@phdthesis{Lennartz2018,
  author    = {Lennartz, Simon},
  title     = {Tissue Engineering der menschlichen Speicheldr{\"u}se unter Verwendung von Epithel- und mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen auf einer Matrix aus dezellularisiertem Schweinedarm},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-164116},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {Eine ausgepr{\"a}gte Mundtrockenheit, Xerostomie, entsteht h{\"a}ufig durch eine irreversible Funktionseinschr{\"a}nkung der Speicheldr{\"u}sen. Diese ist unter anderem durch die Einnahme bestimmter Medikamente, Autoimmunerkrankungen, fortgeschrittenes Alter oder die Bestrahlungstherapie von Tumoren der Kopf-Hals-Region bedingt, wobei letztere eine der h{\"a}ufigsten Ursachen darstellt. Konsequenzen der eingeschr{\"a}nkten Dr{\"u}senfunktion sind herabgesetzte Speichelflussraten, eine Reduktion des Mund-pH-Werts, eine ver{\"a}nderte Elektrolyt- und Immunglobulin-Zusammensetzung des Speichels und somit eine Verringerung des Infektionsschutzes. Die resultierenden Komplikationen erstrecken sich von Karies und rezidivierenden Infektionen bis hin zu Pilzbesiedelungen der Mundschleimhaut. Diese schr{\"a}nken die Lebensqualit{\"a}t der Patienten stark ein und f{\"u}hren h{\"a}ufig zu Therapieunterbrechungen. Fast die H{\"a}lfte der Patienten leidet unter Depressionen oder psychischen Belastungszust{\"a}nden. Es gibt wenige Therapieans{\"a}tze zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie: Pilocarpin erh{\"o}ht zwar die Speichelflussraten, hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Lebensqualit{\"a}t. Die operative Translokation der Glandula submandibularis hat den Weg in die klinische Routine noch nicht gefunden, w{\"a}hrend die intensit{\"a}tsmodulierte Bestrahlung (IMRT) nicht f{\"u}r jeden Patienten geeignet ist; beide zeigen jedoch einen positiven Effekt auf die Lebensqualit{\"a}t. Gentechnische und stammzellbasierte Ans{\"a}tze zur Regeneration des Dr{\"u}sengewebes befinden sich im Experimentalstadium. Somit ergibt sich ein dringender Bedarf an innovativen Optionen zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie. Das Tissue Engineering, die Erstellung einer k{\"u}nstlichen Speicheldr{\"u}se aus k{\"o}rpereigenen Zellen, b{\"o}te hier ein potentielles Behandlungskonzept. Diese Studie soll deshalb untersuchen, ob humane Speicheldr{\"u}senepithelzellen (hSEZ) auf einer Matrix aus dezellularisiertem, porzinem Jejunum, der sogenannten Small intestinal submucosa + mucosa (SIS-muc), kultiviert werden k{\"o}nnen. K{\"o}nnen die Zellen innerhalb der Wachstumsperiode wichtige physiologische Differenzierungsmarker beibehalten? Kann die Produktion von α-Amylase, einem der wichtigsten Enzyme des menschlichen Speichels, erhalten werden? Welchen Einfluss hat die Kokultur mit mikrovaskul{\"a}ren Endothelzellen (mvEZ)? Und zuletzt: Ist dezellularisierter Schweinedarm eine potentiell geeignete Matrix f{\"u}r das Tissue Engineering der menschlichen Speicheldr{\"u}se? Zun{\"a}chst erfolgte die Entnahme von humanem Speicheldr{\"u}sengewebe, woraus hSEZ isoliert wurden. Diese wurden dann sowohl in Mono- als auch in Kokultur mit mvEZ auf die SIS-muc aufgebracht und auf dieser kultiviert. Die SIS-muc wurde aus kurzen Schweinedarm-Segmenten gewonnen, die in einem mehrstufigen Verfahren dezellularisiert wurden. Die besiedelte SIS-muc wurde mittels konventioneller sowie Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen, Raster- und Transmissionsektronenmikroskopie (REM/TEM) sowie quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) untersucht, dar{\"u}ber hinaus erfolgte die Messung der α-Amylase-Enzymaktivit{\"a}t. Histologisch sowie in der REM zeigte sich sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur eine konfluente Besiedelung der SIS-muc mit hSEZ. In der Kokultur formten mvEZ einen Monolayer auf der serosalen Matrixseite. Bei der Charakterisierung der hSEZ zeigte sich in den Immunfluoreszenzaufnahmen eine starke Auspr{\"a}gung von Zytokeratin, α-Amylase und Aquaporin-5 und eine moderate Auspr{\"a}gung von Claudin-1. Bei der Untersuchung der Funktion der α-Amylase konnte in der Kokultur von hSEZ mit mvEZ eine im Gegensatz zur Mono- und 2D-Kultur signifikant erh{\"o}hte Enzymaktivit{\"a}t der α-Amylase nachgewiesen werden. In der qPCR-Analyse der α-Amylase-Genexpression war die 3D-Kultur der 2D-Kultur {\"u}berlegen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Kultur von hSEZ auf der SIS-muc m{\"o}glich ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zellen in 3D-Kultur spezifische Differenzierungsmerkmale beibehalten, die in der 2D-Kultur teils verloren gehen und dass hSEZ in Kokultur mit mvEZ eine gegen{\"u}ber der Monokultur signifikant erh{\"o}hte Produktion von α-Amylase aufweisen. Diese Arbeit liefert die Datengrundlage f{\"u}r zuk{\"u}nftige Studien im dynamischen Bioreaktor-Modell (BioVaSc), die auf dem Weg zur klinischen Translation notwendig sind. Somit stellt sie einen wichtigen Schritt in Richtung einer auf Tissue Engineering basierten Therapie der belastenden Xerostomie dar.},
  subject      = {Tissue Engineering},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stebani2020,
  author    = {Stebani, Tanja Veronika},
  title     = {Tissue Engineering von Fettgewebe: Immunohistochemische und histologische Analyse der Entwicklung der Extrazellul{\"a}rmatrix und der Adipogenese in 3D Gewebekonstrukten in vivo},
  doi       = {10.25972/OPUS-21537},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-215375},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Die Erzeugung von klinisch in der plastischen und rekonstruktiven Chirurgie nutzbarem Fettgewebe stellt einen sehr wichtigen Aspekt in aktuellen Arbeiten des Tissue Engineerings, also der Erzeugung von spezifischem Gewebe aus Spenderzellen dar. Sollte es gelingen, aus patienteneigenen Zellen wieder neues Gewebe zu z{\"u}chten, so w{\"u}rden daraus eine F{\"u}lle neuer Behandlungsm{\"o}glichkeiten f{\"u}r Gewebedefekte resultieren. In einer Vorg{\"a}ngerarbeit zu der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Adipogenese in vivo von Fettgewebe aus Vorl{\"a}uferzellen, den Pr{\"a}adipozyten, durch geeignete Methoden der Vorkultivierung in vitro beeinflusst werden kann. Die Unterschiede in der Vorbehandlung lagen in einer Induktion der Differenzierung der Pr{\"a}adipozyten bei gleichzeitigem Stopp der Proliferation und einer anschließenden verschieden langen Ausdifferenzierungsphase der Zellen in vitro im Brutschrank. Die resultierenden Konstrukte wurden in jeweils drei M{\"a}use in vier Gruppen implantiert und nach 1, 5, 12 und 24 Wochen entnommen und untersucht. W{\"a}hrend die Pr{\"a}adipozyten von Gruppe 1 keine Induktion erfuhren, erfolgte diese bei den anderen drei Gruppen. Die Konstrukte der Gruppe 2 wurden dann bereits nach 2 Tagen der Induktion der Pr{\"a}adipozyten implantiert, die Konstrukte