@phdthesis{Spielmann2018,
  author    = {Spielmann, Benjamin},
  title     = {Identifizierung von Einflussfaktoren auf DNA-Sch{\"a}den in weiblichem Brustgewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-156159},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Spontanmutationen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Brustkrebs. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Einflussfaktoren auf Mutationen in weiblichem Brustgewebe zu identifizieren. Daf{\"u}r wurden zun{\"a}chst von 50 gesunden Frauen, die sich aus kosmetischen Gr{\"u}nden einer Mammareduktion unterzogen hatten, Brustgewebsproben akquiriert. Ein Teil der Spenderinnen nahm im Vorfeld der Operation an einer Isoflavon-Intervention teil. Das Gewebe wurde optisch in Fett- und Dr{\"u}sengewebe separiert. Als potentielle Variablen, die die Mutationsfrequenz beeinflussen k{\"o}nnten, wurden am Lehrstuhl der lobule type, Estrogen- und Estrogenmetabolitspiegel und Tran-skriptspiegel von Genen, die f{\"u}r am Estrogen-Metabolismus beteiligte Enzyme, Transkriptonsfaktoren und Rezeptoren kodieren, im Gewebe der Probandinnen be-stimmt. Des Weiteren wurden am Lehrstuhl Oxycholesterolspiegel im Fettgewebe und am Max-Rubner-Institut in Karlsruhe Isoflavonspiegel im Dr{\"u}sengewebe der Probandinnen bestimmt. Zun{\"a}chst wurde der Umfang an genotoxischem Stress auf mitochondrialer Ebene ermittelt. Daf{\"u}r wurde der Random Mutation Capture Assay als genotypselektive Me-thode, die sensitiv genug zur Bestimmung der mitochondrialen Spontanmutations-frequenz ist, ausgew{\"a}hlt. Die erforderlichen Primer wurden f{\"u}r das Cytochrom-B-Gen designt. Nach Optimierung der Reaktion zur Kopienzahlbestimmung wurde ein linearer und varianzenhomogener Kalibrierbereich festgelegt. Die Standard-Wiederfindungsrate lag, je nach Bereich der Kalibrierung, bei 99 bis 102\% mit einer Schwankung von 2 bis 10\%. Bei Realproben lag das 10.-90. Perzentil der Stan-dardaddition-Wiederfindungsrate zwischen 62 und 117\%. Das 90. Perzentil der Standardabweichung der Wiederfindungsrate lag bei 33\% und das der Stan-dardabweichung der Kopienzahl der Proben bei 12\%. Um eine m{\"o}glichst hohe Sensitivit{\"a}t der Mutantenzahlbestimmungs-PCR zu erreichen, wurde die Reaktion ebenfalls optimiert. Bei Mutationsstandard-Wiederfindungsexperimenten wurden in 91 bis 95 Reaktionen im Mittel 11,0±1,7 PCR-Produkte detektiert, wobei kein statis-tisch signifikanter Unterschied zu den 13,6 erwarteten PCR-Produkten bestand. Die Spontanmutationsfrequenz in mitochondrialer DNA eines vor der DNA-Isolation aufgeteilten Brustdr{\"u}sengewebsaliqouts lag bei 1, 2 und 6*10-5 bp 1. Zwischen den Spontanmutationsfrequenzen im Fett- und im Dr{\"u}sengewebe bestand sowohl indi-viduell bei allen getesten Proben, als auch interindividuell, statistisch kein signifi-kanter Unterschied. Ebenso unterschieden sich die mittels Sanger-Sequenzierung der Amplifikationsprodukte der Mutantenzahlbestimmungs-PCR ermittelten Mutati-onsspektren im Fett- und Dr{\"u}sengewebe statistisch nicht signifikant. Da mehr Fett-gewebsproben als Dr{\"u}sengewebsproben zur Verf{\"u}gung standen, wurde die Spont-anmutationsfrequenz anschließend in allen geeigneten Fettgewebsproben be-stimmt. Aufgrund der großen Anzahl an potentiellen Einflussfaktoren auf die mitochondria-le Spontanmutationsfrequenz, wurden diese im Brustfettgewebe mittels multipler linearer Regressionsanalyse ermittelt. Die mitochondriale Spontanmutationsfre-quenz in humanem Brustfettgewebe wurde dabei signifikant positiv durch das Alter beeinflusst. Dies wurde in der Literatur bereits f{\"u}r humane Gehirne und Gehirne von Ratten beschrieben, jedoch nicht f{\"u}r Brustgewebe. Variablen, die in Zusam-menhang mit der mitochondrialen Proliferation stehen, beeinflussten die mito-chondriale Spontanmutationsfrequenz dagegen nicht. Zudem wurde die mito-chondriale Spontanmutationsfrequenz von Oxycholesterolspiegeln, als Marker f{\"u}r durch reaktive Sauerstoff-Spezies induziertem oxidativen Stress, und Transkript-spiegeln und Genotypen von Genen, die f{\"u}r Enzyme, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress stehen, kodieren, beeinflusst. Ein Einfluss von oxidativem Stress auf die Spontanmutationsfrequenz in humanem Brustgewebe wurde in der Literatur noch nicht beschrieben. Im Gegensatz dazu beeinflussten Variablen, die mit der Bildung von reaktiven Estrogenchinonen in Verbindung stehen, die mitochondriale Spontanmutationsfrequenz nicht signifikant. Auch Rauchen beeinflusste die mito-chondriale Spontanmutationsfrequenz nicht. In der Literatur wurde beschrieben, dass sich auch das mitochondriale Mutationsspektrum in Lungen von Raucher- und Nichtraucherzwillingen nicht unterschied. Ebenso beeinflussten der Fettgehalt des Gewebes und der BMI, welche in Verbindung mit proinflammatorischen Media-tioren gebracht werden, die Spontanmutationsfrequenz nicht signifikant. Ber{\"u}ck-sichtigt werden muss allerdings, dass mit einem Variationskoeffizienten von 0,60 nur 60\% der Varianz der Spontanmutationsfrequenz erkl{\"a}rten werden konnte und somit weitere Einflussfaktoren eine Rolle spielen k{\"o}nnten. In Bezug auf nukle{\"a}re DNA erwies sich der Random Mutation Capture Assay in ei-ner vorangegangenen Arbeit als zu zeitaufwendig und unwirtschaftlich. Mutationen k{\"o}nnen aufgrund von DNA-Adduktbildung entstehen. Bei der Entstehung von reak-tiven Verbindungen, die in der weiblichen Brustdr{\"u}se in der Lage sind, DNA-Addukte zu bilden, wird derzeit von einer Rolle des Estrogenmetabolismus ausge-gangen. Am Lehrstuhl wurden bereits DNA-Adduktfl{\"u}sse in weiblichem Brustdr{\"u}-sengewebe mittels bioinformatischer constraint-based Netzwerkmodellierung er-rechnet. Da die f{\"u}r das Netzwerk-Modell als Surrogat f{\"u}r die Enzymaktivit{\"a}t verwen-deten Transkriptspiegel eine Vereinfachung der Enzymaktivit{\"a}t darstellen, wurden zun{\"a}chst Polymorphismen, die Einfluss auf die Bildung und Entgiftung reaktiver Estrogen-Metabolite nehmen k{\"o}nnen, identifiziert. Mittels allelischer Diskriminie-rung wurden f{\"u}r die Genotypisierung der Proben geeignete Positivkontrollen aus-gew{\"a}hlt und mittels Restriktionsfragmentl{\"a}ngen-Polymorphismus-PCR verifiziert. Die Allelfrequenzen der genotypisierten Brustgewebsproben lagen innerhalb des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts und auch innerhalb bereits publizierter Frequen-zen gesunder deutscher bzw. hellh{\"a}utiger Frauen. Ebenso entsprach der Einfluss der Polymorphismen auf den jeweils assoziierten mRNA-Spiegel den Ergebnissen anderer Studien. F{\"u}r den Polymorphismus innerhalb des Gens der Hydroxysteroid-Dehydrogenase 17β2 waren bisher keine Ergebnisse publiziert. In Brustgewebe nahm dieser Polymorphismus keinen signifikanten Einfluss auf den assoziierten mRNA-Spiegel. Zur Identifizierung von Einflussfaktoren auf Estrogen-Gewebespiegel im Brustdr{\"u}-sen- und im Brustfettgewebe wurden am Lehrstuhl bereits multiple lineare Regres-sionsmodelle mit Estrogen-Gewebespiegeln und daraus errechneten Verh{\"a}ltnissen als abh{\"a}ngige Variablen gerechnet. Bei erneut gerechneten Modellen unter zus{\"a}tz-licher Ber{\"u}cksichtung von Polymorphismen, in Genen, die f{\"u}r am Estrogenmetabo-lismus beteiligte Enzyme kodieren, wurden bei vier von neun Modellen Genotypen in die Modelle selektiert. Anschließend wurde in Kooperation mit dem Lehrstuhl f{\"u}r Bioinformatik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg ein zus{\"a}tzliches Netzwerkmodell erstellt, das die Transkriptspiegel um die relative Aktivit{\"a}t des entsprechenden Genotyps korri-gierte. Die Validierungsergebnisse deuteten darauf hin, dass beide Addukt-Modelle (mit und ohne Polymorphismus-Ber{\"u}cksichtigung) {\"a}quivalent die reale Situation der jeweils evaluierten Estrogenmetabolitspiegel im Gewebe widerspiegelten. Daraufhin wurden mittels multipler linearer Regression Einflussfaktoren auf die mit und ohne Genotypen errechneten DNA-Adduktfl{\"u}sse