@phdthesis{Heinz2023,
  author    = {Heinz, Christine Silvia},
  title     = {Synthesis of Analogues and Hybrid Ligands of Pilocarpine for the Study of Muscarinic Receptor Dynamics},
  doi       = {10.25972/OPUS-28148},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-281486},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) are involved in signal transmission at the synapses of the parasympathetic nervous system. The five subtypes of mAChRs regulate various body functions such as heart function, gland secretion, memory, and learning. For the development of drugs with the least side-effects possible, the molecular causes of subtype selectivity and signalling bias are under investigation. In this context, the study of dualsteric ligands binding simultaneously to the orthosteric and the allosteric binding sites of the receptor is of high interest. To date, dualsteric ligands were synthesised as hybrids of full agonists or superagonists being the orthosteric element, linked to known subtype selective allosteric fragments. In this work, the existing library was expanded to hybrid ligands based on the partial agonist pilocarpine. A suitable linker attachment point to pilocarpine was investigated. For this aim, pilocarpine (2), isopilocarpine (15), pilosinine (16) and desmethyl pilosinine (35) were synthesised as orthosteric ligands and orthosteric fragments for the construction of the hybrid molecules (Figure 42). Pilocarpine was liberated from the commercial hydrochloride or nitrate salt and isopilocarpine was generated by epimerisation of pilocarpine. Pilosinine was synthesised in a Michael addition reaction of a dithiane carrying the imidazole moiety 82 onto the lactone precursor furan-2(5H)-one (83) followed by complete deprotection (Figure 43a).[133] The desmethyl pilosinine (35) was obtained in a newly developed synthetic route based on a Horner-Wadsworth-Emmons (HWE) reaction to build the methylene bridge between the imidazole aldehyde and the precursor of the lactone moiety 57 (Figure 43b). All four orthosters were converted to the respective dualsteric compounds with a naphmethonium fragment as allosteric moiety. The four orthosteric fragments and the four hybrid molecules with a linker length of six methylene units were tested for their dose dependent G protein recruitment at the receptor subtypes M1-5 using a mini-G nanoBRET assay. The study of the orthosteric ligands revealed that pilocarpine has the highest ability of all four orthosters to induce activity at all receptor subtypes. A change of the cis- to a trans-configuration of the lactone substituents or a complete removal of the ethyl substituent provoked a significant reduction of activity. Removal of the methyl substituent of the imidazole moiety led to improved receptor activation. The efficacies of the hybrid ligands show that the linker attachment at the imidazole moiety of pilocarpine and its analogues does not abolish activity and hybrid formation of isopilocarpine even improved receptor activation. Thus, the linker attachment point seems a valid choice, but linker length might not be optimum. In contrast to the orthosters, the trans-substitution of the lactone was advantageous for receptor activation of the hybrid ligands. The hybrid without a methyl substituent at the imidazole (69) had an increased efficacy. Additionally, the naphmethonium fragment lowered the maximum effect of pilocarpine, whereas the activity of isopilocarpine was increased. The intensity of both effects was influenced by the subtype selectivity produced by naphmethonium leading, in the case of the pilocarpine hybrid, to less decreased responses or, in the case of the isopilocarpine hybrid, to more increased responses at the M2 and M4 receptors. The results generally lead to the assumption that the allosteric moiety strongly influences the binding poses of the hybrid ligands so that the orthosteric fragments do not interact with the binding site in the same way as the orthosters alone. A second project was based on molecular dynamics simulations of the binding pose of pilocarpine,[73] leading to the hypothesis that the partial agonism of pilocarpine results from an equilibrium between an agonistic and an antagonistic binding pose at the orthosteric binding site of the receptor. The ratio of occupancy of both binding poses determines the observed efficacy of pilocarpine. The orthosteric binding site provides more space for the ethyl substituent in the supposed antagonistic pose than in the agonistic binding pose. This hypothesis was tested by the synthesis and pharmacological evaluation of pilocarpine analogues with alkyl substituents of different sizes at the lactone (16, 31a, c, d) (Figure 44). The analogues with larger alkyl residues are expected to shift the equilibrium towards the antagonistic binding pose, the analogues with smaller residues should have the inverse effect. The synthesis of the pilocarpine analogues was first attempted as a mixture of stereoisomers which were supposed to be separated at the end of the synthetic route. The racemic mixture of the thermodynamically more stable trans-isomers of the target compounds was prepared in a one-pot Michael-addition-alkylation reaction of a dithiane imidazole onto furan-2(5H)-one similarly to the synthesis of pilosinine (Figure 45). The resulting enolate was quenched by an iodoalkane to achieve alkylation of the lactone and subsequent complete deprotection yielded the racemic trans-analogues of pilocarpine.[133] After unsuccessful attempts of chiral resolution, the mixture of trans-isomers was converted to a mixture of all four possible diastereomers in a kinetic epimerisation reaction.[95] A separation of the stereoisomers was not possible in this project so only the racemic molecule 16 (pilosinine, R = H) was obtained from this synthetic route. For the selective synthesis of the cis-isomers following a patent from Reimann,[146] both stereocenters of the target molecules were produced in the last synthetic step by a syn-hydrogenation of the α,β-unsaturated precursor (Figure 46). The racemic pilocarpine analogues, except the butyl derivative (31d), were purified by crystallisation as their nitrate salts. This provided the racemic mixtures with less than 8\% of the trans-isomers as impurity. The racemic pilocarpine (2), itself, was obtained with 15\% trans-impurity and was used as reference compound. Additionally, the possibility of chiral resolution by chromatographic methods was demonstrated in the case of the methyl derivative (31a). The pharmacological testing of the desired enantiomer of 31a is in progress.},
  subject      = {Muskarinrezeptor},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Scheuplein2023,
  author    = {Scheuplein, Nicolas Julian},
