TY - THES A1 - Weber, Natalia T1 - Psychosoziale Aspekte bei hereditärer Mamma/Ovarial-Ca-Belastung T1 - Psychosocial aspects of hereditary breast/ovarian cancer exposure N2 - Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und Männer mit familiären Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Klärung hinsichtlich der Bewältigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Früherkennungsmaßnahmen, Einstellung gegenüber genetischer Brustkrebsdiagnostik und familiärer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollständig ausgefüllten Fragebögen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum für „Familiären Brust-/Eierstockkrebs“ teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. Für die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielfältigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden. N2 - Goal of this dissertation was to examine the mental state and other health related conditions of women and men with familial breast and ovarian cancer risk and the clarification with regard to coping and impact of genetic risk information. Risk perception, level of information, usage of advisory services and early diagnosis measures, attitude towards genetic breast cancer diagnosis and familial/social communication have been investigated. The completely filled questionnaires of medical advice seeking and concerned persons having participated in the counseling and questioning in the center of familial breast and ovarian cancer have been evaluated by us. For the counseling institutions it is very important to have knowledge about the multifaceted mental and social implications of persons undergoing tests and their families. This is the only way to improve the care concept and the advisory services. KW - Brustkrebs KW - Eierstockkrebs KW - Psychosoziale Situation KW - Psychosoziale Beratung KW - Genetik KW - psychosoziale Aspekte KW - Krebserkrankungen KW - psychosocial aspects KW - cancer Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28330 ER - TY - THES A1 - Teutschbein, Janka T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Proteinen in der Xmrk-induzierten Entwicklung von Melanomen T1 - Identification and characterization of genes and proteins in Xmrk-induced melanomagenesis N2 - Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte. N2 - Melanoma is the most aggressive type of skin cancer with the highest mortality rate. The transformation of melanocytes to malignant melanoma is based on complex molecular and biochemical alterations. In the Xiphophorus melanoma model, the oncogenic receptor tyrosine kinase Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) is the sole trigger of melanoma initiation and progression. Elucidating Xmrk-dependent signaling pathways may contribute to a better understanding of processes that play a role in human melanomagenesis, too. Here, the regulation of gene expression by Xmrk was analyzed using a microarray approach. The genes with the strongest down-regulation in response to receptor activation included son of sevenless homolog 1 (Sos1) and ubiquitin-conjugating enzyme E2I (Ube2i), whereas early growth response 1 (Egr1), cysteine-rich protein 61 (Cyr61), dual-specificity phosphatase 4 (Dusp4), fos-like antigen 1 (Fosl1), epithelial membrane protein (Emp1), Osteopontin (Opn), insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), and tumor-associated antigen L6 (Taal6) were strongly up-regulated. The pathways regulating expression of these genes were identified by applying small molecule inhibitors and siRNA. Interestingly, the SRC-family kinase FYN was found to be a key-player in Xmrk-dependent gene regulation. Furthermore, expression of the genes in human melanoma cell lines compared to normal human melanocytes was investigated. The most promising candidates, which might be important for melanoma induction and progression, were DUSP4 and TAAL6. Their potential suitability as diagnostic and prognostic melanoma markers will be addressed in future studies. In addition to gene expression analysis, protein-protein interactions were to be assayed by the split-ubiquitin-system in order to identify novel Xmrk targets. Unfortunately, inappropriate expression or folding of the receptor in this system precluded it from working as bait. However, the FYN protein, which has a central role in Xmrk-mediated signaling, was established as bait and its association with FAK was analyzed in more detail. A phosphorylated tyrosine residue at position 397 of FAK was demonstrated to be necessary for the interaction of an N-terminally truncated FAK variant with FYN, and this phosphorylation event seems to be feasible in yeast. In future, a split-ubiquitin based screen for novel interaction partners of FYN might provide insights into FYN-dependent processes and help to understand its central role in tumor development. KW - Melanom KW - Schwertkärpfling KW - Microarray KW - Onkogen KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - Yeast-Two-Hybrid-System KW - Xiphophorus KW - Rezeptortyrosinkinase KW - Xmrk KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Split-Ubiquitin-System KW - Microarray KW - EGFR KW - oncogene KW - melanoma KW - protein-protein interaction Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27516 ER - TY - THES A1 - Pfenning, Brenda T1 - Seasonal life-history adaptation in the water strider GERRIS LACUSTRIS T1 - Anpassung der Lebenslaufstrategie an saisonalen Umwelten beim Gemeinen Wasserläufer Gerris lacustris N2 - Insects living in temperate latitudes need to adjust their life-history to a seasonally variable environment. Reproduction, growth, and development have to be completed within the limited period where environmental conditions are favourable while climatically adverse conditions have to be spent in a state of diapause. Consequently, questions how individuals adapt their life-history to seasonality and which mechanisms underlie the responses to seasonal cues, like photoperiod, are important issues in the study of life-history strategies. This thesis focuses on the life-history adaptation to seasonality in the wing-dimorphic common pond skater Gerris lacustris L. (Heteroptera: Gerridae). Using a combination of field and laboratory studies as well as mathematical modelling, it is adressed how variation in the availability of thermal energy impacts on various aspects of larval development such as accumulated thermal energy (i.e. physiological development time), developmental pathway (direct reproduction vs. diapause) and wing dimorphism. N2 - Insekten in temperierten Breiten müssen ihre Lebenslaufstrategie an eine saisonale Umwelt anpassen. Reproduktion, Wachstum und Entwicklung können nur innerhalb der begrenzten Phase geeigneter Umweltbedingungen stattfinden, während klimatisch ungünstige Bedingungen in einem Stadium der Diapause überdauert werden müssen. Die Fragen, wie Individuen ihre Lebenslaufstrategie an Saisonalität anpassen und welche Mechanismen der Reaktion auf saisonale Umweltreize (insbesondere der Photoperiode) zugrunde liegen, sind daher zentrale Aspekte in der Erforschung von Lebenslaufstrategien. Diese Arbeit beschäftigt sich mit Anpassungen der Lebenslaufstrategie des flügeldimorphen Gemeinen Wasserläufers Gerris lacustris L. (Heteroptera: Gerridae) an Saisonaliät. Mit einer Kombination aus Feld- und Laborstudien sowie mathematischer Modellierung wird untersucht, wie Variationen in der Verfügbarkeit thermaler