der Gruppe 3 blieben zur Differenzierung noch 7 Tage, die der Gruppe 4 noch 33 Tage im Brutschrank, bevor sie in die Versuchstiere eingebracht wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zun{\"a}chst, an den Gewebekonstrukten der Vorg{\"a}ngerarbeit eine histomorphometrische Analyse der resultierenden Adipozyten in vivo {\"u}ber die Zeit durchzuf{\"u}hren, um eine detaillierte Beurteilung des Verlaufs der Fettgewebeentwicklung anhand resultierender Zellzahlen darzustellen. Hierf{\"u}r wurden die Gewebed{\"u}nnschnitte der M{\"a}use nach einer HE-Anf{\"a}rbung mikroskopisch untersucht und die Zellzahlen resultierend jeweils aus unreifen und reifen Adipozyten histomorphometrisch quantifiziert. Die Unterscheidung erfolgte mittels einer Gr{\"o}ßenzuordnung, wobei Zellen kleiner 20 µm Durchmesser den unreifen und Zellen gr{\"o}ßer 20 µm Durchmesser den reifen Adipozyten zugeordnet wurden. Aus der quantitativen Analyse mittels Histomorphometrie ergab sich, dass in allen Konstrukten die Zahlen an Zellen der den unreifen Adipozyten zugeordneten Gr{\"o}ßenordnung von kleiner als 20µm tendenziell w{\"a}hrend der gesamten Zeit in vivo klein bleibt. Die Zellzahlen resultierend aus großen Zellen mit einem Durchmesser mehr als 20µm, die den reifen Adipozyten zugeordnet wurden, steigen dagegen in allen Proben leicht an, wobei die Konstrukte der Gruppe 4 den absolut h{\"o}chsten Wert aufwiesen. In der HE-Anf{\"a}rbung ist demgem{\"a}ß in Gruppe 4 eine Vielzahl reifer Adipozyten zu erkennen. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, durch Anf{\"a}rbung charakteristischer Proteine der extrazellul{\"a}ren Matrix mittels markierter Antik{\"o}rper und einer anschließenden immunohistochemischen Analyse des Verlaufs der Signalintensit{\"a}t dieser markierten Komponenten in der EZM die Adipogenese mittels Analyse der entstehenden Ger{\"u}stproteine zu verfolgen. Hierf{\"u}r wurde durch eine umfangreiche immunohistochemische Analyse die Bildung der Kollagene I, IV und VI sowie von Laminin als Bestandteile der EZM analysiert und damit die Art und der Umfang der entstandenen extrazellul{\"a}ren Matrix w{\"a}hrend der Adipogenese qualitativ beurteilt. Die Fluoreszenz-Bilder der Proben nach den jeweiligen Gruppen und Wochen in vivo zeigen einen deutlichen Hinweis im Sinne der Bildung von Fettgewebe in den Gewebe-Konstrukten der Gruppe 4. W{\"a}hrend in den Gruppen 1 und 2 fast durchweg faserartige Bindegewebsstrukturen, verbunden mit den entsprechenden eher fibrill{\"a}rem Aussehen der Signale f{\"u}r die untersuchten Kollagene I, IV, VI und f{\"u}r Laminin gefunden werden konnten, zeigen die Konstrukte der Gruppe 3 und insbesondere von Gruppe 4 in den Fluoreszenz-Abbildungen deutlich ausgepr{\"a}gtere, netzartig ausgebildete Strukturen. Aus den Resultaten der vorliegenden Arbeit kann demnach geschlossen werden, dass die Art der Vorkultivierung eine sp{\"a}tere Adipogenese eindeutig beeinflussen kann. Eine l{\"a}ngere Inkubationszeit nach erfolgter Induktion der Pr{\"a}adipozyten zur F{\"o}rderung der Reifung zu Adipozyten vor der Implantation f{\"o}rdert die Bildung einer h{\"o}heren Anzahl von Adipozyten und die Ausbildung einer charakteristischen EZM. Diese Erkenntnisse er{\"o}ffnen f{\"u}r zuk{\"u}nftige Arbeiten die M{\"o}glichkeit, durch die weitere Optimierung der Vorkultivierung, verbunden mit einer eventuell noch besseren {\"U}berlebensrate der urspr{\"u}nglich eingebrachten Zellen, die Herstellung von klinisch geeigneten Konstrukten aus Fettgewebe weiter voranzutreiben.},
  subject      = {Tissue Engineering},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fey2022,
  author    = {Fey, Christina},
  title     = {Establishment of an intestinal tissue model for pre-clinical screenings},
  doi       = {10.25972/OPUS-24410},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-244107},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {The small intestine represents a strong barrier separating the lumen from blood circulation thereby playing a major role in the absorption and the transport of pharmacological agents prior to their arrival on the respective target site. In order to gain more knowledge about specialized uptake mechanisms and risk assessment for the patient after oral admission of drugs, intestinal in vitro models demonstrating a close similarity to the in vivo situation are needed. In the past, cell line-based in vitro models composed of Caco-2 cells cultured on synthetic cell carriers represented the "gold standard" in the field of intestinal tissue engineering. Expressive advantages of these models are a reproducible, cost-efficient and standardized model set up, but cell function can be negatively influenced by the low porosity or unwanted molecular adhesion effects of the artificial scaffold material. Natural extracellular matrices (ECM) such as the porcine decellularized small intestinal submucosa (SIS) are used as alternative to overcome some common drawbacks; however, the fabrication of these scaffolds is time- and cost-intensive, less well standardized and the 3Rs (replacement, reduction, refinement) principle is not entirely fulfilled. Nowadays, biopolymer-based scaffolds such as the bacterial nanocellulose (BNC) suggest an interesting option of novel intestinal tissue engineered models, as the BNC shows comparable features to the native ECM regarding fiber arrangement and hydrophilic properties. Furthermore, the BNC is of non-animal origin and the manufacturing process is faster as well as well standardized at low costs. In this context, the first part of this thesis analyzed the BNC as alternative scaffold to derive standardized and functional organ models in vitro. Therefore, Caco-2 cells were cultured on two versions of BNC with respect to their surface topography, the unmodified BNC as rather smooth surface and the surface-structured BNC presenting an aligned fiber arrangement. As controls, Caco-2 in vitro models were set up on PET and SIS matrices. In this study, the BNC-based models demonstrated organ-specific properties comprising typical cellular morphologies, a characteristic tight junction protein expression profile, representative ultrastructural features and the formation of a tight epithelial barrier together with a corresponding transport activity. In summary, these results validated the high quality of the BNC-based Caco-2 models under cost-efficient conditions and their suitability for pre-clinical research purposes. However, the full functional diversity of the human intestine cannot be presented by Caco-2 cells due to their tumorigenic background and their exclusive representation of mature enterocytes. Next to the scaffold used for the setup of in vitro models, the cellular unit mainly drives functional performance, which demonstrates the crucial importance of mimicking the cellular diversity of the small intestine in vitro. In this