  title     = {Synthesis and Characterization of Antimicrobial Inhibitors of the "Macrophage Infectivity Potentiator" Protein and Fluorescent Probes},
  doi       = {10.25972/OPUS-32189},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-321892},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {This dissertation focuses on Mip (macrophage infectivity potentiator protein) inhibitors in response to increasing antibiotic resistance. The study follows an antivirulence approach, which aims to inhibit the non-essential Mip protein without exerting too much selective pressure. Three focus areas were (1) development and synthesis of a fluorescent probe for screening Mip inhibitors via fluorescence polarization; (2) design and synthesis of broad spectrum Mip inhibitors bearing a side chain; and (3) understanding the metabolism of Mip inhibitors and identification of active metabolites. A sub-study addressed the biotinylation of anti-leishmanial compounds from Valeriana wallichii rhizomes, with three tracer molecules synthesized for future pull-down experiments.},
  subject      = {Antibiotikum},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Nagl2022,
  author    = {Nagl, Patrick Alexander},
  title     = {Chemistry meets Cancer Immunotherapy: Synthesis and Characterization of Hapten-like Compounds for Selective Immunotherapy},
  doi       = {10.25972/OPUS-21138},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-211385},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Chimeric antigen receptors (CARs) are able to specifically direct T cells to tumor antigens and therapy with anti-CD19 CARs has already cured cancer patients with B-cell lymphomas who have undergone long-term therapy non-successful. Despite this impressive result, the therapy is currently only approved as a last treatment option for blood cancers due to its life-threatening deficiencies. For patient safety and to enable additional application such as the treatment of solid tumors, CAR-T cells must be controllable, e. g. by chemically programmable CARs (cpCARs) regulated by hapten-like compounds. This thesis reports the synthesis and characterization of such hapten-like compounds. In the first step, seven different warheads with two different spacers were bound to biotin in order to find a suitable warhead for programming the cpCAR. In a second step, synthetic routes for the three pharmacophores folate, c(RGD), and an RGD peptidomimetic were developed. The routes allow the modification of the pharmacophores with one of the warheads from the first step. CuAAC was chosen as a bioorthogonal approach to link pharmacophores and warheads. In total, three different pharmacophores were modified with the 1,3-diketone motif of compound 21 leading to 112, 113 and 128. Activation of the T-cell signaling cascade was tested after binding of these hapten-like compounds to the cpCAR in the presence of suitable target structures. For 112, only a slight, non-significant, activation of the T-cell signaling cascade was observed, whereas for 113 and 128, a significant activation of the T-cell signaling cascade was observed. The poor solubility of the folate compounds led to alternative strategies. Folic acid was exchanged by pteroic acid and the bifunctional, linear compounds were enlarged to trifunctional dendrimers. Besides the reported regioisomer in 112, a second one, which was not reported to date, occurred by the cyclization of the linear RGD pentapeptide leading to 113. After the reported synthesis of an RGD peptidomimetic analogous to 128 could not be reproduced, a new synthetic route was developed. It also consists of 17 steps, but reduces the number of linear steps from 13 to 10. Moreover, the developed route contains an asymmetric hydrogenation step and is, compared to the published one, more flexible by the use of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In addition, an unknown reaction was observed. Instead of the formation of a Schiff base in the reductive amination of 129, an insertion of propargylamine occurred forming 131. The reaction is almost quantitative and in high purity. After requiring no purification, it could be predestined for industrial purposes, such as the synthesis of N-functionalized 1,2-dihydroquinolines or as a building block with various orthogonal functional groups. Besides the sulfonamide 16, the diketone (21, 27, 31) and lactam compounds (39 - 41), experiments on adapter molecules with further warheads were performed. In the synthesis of a proadapter approach, in which the warhead is formed only after the retro-aldol reaction catalyzed by the mAb, 6 of 10 steps were successfully performed. A newly developed synthesis to keto-sulfonyl and keto-sulfoxide compounds could not be completed but was performed on a small scale to the point of keto-sulfonyl and keto-sulfoxide. Furthermore, a universal synthesis route was designed to allow the introduction of the warhead at the end of the synthesis by acylation. Thus, after 5 shared steps, 3 of them in quantitative yield, different warheads may be introduced. Moreover, this also facilitates the purification and the analysis of the compounds by the absence of tautomerism or labile groups. However, the acylation experiments were not successful with either the acid cyanide or the Weinreb amide. In summary, this thesis has proven that the 1,3-diketone motif is a suitable warhead for programming the cpCAR, which was developed by Hudecek et al. (unpublished data). The hapten-like compounds 112, 113 and 128 simultaneously bind to integrin \${\alpha}_v{\beta}_3\$ and the cpCAR activating the T-cell signaling cascade. The modular synthesis strategy and the use of the bioorthogonal CuAAC allow straightforward access to these valuable immunotherapeutics but revealed the need for an additional purification step to remove copper ions.},
  subject      = {Organische Synthese},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schwiering2019,
  author    = {Schwiering, Fabian},
  title     = {Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Leberfibrose in der Maus},