ermittelt. Die Adduktfl{\"u}sse wurden dabei vom BMI signifikant positiv beeinflusst. In der Literatur wurde be-schrieben, dass {\"U}bergewicht, wahrscheinlich aufgrund erh{\"o}hter Plasma-Estrogenspiegel, mit dem Brustkrebsrisiko assoziiert ist. Dies k{\"o}nnte sich ebenso auf die DNA-Adduktbildung im Brustgewebe auswirken. Des Weiteren wurden die Adduktfl{\"u}sse, welche unter Ber{\"u}cksichtigung von polymorphismusabh{\"a}ngiger en-zymatischer Umsetzung errechnet worden waren, positiv von einer Isoflavon-Intervention und Isoflavon-Gewebespiegeln beeinflusst. Ein Einfluss von Isoflavo-nen auf estrogenassoziierte DNA-Adduktbildung wurde in der Literatur bisher noch nicht beschrieben. Des Weiteren beeinflusste lobule type 1 nach altersbedingter Regression im Vergleich zu lobule type 2/3 die DNA-Adduktfl{\"u}sse signifikant nega-tiv. Der postmenopausale Status beeinflusste im Vergleich zum pr{\"a}menopausalen Status nur die Estron-DNA-Adduktfl{\"u}sse ohne Ber{\"u}cksichtigung der polymorphis-musabh{\"a}ngigen enzymatischen Umsetzung signifikant negativ. Lobule type 1 nach altersbedingter Regression ist meist bei postmenopausalen Frauen vorzufinden. Daher sind lobule type 1 nach altersbedingter Regression und der postmenopausa-le Status zumindest ann{\"a}hernd vergleichbar. Das Ende der Estrogen-Produktion in den Ovarien in der Menopause verringert Estrogen-Plasmaspiegel, was sich ebenso auf das Brustgewebe auswirken und zu einer verringerten Estrogen-DNA-Adduktbildung im Brustgewebe f{\"u}hren k{\"o}nnte. Das Alter dagegen beeinflusste kei-ne der abh{\"a}ngigen Variablen signifikant. Obwohl bei Rauchern in vielen humanen Geweben bereits eine erh{\"o}hte Cytochrom P450-abh{\"a}ngige Monoxygenase 1A1- und 1B1-Expression nachgewiesen wurde, die potentiell zu mehr reaktiven Estro-genchinonen und damit auch DNA-Adduktbildung f{\"u}hren k{\"o}nnte, beeinflusste Rauchen bei keiner der Modellvarianten die jeweils abh{\"a}ngige Variable signifikant. Des Weiteren beeinflussten weder Ethinylestradiol, noch 17β-estradiol-freisetzende Medikamente bei einer der Modellvarianten die jeweils abh{\"a}ngige Variable signifi-kant. Die Ergebnisse der multiplen linearen Regressionsanalyse der beiden Adduktfluss-Varianten (mit und ohne Ber{\"u}cksichtigung von polymorphismusabh{\"a}ngiger en-zymatischer Umsetzung) waren nicht identisch, widersprachen sich allerdings auch nicht. Ber{\"u}cksichtigt werden muss dabei, dass die Modelle mit einem Variationsko-effizienten zwischen 0,09 und 0,33 nur 9-33\% der Varianz der jeweiligen abh{\"a}ngi-gen Variable erkl{\"a}rten und vermutlich weitere Parameter zur vollst{\"a}ndigen Erkl{\"a}-rung ben{\"o}tigt werden. Oxidativer Stress kann ebenfalls zu DNA-Addukten f{\"u}hren, wird allerdings nicht durch das verwendete metabolische Netzwerk abgebildet. Daher wurden mittels multipler linearer Regression Einflussfaktoren auf Brustgewebs-Transkriptspiegel von der NADPH-Chinon Oxidoreduktase 1, der γ-Glutamyl-Cystein Ligase und des Transkriptionsfaktors nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Transkripten, deren Expression bei oxidativem Stress induziert wird, ermittelt. Die jeweils signifikant mit den abh{\"a}ngigen Variablen assoziierten erkl{\"a}renden Variablen unterschieden sich dabei zum einen bezogen auf jeweils abh{\"a}ngigen Variable, zum anderen bezogen auf das Gewebe. Die Marker-Transkriptspiegel wurden vom BMI, Alkoholkonsum, Rauchen und vom menopausalen Status signifikant beeinflusst. F{\"u}r diese Variab-len wurde in der Literatur bereits ein Einfluss auf Marker f{\"u}r oxidativen Stress in humanem Blut oder Plasma und anderen Geweben, jedoch nicht in Brustgewebe beschrieben. Zellzyklus-Marker und Marker der Gewebedifferenzierung beeinfluss-ten die abh{\"a}ngigen Variablen ebenso signifikant. Des Weiteren beeinflussten Transkriptspiegel und Genotypen von Genen, die f{\"u}r Enzyme kodieren, die zur Ka-techolbildung und -entgiftung f{\"u}hren konnen, die abh{\"a}ngigen Variablen signifi-kant. Estrogenspiegel selbst beeinflussten dagegen keine der abh{\"a}ngigen Variab-len signifikant. Des Weiteren beeinflussten Oxycholesterolspiegel, als Marker f{\"u}r durch reaktive Sauerstoffspezies induzierten, oxidativen Stress, entgegen der Er-wartung keine der abh{\"a}ngigen Variablen signifikant. Obwohl in der Literatur bereits ein Einfluss des Alters auf Marker f{\"u}r oxidativen Stress im humanen Frontal-Cortex, Endothelzellen der Oberarmarterie und in der humanen Leber beschrieben wurde, beeinflusste es keinen der Transkriptspiegel im Brustgewebe signifikant. Zusammengefasst wurde zum ersten Mal die mitochondriale Spontanmutationsfre-quenz in gesundem humanem Brustgewebe bestimmt und in Kombination mit bio-informatischer Netzwerkmodellierung und multipler linearer Regressionsanalyse ein umfassendes Bild der verschiedenen Einflussfaktoren auf mitochondrialen und estrogeninduzierten genotoxischen Stress in der gesunden weiblichen Brust dar-gestellt.},
  subject      = {DNS-Sch{\"a}digung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Scheffler2018,
  author    = {Scheffler, Anne},
  title     = {Entwicklung und Charakterisierung des RMCA f{\"u}r \(Rattus\) \(norvegicus\) in nukle{\"a}rer und mitochondrialer DNA},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-169880},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Mutationstests werden in vitro und in vivo durchgef{\"u}hrt. Insbesondere die ph{\"a}notypselektiven Mutationstests sind meist beschr{\"a}nkt auf die Detektion von Mutationen im Exon und gegebenenfalls in Promotorregionen. Um zun{\"a}chst die Datenlage zu den {\"u}blicherweise verwendeten in vitro Mutationstests zu erweitern und somit eine Bewertung der zu untersuchenden Substanz zu erleichtern, sollte eine Methode zur Erfassung des Mutationsspektrums etabliert und im Rahmen der Untersuchung des mutagenen Potentials des Lebensmittelinhaltsstoffes Irilon angewendet werden. Es wurde eine Methode entwickelt, welche die Sequenzierung eines jeden einzelnen im Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Test enstandenen 6-Thioguanin-resistenten Mutanten erlaubt und somit auch R{\"u}ckschl{\"u}sse auf Mechanismen der Mutationsentstehung zul{\"a}sst. Im Rahmen der Untersuchung zum mutagenen Potential des Lebensmittelinhaltsstoffes Irilon, wurde zwar kein Unterschied in der Mutantenfrequenz, jedoch sehr wohl ein mit steigenden Deletionen und sinkenden Basenpaarsubstitutionen ver{\"a}ndertes Mutationsspektrum detektiert. Die Auswertung des Mikrokerntests unterst{\"u}tzte die Annahme, dass Irilon Chromosomenmutationenen induziert. Zudem wies Irilon ein starkes aneugenes Potential auf. Im Gegensatz zu den ph{\"a}notypselektiven Mutationstests weisen genotypselektive Tests hingegen theoretisch keine Limitierungen hinsichtlich der zu untersuchenden Zielsequenz und der Organwahl auf. Ein Vertreter der genotypselektiven Tests ist der Random Mutation Capture Assay, der 2005 von Bielas und Loeb f{\"u}r das Intron 6 des humanen TP53-Gens publiziert wurde. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen ob die Technik des Random Mutation Capture Assays auf die Ratte {\"u}bertragbar und ob bzw.unter welchen Bedingungen die Bestimmung von spontanen und induzierten Mutationsfrequenzen in verschiedenen Zielsequenzen m{\"o}glich ist. Deshalb wurden zun{\"a}chst das f{\"u}r das Tumorsuppressor Protein 53 kodierenden Gen p53, die f{\"u}r die 18S ribosomale RNA kodierenden DNA und das mitochondriale Cytochrom b Gen als Zielsequenzen gew{\"a}hlt und deren Eignung f{\"u}r die Anwendung im Random Mutation Capture Assays gepr{\"u}ft. F{\"u}r jede Zielsequenz wurden alle f{\"u}r die Durchf{\"u}hrung des Random Mutations Capture Assays ben{\"o}tigten molekularen Werkzeuge unter optimierten PCR-Bedingungen hergestellt und verifiziert. F{\"u}r die Quantifizierung der Gesamtkopiezahl wurde je Zielsequenz eine spezifische Echtzeit-PCR-Methode entwickelt, welche TaqMan®-Sonden-basiert ist. Nach Optimierung der PCR-Bedingungen wurden je Zielsequenz Wiederfindungen im angestrebten Bereich von ca. 90-100\% mit Schwankungen von maximal 20\% erreicht. Ausgenommen hiervon war die f{\"u}r die 18S ribosomale DNA kodierende Zielsequenz. Eine {\"A}nderung der Echtzeit-PCR-Bedingungen f{\"u}hrte zu keiner praktikablen Methode. Daher war diese Zielsequenz, welche trotz geringer DNA-Mengen versprach mehr DNA Kopien zu erhalten und somit die Bestimmung von geringen Mutationsfrequenzen zu erleichtern, nicht im Random Mutation capture Assay anwendbar. F{\"u}r die Wahl einer DNA-Isolierungsmethode wurden 5 Methoden hinsichtlich einer f{\"u}r die Mutationsfrequenz-Bestimmung ausreichenden Kopiezahlausbeute, der Reinheit und des Kosten-/Zeitaufwands verglichen. Mit zwei der f{\"u}nf Methoden wurde aus 100 mg Gewebe die h{\"o}chste nukle{\"a}ren Kopienzahl isoliert, ausreichend um Mutationsfrequenzen im Bereich 1-2*10-7/bp zu bestimmen. Um jedoch die erwarteten Mutationsfrequenzen im Bereich von 1-3*10-8/bp (Intron) bzw. 2-3*10-9/bp (Exon) zu detektieren, w{\"a}ren 2-3 g Gewebe bzw. 3 mg DNA notwendig. Auf Grund der anatomischen Organgewichte w{\"a}re die Durchf{\"u}hrung des nukle{\"a}ren Random Mutation Capture Assays somit auf vereinzelte Organe wie Leber, D{\"u}nndarm und Gehirn beschr{\"a}nkt. Zudem bestanden mit der Hybridisierung und dem Uracil-DNA-Glycosylase-Verdau zwei zus{\"a}tzliche kritische Punkte, welche zu einer Minimierung der Kopiezahl oder einer fehlerhaften Einsch{\"a}tzung der Mutationsfrequenz f{\"u}hren k{\"o}nnen. Aus diesen Gr{\"u}nden wurde eine Entwicklung des Random Mutation Capture Assays f{\"u}r die Zielsequenz im p53-Gen verworfen. Die Kopiezahlausbeuten der mitochondrialen DNA waren ab 50 mg Gewebeeinsatz bei jeder der 5 untersuchten Methoden ausreichend zur Bestimmung einer angestrebten Spontanmutationsfrequenz zwischen 6-100*10-7/bp. Bei Gewebemengen unter 50 mg erwies sich die Aufarbeitung mit DNAzol® auf Grund zu niedriger Kopiezahlausbeuten als ungeeignet. In dieser Arbeit wurde nachfolgend die Phenol-Chloroform-Extraktion nach Vermulst et al (2008) verwendet. Im Rahmen der Etablierung der PCR zur Erfassung der Anzahl mutierter Kopien (Mutations-PCR) wurde ein Mutanten-Standard zur Anwendung als Positivkontrolle in PCR und Agarose-Gelelektrophorese hergestellt, verifiziert und fluorimetrisch quantifiziert. Wiederfindungsexperimente best{\"a}tigten, dass mit der etablierten Mutations-PCR eine einzelne Kopie amplifizier- und detektierbar ist. Um eine Auswertung einer Sequenzierung hinsichtlich Anzahl der Mutanten als auch der Sequenz an sich zu gew{\"a}hrleisten, wurde der akzeptierte Bereich an detektierten 1-19 (80 Reaktionen) gesetzt. Nachfolgend wurde in der gesunden Leber von m{\"a}nnlichen und weiblichen Ratten erfolgreich die mitochondriale Spontanmutationsfrequenz mit dem entwickelten Random Mutation Capture Assay bestimmt. Diese betrug innerhalb einer mitochondrialen DNA-L{\"o}sung 3,2 ± 3,1 *10-6/bp (Median 2,7). Die Mutationsfrequenzen von 3 unabh{\"a}ngigen mitochondrialen DNA-L{\"o}sungen -isoliert aus demselben Organpulver- betrugen durchschnittlich 11,5 ± 8,6 *10-6/bp (Median 8,0) und waren somit ca. 3-mal h{\"o}her. Ein Vergleich zwischen den Mutationsfrequenzen der m{\"a}nnlichen und weiblichen Tiere resultierte in mitochondrialen Mutationsfrequenzen zwischen 1,6-34,4 *10-6/bp (m{\"a}nnlich) und 3,0-12,9 *10-6/bp (weiblich), wobei zwischen m{\"a}nnlichen und weiblichen Tieren kein statistischer Unterschied bestand (Mann-Whitney-Test; p<0,05). Um zu pr{\"u}fen, ob die Mutationsraten bestimmt mit dem mitochondrialen Random Mutation Capture Assay und einem ph{\"a}notypselektiven Mutationstest zu gleichem Maße auf ein mutagenes Potential hinweisen, wurde als n{\"a}chstes der ph{\"a}notypselektive Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Test f{\"u}r normale Nierenepithelzellen der Ratte (NRK-Zelllinie) entwickelt. Nach einer 24 h Inkubation mit 0,1 µM 4-Nitrochinolin-1-oxid, einem bekannten Adduktbildner, stieg die Mutationsfrequenz im Exon des Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gens um den Faktor 5 im Vergleich zur L{\"o}semittelkontrolle an. Mit Hilfe des entwickelten Random Mutation Capture Assays wurde in der DNA -isoliert zum Zeitpunkt der Selektion- eine dreifache Steigerung der Mutationsfrequenz im mt-Cytb-Gen detektiert. Somit war mit beiden Tests eine Erh{\"o}hung der Mutationsfrequenz in der gleichen Gr{\"o}ßenordnung detektierbar, wobei der ph{\"a}notypselektive Mutationstest sensitiver war. Nachdem die Mutations-PCR ca. 1,5 Jahren angewendet wurde, stieg innerhalb von 4 Monaten unabh{\"a}ngig von der verwendeten Templatkonzentration sowohl die H{\"a}ufigkeit der detektierten Schmierbanden als auch die des DNA hang up an. In 7 Mutations-PCRs, welche nach diesen Ph{\"a}nomenen nur mit Blindwerten durchgef{\"u}hrt wurden, lag der Anteil an detektierten DNA-Schmierbanden pro Mutations-PCR zwischen 25,0\% und 38,8\%, der des DNA hang up zwischen 17,5\% und 48,8\%. Das war h{\"a}ufiger als in Reaktionen mit Templat; ein Hinweis daf{\"u}r, dass das Vorliegen von Templat Nebenreaktionen zu einem gewissen Grad verdr{\"a}ngte und dass die unspezifische Amplifizierung am Mastermix der Mutations-PCR lag. Eine {\"A}nderung von chemischen oder physikalischen Parametern innerhalb der PCR-Reaktion f{\"u}hrte zu keiner Reduktion der Nebenprodukte. Somit war der f{\"u}r das mitochondriale Cytochrom b-Gen entwickelte Random Mutation Capture Assay nicht robust gegen{\"u}ber Nebenreaktionen und ist daher nicht f{\"u}r einen routinem{\"a}ßigen Einsatz geeignet. Zusammenfassend war eine Entwicklung der Primer und der molekularen Werkzeuge des Random Mutation Capture Assays vom Mensch auf Ratte mit allen drei gew{\"a}hlten Zielsequenzen m{\"o}glich. Im Rahmen der Experimente zeigte sich, dass die Kopiezahl-PCR der Zielsequenz in der 18S ribosomale RNA kodierenden DNA nicht praktikabel und eine Bestimmung der Mutationsfrequenzen f{\"u}r das Tumorsuppressor Protein 53 kodierenden Gen p53 nur unter Ber{\"u}cksichtigung einer eingeschr{\"a}nkten Organauswahl m{\"o}glich war. F{\"u}r die Zielsequenz des mitochondrialen Cytochrom b Gens war der Random Mutation Capture Assay durchf{\"u}hrbar. Allerdings erwies sich die Mutations-PCR als instabil. Folglich ist eine Bestimmung von Mutationsfrequenzen mit dem Random Mutation Capture Assay in Rattus norvegicus nur sehr begrenzt m{\"o}glich.},
  subject      = {Mutationsrate},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Futh2015,
  author    = {Futh, Susanne},
  title     = {Entwicklung einer Methode mittels Gaschromatographie und gekoppeltem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer zur Quantifizierung von Estrogen-Metaboliten in humanem Brustgewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-118808},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methode f{\"u}r die Quantifizierung von freiem 17β-Estradiol, Estron sowie der hydroxylierten und methylierten Metabolite im Brustgewebe entwickelt. Aufgrund der geringen Probengehalte erforderte dies eine gezielte Isolierung der Analyte aus der Probenmatrix sowie eine effektive Aufreinigung und Aufkonzentrierung, so dass eine Extraktion mit anschließender Festphasenextraktion durchgef{\"u}hrt wurde. Zudem wurde eine empfindliche Mess-Methode etabliert, welche auf Grundlage einer multi-reaction-monitoring-Methode, mittels Gaschromatographie und gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, entwickelt wurde. Die Anwendbarkeit der Aufarbeitungs- und Mess-Methode wurde {\"u}berpr{\"u}ft, indem diese auf 30 Realproben {\"u}bertragen wurde. Dabei sind die ermittelten Gehalte mit den publizierten Daten der Gewebekonzentrationen von 17β-Estradiol, Estron und deren Metaboliten verglichen und Korrelationen mit ausgew{\"a}hlten Brustkrebs-beg{\"u}nstigenden Risikofaktoren betrachtet worden. Um ein quantitatives Metabolitenprofil von 17β-Estradiol, Estron und deren Metaboliten im Gewebe zu