Energie auf verschiedene Aspekte der Larvalentwicklung - wie die akkumulierte thermale Energie (physiologische Entwicklungszeit), den Entwicklungsweg (direkte Reproduktion vs. Diapause) und den Flügeldimorphimus – Einfluss nehmen. KW - Wanzen KW - Temperatur KW - Habitat KW - Entwicklung KW - Gerridae KW - Lebenslaufstrategie KW - Voltinismus KW - Flügeldimorphismus KW - thermale Energie KW - Gerridae KW - life history strategy KW - voltinism KW - wing dimorphism KW - thermal energy Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27900 ER - TY - THES A1 - Nieratschker, Vanessa T1 - Charakterisierung der Serin-/Threonin-Proteinkinase SRPK3 in Drosophila melanogaster und Phosphorylierungsstudien an Synapsin T1 - Characterization of the serine-/threonine protein kinase SRPK3 in Drosophila melanogaster and phosphorylation studies on synapsin N2 - In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine…. N2 - In a previous study, a hypomorphic mutation in the gene locus of a putative serine-/threonine kinase was found to cause aggregates of the active zone protein Bruchpilot in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004). Because of its high homology to SR-protein kinases this gene was named serine-/threonine protein kinase 3 (Srpk3). The 10,3 kb large Srpk3 gene locus is located on the left arm of the third chromosome in the chromosomal region 79D4. According to an earlier annotation in “flybase” (http://flybase.bio.indiana.edu) the Srpk3 gene codes for two transcripts of 4,2 (Srpk3-RC) and 3,8 kb (Srpk3-RB). These two transcripts use different transcription and translation start sites, but from the fourth exon on they are identical. The Srpk3-RC and Srpk3-RB transcripts code for proteins of 816 and 749 amino acids respectively. The existence of these two originally annotated transcripts could be verified by RT-PCR. In addition, an alternatively spliced exon of 159 bp was identified, which is part of both groups of transcripts (Srpk3-RF and Srpk3-RE). Therefore the Srpk3 gene locus codes for at least four transcripts. Srpk3-RB and Srpk3-RC do not contain the newly identified, alternatively spliced exon, whereas Srpk3-RF and Srpk3-RE do. The existence of another transcript (Srpk3- RD) annotated in the current version of “flybase” could not be confirmed by RT-PCR experiments. The hypomorphic BRPK mutant Srpk3P1, which has a P-element insertion in the first exon of the RC/RF group of transcripts that destroys the open reading frame of those isoforms, already existed (Eberle, 1995). Therefore in that line only the RB/RE isoforms are expressed. That hypomorphic mutation was found to cause Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004) and in addition several behavioral deficits (Bock, 2006). The behavioral deficits are similar to those caused by a genetic knock-down of the Bruchpilot expression using RNAi (Wagh et al., 2006; Bock, 2006). This observation points towards an exclusive interaction of both proteins. To prove that in fact the mutation of the SRPK3 causes the observed phenotypes, rescue experiments were performed. We were able to revert the mutant phenotypes by expressing the Srpk3-RF cDNA in the nervous system (see also Bock, 2006; Bloch, 2007). Therefore mutation of the SRPK3 indeed causes the observed phenotypes in the hypomorphic BRPK mutant (Srpk3P1). To confirm the data obtained by in situ hybridization on larval brains (Nieratschker, 2004) and to gain more knowledge regarding the localization of the SRPK3, isoform specific antisera have been generated. These antisera recognize over-expressed protein (Bloch, 2007), but they are not able to recognize SRPK3 in wild type animals. Further data about localization of SRPK3 could be provided by using ectopically overexpressed GFP-tagged SRPK3 isoforms. SRPK3-GFP colocalizes with Bruchpilot at the presynaptic active zone. This result along with the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons and the behavioral deficits of SRPK3 mutants provide further evidence for a possible interaction of both proteins. To investigate, if a complete loss of SRPK3 expression alters the phenotypes observed in the hypomorphic SRPK3 mutant, a SRPK3 null mutant was generated by jump-out mutagenesis. The phenotypic analyses performed with the hypomorphic line Srpk3P1were repeated with the SRPK3 null mutant. It became obvious that the phenotypes were not enhanced by complete loss of SRPK3 expression (also see Bloch, 2007). Regarding the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons, no significant differences between hypomorphic mutant and null mutant were observed, however behavioral deficits seem to be more severe in the hypomorph (Bloch, 2007)….. KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Synapsin KW - Neurobiologie KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Synapsin KW - Neurobiologie KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Synapsin KW - Neurobiology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27806 ER - TY - THES A1 - Bucher, Daniel T1 - An Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction T1 - Eine elektrophysiologische Untersuchung synaptische Transmission an der neuromuskulären Endplatte von Drosophila-Larven N2 - In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo. N2 - Thema dieser Arbeit war die elektrophysiologische Untersuchung synaptischer Transmission, untersucht an einer Modellsynapse in Invertebraten, der neuromuskulären Synapse von Drosophila- Larven des dritten Larvalstadiums. Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde die synaptische Funktion an der neuromuskulären Synapse von Nullmutanten für verschiedene synaptische Proteine charakterisiert (das synapse associated protein of 47 kDa (Sap-47156), Synapsin (Syn97), eine bis dahin uncharakterisierte Drosophila SR-Proteinkinase (SRPK3), und eine Mutante mit einem starken neurodegenerativen Phänotyp (Loe)). Intrazelluläre Ableitungen wurden von Muskel 6 und 7 des Hautmuskelschlauches durchgeführt, um die Amplitude und Frequenz der spontanen Freisetzung von Neurotransmitter aus einzelnen synaptischen Vesikeln (miniature excitatory junction potentials oder mEJPs) zu messen. Außerdem wurden Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) bei verschiedenen Frequenzen und verschiedenen Kalziumkonzentrationen gemessen, um zu erforschen, ob die synaptische Transmission in den genannten Mutanten verändert ist. Zusätzlich wurde die Struktur und die Morphology der präsynaptischen Boutons immunhistochemisch untersucht. Dabei wurden monoklonal Antikörper gegen verschiedene Proteine der synaptischen Vesikel (SAP-47, CSP und Synapsin) und gegen das Aktive Zone Protein Bruchpilot benutzt. Die synaptische Physiologie war in den genannten Nullmutanten für synaptische Proteine nicht verändert, im Vergleich zu den wildtypischen Kontrollen, während Löchrig-Mutanten Defekte der synaptischen Übertragung zeigten, die im Einklang standen mit einem Defekt des Recyclings synaptischer Vesikel. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die elektrophysiologische Charakterisierung von heterolog exprimierten Licht-aktivierbaren Proteinen an der neuromuskulären Synapse von Drosophila. Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein Licht gesteuerter Ionenkanal und eine Licht-aktivierbare Adenylatcyclase (PAC) wurden mit Hilfe des UAS-Gal4-Systems an der larvalen, neuromuskulären Synapse exprimiert. Wenn ChR2-exprimierende Larven mit kurzen (100ms) Lichtpulsen beleuchtet wurden, konnten einzelne EJPs von den Muskeln 15, 16 und 17 abgeleitet werden. Längere Lichtpulse (10 Sekunden) führten zu einer Serie von EJPs mit einer Frequenz von ca. 25 Hz. Larven, die PAC exprimierten zeigten, in Präparationen in denen die Motoneurone vom Ventralganglion gelöst wurden, nach einminütiger Belichtung mit Blaulicht einen signifikanten Anstieg der mEJP-Frequenz. Auch die EJPs waren in einer Umgebung mit geringer Kalziumkonzentration (0,2 mM) signifikant erhöht, wenn PAC durch Blaulicht stimuliert wurde. Wurden die Motoneurone intakt gelassen, führte die Stimulation der PAC durch Blaulicht zu EJPs in den Muskeln 6 und 7, die im Einklang standen mit RP3 Motoneuronaktivität. Beide Proteine (ChR2 und PAC) erwiesen sich daher als nützliche, zuverlässige Werkzeuge, um die neurale Aktivität in vivo zu manipulieren. KW - Drosophila KW - synapse KW - elektrophysiologie KW - Drosophila KW - synapse KW - electrophysiology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27784 ER - TY - THES A1 - Geier, Katja T1 - Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom T1 - Diagnostic in suspicion of Nijmegen breakage syndrome by flow cytometry N2 - Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und eine erhöhte Prädisposition gegenüber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Das Fehlen von Nibrin führt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erklärt die verschiedenen klinischen und zellulären Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. Für die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen Fällen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich höher sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erhöhten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß für Strahlensensitivität, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erhöht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 Fällen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese für beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 Fällen ergab sich ein positives Ergebnis mit erhöhtem Anteil nichtproliferierender Zellen und erhöhter Strahlensensitivität. Unter den positiven Fällen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse bestätigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erhöhter Strahlensensitivität keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erhöhten Strahlensensitivität eindeutig nachweisen kann. Eine erhöhte Strahlensensitivität ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivität bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifität des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl für die Primärdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein. N2 - Nijmegen breakage syndrome is a rare autosomal recessive chromosomal instability disorder with hypersensitivity to ionizing radiation and an increased cancer risk. The clinical phenotype is characterized by congenital microcephaly, dysmorphic facial appearance, growth retardation and immunodeficiency. At the cellular level NBS is characterized with increased spontaneous and induced chromosomal breaks and cell cycle aberrations. NBS1, the gene defective in Nijmegen breakage syndrome, is located on chromosome 8q21 and has been cloned. The NBS1 gene codes for the protein nibrin which is a member of the MRE11-RAD50-NBS1 complex, a central player associated with double–strand breaks repair. Most NBS patients are Slavic origin and homozygous for the founder mutation 657del5, which leads to a frameshift and protein truncation. We have studied 40 patients with the clinical suspicion of NBS using a cell cycle based screening assay. Peripheral blood mononuclear cells were exposed to ionizing radiation and incubated for 72 h in the presence of phytohemagglutinin. To decide between NBS-positive and NBS-negative group the following cell cycle parameters were ascertained: 1. proportion of non-proliferation (G0/G1) cells as a measure of the mitogen response. 2. Proportion of first cycle G2-phase cells relative to the growth fraction as a measure of radiosensitivity. 22 cases could assign to the NBS-negative group and 16 cases could assign to the NBS-positive group. 9 cases of the NBS-positive group were confirmed by NBS mutation analysis. In the other 7 cases no NBS-mutation could be found. We conclude that cell cycle testing by flow cytometry is a very sensitive screening procedure for radiosensitivity and can be successfully applied to the diagnostic of Nijmegen breakage syndrome. But the primary diagnostic of NBS is mutation analysis. KW - Durchflusscytometrie KW - Nijmegen Breakage Syndrom KW - Nibrin KW - Chromosomeninstabilitätssyndrome KW - Strahlensensitivität KW - Nijmegen breakage syndrome KW - chromosomal instability disorder KW - nibrin KW - radiosensitivity KW - flow cytometry Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695 ER - TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Roland T1 - Modellierung von Metabolismus, Transkriptom und Zellentwicklung bei Arabidopsis, Listerien und anderen Organismen T1 - Modeling of metabolism, transcriptome and cell development in Arabidopsis, Listeria and other organisms N2 - Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab. N2 - In the same way that informatical knowledge has made its way into almost all areas of research in the Life Sciences, the focus of bioinformatical research has shifted towards topics originating more in the fields of mathematics and theoretical computer science. Bioinformatics today is more than the computer-driven processing of huge amounts of biological data, but it has a special focus on the emphmodelling of complex biological systems. Of special importance hereby are theories from stochastics and statistics, from the field of machine learning and theoretical computer science. In the following dissertation, I describe the systematic modelling of biological systems from an informatical-mathematical point of view in a case studies approach, applying methods from the aforementioned areas of research and on different levels of biological abstraction. Beginning with the sequence information itself, followed by the transcriptome, metabolome and the interaction of both and finally population effects I show how current biological questions can be tackled with mathematical models and combined with a variety of different experimental datasets. A special focus lies hereby on the procedure of modelling and the concept and notion of a model as such in the framework of bioinformatical research. In more detail, the projects contained the development of a new approach for embedding and visualizing Multiple Sequence and Structure Alignments, which was illustrated using a hemagglutinin alignment from different H5N1 variants as an example. Furthermore we investigated the A. thaliana transcriptome by means of a kernelized non-parametric meta-analysis, thus being able to annotate several new genes as pathogen-defense related. Another major part of this work was the modelling of the metabolic network of L. monocytogenes under activation of the transcription factor prfA, establishing predictions which were later verified by experimental 13C isotopologue studies. Following this project we investigated the relationship between the regulation of metabolism by changes in the cellular genexpression patterns and the flux distributions of the metabolic steady-state network. Modelling