  doi       = {10.25972/OPUS-18652},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-186520},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Mittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse {\"u}ber die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer {\"u}berm{\"a}ßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen f{\"u}hren kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiem{\"o}glichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung bei verschiedenen Organfibrosen kommt. Deshalb wird vermutet, dass die NO-GC eine modulatorische Rolle bei der Entwicklung einer Organfibrose einnimmt. Die Effektorzellen sind bisher unbekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten die Effektorzellen der Lunge in vitro untersucht werden. Da bekannt ist, dass in der Lunge Perizyten NO-GC exprimieren, wurde ein Protokoll etabliert, das es erm{\"o}glichte, Perizyten spezifisch aus der Lunge zu isolieren und in Kultur zu bringen. Durch den Einsatz von verschiedenen Markern wurden im Anschluss diese isolierten Perizyten weiter charakterisiert. Zum einen konnte festgestellt werden, dass die NO-GC in diesen isolierten Zellen exprimiert wird. Zum anderen stellte sich heraus, dass die Perizyten auch durch einen Marker (SM/MHC) identifiziert werden k{\"o}nnen, der eigentlich als VSMC-Marker gilt. Diese Daten waren analog zu den In-vivo-Daten von Aue et al. Zus{\"a}tzlich sollte untersucht werden, ob diese NO-GC- exprimierenden Perizyten in Kultur zu Myofibroblasten differenziert werden k{\"o}nnen. Dies gelang jedoch nicht durch Stimulation mit TGF-β1. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, in welchen Zellen in der Leber die NO-GC exprimiert wird. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die NO-GC in der Leber in den HSC exprimiert wird. Da bekannt ist, dass die NO-GC Einfluss auf die Organfibrose nimmt, sollte die NO-GC-Expression in der Leberfibrose untersucht werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass es zu einer gesteigerten NO-GC-Expression in der CCl4-induzierten Leberfibrose kommt. Diese war vor allem in den Myofibroblasten lokalisiert - den Zellen, die wahrscheinlich f{\"u}r den {\"u}berm{\"a}ßigen Einbau der EZM sorgen. Um den Einfluss der NO-GC auf die Leberfibrose genau- er zu untersuchen, wurde die Fibrose zwischen WT- und GCKO-Tieren verglichen. Dabei konnte beobachtet werden, dass es in den GCKO-Tieren zu einer st{\"a}rkeren Fibrose als in WT-Tieren kam, die sich durch eine vermehrte Einlagerung von Kollagen und einer erh{\"o}hten Expression von TGF-β1 auszeichnete. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die NO-GC eine wahrschein- lich protektive Rolle in der Leberfibrose einnimmt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HSC in der Leberfibrose genauer untersucht. Dabei konnte zum ersten mal festgestellt werden, dass sich die HSC in Subpopulation unter- teilen lassen. Durch den Einsatz von Reporterm{\"a}usen, bei denen unter dem SM/MHC- oder PDGFRβ-Promotor das Flurophor tdTomato exprimiert wurde, ließen sich die HSC in 3 Subpo- pulationen einteilen: (1) SM/MHC-Tomato- und PDGFRβ-Tomato-; (2) SM/MHC-Tomato- und PDGFRβ-Tomato+ und (3) SM/MHC-Tomato+ und PDGFRβ-Tomato-. Durch Lineage-Tracing- Versuche konnte den beschriebenen Subpopulationen Aufgaben in der Leberfibrose und in deren Aufl{\"o}sung zugeordnet werden. Die Subpopulation 1 ist in der gesunden Leber haupts{\"a}chlich in den Zonen 2 und 3 des Leberazinus lokalisiert. In der Fibrose wandern diese Zellen zu den fibrotischen Regionen und differenzieren dort zu Myofibroblasten. In der Aufl{\"o}sung der Fibrose verschwinden diese Zellen durch Apoptose aus der Leber. Die HSC-Subpopulation 2 befindet sich in der gesunden Leber in der Zone 1 des Leberazinus. Auch in und nach Aufl{\"o}sung der Leberfibrose verweilen diese Zellen dort. Zwar befindet sich die HSC-Subpopulation 3 in der ge- sunden Leber ebenfalls nur in Zone 1 des Leberazinus, jedoch wandern die Zellen in der Fibrose in die Zone 2 und 3 und ersetzen dort die HSC-Subpopulation 1, die in die fibrotische Region gewandert ist. Nach Aufl{\"o}sung der Leberfibrose hat die HSC-Subpopulation 3 die Population 1 vollst{\"a}ndig ersetzt. Nach Identifizierung der HSC-Subpopulationen stellte sich die Frage, ob ein spezifischer Aus- schnitt der NO-GC zu einer ver{\"a}nderten Leberfibrose f{\"u}hrt im Vergleich zum WT. Dazu wurde unter dem SM/MHC- und PDGFRβ-Promotor die NO-GC deletiert und die Fibrose in diesen Knockouts untersucht. W{\"a}hrend bei der Deletion der NO-GC unter dem PDGFRβ-Promotor kein Unterschied im Vergleich zum WT gesehen werden konnte, ließ sich beim SM/MHC-GCKO Unterschiede feststellen. Durch den Ausschnitt der NO-GC in den Zellen der HSC-Subpopulation 3 kam es zu einer verringerten Expression von PPARγ in der gesunden Leber. Da PPARγ als Gegenspieler von TGF-β1 fungiert, konnte eine erh{\"o}hte TGF-β1-Expression in der gesunden und fibrotischen Leber des SM/MHC-GCKO im Vergleich zum WT-Tier gesehen werden. Diese Ergebnisse sprechen daf{\"u}r, dass die NO-GC {\"u}ber die Steuerung des PPARγ ihren protektiven Effekt auf die Leberfibrose aus{\"u}bt.},
  subject      = {Leberfibrose},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Riad2019,
  author    = {Riad, Noura},
  title     = {The Development of Dualsteric Ligands for the Elucidation of Mode of Activation of Muscarinic Receptors and their Selective Signaling},
  doi       = {10.25972/OPUS-17928},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-179282},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {GPCRs, particularly muscarinic receptors (mAChRs), are significant therapeutic targets in many physiological conditions. The significance of dualsteric hybrids selectively targeting mAChR subtypes is their great advantage in avoiding undesired side effects. This is attained by exploitation of the high affinity of ligand-binding to the orthosteric site and the structural diversity of the allosteric site to target an individual mAChR subtype, as well as offering signal bias to avoiding undesired transduction pathways. Furthermore, dualsteric targeting of mAChR subtypes helps in the elucidation of the physiological role of each individual mAChR subtype. The first project was the attempt of synthesis of the M2-preferring ligand AFDX-384. AFDX-384 is known to preferentially bind to the M2 receptor subtype as an orthosteric antagonist, with partial interaction with residues in the allosteric site. This project aimed to re-trace the synthesis route of AFDX-384, to open the door to its upscaling and the future synthesis of AFDX-type dualsteric ligands. The multi-step synthesis of AFDX-384 is achieved through the synthesis of its 2 precursors, the chloro acyl derivative VIII and the piperidinyl derivative IV. Upscaled synthesis of the piperidinyl derivative IV was attained. Synthesis of the chloro acyl compound VIII was attempted. Several trials to synthesize the benzopyridodiazepine nucleus as well as its chloro-acylation resulted in the production of the novel crystal structures V and VI. X-ray crystallography was also done for crystallized molecules of the closed-ring benzopyridodiazepine VII that was previously synthesized. Chloro-acylation reactions of compound VII using phosgene seem to be attainable when done using reflux overnight. However, the use of methanol to aid in elution during silica gel column chromatography converted the expected product to the carbamate analogue IX. Hence, further attempts in purification should refrain from the use of methanol. The use of triphosgene instead