erstellen, wurden mit Hilfe einer multi-reaction-monitoring-Methode f{\"u}r alle Metabolite ein spezifischer Quanti- und Qualifier-{\"U}bergang etabliert. Durch die Optimierung der Ionisierungs- und Kollisionsenergien sowie der Initial-, Transferline- und Ionenquell-Temperatur beziehungsweise der dwell-time wurden Methoden- und Ger{\"a}te-bedingte Empfindlichkeitsverluste so weit wie m{\"o}glich reduziert, so dass maximale Signalintensit{\"a}ten aller Quantifier-{\"U}berg{\"a}nge gew{\"a}hrleistet waren. Zur gezielten Isolation sowie Aufreinigung und Anreicherung der Analyten,... ...so dass trotz der geringen Anzahl analysierter Gewebe-spenden der Einfluss des Body-Mass-Index und die Einnahme oraler Kontrazeptiva auf die Gehalte von 17β-Estradiol in der pr{\"a}menopausalen Frau deutlich wurden. Die entwickelte Mess-Methode erm{\"o}glicht den routinem{\"a}ßigen Einsatz f{\"u}r die Quantifizierung von freiem 17β-Estradiol, Estron und deren Methyl-Catecholen in humanem Brustgewebe. Beim Vergleich der berechneten Nachweisgrenzen von Catechol-Estrogenen mit Literaturangaben wurde herausgestellt, dass empfindlichere fl{\"u}ssigchromatographische Methoden als Methode der Wahl bei deren Analytik heranzuziehen sind. Die {\"U}bertragung der in Standardl{\"o}sungen durchgef{\"u}hrten Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von Glucuronid-und Sulfat-Konjugaten auf Gewebematrix stellt f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Arbeiten den entscheidenden Ansatzpunkt dar, um ein quantitatives Metabolitenprofil von freiem und gebundenem 17β-Estradiol, Estron und den Metaboliten in Brustgewebe erstellen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Estradiol},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schmalbach2014,
  author    = {Schmalbach, Katja},
  title     = {Identification of factors influencing 17beta-estradiol metabolism in female mammary gland},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109300},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {The female sex hormone 17beta-estradiol, produced naturally in the body, seems to play an important role in the development of breast cancer, since (i) it can be activated to reactive metabolites, which are known to damage DNA and (ii) the stimulation of the estrogen receptor alpha by 17beta-estradiol enhances cell proliferation. Both processes together increase mutation frequency and subsequently lead to transformation of epithelial cells. Therefore, the aim of this work was to characterize the influence of polymorphisms and lifestyle factors on 17beta-estradiol metabolism in normal mammary gland tissue. [...] In sum, the tissue specific 17beta-estradiol metabolism was described in mammary gland tissue homogenate, whereas differences in proliferation of epithelial cells were only reflected in isolated epithelial cells. Factors associated with breast cancer risk (age, BMI and age-related changes in mammary gland morphology) were shown to affect 17beta-estradiol tissue levels. The 17beta-estradiol mediated genotoxicity was evaluated using bioinformatically calculated DNA adduct fluxes, which were predominately influenced by individual mRNA patterns rather than individual genotypes and (DNA adduct fluxes) were correlated with known breast cancer risk factors (age, parity, BMI and polymorphism of glutathione-S-transferase theta 1).},
  subject      = {Milchdr{\"u}se},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Pfenning2014,
  author    = {Pfenning, Carolin},
  title     = {Untersuchungen zum genotoxischen Wirkmechanismus des Mykotoxins Patulin: Reaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber DNA-Basen unter dem Einfluss von Glutathion},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-109599},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Als Sekund{\"a}rmetabolit verschiedener Schimmelpilze geh{\"o}rt das Mykotoxin Patulin zu den als Kanzerogene diskutierten Lebensmittelinhaltsstoffen nat{\"u}rlichen Ursprungs und kommt vor allem in braunfaulen {\"A}pfeln und daraus verarbeiteten Lebensmitteln vor. Trotz zahlreicher in vitro- und in vivo-Studien zur Genotoxizit{\"a}t von Patulin, ist der Wirkmechanismus f{\"u}r das genotoxische Potential von Patulin weitgehend unbekannt. Um die direkte DNA-Reaktivit{\"a}t von Patulin als m{\"o}gliche genotoxische Wirkung zu betrachten, wurde im ersten Teil der Arbeit zun{\"a}chst die direkte Reaktion von Patulin mit DNA-Basen untersucht. Nach Inkubation von Patulin mit der DNA-Base Adenin wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus insgesamt f{\"u}nf Addukte von Patulin mit Adenin identifiziert. Anhand der Fragmentierungsmuster ohne und nach Methylierung freier Carboxyl- und Ketogruppen wurde f{\"u}r drei Patulin-Adenin-Addukte eine Ketohexans{\"a}ure-Derivat-Struktur des Patulin-R{\"u}ckgrates und die Bindung des Adenin-Molek{\"u}ls an C6 (C5) abgeleitet. Zus{\"a}tzlich wurden zwei Addukte identifiziert, welche die gleiche Patulin-Struktur aufwiesen, jedoch je ein Molek{\"u}l Adenin an C5 und C6 gebunden haben. Patulin reagierte folglich mit Adenin unter Bildung von Mono- und Diaddukten. In Gegenwart von einer zu Adenin {\"a}quimolarer Konzentrationen an Glutathion im Inkubationsansatz wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus die gleichen Patulin-Adenin-Addukte wie in Abwesenheit von Glutathion beschrieben beobachtet. Weiterhin wurden drei bisher unbekannte Glutathion-Patulin-Addukte identifiziert. Es handelte sich, abgeleitet von deren Fragmentierungsverhalten ohne und nach Methylierung, um C6-monosubstituierte Addukte mit Ketohexans{\"a}ure-Derivat-Struktur. In einem dieser Addukte lag das Glutathion-Molek{\"u}l linear gebunden vor, wohingegen in den beiden anderen Addukten die α-Aminogruppe des Glutamins{\"a}urerestes zudem an C1 oder C7 von Patulin verkn{\"u}pft war und es sich somit um 6,1- bzw. 6,7-cyclische Glutathion-Patulin-Addukte handelte. Interessanterweise, wurden sieben weitere Produktpeaks nur bei gleichzeitiger Anwesenheit beider Nukleophilkomponenten im Inkubationsansatz gebildet, was folglich auf gemischte Addukte aus Patulin, Glutathion und Adenin hinwies. Das Fragmentierunsmuster best{\"a}tigte die Anwesenheit von Adenin und Glutathion in der Adduktstruktur und zeigte zudem, dass die neuartigen Addukte Regioisomere mit Ketohexans{\"a}ure-Derivat-Struktur waren, die ein 6,7-cyclisch gebundenes Glutathion-Molek{\"u}l aufwiesen. Durch Methylierung der freien Carboxylgruppen innerhalb der Adduktstruktur und Analyse der Molek{\"u}l- und Fragmentionen wurde die Bindung des Adenin-Molek{\"u}ls lokalisiert. In zwei diastereomeren Adduktpaaren war das Adenin-Molek{\"u}l an C1 {\"u}ber eine Amidbindung gebunden. In geringerer Intensit{\"a}t wurden auch zwei diastereomere gemischte Glutathion-Patulin-Adenin-Addukte mit linearem Glutathion-Molek{\"u}l und C1-gebundenem Adenin-Molek{\"u}l identifiziert. Die Summenformeln aller postulierten Strukturen wurden mittels hochaufl{\"o}sender Massenspektrometrie best{\"a}tigt. Zudem wurde ein Reaktionsmechanismus f{\"u}r die Bildung der neuen (Glutathion-)Patulin(-Adenin)-Addukte hergeleitet. Die Bildung gemischter Glutathion-DNA-Basen-Addukte wurde bisher weder f{\"u}r Patulin noch f{\"u}r andere α,β-unges{\"a}ttigte Carbonyle beschrieben. Die Reaktion der Mischadduktbildung unterscheidet sich zudem mechanistisch von den Reaktionen, welche zur Bildung bereits bekannter Glutathion-DNA-Basen-Addukte von 1,2-Dihaloalkanen, sowie 1,2,3,4-Diepoxybutan f{\"u}hren. ...},
  subject      = {Patulin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{MartinezJaramillo2013,
  author    = {Mart{\´i}nez Jaramillo, Daniela},