context, intestinal primary organoids are of high interest, as they show a close similarity to the native epithelium regarding their cellular diversity comprising enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, paneth cells, transit amplifying cells and stem cells. In general, such primary organoids grow in a 3D Matrigel® based environment and a medium formulation supplemented with a variety of growth factors to maintain stemness, to inhibit differentiation and to stimulate cell migration supporting long term in vitro culture. Intestinal primary spheroid/organoid cultures were set up as Transwell®-like models on both BNC variants, which resulted in a fragmentary cell layer and thereby unfavorable properties of these scaffold materials under the applied circumstances. As the BNC manufacturing process is highly flexible, surface properties could be adapted in future studies to enable a good cell adherence and barrier formation for primary intestinal cells, too. However, the application of these organoid cultures in pre-clinical research represents an enormous challenge, as the in vitro culture is complex and additionally time- and cost-intensive. With regard to the high potential of primary intestinal spheroids/organoids and the necessity of a simplified but predictive model in pre-clinical research purposes, the second part of this thesis addressed the establishment of a primary-derived immortalized intestinal cell line, which enables a standardized and cost-efficient culture (including in 2D), while maintaining the cellular diversity of the organoid in vitro cultures. In this study, immortalization of murine and human intestinal primary organoids was induced by ectopic expression of a 10- (murine) or 12 component (human) pool of genes regulating stemness and the cell cycle, which was performed in cooperation with the InSCREENeX GmbH in a 2D- and 3D-based transduction strategy. In first line, the established cell lines (cell clones) were investigated for their cell culture prerequisites to grow under simplified and cost-efficient conditions. While murine cell clones grew on uncoated plastic in a medium formulation supplemented with EGF, Noggin, Y-27632 and 10\% FCS, the human cell clones demonstrated the necessity of a Col I pre coating together with the need for a medium composition commonly used for primary human spheroid/organoid cultures. Furthermore, the preceding analyses resulted in only one human cell clone and three murine cell clones for ongoing characterization. Studies regarding the proliferative properties and the specific gene as well as protein expression profile of the remaining cell clones have shown, that it is likely that transient amplifying cells (TACs) were immortalized instead of the differentiated cell types localized in primary organoids, as 2D, 3D or Transwell®-based cultures resulted in slightly different gene expression profiles and in a dramatically reduced mRNA transcript level for the analyzed marker genes representative for the differentiated cell types of the native epithelium. Further, 3D cultures demonstrated the formation of spheroid-like structures; however without forming organoid-like structures due to prolonged culture, indicating that these cell populations have lost their ability to differentiate into specific intestinal cell types. The Transwell®-based models set up of each clone exhibit organ-specific properties comprising an epithelial-like morphology, a characteristic protein expression profile with an apical mucus-layer covering the villin-1 positive cell layer, thereby representing goblet cells and enterocytes, together with representative tight junction complexes indicating an integer epithelial barrier. The proof of a functional as well as tight epithelial barrier in TEER measurements and in vivo-like transport activities qualified the established cell clones as alternative cell sources for tissue engineered models representing the small intestine to some extent. Additionally, the easy handling and cell expansion under more cost-efficient conditions compared to primary organoid cultures favors the use of these newly generated cell clones in bioavailability studies. Altogether, this work demonstrated new components, structural and cellular, for the establishment of alternative in vitro models of the small intestinal epithelium, which could be used in pre-clinical screenings for reproducible drug delivery studies.},
  subject      = {D{\"u}nndarm},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Muehlemann2018,
  author    = {M{\"u}hlemann, Markus},
  title     = {Intestinal stem cells and the Na\(^+\)-D-Glucose Transporter SGLT1: potential targets regarding future therapeutic strategies for diabetes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-169266},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2018},
  abstract  = {The pancreas and the small intestine are pivotal organs acting in close synergism to regulate glucose metabolism. After absorption and processing of dietary glucose within the small intestine, insulin and glucagon are released from pancreatic islet cells to maintain blood glucose homeostasis. Malfunctions affecting either individual, organ-specific functions or the sophisticated interplay of both organs can result in massive complications and pathologic conditions. One of the most serious metabolic diseases of our society is diabetes mellitus (DM) that is hallmarked by a disturbance of blood glucose homeostasis. Type 1 (T1DM) and type 2 (T2DM) are the main forms of the disease and both are characterized by chronic hyperglycemia, a condition that evokes severe comorbidities in the long-term. In the past, several standard treatment options allowed a more or less adequate therapy for diabetic patients. Albeit there is much effort to develop new therapeutic interventions to treat diabetic patients in a more efficient way, no cure is available so far. In view of the urgent need for alternative treatment options, a more systemic look on whole organ systems, their biological relation and complex interplay is needed when developing new therapeutic strategies for DM. T1DM is hallmarked by an autoimmune-mediated destruction of the pancreatic β-cell mass resulting in a complete lack of insulin that is in most patients restored by applying a life-long recombinant insulin therapy. Therefore, novel regenerative medicine-based concepts focus on the derivation of bioartificial β-like cells from diverse stem cell sources in vitro that survive and sustain to secrete insulin after implantation in vivo. In this context, the first part of this thesis analyzed multipotent intestinal stem cells (ISCs) as alternative cell source to derive bioartificial, pancreatic β-like cells in vitro. From a translational perspective, intestinal stem cells pose a particularly attractive cell source since intestinal donor tissues could be obtained