of phosgene demonstrates a cleaner route for further upscaled synthesis. The second project was the synthesis of dualsteric ligands involving variable orthosteric and allosteric moieties. Four different types of hybrids have been created over multiple steps. Dualsteric ligands have been synthesized using either a phthalimido- or 1,8-naphthalimidopropylamino moiety as the allosteric-binding group, coupled to either N-desmethyl pirenzepine or N-desmethyl clozapine using variable chain lengths. Furthermore, the synthesis of the dualsteric ligands involving N-desmethyl clozapine linked to either the super-agonist iperoxo or acetylcholine, and being connected using variable alkane chain lengths. Several reaction conditions have been investigated throughout the analysis of the optimal condition to conduct the critical final step of synthesis of these dualsteric hybrids, which involves the linking of the two segments of the hybrid together. The optimal method, which produced the least side products and highest yield, was to connect the two intermediates of the compound in absence of base, catalyst or microwaves while stirring at 35 °C for several days using acetonitrile as solvent (silica gel TLC monitoring, 0.2 M aqueous KNO3/MeOH 2:3). The ideal purification methods for the final compounds were found to be either crystallization from the reaction medium or using C18 reverse phase silica gel flash chromatography (using H2O/MeOH solvent system). All the hybrids will be subjected to pharmacological testing using the appropriate FRET assays.},
  subject      = {Muscarinrezeptor},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Erk2018,
  author    = {Erk, Christine},
  title     = {Metabolismus und Reaktivit{\"a}tsstudien neuer Arzneistoffe mittels LC-MS/MS-Methoden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-167025},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung des Metabolismus sowie der Reaktivit{\"a}t verschiedener Wirk- und Arzneistoffe mittels fl{\"u}ssigchromatographischer und massen-spektrometrischer Methoden, sie gliedert sich dabei in vier Projekte. Zur Bestimmung des Metabolitenprofils wurde ein passendes In-vitro-Inkubationssystem mit Cytochrom-P-450-Systemen entwickelt. So wurden der Metabolismus und die Pharmakokinetik der Mip-Inhibitoren SF110, SF235 und SF354 gegen Legionellen, sowie neuer antitrypanosomaler Verbindungen MB209, MB343 und MB444 und von Daptomycin bestimmt. Dar{\"u}ber hinaus wurde die antibakterielle Aktivit{\"a}t des Daptomycins gegen{\"u}ber einem unbekannten Staphylokokkus-Stammes S. sciuri ermittelt. Außerdem wurden Reaktivit{\"a}tsuntersuchungen neu synthetisierter Inhibitoren gegen Tuberkulose und S. aureus durchgef{\"u}hrt. Die untersuchten Mip-Inhibitoren lieferten ein Metabolitenprofil, welches durch Ester- und Amidhydrolysen sowie Hydroxylierungen gepr{\"a}gt wurde. Die Verbindung SF110 schien dabei bereits eine gewisse Instabilit{\"a}t der Esterbindung aufzuweisen, da auch im Blindwert entsprechende Spaltprodukte identifiziert werden konnten. Die Hauptmetabolite von SF235 und SF354 bildeten sich durch unterschiedliche Hydrolysen, da die Spaltung des Molek{\"u}ls von den jeweiligen Substituenten abh{\"a}ngig ist. Innerhalb dieser Substanzklasse dominiert die mikrosomale Enzymkatalyse, da der gr{\"o}ßte metabolische Umsatz sowie die meisten Metabolite mittels mikrosomaler Fraktion des Menschen bzw. der Maus gefunden wurden. Die Klasse der Mip-Inhibitoren wird somit vor allem durch Cytochrom-P-450-Enzyme umgesetzt, wobei die Hydrophilie durch Einf{\"u}hrung polarer OH-Gruppen der Molek{\"u}le erh{\"o}ht wird. Die Hydroxylierung scheint dabei positionsspezifisch, bedingt durch sterische Hinderungen oder dirigierende Einfl{\"u}sse, abzulaufen. Stabilit{\"a}tsvergleiche zwischen SF110, SF235 und SF354 zeigten, dass die Einf{\"u}hrung einer Amidbindung anstelle der korrespondierenden Esterbindung die Substanzklasse maßgeblich metabolisch stabilisiert. Im Rahmen des murinen In-vivo-Metabolismus wurde beobachtet, dass SF235 einem deutlich st{\"a}rkeren Metabolismus unterlag als SF354 und sich der Metabolismus vor allem innerhalb der ersten 30 min vollzog. Demgegen{\"u}ber zeigten die In-vitro-Ergebnisse gegenteilige Ergebnisse, bei denen SF354 die am st{\"a}rksten metabolisierte Substanz war. Diese widerspr{\"u}chlichen Ergebnisse deuten darauf hin, dass In-vitro-Modelle nur als Anhaltspunkt verwendet werden sollten, um m{\"o}gliche Trends abzuleiten. Metabolismusstudien der Chinolonamide, die gegen die afrikanische Schlafkrankheit wirken sollen, veranschaulichten, dass die gr{\"o}ßte enzymatische Umsetzung aller drei getesteten Verbindungen mittels cytosolischer Fraktion erfolgte. Die Enzymreaktionen werden vermutlich durch ALDH bzw. MAO dominiert und nicht durch CYP bzw. FMO. Die gebildeten Metabolite in den verschiedenen Fraktionen unterlagen (ω-1)-Oxidationen, N-Desalkylierungen, Amidhydrolysen und aromatischen Hydroxylierungen. Auffallend war, dass eine Hydroxylierung am aromatischen Benzylring nur erfolgen konnte, sofern der Benzylaromat keinen Fluorsubstitutenten trug, da dieser desaktivierend wirkte. Die aromatische Hydroxylierung am Chinolonamid erfolgte dagegen bei allen drei Substanzen. Es wurde somit lediglich eine Hydroxylierung am Benzylring von MB343 festgestellt. Die enzymatische Aktivit{\"a}t aller Substanzen folgte einer Reaktionskinetik 1. Ordnung. Die unterschiedlichen Stabilit{\"a}ten der Substanzen zeigten einen deutlichen Trend: MB209 wurde, da es die instabilste Verbindung darstellt, im gr{\"o}ßten Maße umgesetzt, gefolgt von den stabileren Derivaten MB343 und MB444. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivit{\"a}ten zeigte, dass die drei Substanzen, verglichen mit der Leitstruktur GHQ168, eine um den Faktor zehn geringere Aktivit{\"a}t aufwiesen [19]. Aufgrund der eingef{\"u}hrten Fluoratome weisen die Substanzen somit eine wesentlich h{\"o}here Stabilit{\"a}t auf. Diese Ergebnisse wurden durch die Untersuchung der Halbwertszeit best{\"a}tigt, bei der MB444 den h{\"o}chsten Wert besaß. Weiterhin ist die Position des Fluorsubstituenten am Chinolonger{\"u}st ausschlaggebend f{\"u}r die metabolische Stabilit{\"a}t, wobei MB444 aufgrund des para-Fluorsubstituenten am Chinolonamid die stabilste Verbindung darstellt. Durch Inkubation von Daptomycin mit unterschiedlichen S. sciuri-Isolaten wurde ein m{\"o}glicher Inaktivierungsmechanismus beobachtet, bei dem das Antibiotikum durch Spaltung des cyclischen Aminos{\"a}ureringes, durch Deacylierung des Fetts{\"a}ureschwanzes, einer Kombination beider Mechanismen oder durch eine Spaltung des heteroaromatischen Ringsystems von Tryptophan inaktiviert wurde. Die Proteasen des Daptomycin-resistenten S. sciuri-Isolats TS92 f{\"u}hrten zu einem Daptomycinabbau von 35 \%, unabh{\"a}ngig von der