  title     = {Einfluss einer definierten Enzymausstattung auf die Mutagenit{\"a}t von 17β-Estradiol und dessen Metaboliten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-91903},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abh{\"a}ngigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung k{\"o}nnen diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren k{\"o}nnen. Eine niedrige COMT-Aktivit{\"a}t, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, k{\"o}nnte daher die Mutagenit{\"a}t von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t auf die Mutagenit{\"a}t von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenit{\"a}tsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt. Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollst{\"a}ndig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zus{\"a}tzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollst{\"a}ndig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit. 2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, keine Erh{\"o}hung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivit{\"a}t st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war. {\"U}ber den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den gr{\"o}ßten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86\%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollst{\"a}ndigen Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war. 4-HO-E2 induzierte {\"u}ber den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation. Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 f{\"u}r bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten {\"u}ber die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86\%) und Estron (> 10\%, bezogen auf die Summe aller Peakfl{\"a}chen) den gr{\"o}ßten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar. Die durchgehende, zwei- und dreiw{\"o}chige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegen{\"u}ber erh{\"o}hte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t und dreiw{\"o}chiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-st{\"u}ndiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, keine Erh{\"o}hung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. {\"U}ber die gesamte Dauer der Mutagenit{\"a}tstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsf{\"a}higkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen. Zusammenfassend best{\"a}tigen die durchgef{\"u}hrten Untersuchungen, dass die zellul{\"a}re COMT-Aktivit{\"a}t eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivit{\"a}t dieses Enzyms f{\"u}hrt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivit{\"a}t und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach k{\"o}nnte eine Reduktion der COMT-Aktivit{\"a}t durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen beg{\"u}nstigen.},
  subject      = {Mutagenit{\"a}t},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jarzina2022,
  author    = {Jarzina, Sebastian Oskar},
  title     = {Assessment of systemic toxicity in vitro using the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept: nephrotoxicity due to receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and inhibition of mtDNA polymerase-ɣ as case studies},
  doi       = {10.25972/OPUS-26484},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-264842},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {The US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP concept was ap-plied in this work to develop AOPs for proximal tubule injuries initiated by Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and Inhibition of mtDNA polymerase-. These AOPs were used as a mechanistic basis for the development of in vitro assays for each key event (KE). To experimentally support the developed in vitro assays, proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) were treated with model compounds. To measure the dis-turbance of lysosomal function in the AOP - Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload, polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide) were used as model compounds. Altered expression of lysosomal associated membrane protein 1/2 (LAMP-1/2) (KE1) and cathepsin D release from lysosomes (KE2) were determined by im-munofluorescence, while cytotoxicity (KE3) was measured using the CellTiter-Glo® cell via-bility assay. Importantly, significant differences in polymyxin uptake and susceptibility be-tween cell lines were observed, underlining the importance of in vitro biokinetics to determine an appropriate in vitro point of departure (PoD) for risk assessment. Compared to the in vivo situation, distinct expression of relevant transporters such as megalin and cubilin on mRNA and protein level in the used cell lines (RPTEC/TERT1 and NRK-52E) could not be con-firmed, making integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolations (QIVIVE) neces-sary. Integration of QIVIVE by project partners of the University of Utrecht showed an im-provement in the modelled biokinetic data for polymyxin B. To assess the first key event, (KE1) Depletion of mitochondrial DNA, in the AOP - Inhibition of mtDNA polymerase-, a RT-qPCR method was used to determine the mtDNA copy number in cells treated with mod-el compounds (adefovir, cidofovir, tenofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil fumarate). Mitochondrial toxicity (KE2) was measured by project partners using the high-content imaging technique and MitoTracker® whereas cytotoxicity (KE3) was determined by CellTiter-Glo® cell viability assay. In contrast to the mechanistic hypothesis underlying the AOP - Inhibition of mtDNA polymerase-, treatment with model compounds for 24 h resulted in an increase rather than a decrease in mtDNA copy number (KE1). Only minor effects on mitochondrial toxicity (KE2) and cytotoxicity (KE3) were observed. Treatment of RPT-EC/TERT1 cells for 14 days showed only a slight decrease in mtDNA copy number after treatment with adefovir dipivoxil and tenofovir disoproxil fumarate, underscoring some of the limitations of short-term in vitro systems. To obtain a first estimation for risk assessment based on in vitro data, potential points of departure (PoD) for each KE were calculated from the obtained in vitro data. The most common PoDs were calculated such as the effect concentra-tion at which 10 \% or 20_\% effect was measured (EC10, EC20), the highest no observed effect concentration (NOEC), the lowest observed effect concentration (LOEC), the benchmark 10 \% (lower / upper) concentrations (BMC10, BMCL10, BMCU10) and a modelled non-toxic con-centration (NtC). These PoDs were then compared with serum and tissue concentrations de-termined from in vivo studies after treatment with therapeutic / supratherapeutic doses of the respective drugs in order to obtain a first estimate of risk based on in vitro data. In addition, AOPs were used to test whether the quantitative key event relationships between key events allow prediction of downstream effects and effects on the adverse outcome (AO) based on measurements of an early key event. Predictions of cytotoxicity from the mathematical rela-tionships showed good concordance with measured cytotoxicity after treatment with colistin and polymyxin b nonapeptide. The work also revealed uncertainties and limitations of the ap-plied strategy, which have a significant impact on the prediction and on a risk assessment based on in vitro results.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schott2021,
  author    = {Schott, Lea Marie},
  title     = {In vitro Untersuchung zur Genotoxizit{\"a}t ausgew{\"a}hlter Pyrrolizidinalkaloide},