of a complex organismal property, the cell size development of the planktonic diatom Pseudo-nitzschia delicatissima concludes this work. KW - Bioinformatik KW - Würzburg / Universität / Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Modellierung KW - Metabolismus KW - Stoffwechsel KW - Transkriptom KW - Transkriptomanalyse KW - bioinformatics KW - metabolome KW - transcriptome KW - modeling KW - steady-state Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27622 ER - TY - THES A1 - Bollazzi Sosa, Leonardo Martin T1 - Building behaviour and the control of nest climate in Acromyrmex leaf-cutting ants T1 - Bauverhalten und die Kontrolle des Nestklimas in der Blattschneiderameisen Acromyrmex N2 - This work was aimed at experimentally studying whether climatic variables act as environmental cues for workers’ building behaviour in leaf-cutting ants of the genus Acromyrmex, and to what extent building responses account for the maintenance of nest climate in a proper range for the inhabiting colony. Specifically, this work presents independent analysis in different Acromyrmex species with disparate ecology and nesting habits, aimed at understanding to what extent: i) temperature and humidity act as cues for workers’ building behaviour, ii) inter- and intraspecific differences in the nesting habits observed in South American Acromyrmex are based on distinct building behaviours and on the variation in regional climate across continent, iii) differences in nest architecture account for the maintenance of nest climate in a proper range for colony members and, iv) climatic variables trigger building responses aimed at controlling short-term changes in nest climate. It is first experimentally shown that soil temperature acts as a cue for workers’ digging behaviour. Acromyrmex lundi workers were observed to respond to both soil temperature as well as its changes, and to decide accordingly where to start or whether to stop digging. The soil temperature range preferred by workers to dig, between 20°C and maximally 30.6°C, matches the range at which colony growth is expected to be maximized. Temperature-sensitive digging might therefore lead to the establishment of the fungus chambers in soil layers with a proper range of temperatures for colony growth. Based on that, it was hypothesized that nest depth in Acromyrmex largely depends on the depth at which this temperature range is located across the soil profile, i.e., the higher the temperature in the superficial soil layers, the deeper the nest location, since soil temperature decreases with increasing depth. A bibliographic survey on nesting habits of 21 South American Acromyrmex species confirmed that the warmer the soil temperature at 50 cm depth throughout the South American continent, the higher the number of species presenting subterranean nests, compared with those inhabiting superficial nests. Temperature-sensitive digging in Acromyrmex would therefore explain the geographical distribution of nesting habits observed for this genus in the South American continent, i.e., subterranean in the northern tropical regions, and superficial in the southern temperate ones. In addition, results showed that Acromyrmex colonies from temperate regions indeed achieve thermoregulatory benefits through the determination of nest depth based on thermoregulatory needs. In sympatrically-occurring colonies of the grass-cutting ant A. heyeri, temperature inside superficial thatched nests was higher, and more suitable for colony growth, than that inside subterranean nests. This temperature surplus was even higher in spring, at the time of production of sexual brood, than in winter or summer. It was demonstrated that such temperature surplus was brought about by the low thermal diffusivity of the nest thatch, which prevents diurnal nest overheating by the incoming solar radiation, and avoids losses of the accumulated daily heat into the cold air during night, thus leading to high average nest temperatures. Although highly advantageous for colonies in terms of nest temperature, the determination of nest depth based on thermoregulatory needs may differentially affect nest ventilation and humidity depending on how nest exposition influences the exchange of nest air with the outside air. For instance, colonies with a superficial nesting habit might benefit from improved nest ventilation, but be at risk of desiccation due to their exposition and the consequent humidity losses into the dry outside air. Results demonstrated that in two Acromyrmex species, short-term regulatory building responses triggered and spatially organized by climatic variables occur, and may counteract undesired changes in internal nest humidity. Workers of the thatching grass-cutting ant A. heyeri, for instance, closed a number of nest-thatch openings as a response to desiccation of the outside air, even at a nest temperature that otherwise triggered the response of opening them so as to reduce nest temperature. In the leaf-cutting ant A. ambiguus, the direction of the airflow inside nest tunnels was shown to act as a cue for spatially guiding the building behaviour of plugging nest entrances. However, workers only responded if the humidity content of the circulating air was low, trading therefore nest ventilation for humidity maintenance. N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht, inwiefern das Bauverhalten von Blattschneiderameisen der Gattung Acromyrmex durch klimatische Variablen beeinflusst wird und dem Erhalt für die Ameisen geeigneter klimatischer Bedingungen dient. Betrachtet werden verschiedene Acromyrmex-Arten, die sich in ihrer Ökologie und ihren Nistgewohnheiten unterscheiden. Ziel ist es zu verstehen, in wie fern: i) Temperatur und Feuchtigkeit als Reize das Bauverhalten der Arbeiterinnen beeinflussen, ii) Unterschiede im Bauverhalten und die regionale Variation des Klimas über den südamerikanischen Kontinent die beobachteten, inter- und intraspezifischen Unterschiede zwischen den Nesttypen südamerikanischer Acromyrmex-Arten erklären, iii) unterschiedliche Nestarchitekturen für die Aufrechterhaltung für die Ameisen geeigneter klimatischer Bedingungen im Nest sorgen, iv) klimatische Variablen Verhaltensweisen auslösen, die der Kontrolle kurzfristiger Änderungen des Nestklimas dienen. Zunächst wird experimentell gezeigt, dass die Bodentemperatur ein Reiz ist, der das Bauverhalten von Ameisen beeinflusst. Es wurde beobachtet, dass Acromyrmex lundi-Arbeiterinnen sowohl auf Temperaturen als auch auf Temperaturänderungen reagieren, und, abhängig von diesen Variablen, über die Aufnahme oder den Abbruch des Grabeverhaltens entscheiden. Der Temperaturbereich im Boden, in dem die Arbeiterinnen zu Graben bevorzugen, also zwischen 20°C und maximal 30.6°C, entspricht dem Temperaturbereich, bei dem ein maximales Koloniewachstum erwartet werden sollte. Zudem legen die Ergebnisse nahe, dass die Orientierung des kollektiven Grabenverhaltens an der Bodentemperatur den Ameisen ermöglicht, Nestkammern in Bodenschichten zu etablieren die geeignete Temperaturbedingungen bieten. Es wird angenommen, dass die Nesttiefe bei Acromyrmex stark davon abhängt, wie tief im Boden geeignete Temperaturbedingungen anzutreffen sind. Je höher die Temperatur in den obersten Bodenschichten, desto tiefer das Nest, denn die Bodentemperatur sinkt mit zunehmender Tiefe. Literaturdaten zu den Nistgewohnheiten von 21 südamerikanischen Acromyrmex-Arten wurden