eingesetzten Menge des Arzneistoffes. Das Ausmaß des Abbaus scheint dar{\"u}ber hinaus vom eingesetzten Inkubationsmedium abh{\"a}ngig zu sein, da die Proteasen voraussichtlich auf ein bestimmtes N{\"a}hrmedium angewiesen sind. Der sensitive S. sciuri-Stamm TS93 lieferte die h{\"o}chste Abbaurate an Daptomycin mit 55 \% und widerlegt damit die Vermutung, dass Daptomycin die geringste antibakterielle Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber diesem S. sciuri-Stamm aufweist. Im In-vitro-Metabolismus zeigte Daptomycin insgesamt eine sehr geringe Umsetzungsmenge mit maximal 5 \% nach 4 h und einer geringen Metabolitenbildung. Hier wurde nur ein Metabolit gefunden, welcher auch mittels S. sciuri-Inkubation identifiziert wurde. Dieser Mechanismus k{\"o}nnte somit auf anderem Wege verlaufen. Die Reaktivit{\"a}tsstudien der kovalenten Inhibitoren der FadA5-Thiolase gegen Tuberkulose zeigten, dass nur die Verbindungen C1 und C4 eine Reaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber der Aminos{\"a}ure Cystein93 im aktiven Zentrum besaßen, die somit f{\"u}r den gew{\"u}nschten Einsatzzweck geeignet sein k{\"o}nnten. Weiterhin wurde bei den kovalenten Inhibitoren der Enoyl-ACP-Reduktase mit dem Enzym FabI, welches im aktiven Zentrum ein Tyrosin besitzt, keine Reaktion festgestellt, da keine Addukte identifiziert wurden. Dies ist vermutlich auf die Unl{\"o}slichkeit im verwendeten TRIS-Puffer zur{\"u}ckzuf{\"u}hren.},
  subject      = {Biotransformation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bach2019,
  author    = {Bach, Matthias},
  title     = {Massenspektrometrische Analyse der Interaktionen von Protein mit Proteinen und Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen},
  doi       = {10.25972/OPUS-16046},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-160462},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Proteine k{\"o}nnen aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu identifizieren und zu validieren. Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsf{\"a}hige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zus{\"a}tzliche Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu k{\"o}nnen (Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexit{\"a}t verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im n{\"a}chsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus Hefe angewendet. Die Probenkomplexit{\"a}t ist hierbei 500 - 1000-fach h{\"o}her als bei der Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren subst{\"o}chiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden. Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt: 1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der w{\"a}hrend der Messung selektiv durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu vereinfachen. Die Funktionalit{\"a}t der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend k{\"o}nnen die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren von zwei Peptiden nicht der Fall w{\"a}re. Beim Quervernetzen der rekombinanten Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu best{\"a}tigende Crosslink zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierf{\"u}r k{\"o}nnte eine zu kurze Linkerl{\"a}nge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschr{\"a}nkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da das Spalten des Linkers einen zus{\"a}tzlichen Intensit{\"a}tsverlust f{\"u}r die folgende Identifizierung der Peptide mit sich bringt. 2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um w{\"a}hrend der Messung direkt nach diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierf{\"u}r war, dass quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur H{\"a}lfte enzymatisch mit 18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8 Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann w{\"a}hrend der Messung direkt gesucht werden. Die vollst{\"a}ndige Markierung von Peptiden mit 18O wurde zun{\"a}chst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich heraus, dass der enzymatische R{\"u}cktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die Markierungseffizienz von Aminos{\"a}uren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollst{\"a}ndige Markierung f{\"u}r alle Peptide erreichen, was f{\"u}r diese Strategie essentiell gewesen w{\"a}re. 3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das Quervernetzen von Proteinen entstehen zus{\"a}tzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE, die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensit{\"a}tsmaxima der Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zus{\"a}tzlichen Fraktionen gefunden werden, was den indirekten Nachweis f{\"u}r eine Interaktion darstellt. Die Funktionalit{\"a}t der Strategie konnte somit best{\"a}tigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50 Proteine in einer Fraktion, k{\"o}nnen potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet. Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten Bindungspartner wurde {\"u}ber quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und {\"U}berlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms (MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α- acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen m{\"o}glichen Therapieansatz dar, wenn er zusammen mit hitzestressausl{\"o}senden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Armadillodom{\"a}ne innerhalb der potentiellen Drug targets signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl Aminocarboxamide dar. Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat angereichert, deren Vorl{\"a}ufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende- und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell f{\"u}r das Spleißen in-vivo sind. Hierzu geh{\"o}ren mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren 3A und 3B. Die Ver{\"a}nderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst.},
  subject      = {Massenspektrometrie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Ferraro2021,
  author    = {Ferraro, Antonio},
  title     = {Entwicklung potenzieller (ir-)reversibler Inhibitoren der Enoyl-ACP-Reduktase FabI in S. aureus/ E. coli und der Thiolase FadA5 in M. tuberculosis},
