMMENFASSUNG Obwohl diverse Mutationen des NF-κB Systems in Myelomzelllinien und prim{\"a}ren Myelomzellen eine pathogenetische Beteiligung andeuten, ist die Relevanz des IKK Komplexes als molekularer Angriffspunkt f{\"u}r die Entwicklung medikament{\"o}ser Therapieoptionen noch nicht ausreichend gekl{\"a}rt. Zwar f{\"u}hrte die Applikation des IKK-β Inhibitors MLN120b dosisabh{\"a}ngig und l{\"a}ngerfristig zu einer Reduktion der Zellviabilit{\"a}t in einer Vielzahl von Myelomzelllinien, doch kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei h{\"o}heren Konzentrationen unspezifische Wirkungen f{\"u}r die beobachteten Effekte (mit-) verantwortlich sind. Aus diesem Grund erfolgte in der vorliegenden Arbeit eine spezifische Suppression von IKK-α, IKK-β oder IKK-γ mittels transienter Transfektion von shRNA Expressionsvektoren oder Stealth-siRNA. Es folgte die Charakterisierung der verminderten Zielproteinspiegel mittels Western-Blot und die Messung der Viabilit{\"a}t der Zellen mittels FACS Analysen. Dar{\"u}ber hinaus wurde in TNF-α Stimulationsexperimenten der Effekt der Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA auf (Phospho-)IκB-α analysiert. Schließlich erfolgte die Applikation des IKK-β Inhibitors TPCA, dessen Wirkung auf die Zellviabilit{\"a}t und auf die TNF-α-vermittelte Phosphorylierung und Degradation von IκB-α in MM.1S Zellen untersucht wurde. Die Experimente mit Stealth-siRNA zeigten, dass weder die Suppression von IKK-β, noch die Suppression von IKK-α oder IKK-γ in AMO-1, L363 oder MM.1S eine Verminderung der Zellviabilit{\"a}t bewirken konnte. Auch eine kombinierte Suppression von IKK-α zusammen mit IKK-β in L363 und MM.1S Zellen bewirkte keinen vermehrten Zelltod. Dagegen zeigte die Behandlung von MM.1S Zellen mit hohen Konzentrationen von TPCA einen geringen Effekt auf das {\"U}berleben dieser Zellen. Die Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA in MM.1S konnte nicht die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation verhindern. Sowohl die hohe TNF-α Konzentration von 100ng/ml, als auch eine unvollst{\"a}ndige Suppression von IKK-β k{\"o}nnte dazu beigetragen haben. In analogen Experimenten mit TPCA konnte die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation dagegen effektiv unterdr{\"u}ckt werden. In der Zusammenschau der Ergebnisse konnte somit eine potenzielle therapeutische Relevanz des IKK-Komplexes als molekularer Angriffspunkt f{\"u}r eine Myelomtherapie nicht gefunden werden. Eine noch detailliertere Analyse der Funktionalit{\"a}t des Signalwegs (insbesondere eine Messung der Aktivit{\"a}t der NF-κB Transkriptionsfaktoren im Zellkern) und die Etablierung stabiler und induzierbarer Expressionssysteme f{\"u}r l{\"a}ngerfristige Untersuchungen der RNAi Wirkungen in Myelomzellen, stellen weiterf{\"u}hrende Wege zu einer umfangreicheren Beurteilung der pathobiologischen und therapeutischen Bedeutung des NF-κB Systems dar. Dar{\"u}ber hinaus sind die das NF-κB System betreffenden Mutationen genauer hinsichtlich ihrer potenziellen Wirkung auf NF-κB unabh{\"a}ngige Signalwege zu untersuchen.},
  subject      = {Multiples Myelom},
  language  = {de}
}