verglichen. Hierbei bestätigte sich, dass über den südamerikanischen Kontinent mit zunehmender, mittlerer Bodentemperatur in einer Tiefe von 50 cm auch der Anteil der Arten zunimmt, die ausschließlich unterirdische Nester bauen im Verhältnis zu den Arten mit Oberflächennestern zunimmt. Temperaturabhängiges Graben würde die geographische Verteilung der Nistgewohnheiten von Acromyrmex in Südamerika erklären: Unterirdische Nester überwiegen in den nördlichen, tropischen Regionen und Oberflächennester in den gemäßigten Regionen im Süden. Zudem konnte gezeigt werden, dass Acromyrmex-Kolonien der gemäßigten Regionen tatsächlich ihre Nesttemperatur durch Anpassung der Nesttiefe an klimatische Bedingungen regulieren. Bei der Grassschneiderameise A. heyeri, bei der Kolonien mit unterirdischen Nestern und solche mit oberflächlichen Hügelnestern sympatrisch vorkommen, war die Temperatur in den Oberflächennestern höher, und für das Koloniewachstum günstiger, als in unterirdischen Nestern. Dieser Temperaturvorteil war im Frühling, der Zeit, in der die Geschlechtstierbrut herangezogen wird, größer als in Winter oder Sommer. Es wurde gezeigt, dass dieser Vorteil durch die niedrige Wärmeleitfähigkeit der Nesthügels bedingt ist. Tagsüber verhindert der Nesthügel zunächst die Überhitzung durch Sonneneinstrahlung, und minimiert dann während der Nacht den Wärmeverlust an die kalte Umgebungsluft. Dies führt zu hohen Durchschnittstemperaturen innerhalb solcher Nester. Neben dem Vorteil, den eine geringe Nesttiefe in diesem Fall für die Temperatur in der Nestkammer bietet, spielen auch weitere Aspekte eine Rolle. Kolonien mit oberflächlichen Nestern profitieren zwar von der vergleichsweise guten Nestventilation, setzen sich dabei aber einem Erhöhten Risiko aus, durch den Verlust von Feuchtigkeit an die Außenluft auszutrocknen. Bei zwei Acromyrmex-Arten zeigen die Ergebnisse das Auftreten regulatorischer Bauaktivität, die, ausgelöst und räumlich organisiert durch klimatische Variablen, einem unerwünschten Feuchtigkeitsverlust innerhalb des Nestes entgegenwirkt. Arbeiterinnen der hügelbauenden Grassschneiderameise A. heyeri verschlossen Öffnungen im Nesthügel als Antwort auf die Austrocknung der Aussenluft, und das selbst bei einer Nesttemperatur, auf die unter anderen Umständen mit der Öffnung derselben zur Reduzierung der Nesttemperatur reagiert worden wäre. Bei der Blattschneiderameise A. ambiguus, die unter bestimmten Bedingungen ihre Tunnel mit Pflanzenmaterial verschließt, wurde gezeigt, dass die Richtung der Luftbewegung in den Nestgängen das Verschließen der Eingänge räumlich beeinflusst. Dennoch reagierten Arbeiteinnen nur, wenn der Feuchtigkeitsgehalt der zirkulierenden Luft niedrig war, sie beschränkten somit die Nestventilation um die Feuchtigkeit aufrecht zu erhalten. KW - Verhaltensökologie KW - Bauverhalten KW - Nestklimas KW - Acromyrmex KW - Blattschneiderameisen KW - Building behaviour KW - nest climate KW - Acromyrmex KW - leaf-cutting ants Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27610 ER - TY - THES A1 - Blenk, Steffen T1 - Bioinformatical analysis of B-cell lymphomas T1 - Bioinformatische Analyse von B-Zell Lymphomen N2 - Background: The frequency of the most observed cancer, Non Hodgkin Lymphoma (NHL), is further rising. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common of the NHLs. There are two subgroups of DLBCL with different gene expression patterns: ABC (“Activated B-like DLBCL”) and GCB (“Germinal Center B-like DLBCL”). Without therapy the patients often die within a few months, the ABC type exhibits the more aggressive behaviour. A further B-cell lymphoma is the Mantle cell lymphoma (MCL). It is rare and shows very poor prognosis. There is no cure yet. Methods: In this project these B-cell lymphomas were examined with methods from bioinformatics, to find new characteristics or undiscovered events on the molecular level. This would improve understanding and therapy of lymphomas. For this purpose we used survival, gene expression and comparative genomic hybridization (CGH) data. In some clinical studies, you get large data sets, from which one can reveal yet unknown trends. Results (MCL): The published proliferation signature correlates directly with survival. Exploratory analyses of gene expression and CGH data of MCL samples (n=71) revealed a valid grouping according to the median of the proliferation signature values. The second axis of correspondence analysis distinguishes between good and bad prognosis. Statistical testing (moderate t-test, Wilcoxon rank-sum test) showed differences in the cell cycle and delivered a network of kinases, which are responsible for the difference between good and bad prognosis. A set of seven genes (CENPE, CDC20, HPRT1, CDC2, BIRC5, ASPM, IGF2BP3) predicted, similarly well, survival patterns as proliferation signature with 20 genes. Furthermore, some bands could be associated with prognosis in the explorative analysis (chromosome 9: 9p24, 9p23, 9p22, 9p21, 9q33 and 9q34). Results (DLBCL): New normalization of gene expression data of DLBCL patients revealed better separation of risk groups by the 2002 published signature based predictor. We could achieve, similarly well, a separation with six genes. Exploratory analysis of gene expression data could confirm the subgroups ABC and GCB. We recognized a clear difference in early and late cell cycle stages of cell cycle genes, which can separate ABC and GCB. Classical lymphoma and best separating genes form a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups. Together with gene sets which identify ABC and GCB we get a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups (ASB13, BCL2, BCL6, BCL7A, CCND2, COL3A1, CTGF, FN1, FOXP1, IGHM, IRF4, LMO2, LRMP, MAPK10, MME, MYBL1, NEIL1 and SH3BP5; Altogether these findings are useful for diagnosis, prognosis and therapy (cytostatic drugs). N2 - Hintergrund: Die Häufigkeit von Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL), den am meisten beobachteten Krebserkrankungen, steigt weiter an. Von den aggressiven Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) macht das “großzellige, diffuse B-Zell-Lymphom” (DLBCL) den größten Anteil aus. Durch Genexpressionsmuster wurden zwei Subtypen definiert: ACB (“Activated B-like DLBCL”) und GCB (“Germinal Center B-like DLBCL”). Die Patienten der Gruppe ABC sterben ohne Therapie oft innerhalb weniger Monate, weil der ABC Typ einen aggressiveren Krankheitsverlauf aufweist. Ein weiteres, von einer malignen Entartung der B-Lymphozyten ausgehendes Lymphom, ist das “Mantelzell Lymphom” (MCL). Es tritt selten auf und ist ebenfalls mit einer schlechten Prognose verbunden. Eine vollständige Heilung nach der Therapie ist sehr selten. Methoden: In diesem Projekt wurden diese B-zell Lymphome mit bioinformatischen Methoden untersucht, um auf molekularer Ebene neue Eigenschaften oder bisher unentdeckte Zusammenhänge zu finden. Das würde das Verständnis und damit auch die Therapie voranbringen. Dafür standen uns Überlebens-, Genexpressions- und chromosomale Aberrationsdaten zur Verfügung. Sie sind die bevorzugte Wahl der Mittel, um genetische Veränderungen in Tumorzellen zu bestimmen. Hierbei fallen oft große Datenmengen an, aus welchen man mit bioinformatischen Methoden vorher unerkannte Trends und Hinweise identifizieren kann. Ergebnisse (MCL): Explorative Analysen sowohl der Genexpressions- (zweite Hauptachse der Korrespondenz Analyse) als auch der