via minimal invasive endoscopy in an autologous way. Furthermore, intestinal and pancreatic cells both derive from the same developmental origin, the endodermal gut tube, favoring the differentiation process towards functional β-like cells. In this study, pancreas-specific differentiation of ISCs was induced by the ectopic expression of the pancreatic transcription factor 1 alpha (Ptf1a), a pioneer transcriptional regulator of pancreatic fate. Furthermore, pancreatic lineage-specific culture media were applied to support the differentiation process. In general, ISCs grow in vitro in a 3D Matrigel®-based environment. Therefore, a 2D culture platform for ISCs was established to allow delivery and ectopic expression of Ptf1a with high efficiency. Next, several molecular tools were applied and compared with each other to identify the most suitable technology for Ptf1a delivery and expression within ISCs as well as their survival under the new established 2D conditions. Success of differentiation was investigated by monitoring changes in cellular morphology and induction of pancreatic differentiation-specific gene expression profiles. In summary, the data of this project part suggest that Ptf1a harbors the potential to induce pancreatic differentiation of ISCs when applying an adequate differentiation media. However, gene expression analysis indicated rather an acinar lineage-determination than a pancreatic β-cell-like specification. Nevertheless, this study proved ISCs not only as interesting stem cell source for the generation of pancreatic cell types with a potential use in the treatment of T1DM but alsoPtf1a as pioneer factor for pancreatic differentiation of ISCs in general. Compared to T1DM, T2DM patients suffer from hyperglycemia due to insulin resistance. In T2DM management, the maintenance of blood glucose homeostasis has highest priority and can be achieved by drugs affecting the stabilization of blood glucose levels. Recent therapeutic concepts are aiming at the inhibition of the intestinal glucose transporter Na+-D-Glucose cotransporter 1 (SGLT1). Pharmacological inhibition of SGLT1 results in reduced postprandial blood glucose levels combined with a sustained and increased Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) secretion. So far, systemic side effects of this medication have not been addressed in detail. Of note, besides intestinal localization, SGLT1 is also expressed in various other tissues including the pancreas. In context of having a closer look also on the interplay of organs when developing new therapeutic approaches for DM, the second part of this thesis addressed the effects on pancreatic islet integrity after loss of SGLT1. The analyses comprised the investigation of pancreatic islet size, cytomorphology and function by the use of a global SGLT1 knockout (SGLT1-/-) mouse model. As SGLT1-/- mice develop the glucose-galactose malabsorption syndrome when fed a standard laboratory chow, these animals derived a glucose-deficient, fat-enriched (GDFE) diet. Wildtype mice on either standard chow (WTSC) or GDFE (WTDC) allowed the discrimination between diet- and knockout-dependent effects. Notably, GDFE fed mice showed decreased expression and function of intestinal SGLT1, while pancreatic SGLT1 mRNA levels were unaffected. Further, the findings revealed increased isled sizes, reduced proliferation- and apoptosis rates as well as an increased α-cell and reduced β-cell proportion accompanied by a disturbed cytomorphology in islets when SGLT1 function is lost or impaired. In addition, pancreatic islets were dysfunctional in terms of insulin- and glucagon-secretion. Moreover, the release of intestinal GLP-1, an incretin hormone that stimulates insulin-secretion in the islet, was abnormal after glucose stimulatory conditions. In summary, these data show that intestinal SGLT1 expression and function is nutrient dependent. The data obtained from the islet studies revealed an additional and new role of SGLT1 for maintaining pancreatic islet integrity in the context of structural, cytomorphological and functional aspects. With special emphasis on SGLT1 inhibition in diabetic patients, the data of this project indicate an urgent need for analyzing systemic side effects in other relevant organs to prove pharmacological SGLT1 inhibition as beneficial and safe. Altogether, the findings of both project parts of this thesis demonstrate that focusing on the molecular and cellular relationship and interplay of the small intestine and the pancreas could be of high importance in context of developing new therapeutic strategies for future applications in DM patients.},
  subject      = {Stammzelle},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Strulik2021,
  author    = {Strulik, Jonas},
  title     = {Aufbau, Charakterisierung und Validierung eines in vitro Zellkulturmodells des pankreatischen Adenokarzinoms},
  doi       = {10.25972/OPUS-24496},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-244963},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Da in den letzten Jahrzehnten nur geringf{\"u}gige Verbesserungen der {\"U}berlebensraten bei an einem Pankreaskarzinom erkrankten Patienten erzielt wurden, besteht ein dringender klinischer Bedarf f{\"u}r die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Dreidimensionale in vitro Modelle sind f{\"u}r das Screening und die Validierung von Therapeutika essenziell. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels der Methoden des Tissue Engineerings ein biolumineszenzbasiertes dreidimensionales in vitro Testsystem des pankreatischen Karzinoms aufgebaut und charakterisiert werden. F{\"u}r die Detektion von LumineszenzIntensit{\"a}ten wurde die pankreatische Krebszelllinie PANC-1 zuvor mit firefly luciferase (FLUC) transduziert. PANC-1 FLUC Zellen wurden auf porziner Pankreasmatrix (PanMa) und D{\"u}nndarmmatrix (SISser) kultiviert, um den Einfluss unterschiedlicher Matrizen auf das Verhalten der Zellen im Tumormodell zu untersuchen. Dar{\"u}ber hinaus wurden in dieser Arbeit die PANC-1 FLUC mit einem Standardtherapeutikum der Pankreaskarzinomtherapie, Gemcitabin, behandelt und die Wirkung mittels biolumineszenbasierter Bildgebung detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Lumineszenz-Intensit{\"a}t von PANC-1 FLUC Zellen einer bestimmten Zellzahl durch biolumineszenzbasierte Messverfahren zugeordnet werden kann. Weiter wurde nachgewiesen, dass die Extrazellul{\"a}rmatrix einen Einfluss auf die Expression tumorspezifischer Marker hat und PANC-1 FLUC Zellen ein unterschiedlich invasives Wachstum auf organspezifischen Matrizen aufweisen. Die Wirkung von Gemcitabin auf die Tumorzellen kann durch das hier vorgestellte biolumineszenzbasierte Messverfahren detektiert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse sind die Grundlage f{\"u}r die weitere Validierung eines biolumineszenzbasierten dreidimemsionalen in vitro Testystems des pankreatischen Karzinoms f{\"u}r die pr{\"a}klinische Erforschung neuartiger Therapiestrategien.},