  doi       = {10.25972/OPUS-23839},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-238392},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Antimikrobielle Resistenzen stellen eine weltweite Herausforderung dar und sind mit einer hohen Morbidit{\"a}t und Mortalit{\"a}t verbunden. Die Letalit{\"a}tsrate durch multiresistente Keime steigt stetig an, weshalb die WHO im Jahr 2017 eine Priorit{\"a}tenliste resistenter Keime erstellte, die die Entwicklung neuer Antibiotika vorantreiben soll. Diese umfasst vornehmlich gramnegative Bakterien, da diese aufgrund ihres Zellaufbaus sowie diverser Resistenzmechanismen besonders widerstandsf{\"a}hig gegen{\"u}ber dem Angriff vieler Antibiotika sind. Einige grampositive Keime (z.B. S. aureus) stehen ebenfalls auf dieser Liste und stellen eine große Herausforderung f{\"u}r die Medizin dar. Infolgedessen ist die Entwicklung neuer Antiinfektiva mit neuen Angriffspunkten gegen resistente Pathogene zwingend n{\"o}tig, um mit bisherigen Resistenzen umgehen zu k{\"o}nnen. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung und Synthese von kovalent (reversibel) bindenden Inhibitoren der Enoyl-ACP-Reduktase FabI (Staphylococcus aureus, Escherichia coli) und der Thiolase FadA5 (Mycobacterium tuberculosis). Beide Enzyme sind essenziell f{\"u}r das {\"U}berleben des jeweiligen Bakteriums. FabI ist ein wichtiges und geschwindigkeitsbestimmendes Schl{\"u}sselenzym der Fetts{\"a}uresynthese Typ II diverser Bakterien. Hierbei werden wichtige Phospholipide hergestellt, die f{\"u}r den Aufbau der Zellmembran n{\"o}tig sind. Schiebel et al. ist es gelungen, einen potenten Inhibitor f{\"u}r den Erreger S. aureus sowie E. coli zu entwickeln und zu charakterisieren. Ausgehend von dieser Verbindung wurde eine Substanzbibliothek mit verschiedenen „warheads" hergestellt. Hierbei wurde die Verkn{\"u}pfung zwischen dem Pyridon-Grundger{\"u}st und der elektrophilen Gruppe sowie die {\"u}ber den Ether verkn{\"u}pften aromatischen Ringsysteme variiert. Diese Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivit{\"a}t am jeweiligen Enzym getestet. Anschließend wurde von Verbindung 32 und 33, die jeweils eine gute Inhibition des Enzyms aufweisen, der IC50-Wert gemessen. Beide Verbindungen weisen eine 50-prozentige Reduktion der Enzymaktivit{\"a}t im mittleren nanomolaren Bereich auf. Zus{\"a}tzlich wurde Verbindung 32 in einem sogenannten „jump-dilution"-Assay auf kovalente Inhibition getestet. Durch dieses Experiment konnte eine kovalente Inhibition des Enzyms ausgeschlossen werden. Die Reaktivit{\"a}t der eingesetzten „warheads" wurde gegen{\"u}ber einem Tripeptid mittels eines LC/MS-Iontrap-Systems bestimmt. Die untersuchten Verbindungen zeigten keine signifikante Reaktion mit der im Tripeptid eingebauten nukleophilen Aminos{\"a}ure Tyrosin, deren Nukleophilie bei dem pH-Wert des Tests (pH = 8.2 und 10.8) nicht hoch genug ist. Um einen Einblick in den Bindemodus der Verbindungen zu erhalten, wurden ferner Kristallisationsversuche durchgef{\"u}hrt. Die erhaltenen Kristallstrukturen zeigen, dass die Verbindungen mit dem gew{\"u}nschten Bindemodus am Zielenzym binden, aber eine kovalente Modifizierung des Tyrosins146 durch die eingesetzten „warheads" aufgrund der großen Entfernung (6 {\AA} zwischen elektrophiler Gruppe und Tyrosin146), unwahrscheinlich ist. Zus{\"a}tzlich wurden die physikochemischen Eigenschaften (Stabilit{\"a}t, Wasserl{\"o}slichkeit und logP) der Verbindung 32 sowie Verbindung 33 charakterisiert. M. tuberculosis ist der Erreger der global verbreiteten Infektionskrankheit Tuberkulose (TB), die zu den zehn h{\"a}ufigsten Todesursachen weltweit geh{\"o}rt. Das Bakterium kann das im menschlichen K{\"o}rper vorkommende Cholesterol metabolisieren und nutzt dessen Abbauprodukte als wichtige Kohlenstoffquelle. Die Thiolase FadA5 ist bei diesem Abbau ein wichtiges Enzym und konnte als potenzielles innovatives Target f{\"u}r neue Antibiotika definiert werden. Durch Dockingstudien konnten zwei potenzielle Leitstrukturen als Inhibitoren der Thiolase FadA5 identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die vorgeschlagenen Strukturen mit dem gew{\"u}nschten „warhead" synthetisiert und hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem Enzym untersucht. Die Zielverbindungen zeigen keine signifikante Hemmung sowie kovalente Bindung {\"u}ber die eingesetzten „warheads" an die Thiolase FadA5.},
  subject      = {Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase<Enoyl-[acyl-carrier-protein]-Reductase>},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Volpato2021,
  author    = {Volpato, Daniela},
  title     = {Bitopic Ligands and their molecular fragments for the study of the M1 Muscarinic Receptor},
  doi       = {10.25972/OPUS-24881},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-248815},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {The past decades have witnessed the development of new pharmaceutical compounds that modulate receptor function by targeting allosteric sites. Allosteric sites are, by definition, domains topographically distinct from the orthosteric binding pocket where the natural ligand binds. Exploring the possibilities of linking orthosteric and allosteric pharmacophores in one compound to yield 'bitopic' compounds is a strategy derived from the "message-address" concept by Schwyzer , first applied to GPCRs by Portoghese et al. This concept explicitly underlines the orthosteric/allosteric combination, in opposite to the more general umbrella term bivalent. The broad possibilities of bitopic ligands in the pharmaceutical field are under continuous study. Bitopic compounds are promising pharmaceutical tools for taking advantage of the allosteric binding to achieve subtype selectivity while preserving high affinity at the receptor. The development of bitopic ligands, based on the idea of combining high affinity (via orthosteric sites) with high selectivity (via allosteric sites), have led to the development of highly selective bivalent ligands for GPCRs , such as for the opioid receptors , muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), serotonin receptors, cannabinoid receptors, and gonadotropin-releasing hormone receptors. This concept has even been extended to other receptors, for examples nicotinic receptors and other proteins, such as acetylcholinesterases and the tyrosine kinase receptors TrkA and TrkC. The reasons to pursue a bitopic ligand approach are various. An improved affinity for the target GPCR and/or an improved selectivity either at the level of receptor subtype, or at the level of signaling pathway. Another advantage of bitopic ligands over purely allosteric ligands is that the former rely on the appropriate presence of endogenous agonist tone to mediate their effects, whereas a bitopic ligand would engage the orthosteric site irrespective of the presence or absence of endogenous tone. By way of introduction to the hybrid approach, a review of the concept of hybrids compounds targeting the cholinergic system is presented in section A of this thesis. Recent updates in hybrid molecule design as a strategy for selectively addressing multiple target proteins involved in Alzheimer's disease (AD) is here reported . This represents the potential and the growing interest in hybrid compound as pharmacological tools to achieve receptor subtype selectivity and/or, to study the