chromosomalen Aberrationsdaten des Mantelzell-Lymphom zeigten uns hierbei, daß es trotz der linearen Korrelation zwischen der veröffentlichten Proliferationssignatur und der Überlebenszeit sinnvoll ist, in den Patienten (n=71) zwei Ausprägungen zu betrachten: Patienten mit schlechter und mit guter Prognose. Statistische Tests (moderate t-test, Wilcoxon rank-sum test) dieser beiden Typen zeigten Unterschiede im Zellzyklus und ein Netzwerk von Kinasen auf, welche für den Unterschied zwischen guter und schlechter Prognose verantwortlich sind. Sieben Gene (CENPE, CDC20, HPRT1, CDC2, BIRC5, ASPM, IGF2BP3) konnten gefunden werden, die eine ähnliche gute Prognose für Überlebenszeiten ermöglichen, wie eine früher veröffentlichte Proliferationssignatur mit 20 Genen. Außerdem konnten chromosomale Banden durch eine explorative Analyse mit der Prognose assoziiert werden (Chromosom 9: 9p24, 9p23, 9p22, 9p21, 9q33 and 9q34). Ergebnisse (DLBCL): Durch geeignete Normalisierung der Genexpressionsdaten von 248 DLBCL-Patienten trennte der Signatur basierte Predictor die Risikogruppen nun besser auf. Eine ähnlich gute Auftrennung konnte von uns sogar mit sechs Genen erreicht werden. Die explorative Analyse der Genexpressionsdaten konnte die Subtypen ABC und GCB als valide Gruppen bestätigen. In den Genen, die ABC und GCB unterscheiden, ergab sich eine Häufung in späten und frühen Zellzyklusstadien. Klassische Lymphommarker, neu aufgefundene spezielle Gene und Zellzyklusgene bilden ein Netzwerk, das die ABC und GCB Gruppen klassifizieren und Unterschiede in deren Regulation erklären kann (ASB13, BCL2, BCL6, BCL7A, CCND2, COL3A1, CTGF, FN1, FOXP1, IGHM, IRF4, LMO2, LRMP, MAPK10, MME, MYBL1, NEIL1 and SH3BP5. Dies ist auch für die Diagnose, Prognose und Therapie (Zytostatika) interessant. KW - Bioinformatik KW - Genexpression KW - Auswertung KW - B-Zell-Lymphom KW - Diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom KW - Mantelzell-Lymphom KW - Bioinformatics KW - gene expression KW - B-cell lymphoma KW - Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) KW - Mantle cell lymphoma (MCL) Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27421 ER - TY - THES A1 - Kalb, Reinhard T1 - Fanconi anemia and RAD50 deficiency : genetic and functional analysis T1 - Fanconi Anämie und RAD50-Defizienz : genetische und funktionelle Analysen N2 - Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex. N2 - Die sogenannten “Caretaker”-Gene spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Antwort auf DNA Schäden. Mutationen in diesen Genen führen zur Ausprägung von einigen seltenen Erbkrankheiten, die sich durch genetische Instabilität und in vielen Fällen durch erhöhtes Krebsrisiko auszeichnen. Eine dieser Erkrankungen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, ist Fanconi Anämie (FA). Dabei handelt es sich um eine sehr seltene chromosomale Instabilitätserkrankung, die einem rezessiven Erbgang folgt. Der klinische Phänotyp von FA ist gekennzeichnet durch ein variables Spektrum von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarksversagen und einer Prädisposition für Neoplasien. Durch somatische Zellfusionstudien und in einigen Fällen durch direkte genetische Zuordnung konnten bisher 13 Komplementationsgruppen definiert werden (FAA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), von denen jede einen Defekt in einem bestimmten Gen widerspiegelt. Inzwischen sind, mit Ausnahme von FANCI, alle korrespondierenden FA Gene identifiziert. Ein Überblick über den aktuellen Stand ist in den Kapiteln 1 und 2 dieser Arbeit zu finden. Zellen von FA-Patienten zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität gegenüber DNA quervernetzenden Substanzen und einer hohen Empfindlichkeit gegenüber einer erhöhten Sauerstoffkonzentration aus. Zur Frage der Radiosensitivität von FA-Zellen gab es bisher nur widersprüchliche Daten. Mit Hilfe einer systematischen Analyse von primären Fibroblasten aller (zum Zeitpunkt der Untersuchung) bekannten Komplementationsgruppen konnte gezeigt werden, dass unter physiologischen Sauerstoffkonzentrationen keine erhöhte Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und ultraviolettem Licht (UV) besteht (Kapitel 3). Trotz einigen Zellinien-spezifischen Schwankungen waren die Unterschiede zwischen Patientenzellen und gesunden Kontrollen marginal, verglichen mit der eindeutig erhöhten Sensitivität von Zellen positiver Kontrollen (Ataxia telangiactasia (IR Kontrolle) bzw. Cockayne Syndrom (UV-Kontrolle)). Die in Kapitel 3 nachgewiesene fehlende Radiosensitivität von FA-Zellen ist im Kontext des FANCD2-Gens von besonderem Interesse, da diesem Gen eine Schlüsselposition im FA/BRCA Doppelstrangbruch-Reparaturweg zukommt. Das Screening von FA-Patienten, bei denen bereits eine Zuordnung zu den Komplementationsgruppen FA-A, C, E, F, G und L ausgeschlossen war, führte zur Identifikation einer Reihe von FA-D2 Patienten. In einer großen Kohortenstudie wurden 29 FA-D2 Patienten mit klinischen Informationen sowie 3 zusätzliche FA-D2 Patienten hinsichtlich ihrer Mutationen in FANCD2 untersucht (Kapitel 4). Für alle 32 Patienten konnten biallelische Mutationen nachgewiesen werden, auch wenn das Vorhandensein von pseudogenen Regionen die Mutationsanalyse erschwerte. Wie in keinem der anderen FA-Gene führt die Mehrzahl der Mutationen in FANCD2 zu verändertem Spleißenverhalten, wie zum Beispiel zur Exklusion eines Exons, zur Exonisation intronischer Bereiche, der Aktivierung von kryptischen oder der Erzeugung von neuen 3´ Spleißstellen. Viele Allele wurden mehrfach gefunden und konnten einem ethnischen Hintergrund zugeordnet werden. In allen verfügbaren lymphoblastoiden Patienten-Zelllinien wurde residuales FANCD2-Protein detektiert, wobei das Vorhandensein der monoubiquitinylierten Isoform auf ein funktionelles Protein hindeutet. Zusammen mit der Tatsache, dass in keinem der Patienten eindeutige biallelische Nullmutationen nachgewiesen werden konnten, ist somit offenbar das Vorhandensein von hypomorphen Mutationen und entsprechendem Restprotein für die Lebensfähigkeit von FA-D2 Patienten essentiell. In Kapitel 5 wird der weltweit zweite FA Patient vorgestellt, welcher der Komplementationsgruppe FA-L zugeordnet werden konnte. Die genetische Analyse von primären Fibroblasten dieses Patienten führte zum Nachweis einer 5 Basen umfassenden Deletion in Exon 7 sowie zu einer Missense-Mutation in Exon 11. Im Gegensatz zu den untersuchten Fibroblasten zeigten zwei unabhängig etablierte lymphoblastoide Zellinien keine erhöhte Sensitivität gegenüber Mitomycin C, was auf einer somatische Reversion beruhen kann. Diese Vermutung wurde durch den Nachweis einer induzierbaren Monoubiquitinylierung von FANCD2 in Lymphoblasten bestätigt. Die funktionelle Reversion basiert auf einer zur Deletion in cis befindlichen kompensatorischen Mutation im Spleiß-Akzeptor von Exon 7, die zu einem veränderten Spleißprodukt und der Wiederherstellung des Leserahmens führt. Die somatische Reversion beschränkt sich jedoch auf die lymphatischen Zellreihen und hatte daher nur einen partiellen Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Ein allgemeines Knochenmarksversagens machte eine Transplantation unumgänglich. Die Konditionierung wurde jedoch auf das vorhandene hämatopoietische Mosaik abgestimmt, um eine Graft vs. Host Reaktion zu vermeiden. Die Identifizierung des BRCA1 interagierenden Proteins 1 (BRIP1/BACH1) als ein bona fide FA-Gen (Kapitel 6) verdeutlicht die direkte Verknüpfung des FA/BRCA DNA Reparaturweges mit anderen DNA Reparaturwegen. Trunkierende Mutationen in BRIP1 wurden in zwei blutsverwandten Eskimofamilien mittels genetischer Positionsanalysen gefunden. Im Gegensatz zu den meisten anderen FA Patienten war die Monoubiquitinylierung von FANCD2 trotz MMC Empfindlichkeit intakt, was für eine Zuordnung zur Komplementationsgruppe FA-J sprach. Biallelische Mutationen in BRIP1 wurden in 8 weiteren Patienten gefunden, von denen einer ursprünglich durch somatische Zellfusion zu FA-J zugeordnet wurde. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das postulierte FANCJ Gen mit BRIP1 identisch ist. Als eines der wenigen FA Gene besitzt BRIP1 bekannte funktionelle Domänen (DNA Helikase), die somit biochemisch für die Entschlüsselung des FA/BRCA Weges genutzt werden können. Biallelische Muatationen in FANCD1, welches identisch mit dem bekannten Brustkrebsgen BRCA2 ist, führen zu einer besonders schweren Form von Fanconi Anämie, die bereits im frühen Kindesalter mit einem sehr hohen Krebsrisko verbunden ist. Kurz vor Abschluss dieser Arbeit gelang die Charakterisierung eines mit BRCA2 interagierendes Proteins, welches als „partner und localizer of BRCA2“ (kurz PALB2) bezeichnet wurde und offenbar zelluläre Resistenz gegenüber Mitomycin C (MMC) bedingt. Ein genetischer Screen von bisher nicht-klassifizierten FA-Patienten führte zur Identifizierung von sieben Patienten mit biallelischen Mutationen in PALB2 (Kapitel 7). Alle Patienten entwickelten bereits im frühen Kindesalter bösartige Tumore. Der zelluläre Phänotyp von PALB2- defizienten Zellen weist eine Störung der MMC induzierten RAD51 Foci-Bildung auf. Darüberhinaus zeigen PALB2-defiziente Zellen eine spontane chromosomale Instabilität, die durch eine MMC-Gabe stark erhöht werden kann. Die Transduktion von PALB2 cDNA führt zur Reduktion der MMC induzierten G2 Phasen Arretierung und zur Reversion des MMC-sensitiven Phänotyps. Biallelische Mutationen in PALB2 verursachen somit eine Form von Fanconi Anämie, die mit hohem Krebsrisiko verbunden ist. PALB2 wird nach der gängigen FA-Nomenklatur als FANCN bezeichnet und liegt der neu definierten Komplementationsgruppe FA-N zugrunde. Die vorliegende Arbeit hat in mehreren Punkten zur Verbesserung des derzeitigen Wissenstandes über die komplexe genetisch bedingte Erkrankung Fanconi Anämie beigetragen 1. trotz molekularer Wechselwirkung von FA-Proteinen mit Komponenten aus anderen DNA-Reparatursystemen zeigen Zellen von FA Patienten unabhängig von der Komplentationsgruppe weder Strahlen- noch UV-Sensitivität; 2. die Existenz von hypomorphen Mutationen in FANCD2 und das Auftreten von Restprotein korreliert offenbar mit der Lebensfähigkeit von biallelischen Mutationen im FANCD2 Gen. 3. unter den bisher nicht klassifizierten Patienten wurde der weltweit zweite Patient der Komplementationsgruppe FA-L gefunden, in dessen Blutzellen ein neuartiger Mechanismus von somatischer Reversion nachgewiesen werden konnte 4. die Beteiligung an der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von zwei neuen FA-Genen (FANCJ und FANCN), welche die FA-abhängigen DNA-Reparaturwege direkt mit den Brustkrebsgenen BRCA1 und BRCA2 in Verbindung bringen. Das letzte Kapitel der Arbeit befasst sich mit einem DNA-Reparaturweg, der insbesondere nach Strahlenexposition aktiviert wird. Eines der zentralen Proteine, das an der Erkennung von strahleninduzierten DNA Schäden beteiligt ist, ist die Kinase ATM. Eine Reihe von Proteinen wird von ATM phosphoryliert, womit eine DNA Schadensantwort bei Doppelstrangbrüchen ausgelöst wird. Der NMR-Proteinkomplex, bestehend aus NBS1, MRE11 und RAD50, ist an der Aktivierung der ATM Kinase beteiligt und wird daher als ein Sensor für DNA Doppelstrangbrüche angesehen. Biallelische Mutationen in MRE11 und NBS1 führen zu den Radiosensitivitätssyndromen „Ataxia telangiectasia-like disease“ (AT-LD) bzw. „Nijmegen breakage syndrome“ (NBS). In Kapitel 8 wird der erste Patient mit RAD50 Defizienz vorgestellt. Bei einer 18 jährigen Patientin mit einem NBS- ähnlichem klinischem Phänotyp, jedoch ohne Immundefizienz, wurden eine prämature Stopp- Mutation und der Verlust des natürlichen Translationsterminations-Signals gefunden. Die Expression von RAD50 ist in Fibroblasten und Lymphozyten der Patientin auf weniger als 10% reduziert. Auf zellulärer Ebene ist eine hohe Chromosomenbruchrate, eine dosisabhängige Arretierung in der G2 Phase des Zellzyklus, Defekte in den G1 und S Phase Kontrollpunkten, sowie das Fehlen der IR-induzierten Relokalisation von NBS1 und MRE11 zu beobachten. Korrekte Relokalisation und normale Phosphorylierungsmuster wurden experimentell durch transiente Transfektion von RAD50 cDNA wiederhergestellt, was die Bedeutung von RAD50 für diese Prozesse belegt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass RAD50, ebenso wie NBS1 und MRE11, die ATM abhängige DNA Schadensantwort und die G1/S Zellzykluskontrolle moduliert. RAD50 scheint für die nukleäre Lokalisation von MRE11, sowie für die induzierte Relokalisation von MRE11 und NBS1 in nukleäre Foci notwendig zu sein. Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann die RAD50-Defizienz zu der wachsenden Liste von Caretaker-Syndromen als eine neue Radiosensitivität-Erkrankung hinzugefügt werden. Das Krankheitsbild unterscheidet sich trotz enger molekularer Interaktion zwischen RAD50, NBS1 und MRE11 im NMR-Komplex von den Defekten in diesen Genen. KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi-Anämie KW - Erbkrankheit KW - Genmutation KW - chromosomale Instabilität KW - FA KW - RAD50-Defizienz KW - Fanconi anemia KW - chromosomal instability KW - DNA repair KW - FA KW - mutation analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25823 ER - TY - THES A1 - Berg, Daniela T1 - Entwicklung von TRAIL-Fusionsproteinen und ihre Wirkung auf Myelomzellen N2 - 1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren. N2 - 2. Summary Variants of soluble human TRAIL (hTRAIL), encompassing solely the TNF-homology domain (THD), interact with TRAILR1 and TRAILR2, but they only stimulate TRAILR1 robustly. After crosslinking however, these ligands are also able to activate TRAILR2. Contrarily, the corresponding murine TRAIL variants poorly bind and activate their receptors even after crosslinking. Interestingly, a fusion protein consisting of the THD of mTRAIL and the trimerization domain of Tenascin-C (TNC) shows an effictive receptor binding and TRAILR2 activation after crosslinking. A variant of mTRAIL that not only contains the THD, but also the the stalk region, which seperates the transmembranedomain from the THD, does also induce apoptosis after crosslinking, but not as effective as the TNC-mTRAIL fusionprotein. The activity of soluble human TRAIL variants is also enhanced after fusion with TNC. It seems that especially for mTRAIL the spatial fixation of the THD by TNC is necessary for proper receptor binding and activation. This spatial fixiation is otherwise ensured by the stalk region or the transmembrane-domain. So the stalk region has unanticipated functions for the activity of the TNF ligands. Moreover, there is now an option to generate soluble ligands of the TNF-family with improved activity. TRAIL-induced apoptosis could be applied in the treatment of tumor cells. However, it was shown that TRAIL cannot only induce apoptosis, but also activates proinflammatory potentially tumor promoting pathways, especially