  doi       = {10.25972/OPUS-24171},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-241716},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Pyrrolizidinalkaloide (PA) sind sekund{\"a}re Pflanzenstoffe, welche {\"u}ber Nahrungsmittel in den menschlichen Organismus gelangen k{\"o}nnen. Zahlreiche Studien belegen, dass PA in der Leber verstoffwechselt und dabei in aktive genotoxische Metabolite umgewandelt werden. Diese verursachen vor allem in der Leber zellul{\"a}re Sch{\"a}den, was sich klinisch in Form einer hepatischen ven{\"o}sen okklusiven Leberkrankheit, aber auch in der Entstehung von Tumoren zeigt. Die vorliegende Arbeit testet das genotoxische Potential der drei PA Lasiocarpin, Senecionin und Seneciphyllin anhand der Leberzelllinie Huh6 mit Hilfe des Mikrokerntests. Dar{\"u}ber hinaus wird die Wirkung von Lasiocarpin auf den intrazellul{\"a}ren Glutathion-Gehalt, die Superoxidproduktion und das mitochondriale Membranpotential analysiert. Zudem werden sowohl der eventuell negative Einfluss einer Glutathion Depletion, als auch die m{\"o}glicherweise sch{\"u}tzenden Effekte des pflanzlichen Antioxidans Delphinidin in Bezug auf die Genotoxizit{\"a}t von Lasiocarpin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass alle drei ausgew{\"a}hlten PA einen signifikanten Anstieg der Mikrokernfrequenz bewirken.Unsere Messungen zeigten f{\"u}r Lasiocarpin eine dezente Reduktion des Glutathion Gehalts. Dagegen f{\"u}hrte eine Glutathion-Depletion in den Huh6 Zellen zu keiner Steigerung der Genotoxizit{\"a}t von Lasiocarpin. In Kombination mit dem Antioxidans Delphinidin zeigte sich f{\"u}r Lasiocarpin eine signifikante Reduktion der Mikrokernfrequenz. Abschließend ist anzumerken, dass in Zukunft vor allem die Wechselwirkung der PA untereinander und mit anderen (Pflanzen-)bestandteilen f{\"u}r eine verbesserte Risikoabsch{\"a}tzung der PA-Exposition untersucht werden sollte.},
  subject      = {Pyrrolizidinalkaloide},
  language  = {de}
}
@phdthesis{CalderonGiraldo2022,
  author    = {Calder{\´o}n Giraldo, Jeniffer},
  title     = {Analysis of estrogen profiles including methoxyestrogen glucuronides: method validation and applicability to human plasma and breast tissue},
  doi       = {10.25972/OPUS-20939},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-209396},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Estrogens, namely 17β-estradiol (E2) and estrone (E1) are considered to play an important role in the initiation and promotion of breast cancer (summarized in Raftogianis et al., 2000), a malignancy responsible for around 500,000 deaths per year (summarized in Ghislain et al., 2016). Two major mechanisms have been postulated to explain the carcinogenic effects of estrogens: (1) the estrogen receptor-mediated stimulation of breast cell proliferation with a concomitant enhanced rate of mutations and (2) the metabolism of hydroxylated estrogens to quinone derivatives which can react with the DNA (Russo and Russo, 2006, summarized in Yager and Davidson, 2006). Nevertheless, as a detoxifying mechanism, E1, E2, and their hydroxylated and methoxylated metabolites are reversibly conjugated into sulfates and glucuronides devoid of biological activity (summarized in Guillemette et al., 2004). Yet, despite the key detoxifying function of these conjugates, the study of their circulating levels face some significant problems: (1) analysis by techniques such as radioimmunoassay lack specificity and accuracy and requires enzymatic/chemical hydrolysis before analysis, being unable to differentiate between sulfates and glucuronides (summarized in Stanczyk et al., 2007, summarized in Wang et al., 2016), (2) very little knowledge in healthy women, which has been identified as a barrier to advance in breast cancer research (summarized in Liu, 2000), and (3) far fewer studies in pre- than in postmenopausal women (summarized in Samavat and Kurzer, 2015). Therefore, to get more insights into the research of breast cancer etiology and prevention, the analysis of circulating levels of estrogens (including metabolites and conjugates) in women without breast cancer through reliable analytical techniques, is required.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Mahdiani2017,
  author    = {Mahdiani, Maryam},
  title     = {Quantitative analysis of fatty acids, cholesterol and oxidation products thereof in human breast adipose tissues},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-156102},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {The aim of the present work was to determine the breast adipose tissue composition regarding fatty acids, cholesterol and (aut)oxidation products of cholesterol in women without breast cancer and to identify associated variables. Thus the necessary methods were optimized and validated where required and the breast adipose tissues of women without breast cancer were collected and analyzed. The gas chromatography with flame ionization detection was optimized for detection and separation of 37 relevant fatty acids. Fifty breast adipose tissues were analyzed using the optimized method. 26 fatty acids were detected in breast adipose tissues. The median proportion of saturated (sum of 11 fatty acids), monounsaturated (sum of 5 fatty acids), polyunsaturated (sum of 9 fatty acids) and one trans fatty acid were 34.6\%, 53.2\%, 12.1\% and 0.3\% respectively. Moreover, absolute levels of pentadecanoic acid (median: 0.37 mg/g, range: 0.08 - 1.31 mg/g), elaidic acid (median: 0.50 mg/g, range: 0.09 - 1.92 mg/g), linolenic acid (median: 0.88 mg/g, range: 0.10 - 3.06 mg/g) and docosahexaenoic acid (median: 0.31 mg/g, range: 0.04 - 1.80 mg/g) were determined in breast adipose tissues for the first time. These four fatty acids are indicative for consumption of dairy products, processed fats, vegetable oils such as flax seed oil and fish respectively. Furthermore, for the investigation of cholesterol in breast adipose tissues a gas chromatography was optimized and validated. The accuracies of the method in three independent spiked samples with low, medium and high levels of cholesterol were 99.1 ± 10.1\%, 87.0 ± 11.2\%, and 103.4 ± 4.6\% with precisions of 2.1, 2.1, and 0.8\% respectively. Using external calibration with internal standard cholesterol was quantified in samples (median: 1.1 mg/g, range: 0.7 - 1.5 mg/g). In order to detect (aut)oxidation products of cholesterol, gas chromatography coupled triple quadrupole mass spectrometry was optimized and validated. The accuracy was between 81.6\% and 115.7\% and precisions for low, medium and high oxy-cholesterols levels were below 10.0\%. The quantitative determination of (aut)oxidation products of cholesterol was established using external calibration with an internal standard. The most abundant oxy-cholesterol was 5,6β-Epoxy- (median: 147.2 ng/g, range: 25.7 - 624.2 ng/g), followed by 5,6α-Epoxy- (median: 34.6 ng/g, range: 9.9 - 124.7 ng/g), 7-Keto- (median: 19.1 ng/g, range: 7.9 - 220.6 ng/g), 7α-Hydroxy- (median: 10.2 ng/g, range: 3.8 - 111.3 ng/g) and 7β-Hydroxy-Cholesterol (median: 3.5 ng/g, range: 1.0 - 45.6 ng/g) respectively. Median oxy-cholesterol/cholesterol ratios ranged from 0.0001 (5,6β-Epoxy-Cholesterol) to 0.000003 (7β-Hydroxy-Cholesterol). Finally the associations between fatty acids, cholesterol and oxy-cholesterol were investigated using Spearman's rank correlation. Absolute levels of elaidic acid were positively correlated with levels of linolenic and docosahexaenoic acid (R = 0.79, 0.68, p < 0.01). Absolute levels of linolenic acid were positively associated with levels of docosahexaenoic acid (R = 0.81, p < 0.01). Moreover, relative proportions of saturated fatty acids capric, myristic, palmitic and stearic acid were negatively correlated with oleic acid (R = -0.36, -0.71, -0.65, -0.39, p < 0.05). Tissue levels of cholesterol were not correlated with levels of 5,6α/β-Epoxy-Cholesterols but were negatively associated with that of 7α-Hydroxy-, 7β-Hydroxy- and 7-Keto-Cholesterol (R = -0.29, -0.32, -0.29 p = 0.04, 0.02, 0.04). Levels of 7-Keto- and 7-Hydoxy-Cholesterol were strongly correlated with each other (R = 0.81, 0.91, p < 0.01) and, weaker, with 5,6α/β-Epoxy-Cholesterols (R = 0.60-0.70, p < 0.01). 5,6α/β-Epoxy-Cholesterols were associated positively with each other (R = 0.90, P < 0.01). Total oxy-cholesterol, 7β-Hydroxy-Cholesterol, and 5,6β-Epoxy-Cholesterol levels were correlated with relative proportions of elaidic acid (R = 0.30, 0.30, and 0.31 respectively, p = 0.04, 0.03, 0.03, respectively), whereas no correlation was observed between levels of oxy-cholesterols and relative proportion of pentadecanoic acid, linolenic acid and docosahexaenoic acid. Furthermore, Spearman's rank correlation was performed to investigate the relationship of fatty acids, cholesterol and oxy-cholesterol with age and body mass index. The relative proportions of total saturated fatty acids were negatively correlated with age (R = -0.47, p < 0.01) and body mass index (R = -0.29, p = 0.05). A positive significant correlation was observed between proportions of oleic acid and body mass index (R = 0.32, p = 0.02). There was no correlation between levels of cholesterol and body mass index or age. Likewise, no correlations of oxy-cholesterol levels with age or body mass index were observed. In sum, in this work the quantification methods of cholesterol and oxy-cholesterol were validated. The validation data met the criteria according to the FDA guideline. Using the validated methods the absolute levels of cholesterol and oxy-cholesterols were determined in breast adipose tissue of human females for the first time.},