overall functional activity of the receptor. Until now, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) have proved to be a particularly fruitful receptor model for the development and characterization of bitopic ligands. In this thesis, several examples of new muscarinic bitopic approach are reported in the results section. A study of bipharmacophoric ligands composed of the muscarinic positive allosteric modulators (BQCAderived compounds) linked with chain of various lengths to different orthosteric building blocks is reported in the result part 1. Synthesis and examination of the potential pharmacological characteristic of Oxotremorine-BQCAd compounds and Xanomeline-BQCAd hybrid derivatives are described in results parts 2 and 4, respectively. Moreover, the bitopic concept has even been extended to other proteins, such as acetylcholinesterase. In the result part 5 an overview of the new Tacrine-Xanomeline hybrids aiming to improve the inhibitory potency of the acetylcholinesterase and simultaneously to increase the cholinergic tone, via the xanomelinic portion acting on the M1 receptor is given. A new trivalent approach is presented for the first time to deepen the study of the M1 muscarinic receptor in the result part 6. Moreover, the synthesis of a new series of iperoxo-derived alkane, bis(ammonio)alkane-type and rigidified chain ligands is given in the result part 7 together with some prospects for further research.},
  subject      = {Ligand <Biochemie>},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Unger2020,
  author    = {Unger, Nina},
  title     = {Stability of Tryptophan in Parenteral Amino Acid Solutions: Identification of Degradation Products and Development of HPLC Analysis Methods},
  doi       = {10.25972/OPUS-19982},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-199825},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {The stability of Trp in pure solutions and in parenteral AA formulations was evaluated with regard to typically used manufacturing processes, storage conditions and primary packaging. Therefore, thorough stability studies on Trp solutions were conducted beforehand. The applied stressing method, i.e. steam sterilization by autoclave, are chemically seen relatively mild but showed to be efficient to induce Trp degradation in the presence of oxygen. Subsequent identification, separation and characterization were challenging due to similar substance properties, numerous stereoisomers and pairs of diastereomers found amongst them. However, the identified o-aminoacetophenone compounds, Kyn and NFK, are associated with photo reactivity and have photo-oxidizing properties. Thus, best possible protection from UV-light, together with strict oxygen expulsion, are the most important criteria to impede Trp degradation after autoclaving. The identification of Trp degradation products was assisted by the compilation of a substance library, which included manifold reported and chemically plausible Trp degradation substances. The substances were classified for priority and their early or late-stage occurrence. The large number of possible substances and stereoisomers was narrowed down with the information retrieved from LC-UV/MS experiments. However, final identification was achieved by the synthesis of proposed substances as references. The following eight substances were characterized as Trp degradation substances: Kyn, NFK and three pairs of diastereomers R,R/R,S DiOia, R,R/R,S Oia and cis/trans PIC. Fig. 33 shows the proposed degradation pathway and demonstrates the close chemical relationship, which may be an explanation for the conversion of some substances into each other during the storage period. The proposed pathway brings together the results of different Trp stability and stressing studies, respectively [89, 94, 97, 98, 103, 133]. To our knowledge, the simultaneous formation of the identified degradation substances has not been reported before and especially not under the stressing conditions applied. The application of a traditional RP-HPLC method was compared to two developed IP-HPLC methods and a RP-HPLC methods using a modified perfluorinated column. Orthogonal analyses methods and especially the combination of UV and MS detection are necessary in order to indicate potentially undetected degradation substances. Main evaluation criteria were the separation performance, analyses time, reproducibility and feasibility. The best results upon assessment of all Trp degradation products, in both; pure Trp solutions and pharmaceutical formulations, were obtained by a traditional RP-HPLC. The optimized method was validated according to ICH guidelines Q2(R1) and meets the criteria of a stability-indicating HPLC-UV method. The validated method has a sufficient separation performance with an adequate selectivity indicating the Trp degradation substances next to each other and next to other AAs in finished pharmaceutical formulations. The detailed knowledge of Trp degradation and the method presented may be transferred practically to the pharmaceutical industry processing Trp-containing products. In general, the findings might contribute to the quality management of such pharmaceutical products during manufacturing and storage. Additionally, the study results provide basic information for the establishment of an impurity consideration following the ICH guidelines Q3B (R2) (impurities in new drug products) for products containing Trp. However, further development of the method applying more sophisticated detectors or more potent HPLC techniques like e.g. UHPLC and the implication of more sensitive (MS) detectors like ToF-MS would be advantageous with regard to economic and practical aspects.},
  subject      = {Stabilit{\"a}t},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Geyer2023,
  author    = {Geyer, Florian},
  title     = {Targeting of M\(_2\) and M\(_4\) Muscarinic Receptor Subtypes with New Dualsteric Ligands},
  doi       = {10.25972/OPUS-27150},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-271506},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {As part of the parasympathetic nervous system, muscarinic receptors are involved in the regulation of numerous functions in the human body. However, targeting a specific subtype of muscarinic receptors is challenging due to the high degree of similarity within the binding site of the endogenous neurotransmitter acetylcholine. Therefore, this study focused on the investigation of dualsteric ligands. Such hybrid ligands target the orthosteric acetylcholine binding site and, simultaneously, a distinct allosteric binding site. Since allosteric binding regions show significant structural differences throughout muscarinic receptor subtypes, it was aimed to produce selective ligands by means of combination of two pharmacophores in one molecule. Herein, the thienopyridine derivatives LY2033298 and LY2119620 were chosen as allosteric moieties. Based on literature studies, the investigated allosteric modulators were analyzed in terms of adequate attachment points for the combination with an orthosteric agonist. As orthosteric units, muscarinic superagonist iperoxo, xanomeline, and TMA were applied in this work. Since the distance between orthosteric and allosteric moieties plays a crucial role for dualsteric ligand binding, the linker chain length was also varied. Pharmacological investigations of the synthesized hybrid ligands were perfomed via FRET- and BRET-assay measurements.},