  subject      = {Zellkulturmodell},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stroehle2020,
  author    = {Str{\"o}hle, Serge - Peer},
  title     = {Kultivierung von humanem Speicheldr{\"u}sengewebe in einer dreidimensionalen Polyurethanmatrix},
  doi       = {10.25972/OPUS-21688},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-216887},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Bei Tumoren von Kopf und Hals kann prim{\"a}r oder adjuvant durch Bestrahlung therapiert werden. Die Folgen dieser Behandlung k{\"o}nnen Xerostomie, Karies, Infektionen, Dysphagie oder Mundgeruch sein. Diese Nebenwirkungen vermindern die Lebensqualit{\"a}t des Patienten. Unterschiedliche Behandlungsans{\"a}tze haben aufgrund von therapiebedingten Einschr{\"a}nkungen nicht den Weg in den klinischen Alltag gefunden. Eine Alternative zu den vorhandenen Behandlungsans{\"a}tzen kann das Tissue Engineering sein. Das Ziel einer Normalisierung der Speichelproduktion nach Behandlung soll durch eine implantierbare, k{\"u}nstliche Speicheldr{\"u}se erreicht werden. Kann humanes natives Speicheldr{\"u}sengewebe der Parotis auf gradientenfreiem dreidimensional aufgebauten Polyurethan wachsen und seine Funktionalit{\"a}t beibehalten? Humane Parotiszellen wurden von 20 Patienten im Alter von 42 - 90 Jahren durch Operation entnommenen und in Polystyrol-Zellkulturflaschen mit dem N{\"a}hrmedium BEGM herangez{\"u}chtet. Es erfolgte eine 2D-Zellverteilung der reinen Parotiskultur. Zur Kontrolle der Vitalit{\"a}t zwischen den Passagen wurde eine Trypan-Blau F{\"a}rbung verwendet. Als Tr{\"a}germaterial der Zellen wurde eine biokompatible, abbaubare Matrix aus ε-Polycaprolacton verarbeitet. Die {\"U}bertragung der humanen Parotiszellen wurde mit einer Kleberproteinl{\"o}sung, bestehend aus den Hauptbestandteilen Aprotinin, Fibrinogen und der Thrombinl{\"o}sung durchgef{\"u}hrt. 7,14 und 21 Tage nach Aufbringung wurde der {\"U}berstand der zeitgleich entnommenen Konstrukte zur {\"U}berpr{\"u}fung des α-Amylase konserviert. Zus{\"a}tzlich wurden an den 3 Untersuchungstagen Konstrukte f{\"u}r die Anfertigung von histologischen Schnitten, quantitativer PCR, indirekter Immunfluoreszenz und zur Elektronenmikroskopie entnommen. Zur {\"U}berpr{\"u}fung der Funktionalit{\"a}t der angez{\"u}chteten Speicheldr{\"u}senzellen wurde das Enzym α-Amylase und das Wasserkanalprotein Aquaporin 5 herangezogen. Bei der Kultivierung der humanen Speicheldr{\"u}senzellen konnte durch den Vitalit{\"a}tstest Trypan-Blau F{\"a}rbung in Kombination mit einer Neubauerz{\"a}hlkammer eine konstant hohe Anzahl an vitalen Zellen bis zur 4. Passage nachgewiesen werden. Durch die Lebend/Tot F{\"a}rbung auf FDA/EB Basis der Konstrukte {\"u}ber die Untersuchungszeit von 14 Tagen konnte keine Vermehrung von avitalen Zellen mikroskopisch festgestellt werden. Die statistische Auswertung mittels Boxplots des ELISA berechnete f{\"u}r den ersten Untersuchungstag einen Median auf niedrigem Niveau von 4,4 U/l und sank im weiteren Zeitverlauf am Untersuchungstag 21 auf die niedrigsten Median von 2,2 U/l ab. α-Amylase konnte an allen 3 Tagen mittels quantitativer PCR und indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Aquaporin 5 als Funktionsnachweis war in der vorliegenden Studie nicht signifikant durch quantitative PCR beweisbar. Die Rasterelektronenmikroskopie bildete adh{\"a}rente Zellen in kugeliger Form aus den besiedelten Matrices nach 7 Tagen Kultivierung ab. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie konnten Zellen, die Zellforts{\"a}tze ausgebildet hatten nach 14 Tagen beobachtet werden. Der Versuch, histologische Schnitte auf Grundlage der Paraffineinbettung oder Kryo-Konservierung zu erzeugen, musste frustran abgeschlossen werden. Eine Kultivierung von Speicheldr{\"u}senzellen auf einer Matrix aus ε-Polycaprolacton ohne Gradienten ist eingeschr{\"a}nkt umsetzbar. Die Studie konnte zeigen, dass das Wachstum der Zellen auf konstant niedrigem Niveau {\"u}ber den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen lag. Der Funktionsnachweis von α-Amylase auf absinkendem niedrigem Niveau sowie fehlender Best{\"a}tigung von Aquaporin 5 kann als station{\"a}re Phase des Wachstums interpretiert werden. Zur Verbesserung der Zellentwicklung sollte die besiedelte Matrix zu einem 3D-Zellwachstum anregen. Bei sequenziell entstehender Polarit{\"a}t der Zellen k{\"a}me es zu einer Verbesserung der Vitalit{\"a}t sowie der vermehrten Ausbildung von α-Amylase und Aquaporin 5. Dies k{\"o}nnte in einer Kombination der Zellkultur aus Parotiszellen mit Kokulturen aus humanen Myoepithelzellen und Parenchymzellen erreicht werden. Sehr gute Ergebnisse des Zellwachstums und der Zellfunktion konnten aktuell in anderen Studien auf der Tr{\"a}gersubstanz Matrigel oder durch Rebesiedelung von dezellularisierten Organen beobachtet werden.},
  subject      = {Ohrspeicheldr{\"u}se},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Berger2023,
  author    = {Berger, Constantin},
  title     = {Influence of the pancreatic extracellular matrix on pancreatic differentiation of human induced pluripotent stem cells and establishment of 3D organ models},
  doi       = {10.25972/OPUS-24126},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-241268},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {Der Diabetes mellitus bezeichnet eine bislang unheilbare, metabolische Erkrankung, die mit schwerwiegenden Folgeerkrankungen einhergeht. Unter den potentiellen Strategien zur Heilung von Diabetes mellitus stellt die in vitro Generierung adulter β-Zellen des endokrinen Pankreas aus humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPS) einen vielversprechenden Ansatz dar. Zwar erm{\"o}glichen bisherige Protokolle die Herstellung von Zellen mit einem β-Zell-{\"a}hnlichen Charakter, jedoch zeigen diese eine zun{\"a}chst eingeschr{\"a}nkte Funktion, die sich erst im Verlauf einer vollst{\"a}ndigen, durch Transplantation induzierten, Reifung der Zellen, normalisiert. Vorangegangene Studien zeigen, dass sich die Extrazellularmatrix (EZM) von Geweben positiv auf das {\"U}berleben und die Funktion adulter, isolierter Langerhans-Inseln des Pankreas auswirkt. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, ob Einfl{\"u}sse der organspezifischen EZM die finale Reifung in vitro hergestellter β-Zellen herbeif{\"u}hren k{\"o}nnen. Um diese Hypothese zu testen, wurde im Rahmen der vorliegenden Studie die Wirkung der pankreatischen EZM auf die in vitro Differenzierung von hiPS zu endokrinen Zellen des Pankreas untersucht sowie die Eignung der pankreatischen EZM zur Etablierung eines Organmodells des endokrinen Pankreas erprobt. Hierzu wurde zun{\"a}chst eine pankreasspezifische EZM-Tr{\"a}gerstruktur (PanMa) durch Dezellularisierung von Pankreaten des Schweins mittels Natriumdesoxycholat hergestellt. Die generierte PanMa wurde anhand (immun-) histologischer F{\"a}rbungen, Rasterelektronen-mikroskopie, Feststellung des DNA-Gehalts sowie durch Versuche zur Perfusion und Wiederbesiedelung mit Endothelzellen eingehend charakterisiert. Zudem wurde auf Basis der ermittelten Daten ein Bewertungssystem (PancScore) zur standardisierten Herstellung der PanMa entwickelt. Als N{\"a}chstes wurde untersucht, ob die PanMa {\"u}ber gewebespezifische EZM-Merkmale verf{\"u}gt. Zu diesem Zweck wurden biophysikalische und strukturelle Eigenschaften wie Festigkeit, Porosit{\"a}t und Hygroskopie mittels rheologischer Messungen sowie Versuchen zur Teilchendiffusion und zum Wasserbindungsverhalten bestimmt und mit azellul{\"a}ren EZMs des D{\"u}nndarms (SISser) und der Lunge (LungMa) verglichen. Nach der eingehenden Analyse der PanMa wurde deren Effekt auf die Eigenschaften von Stammzellen sowie auf fr{\"u}he Stadien der Stammzellentwicklung untersucht. Hierzu wurde die PanMa als Tr{\"a}gerstruktur w{\"a}hrend der Erhaltung sowie der spontanen Differenzierung von hiPS verwendet und der Einfluss der PanMa anhand von Genexpressionsanalysen und immunhistochemischer F{\"a}rbungen analysiert. In einem n{\"a}chsten Schritt wurde die Wirkung der PanMa auf die Differenzierung von hiPS zu endokrinen Zellen des Pankreas untersucht. Hierf{\"u}r wurde die PanMa zum einen in fl{\"u}ssiger Form als Mediumzusatz sowie als solide Tr{\"a}gerstruktur w{\"a}hrend der Differenzierung von hiPS zu hormonexprimierenden Zellen (Rezania et al. 2012; Rezania et al. 2014) oder maturierenden β-Zellen verwendet (Rezania et al. 2014). Der Effekt der PanMa wurde anhand von Genexpressions-analysen, immunhistochemischer F{\"a}rbungen und Analysen zur Glukose-abh{\"a}ngigen Insulinsekretion untersucht. In einem letzten Teil der Studie wurde die Eignung der PanMa zur verl{\"a}ngerten Kultivierung von hiPS-abgeleiteten endokrinen Zellen des Pankreas im Hinblick auf die Etablierung eines Organmodells des endokrinen Pankreas getestet. Hierzu wurde die PanMa zu einem Hydrogel weiterverarbeitet, welches zur Einkapselung und Kultivierung von hiPS-abgeleiteten hormonexprimierenden Zellen eingesetzt wurde. Um die Auswirkungen der Hydrogel-Kultur nachzuvollziehen, wurden die kultivierten Zellen mittels Genexpression, immun-histochemischer F{\"a}rbungen und Analysen zur Glukose-abh{\"a}ngigen Insulinsekretion untersucht. Mittels Dezellularisierung porziner Pankreaten konnte eine zellfreie, pankreasspezifische EZM-Tr{\"a}gerstruktur mit geringen Restbest{\"a}nden an DNA sowie einer weitgehend erhaltenen Mikro- und Ultrastruktur mit typischen EZM-Komponenten wie Kollagen I, III und IV hergestellt werden. Im Rahmen der Besiedelung arterieller Gef{\"a}ße mit humanen Endothelzellen wurde die Zellkompatibilit{\"a}t der hergestellten PanMa sowie eine weitgehende Unversehrtheit der Gef{\"a}ßstrukturen nachgewiesen. Verglichen zu SISser und LungMa zeichnete sich die PanMa als eine relativ weiche, stark wasserbindende, faserbasierte Struktur aus. Weiterhin konnten Hinweise f{\"u}r einen Effekt der PanMa auf den Stammzellcharakter und die fr{\"u}he Entwicklung von hiPS beobachtet werden. Hierbei f{\"u}hrte die Erhaltung von hiPS auf der PanMa zu einer leicht ver{\"a}nderten Expression von Genen des Kernpluripotenznetzwerks sowie zu einem reduziertem NANOG-Proteinsignal. Einhergehend mit diesen Beobachtungen zeigten hiPS w{\"a}hrend spontaner Differenzierung auf der PanMa eine verst{\"a}rkte endodermale Entwicklung. Im Verlauf der pankreatischen Differenzierung f{\"u}hrte die Kultivierung auf der PanMa zu einer signifikant verringerten Expression von Glukagon und Somatostatin, w{\"a}hrend die Expression von Insulin unver{\"a}ndert blieb, was auf eine Verminderung endokriner α- und δ-Zellen hinweist. Diese Ver{\"a}nderung {\"a}ußerte sich jedoch nicht in einer verbesserten Glukose-abh{\"a}ngigen Insulinsekretion der generierten hormonexprimierenden Zellen. Unter Anwendung der PanMa als Hydrogel konnten hormonexprimierenden Zellen {\"u}ber einen verl{\"a}ngerten Zeitraum kultiviert werden. Nach 21 Tagen in Kultur zeigten die eingekapselten hormonexprimierenden Zellen eine unver{\"a}ndert hohe Viabilit{\"a}t, wiesen allerdings bereits eine erste ver{\"a}nderte Zellanordnung sowie eine leicht verminderte Glukose-abh{\"a}ngige Insulinsekretion auf. Zusammengefasst konnte in dieser Studie ein biologischer Effekt gewebespezifischer EZM-Merkmale auf die Differenzierung von hiPS nachgewiesen werden. Dar{\"u}ber hinaus weisen die Daten auf eine relevante Funktion der EZM im Rahmen der endokrinen Spezifizierung von hiPS w{\"a}hrend der pankreatischen Differenzierung hin. Diese Beobachtungen verdeutlichen die eminente Rolle der EZM in der Herstellung von funktionalen hiPS-abgeleiteten Zellen und pl{\"a}dieren f{\"u}r eine st{\"a}rkere Einbindung organspezifischer EZMs im Bereich des Tissue Engineering und der klinischen Translation in der Regenerativen Medizin.},
  subject      = {Bauchspeicheldr{\"u}se},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kannapin2023,
  author    = {Kannapin, Felix},
  title     = {Untersuchungen zur Bedeutung des neurotrophen Faktors GDNF f{\"u}r die Interaktion zwischen enterischen Gliazellen und Enterozyten f{\"u}r die Regulation der Darmbarriere},
  doi       = {10.25972/OPUS-34471},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-344719},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {In der vorliegenden Dissertation wurde das Zusammenspiel von enterischen Gliazellen (EGC) und Darmepithelzellen (Caco-2) thematisiert, wobei der Fokus auf der Bedeu-tung des neurotrophen Faktors GDNF f{\"u}r die Interaktion zwischen den beiden genann-ten Zelltypen lag. Weiterhin wurde evaluiert, ob die Tyrosinkinase RET auch in Darme-pithelzellen f{\"u}r die GDNF-Signaltransduktion unter Ruhebedingungen und bei Entz{\"u}n-dungen verantwortlich ist. Als Grundlage diente ein Ko-Kultur-Modell mit Caco-2 und EGC. Durch Permeabili-t{\"a}ts- und Widerstandsmessungen wurden die Auswirkungen von GDNF auf Zell-Monolayer ermittelt. Effekte auf die Barrieredifferenzierung wurden anhand subkon-fluenter Zell-Monolayer charakterisiert, wohingegen die Auswirkungen auf Entz{\"u}n-dungsstimuli an konfluenten Zellen untersucht wurden. Ver{\"a}nderungen von Junktions-proteinen wurden mit Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen und Western-Blot-Analysen aufge-zeigt. Abschließend erfolgte eine Analyse humaner Gewebeproben von Patienten mit und ohne chronisch-entz{\"u}ndlichen Darmerkrankungen (CED) in Bezug auf deren GDNF-Expression. Die verwendeten intestinalen Epithelzellen exprimieren die GDNF-Rezeptoren GFRα1, GFRα2, GFRα3 und RET. Nach Etablierung des Kultursystems zeigten Permeabilit{\"a}ts-messungen, Messungen des Epithelwiderstandes sowie Immunfluoreszenz-F{\"a}rbungen, dass die Differenzierung der Darmepithelzellen in der Ko-Kultur mit EGC durch GDNF vermittelt wird. Zudem war eine GDNF-abh{\"a}ngige, barrierestabilisierende Wirkung in einem Inflammationsmodell zu beobachten. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass GDNF-Effekte auf Enterozyten auch im Darmepithel {\"u}ber die RET-Tyrosinkinase mit nachfolgender Hemmung des p38-MAPK-Signalwegs bedingt werden. Eine Stimulation der EGC mit Zytokinen best{\"a}tigte eine Hochregulation der GDNF-Expression und Sek-retion. In humanen Proben war intestinales GDNF bei schwerer Entz{\"u}ndung reduziert. Zusammenfassend wurde erstmalig der Nachweis erbracht, dass von EGC sezerniertes GDNF die Differenzierung der Barriere in Darmepithelzellen induziert und diese gegen einen Zytokin-vermittelten Zusammenbruch sch{\"u}tzt. Dies wird {\"u}ber eine RET-abh{\"a}ngige Regulation der p38-MAPK vermittelt. Die Reduktion der GDNF-Konzentration in transmuralen Gewebeproben von Patienten mit CED tr{\"a}gt m{\"o}glicher-weise zur Pathogenese der CED bei.},
  subject      = {Crohn-Krankheit},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Daeullary2024,
  author    = {D{\"a}ullary, Thomas},
  title     = {Establishment of an infection model of the human intestinal epithelium to study host and pathogen determinants during the \(Salmonella\) Typhimurium infection process},
  doi       = {10.25972/OPUS-31154},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-311548},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {According to the WHO, foodborne derived enteric infections are a global disease burden and often manifest in diseases that can potentially reach life threatening levels, especially in developing countries. These diseases are caused by a variety of enteric pathogens and affect the gastrointestinal tract, from the gastric to the intestinal to the rectal tissue. Although the complex mucosal structure of these organs is usually well prepared to defend the body against harmful agents, specialised pathogens such as Salmonella enterica can overcome the intestinal defence mechanism. After ingestion, Salmonella are capable of colonising the gut and establishing their proliferative niche, thereby leading to inflammatory processes and tissue damage of the host epithelium. In order to understand these processes, the scientific community in the last decades mostly used cell line based in vitro approaches or in vivo animal studies. Although these approaches provide fundamental insights into the interactions between bacteria and host cells, they have limited applicability to human pathology. Therefore, tissue engineered primary based approaches are important for modern infection research. They exhibit the human complexity better than traditional cell lines and can mimic human-obligate processes in contrast to animal studies. Therefore, in this study a tissue engineered human primary model of the small intestinal epithelium was established for the application of enteric infection research with the exemplary pathogen Salmonella Typhimurium. To this purpose, adult stem cell derived intestinal organoids were used as a primary human cell source to generate monolayers on biological or synthetic scaffolds in a Transwell®-like setting. These tissue models of the intestinal epithelium were examined for their comparability to the native tissue in terms of morphology, morphometry and barrier function. Further, the gene expression profiles of organotypical mucins, tight junction-associated proteins and claudins were investigated. Overall, the biological scaffold-based tissue models showed higher similarity to the native tissue - among others in morphometry and polarisation. Therefore, these models were further characterised on cellular and structural level. Ultrastructural analysis demonstrated the establishment of characteristic microvilli and tight-junction connections between individual epithelial cells. Furthermore, the expression pattern of typical intestinal epithelial protein was addressed and showed in vivo-like localisation. Interested in the cell type composition, single cell transcriptomic profiling revealed distinct cell types including proliferative cells and stem cells, progenitors, cellular entities of the absorptive lineage, Enterocytes and Microfold-like cells. Cells of the secretory lineage were also annotated, but without distinct canonical gene expression patterns. With the organotypical polarisation, protein expression, structural features and the heterogeneous cell composition including the rare Microfold-like cells, the biological scaffold-based tissue model of the intestinal epithelium demonstrates key requisites needed for infection studies with Salmonella. In a second part of this study, a suitable infection protocol of the epithelial tissue model with Salmonella Typhimurium was established, followed by the examination of key features of the infection process. Salmonella adhered to the epithelial microvilli and induced typical membrane ruffling during invasion; interestingly the individual steps of invasion could be observed. After invasion, time course analysis showed that Salmonella resided and proliferated intracellularly, while simultaneously migrating from the apical to the basolateral side of the infected cell. Furthermore, the bacterial morphology changed to a filamentous phenotype; especially when the models have been analysed at late time points after infection. The epithelial cells on the other side released the cytokines Interleukin 8 and Tumour Necrosis Factor α upon bacterial infection in a time-dependent manner. Taken together, Salmonella infection of the intestinal epithelial tissue model recapitulates important steps of the infection process as described in the literature, and hence demonstrates a valid in vitro platform for the investigation of the Salmonella infection process in the human context. During the infection process, intracellular Salmonella populations varied in their bacterial number, which could be attributed to increased intracellular proliferation and demonstrated thereby a heterogeneous behaviour of Salmonella in individual cells. Furthermore, by the application of single cell transcriptomic profiling, the upregulation of Olfactomedin-4 (OLFM4) gene expression was detected; OLFM4 is a protein involved in various functions including cell immunity as well as proliferating signalling pathways and is often used as intestinal stem cell marker. This OLFM4 upregulation was time-dependent, restricted to Salmonella infected cells and seemed to increase with bacterial mass. Investigating the OLFM4 regulatory mechanism, nuclear factor κB induced upregulation could be excluded, whereas inhibition of the Notch signalling led to a decrease of OLFM4 gene and protein expression. Furthermore, Notch inhibition resulted in decreased filamentous Salmonella formation. Taken together, by the use of the introduced primary epithelial tissue model, a heterogeneous intracellular bacterial behaviour was observed and a so far overlooked host cell response - the expression of OLFM4 by individual infected cells - could be identified; although Salmonella Typhimurium is one of the best-studied enteric pathogenic bacteria. This proves the applicability of the introduced tissue model in enteric infection research as well as the importance of new approaches in order to decipher host-pathogen interactions with higher relevance to the host.},