  subject      = {Lebensmittelchemie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Jaud2023,
  author    = {Jaud, Tobias Armin},
  title     = {Application based personalized food choices and health sustainment: scientific background and investigation of biomarkers in human tissue specimens},
  doi       = {10.25972/OPUS-29864},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-298646},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Dietary fatty acids serve as objective biomarkers for the estimation of habitual diet mainly because biomarkers are free of memory bias or inaccuracies of food databases. The aim of the present work encompassed the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens, their analytical determination and statistical evaluation in two different study populations and different biospecimens as well as the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. The first aim was the identification of potential influence of fatty acid biomarkers on desaturase and elongase indexes (Δ9DI, Δ6DI, Δ5DI and ELOVLI5), which are factors in type 2 diabetes risk, in breast adipose tissue from healthy women. Influence of further variables on respective indexes was also investigated. 40 samples were investigated and potential variables were either collected by questionnaire or determined. Principle component analysis was applied for fatty acid biomarkers (PCdiet1, PCdiet2 and PCdiet3 representative for the dietary intake of vegetable oils/nuts, fish and partially hydrogenated vegetable oils), endogenous estrogens (PCE1) and oxysterols (PCOxy1). Multiple linear regression models were applied. Δ9DI and Δ6DI were influenced non-significantly and significantly negatively by PCdiet2 supporting a putative beneficial effect of vegetable oils and nuts on type 2 diabetes risk factors. ELOVLI5 and Δ5DI were influenced significantly and non-significantly positively by PCdiet1 supporting a putative beneficial effect of fish consumption on type 2 diabetes risk factors. On the other hand, PCdiet1 also significantly and non-significantly positively influenced Δ9DI and Δ6DI supporting a putative adverse effect of fish biomarkers on type 2 diabetes risk factors. The opposing influences of PCdiet1 suggesting an ambivalent role of dietary intake of fish on investigated indexes. Δ6DI was significantly positively influenced by PCdiet3 and number of pregnancies supporting a putative adverse effect of partially hydrogenated vegetable oils and pregnancies on type 2 diabetes risk factors. Lifestyle factors like smoking significantly and non-significantly influenced Δ9DI and Δ6DI putatively adversely. Δ5DI was influenced significantly positively by estrogen active drugs suggesting a putative beneficial effect on type 2 diabetes risk factors. It must be considered that a variation coefficient of up to 0.44 only explained 44\% of variance of the respective indexes, suggesting other influencing factors might play a role. The second aim was the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens. The method was optimized for separation and detection of 40 fatty acids. Mean recovery for tridecanoic acid was x(tridecanoic acid) = 90.51\% and for nonadecanoic acid x(nonadecanoic acid) = 96.21\%. Thus, there was no significant loss of fatty acids with shorter and longer carbon chains over the extraction process to be expected. Limit of detections were calculated in adipose tissue samples and ranged from 0.007 to 0.077\% of the proportion of the respective fatty acid to total fatty acids. The third aim was the investigation if differentiation between breast glandular and adipose tissue had a relevant impact on the analysis of dietary fatty acid biomarkers or if contamination of breast glandular with breast adipose tissue and vice versa was neglectable for the analysis of dietary fatty acid biomarkers. No statistical significant differences were observed for all investigated fatty acid biomarkers (pentadecanoic-, heptadecanoic-, trans palmitoleic-, eicosapentaenoic-, docosahexaenoic-, linoleic and α-linolenic acid) between breast glandular and adipose tissue. Thus, differentiation between breast glandular and adipose tissue seems not to be necessary for the analysis of fatty acids serving as biomarkers for the intake of specific food groups. Potential influence of mixed breast tissue on fatty acid biomarkers analysis seems to be neglectable. The fourth aim was the determination of fatty acid biomarkers in adipose tissue in another study population from healthy participants. 27 adipose tissue samples were analyzed. Milk and ruminant fat biomarkers exhibited proportions of 0.47\% for pentadecanoic acid, 0.34\% for heptadecanoic acid and 0.25\% for trans palmitoleic acid. Fish fatty acid biomarkers revealed proportions of 0.034\% for eicosapentaenoic acid and 0.061\% for docosahexaenoic acid. The mean proportion of vegetable oils and nuts biomarkers were 9.58\% for linoleic acid and 0.48\% for α-linolenic acid in all adipose tissues. Principle component analysis was applied for the fatty acid biomarkers to provide objective markers of habitual diet for this study population. PCdiet1 was mainly characterized by pentadecanoic acid, heptadecanoic acid and trans palmitoleic acid and therefore served as a principle component for the dietary intake of milk and ruminant fat. PCdiet2 and PCdiet3 only exhibited pattern for ω3 and ω6 fatty acids but not for dietary intake of specific food groups and could therefore not used as objective marker. PCdiet1, 2 and 3 explained 82.76\% of variance. The last aim of this thesis was the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. Scientific information on adverse reactions to food ingredients and trigger substances was provided in this thesis and possible implementation strategies were evaluated. For food allergens, which have regulatory requirements in the context of labelling, a strategy was elaborated, where it is necessary to provide information on the list of ingredients, the nexus 'contain' and the respective food allergen as well as information on the name of the product. For food intolerances, which do not have regulatory requirements, limits were shown in the context of the application. If the elaborated food intolerances shall be implemented into the application, a professional dietary concept has to be developed for every food intolerance because of the complexity of the implementation.},
  subject      = {Lebensmittelchemie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Eshun2023,
  author    = {Eshun, Guy},
  title     = {Functional properties and chemical constituents of eight underutilized Ghanaian legumes},