  subject      = {GTP-bindende Proteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Volpp2021,
  author    = {Volpp, Miriam},
  title     = {Bestimmung der Plasmaproteinbindung von niedrig affinen Liganden am Beispiel der Ephedra-Alkaloide},
  doi       = {10.25972/OPUS-21961},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-219619},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Zur Bestimmung der Bindungsaffinit{\"a}t von Liganden zu den Plasmaproteinen, insbesondere Albumin, wurden {\"u}ber die Jahre zahlreiche Methoden entwickelt. Die Grundlage dieser Arbeit war die Bestimmung der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide unter Verwendung einzelner dieser etablierten Methoden. Aufgrund ihres Anwendungsgebiets als Notfallmedikation bei An{\"a}sthesie-bedingter Hypotonie und den damit verbundenen Anforderungen an die Pharmakokinetik, sollten die Ephedra-Alkaloide niedrig-affine Liganden der Plasmaproteine darstellen. In der Literatur und in vorhergehenden Arbeiten wurden f{\"u}r die Ephedra-Alkaloide jedoch sehr unterschiedliche, teilweise der Indikation widersprechende Affinit{\"a}ten bestimmt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide weiter untersucht und die Affinit{\"a}t zu Albumin bzw. anderen Plasmaproteinen im humanen Serum bestimmt werden. Neben der Affinit{\"a}t sollte auch die Stereoselektivit{\"a}t der Bindung genauer betrachtet werden, die bei der Bindung vieler Wirkstoffe eine Rolle spielt. Als Referenzmethode diente die kontinuierliche Ultrafiltration, die auch schon bei H{\"o}rst verwendet wurde. Folgende Schlussfolgerungen konnten aus den Ergebnissen dieser Arbeit gezogen werden: 1) Die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration zeigten, dass die Ephedra-Alkaloide, Ephedrin und Pseudoephedrin, ein nur geringes Ausmaß an Plasmaprotein-bindung von 4 - 9 \% gegen{\"u}ber bovinem und humanem Serumalbumin zeigen. Eine deutlich h{\"o}here Plasmaproteinbindung von 19 - 37 \% konnte hingegen bei der Verwendung von humanem Serum bestimmt werden. Die Affinit{\"a}t von Pseudoephedrin war dabei jeweils geringer als die von Ephedrin. 2) Diese Ergebnisse mit humanem Serum und die Tatsache, dass Albumin vorwiegend saure Stoffe bindet, legen nahe, dass die Ephedra-Alkaloide vermehrt an andere Plasmaproteine in Serum binden. Erste Messergebnisse mit saurem α1 Glykoprotein best{\"a}tigen diese Vermutung. 3) Eine Stereoselektivit{\"a}t konnte nur in geringem Maß bei (+) Ephedrin beobachtet werden, wobei der Unterschied nur im Serum signifikant ist. Pseudoephedrin dagegen zeigte keinerlei Stereoselektivit{\"a}t. Diese Beobachtung passt zu den Schlussfolgerungen der Pfeiffer'schen Regel zur Stereoselektivit{\"a}t einer Bindung. 4) Andere Sympathomimetika mit einer zus{\"a}tzlichen Phenolgruppe im Molek{\"u}l zeigen eine {\"a}hnlich niedrige Affinit{\"a}t zu Albumin von ca. 10 \%. Eine zus{\"a}tzliche Phenolgruppe scheint die sauren Eigenschaften des Liganden nicht ausreichend zu erh{\"o}hen, um die Affinit{\"a}t zu Albumin signifikant zu steigern. 5) Das terti{\"a}re Kohlenstoffatom am Stickstoff des Ephedrins scheint in gewisser Weise an der Bindung zu Albumin beteiligt zu sein. Sympathomimetika mit einer zus{\"a}tzlichen Methylgruppe an diesem Kohlenstoffatom, wie Ephedrin, Pseudoephedrin und Oxilofrin, zeigen eine gr{\"o}ßere Streuung der Messergebnisse. Eine zus{\"a}tzliche Methylgruppe in dieser Position scheint die Bindung daher sterisch zu hindern. 6) Die Ergebnisse der diskontinuierlichen Ultrafiltration best{\"a}tigen weitestgehend die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration 7) Eine Bestimmung des Ausmaßes der Plasmaproteinbindung von niedrig-affinen Stoffen ist mit den anderen orthogonalen Methoden ACE, NMR und iTC nicht m{\"o}glich. Diese drei verwendeten Methoden trennen nicht wie die klassischen Methoden den gebundenen vom ungebundenen Wirkstoff, sondern beruhen auf einer Ver{\"a}nderung bestimmter Messparameter: bei der ACE die Migrationszeit, bei der NMR-Spektroskopie die chemische Verschiebung der Signale bzw. der Diffusionskoeffizient und bei der iTC die frei werdende Bindungsw{\"a}rme. Bei allen drei Methoden war die {\"A}nderung der Messgr{\"o}ße aufgrund der niedrigen Plasmaproteinbindung zu gering, um auswertbar zu sein. 8) Eine St{\"o}rgr{\"o}ße bei die orthogonalen Methoden war vielfach auch das Albumin selbst bzw. dessen Eigenschaften. Bei der Affinit{\"a}ts-Kapillarelektrophorese sind physiologische HSA-Konzentrationen wegen des starken Basislinienrauschens nicht messbar. Zudem bewirkt der Albuminzusatz im Trennpuffer eine Viskosit{\"a}ts{\"a}nderung, die den EOF verlangsamt und so die Messung st{\"o}rt. Bei der NMR-Spektroskopie k{\"o}nnen wegen der {\"U}berlagerung der Signale durch die breiten Albuminbanden weder Ver{\"a}nderungen in der chemischen Verschiebung noch des Diffusionskoeffizienten zuverl{\"a}ssig bestimmt werden. In der iTC erschwerte die Schaumbildung der L{\"o}sung, die durch die Oberfl{\"a}chenaktivit{\"a}t des Albumins verursacht wird, die Messung. In dieser Arbeit konnte somit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide mit verschiedenen Methoden erfolgreich bestimmt werden. Damit best{\"a}tigte diese Arbeit, dass die Ephedra-Alkaloide, wie deren Indikation vermuten l{\"a}sst, zu den niedrig affinen Liganden des Albumins z{\"a}hlen. Um genauer eingrenzen zu k{\"o}nnen durch welche Plasmaproteine im Blutserum die Ephedra-Alkaloide transportiert werden, sollten die Untersuchungen zum sauren α1-Glykoprotein fortgesetzt und gegebenenfalls durch weitere Bestimmungen mit anderen Plasmaproteinen erg{\"a}nzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben auch gezeigt, dass viele der unz{\"a}hligen Methoden zur Untersuchung der Plasmaproteinbindung bei der Bestimmung von niedrig affinen Liganden ihre Grenzen haben. Nach wie vor sind zur Bestimmung einer niedrigen Bindungsaffinit{\"a}t weiterhin die klassischen Methoden, wie die kontinuierliche Ultrafiltration, Mittel der Wahl. Nicht zuletzt deshalb erfreuen sich diese Methoden auch heute noch großer Beliebtheit.},
  subject      = {Proteinbindung},
  language  = {de}
}