  subject      = {Salmonella typhimurium},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Englert2024,
  author    = {Englert, Nils},
  title     = {Die Rolle der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der Lungenfibrose der Maus},
  doi       = {10.25972/OPUS-34805},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-348054},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) stellt eine chronische Krankheit mit einer schlechten Prognose dar. Die Erkrankung zeichnet sich durch ein dysfunktionales Alveolarepithel, die Formation von α-smooth muscle actin (α-SMA)-positiven Myofibroblasten, eine starke Kollagendeposition sowie eine fehlgeleitete Inflammation aus. In der Vermittlung dieser pro-fibrotischen Effekte spielt das Zytokin transforming growth factor β (TGF-β) eine Schl{\"u}sselrolle. Aufgrund des t{\"o}dlichen Verlaufs der IPF und der limitierten Therapieoptionen ist die Entdeckung neuer Behandlungsans{\"a}tze erforderlich. Der NO/cGMP-Signalweg ist in der Modulation grundlegender physiologischer Vorg{\"a}nge wie der Blutdruckregulation und der Peristaltik involviert. Hierbei spielt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) als NO-Rezeptor eine fundamentale Rolle. In der Lunge wird die NO-GC in glatten Muskelzellen und Perizyten exprimiert. W{\"a}hrend das Enzym in glatten Muskelzellen die Relaxation der glatten Muskulatur vermittelt, reguliert die NO-GC in Perizyten die Angiogenese, die Kapillardurchl{\"a}ssigkeit und den Blutfluss. Neben den physiologischen Aufgaben wurden anti-fibrotische sowie anti-inflammatorische Effekte der NO-GC in Herz, Leber, Niere und Haut beschrieben. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit die NO-GC auf eine anti-fibrotische und anti-inflammatorische Bedeutung in der Lungenfibrose der Maus {\"u}berpr{\"u}ft. Hierzu wurden Wildtyp- (WT) und globale NO-GC-Knockout-M{\"a}use (GCKO) untersucht. Die Fibrose wurde durch einmalige, orotracheale Bleomycin-Gabe induziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tag 7 und 21) untersucht. Unbehandelte (Tag 0) Tiere dienten als Kontrolle. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die NO-GC auf eine anti-fibrotische Wirkung untersucht. Mittels Immunfluoreszenz wurde das Verhalten der α-SMA-positiven Myofibroblasten in den platelet-derived growth factor receptor β (PDGFRβ)-positiven fibrotischen Regionen untersucht. Der Kollagengehalt wurde mithilfe eines Hydroxyprolin-Kollagenassays ermittelt. Die untersuchten Fibrose-Kriterien waren in beiden Genotypen an Tag 21 st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt als an Tag 7. An Tag 21 konnten im GCKO mehr α-SMA-positive Myofibroblasten, ausgepr{\"a}gtere PDGFRβ-positive fibrotische Areale und ein h{\"o}herer Kollagengehalt als im WT festgestellt werden. Zudem zeigten die GCKO-Tiere ein schlechteres {\"U}berleben als WT-M{\"a}use. Diese Ergebnisse wiesen auf eine {\"u}berschießende fibrotische Antwort im GCKO und somit auf eine anti-fibrotische Wirkung der NO-GC in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. Dass an Tag 21 die Fibrose im GCKO st{\"a}rker ausfiel als im WT, konnte mit dem signifikant h{\"o}heren TGF-β-Gehalt in der bronchoalveol{\"a}ren Lavagefl{\"u}ssigkeit (BALF) im GCKO erkl{\"a}rt werden. Das Fehlen der NO-GC im GCKO k{\"o}nnte zu einem Wegfall der Inhibierung der TGF-β-vermittelten, pro-fibrotischen Effekte durch die NO-GC f{\"u}hren. Weitere Studien sind erforderlich, um die Hypothese zu belegen und zugrundeliegende Mechanismen aufzukl{\"a}ren. Die de novo Entstehung von Myofibroblasten, die maßgeblich an der Kollagensynthese beteiligt sind, stellt ein entscheidendes Fibrose-Merkmal dar. Umso bedeutender ist die Identifikation zweier Myofibroblasten-Subtypen, die sich in Lokalisation, NO-GC-Expression und Herkunft unterscheiden: (1) interstitielle, NO-GC-positive Myofibroblasten, die von Perizyten abstammen und Kollagen Typ I produzieren, und (2) intra-alveol{\"a}re, NO-GC-negative Myofibroblasten, deren Ursprung noch nicht abschließend gekl{\"a}rt ist. Die Anwesenheit beider Myofibroblasten-Typen konnte zu beiden untersuchten Zeitpunkten nach Bleomycin-Gabe best{\"a}tigt werden. Die NO-GC-Expression der Alveolarwand-st{\"a}ndigen Myofibroblasten, deren Abstammung von NO-GC-positiven Perizyten sowie deren dauerhafte Pr{\"a}senz sprechen f{\"u}r eine relevante Rolle der NO-GC in der murinen Lungenfibrose. In weiteren Untersuchungen m{\"u}ssen die exakten Funktionen und spezifische Marker der Myofibroblasten-Subtypen identifiziert werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die NO-GC auf anti-inflammatorische Effekte in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Mittels HE-F{\"a}rbung und Immunfluoreszenz wurden lymphozyt{\"a}re Infiltrate an Tag 21 im GCKO festgestellt, was auf einen modulatorischen Einfluss der NO-GC auf das Immunsystem hindeutete. An Tag 21 wurden in der BALF von GCKO-Tieren signifikant mehr Gesamtimmunzellen, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten als im WT gez{\"a}hlt, was auf eine starke Einwanderung von Immunzellen und somit auf eine ausgepr{\"a}gte Entz{\"u}ndung in GCKO-Lungen hinwies. Folglich k{\"o}nnte die NO-GC eine anti-inflammatorische Rolle {\"u}ber die Regulation der Immigration von Immunzellen in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose spielen. In der Literatur werden pro- und anti-fibrotische Effekte der Immunzellen in der murinen Lungenfibrose diskutiert. Durch Korrelationsanalysen wurde ein positiver Zusammenhang zwischen der Gesamtimmunzellzahl und der TGF-β-Konzentration an Tag 21 festgestellt. In verschiedenen Studien wurde ein pro-fibrotischer Einfluss der Immunzellen {\"u}ber die Aktivierung/Sekretion von TGF-β beschrieben. Die Abwesenheit der NO-GC im GCKO k{\"o}nnte also {\"u}ber die verst{\"a}rkte Immigration von Immunzellen in einem erh{\"o}hten TGF-β-Gehalt resultieren und so zu einer {\"u}berschießenden fibrotischen Reaktion an Tag 21 f{\"u}hren. Auf welche Weise die NO-GC die Einwanderung der Immunzellen in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose beeinflusst, muss in weiteren Studien untersucht werden. Zusammenfassend deuten die Daten dieser Arbeit auf eine anti-inflammatorische und anti-fibrotische Rolle der NO-GC in der Lungenfibrose der Maus hin.},
  subject      = {Lunge},
  language  = {de}
}