  doi       = {10.25972/OPUS-29927},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-299274},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {The aim of this study was to determine the potential of some Ghanaian underutilized legumes in helping to reduce the problems of poverty, hunger and malnutrition among the vulnerable group of the Ghanaian population. The study looked into the functional properties, fat and fatty acid distribution, raffinose, sucrose, glucose, fructose, calcium, magnesium, sodium, potassium, iron, copper, manganese, zinc, cyanide and isoflavone contents of raw and processed seed flours of Cajanus cajan, Canavalia ensiformis, Canavalia gladiata, Mucuna pruriens, Parkia biglobosa, Phaseolus lunatus and Vigna subterranea. The parameters mentioned above were also determined for raw fruit flour of Dialium guineense. In addition to these, the study also looked into the crude protein and starch contents of the raw and processed seed flours of Canavalia gladiata, Parkia biglobosa and Vigna subterranea. The obtained results suggest that the legumes may have untapped potential, which may be exploited to help assist in reducing hunger, malnutrition and poverty in Ghana. Results of the functional properties reveal that the legumes may serve useful roles in various food products. For instance, velvet tamarind (Dialium guineense) flour may be useful in infant food formulations because of it high solubility and low bulk density. African Locust bean (Parkia biglobosa) flour had the highest fat content among the studied flours, recording a fat content of approximately 14\%. It may therefore be economical to express the oil and use the oil as an edible oil or for industrial applications for products such as soaps, shampoos, paints, etc. This means the properties of the oil of African Locust bean flour need to be studied to know the uses of the oil. Unsaturated fatty acids in the cis configuration formed more than 50\% of the fatty acids in all the legumes. This observation coupled with the low sodium content of all the legumes suggest that these legumes may be suitable for consumption to prevent cardiovascular diseases. The daily nutrient needs of individuals can be met by the consumption of the appropriate amounts of these legumes. For example, 375.25 g of processed velvet beans (Mucuna pruriens) flour may be able to meet the adequate intake (AI) of 350 mg/day magnesium for adult males.},
  subject      = {H{\"u}lsenfr{\"u}chte},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dekant2024,
  author    = {Dekant, Raphael H.},
  title     = {Species-differences in the \(in\) \(vitro\) biotransformation of trifluoroethene (HFO-1123)},
  doi       = {10.25972/OPUS-31403},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-314035},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {1,1,2-trifluoroethene (HFO-1123) is intended for use as a refrigerant. Inhalation studies on HFO-1123 in rats suggested a low potential for toxicity, with no-observed-adverse-effect levels greater then 20,000 ppm. However, single inhalation exposure of Goettingen Minipigs and New Zealand White Rabbits resulted in mortality. It was assumed that conjugation of HFO-1123 with glutathione, via glutathione S-transferase, gives rise to S-(1,1,2-trifluoroethyl)-L-glutathione (1123-GSH), which is then transformed to the corresponding cysteine S-conjugate (S-(1,1,2-trifluoroethyl)-L-cysteine, 1123-CYS). Subsequent beta-lyase mediated cleavage of 1123-CYS may result in monofluoroacetic acid, a potent inhibitor of aconitase. Species-differences in 1123-GSH formation and 1123-CYS cleavage to MFA may explain species-differences in HFO-1123 toxicity. This study was designed to test the hypothesis, that GSH-dependent biotransformation and subsequent beta-lyase mediated formation of monofluoroacetic acid, a potent inhibitor of aconitase in the citric acid cycle, may play a key role in HFO-1123 toxicity and to evaluate if species-differences in the extent of MFA formation may account for the species-differences in HFO-1123 toxicity. The overall objective was to determine species-differences in HFO-1123 biotransformation in susceptible vs. less susceptible species and humans as a basis for human risk assessment. To this end, in vitro biotransformation of HFO-1123 and 1123-CYS was investigated in renal and hepatic subcellular fractions of mice, rats, humans, Goettingen Minipigs and NZW Rabbits. Furthermore, cytotoxicity and metabolism of 1123-CYS was assessed in cultured renal epithelial cells. Enzyme kinetic parameters for beta-lyase mediated cleavage of 1123-CYS in renal and hepatic cytosolic fractions were determined, and 19F-NMR was used to identify fluorine containing metabolites arising from 1123-CYS cleavage. Quantification of 1123-GSH formation in hepatic S9 fractions after incubation with HFO-1123 was performed by LC-MS/MS and hepatic metabolism of HFO-1123 was monitored by 19F-NMR. Rates of 1123-GSH formation were increased in rat, mouse and NZW Rabbit compared to human and Goettingen hepatic S9, indicating increased GSH dependent biotransformation in rats, mouse and NZW Rabbits. NZW Rabbit hepatic S9 exhibited increased 1123-GSH formation in the presence compared to the absence of acivicin, a specific gamma-GT inhibitor. This indicates increased gamma-GT mediated cleavage of 1123-GSH in NZW Rabbit hepatic S9 compared to the other species. 19F-NMR confirmed formation of 1123-GSH as the main metabolite of GSH mediated biotransformation of HFO-1123 in hepatic S9 fractions next to F-. Increased F- formation was detected in NZW Rabbit and Goettingen Minipig hepatic S9 in the presence of an NADPH regenerating system, indicating a higher rate of CYP-450 mediated metabolism in these species. Based on these findings, it is possible that CYP-450 mediated metabolism may contribute to HFO-1123 toxicity. In contrast to the increased formation of 1123-GSH in rat, mouse and NZW Rabbit hepatic S9 (compared to human and Goettingen Minipig), enzyme kinetic studies revealed a significantly higher beta-lyase activity towards 1123-CYS in renal cytosol of Goettingen Minipigs compared to cytosol from rats, mice, humans and NZW Rabbits. However, beta-lyase cleavage in renal NZW Rabbit cytosol was slightly increased compared to rat, mouse and human renal cytosols. 19F-NMR analysis confirmed increased time-dependent formation of MFA in renal Goettingen Minipig cytosol and NZW Rabbit (compared to human and rat cytosolic fractions). Three structurally not defined MFA-derivatives were detected exclusively in NZW Rabbit and Goettingen Minipig cytosols. Also, porcine kidney cells were more sensitive to cytotoxicity of 1123-CYS compared to rat and human kidney cells. Overall, increased beta-lyase mediate cleavage of 1123-CYS to MFA in Goettingen Minipig and NZW Rabbit kidney (compared to human and rat) may support the hypothesis that enzymatic cleavage by beta-lyases may account for the species-differences in HFO-1123 toxicity. However, the extent of GST mediated biotransformation in the liver as the initial step in HFO-1123 metabolism does not fully agree with this hypothesis, since 1123-GSH formation occurs at higher rates in rat, mouse and NZW Rabbit S9 as compared to the Goettingen Minipig. Based on the inconsistencies between the extent of GST and beta-lyase mediated biotransformation of HFO-1123 obtained by this study, a decisive statement about an increased biotransformation of HFO-1123 in susceptible species with a direct linkage to the species-specific toxicity cannot be drawn. Resulting from this, a clear and reliable conclusion regarding the risk for human health originating from HFO-1123 cannot be made. However, considering the death of Goettingen Minipigs and NZW Rabbits after inhalation exposure of HFO-1123 at concentrations great than 500 ppm and greater than 1250 ppm, respectively, this indicates a health concern for humans under peak exposure conditions. For a successful registration of HFO-1123 and its use as a refrigerant, further in vitro and in vivo investigations addressing uncertainties in the species-specific toxicity of HFO-1123 are urgently needed.},
  subject      = {Biotransformation},
  language  = {en}
}