in apoptosis resistant cells. Therefore, the ability of TRAIL to activate such pathways in myeloma cells was analyzed. Oligomerized TRAIL induces apoptosis and caspase activation in all analyzed myeloma cells. In experiments with the pan-caspase inhibitor ZVAD caspase acitvation could be blocked in all cell lines, but apoptosis could be blocked only in two cell lines. Three other myeloma cell lines were only marginally rescued from apoptosis. Therefore, TRAIL can also induce caspase independent cell death in myeloma cells. Beside apoptosis TRAIL also stimulates proinflammatory pathways like the NFкB-, the JNK, the p38- and the p42/44- pathway. Thereby, the activation of the NFкB- and p42/44-pathways is always caspase-dependent, but the induction of the p38- and JNKpathways is cell type specifically caspase-dependent. Thus, taken together for myeloma therapy TRAIL should be used in combination with anti-proinflammatory drugs to avoid potential side effects related to the proinflammatory properties of TRAIL. KW - TRAIL KW - Myelom KW - Apoptose KW - TRAIL KW - multiple myeloma KW - apoptosis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27430 ER - TY - THES A1 - Patiño Gonzalez, Edwin T1 - Functional Studies and X-Ray Structure Analysis of Human Interleukin-5 Receptor Alpha and Human Interleukin-5 Complex N2 - Interleukin-5 (IL-5) is a member of the hematopoietic class I cytokines and is specifically involved in eosinophil activation. IL-5 plays an important role in disease conditions such as allergic asthma and other hypereosinophilias, which are characterized by highly increased levels of eosinophils in peripheral blood and tissues. The IL-5 receptor is a heterodimer consisting of a binding alpha subunit (IL- 5Rα) and a common beta subunit (IL-5Rβ). This IL-5Rβ is shared with the IL-3 and GM-CSF receptors. The IL-5Rα is required for ligand-specific binding, whereas the association of the IL-5Rβ subunit triggers intracellular signal transduction. Previous studies have described the crystallographic structure of human IL-5 (hIL-5), as well as that of the common IL-5Rβ chain (IL-5Rβc) However, no experimental structural data are yet available for the interaction of the high-affinity IL-5 receptor IL-5Rα with its ligand IL-5. Therefore, this thesis had the principle objective to gain new insights into the basis of this important agonist-receptor interaction. In particular, data on the recombinant expression, purification and preparation of the binary complex of hIL-5 bound to the receptor ectodomain of hIL-5Rα are shown, as well as the subsequent crystal structure analysis of the binary ligand-receptor (hIL-5Rα/hIL-5) complex. Both proteins were expressed in an Escherichia coli expression system, purified to homogeneity, and crystallized. However, since the initial analysis of these crystals did not show any X-ray diffraction, each step of the preparation and crystallization procedure had to be stepwise optimized. Several improvements proved to be crucial for obtaining crystals suitable for structure analysis. A free cysteine residue in the N-terminal domain of the hIL-5Rα ectodomain protein was mutated to alanine to remove protein heterogeneity. In addition, hIL-5 affinity chromatography of the receptor protein proved to be absolutely crucial for crystal quality. Additive screening using the initial crystallization condition finally yielded crystals of the binary complex, which diffracted to 2.5Å resolution and were suitable for structure analysis. The preliminary structure data demonstrate a new receptor architecture for the IL-5Rα ligand-binding domain, which has no similarities to other cytokine class I receptor structures known so far. The complex structure demonstrates that the ligand-binding region of human IL-5Rα is dispersed over all three extracellular domains, and adopts a binding topology in which the cytokine recognition motif (CRM) needs the first Fn-III domain of the human IL-5Rα to bind the ligand. In a second project, a prokaryotic expression system for murine IL-5 (mIL-5) was established to allow the production of mIL-5 and mIL-5 antagonist that should facilitate functional studies in mice. Since the expression of mIL-5 in E. coli had never been successful so far, a fusion protein system was generated expressing high yields of mIL-5. Chemical cleavage with cyanogen bromide (CNBr) was used to release mIL-5 monomers, which were subsequently purified and refolded. This technique yielded an active murine IL-5 dimer as confirmed by TF-1 cell proliferation assays. The protein was crystallized and the structure of mIL-5 could be determined at 2.5Å resolution. The molecular structure revealed a symmetrical left-handed four helices bundle dimer similar to human IL-5. Analysis of the structure-/function relationship allowed us to design specific mIL-5 antagonist molecules, which are still under examination. Taken together, these findings provide further insights in the IL-5 and IL-5R interaction which may help to further understand and depict this and other cytokine-receptor interactions of similar architecture, e.g. the IL-13 ligand-receptor system. Ultimately, this may represent another piece of puzzle in the attempts to rationally design and engineer novel IL-5-related pharmacological therapeutics. N2 - Interleukin-5 (IL-5) ist ein Mitglied der Gruppe der hematopoetischen Zytokine der Klasse I und spielt eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von eosinophilen Granulozyten. IL-5 hat damit ein wichtige pathophysiologische Funktion bei der Entstehung von Krankheiten wie allergischem Asthma und anderen Hypereosinophilien, die alle durch eine stark erhöhte Zahl von Eosinophilen in peripherem Blut und Geweben charakerisiert sind. Der IL-5 Rezeptor ist ein Heterodimer, der aus einer alpha-Untereinheit (IL-5Rα) und einer mit den IL-3 und GM-CSF Rezeptoren gemeinsamen beta-Untereinheit (IL-5Rβ) besteht. Der IL-5Rα ist für die spezifische Liganden-Bindung notwendig, während der mit der IL-5Rβ Untereinheit assozierte Komplex die intrazelluläre Signaltransduktion einleitet. In früheren Studien konnte bereits die Kristallstruktur des menschlichen IL-5 (hIL-5) und der gemeinsamen IL-5Rβ-Kette (IL-5Rβc) aufgeklärt werden. Allerdings liegen bisher noch keine experimentellen Strukturdaten für die Interaktionen des hochaffinen IL-5 Rezeptor IL-5Rα mit seinem Ligand IL-5 vor. Deshalb war es die Hauptzielsetzung dieser Arbeit, neue Einblicke in die molekulare Basis der Interaktion von IL-5 Rezeptor und Agonisten zu gewinnen. Im Einzelnen beschreibe ich in dieser Arbeit die rekombinante Expression, Aufreinigung und Herstellung des binären Komplexes von der hIL-5 Bindung an die extrazellulären Domäne des Rezeptors hIL-5Rα sowie die anschließende kristallographische Strukturanalyse dieses binären Ligand-Rezeptor-Komplexes (hIL-Rα/hIL-5). Beide Proteine wurden in einem Escherichia coli-Expressionssystem rekombinant hergestellt, bis zur Homogenität gereinigt und anschließend kristallisiert. Die Analysen dieser ersten Kristalle zeigten nicht die gewünschte Beugung der Röntgenstrahlung, weshalb in allen anschließenden Schritten eine schrittweise Optimierung der Produktions- und Kristallisationsbedingungen durchgeführt wurde. Als Ergebnis dieser Optimierungsstrategie konnten schließlich Kristalle erhalten werden, die für eine Strukturanalyse geeignet waren. Ein ungepaartes Cystein in der N-terminalen Domäne des extrazellulären hIL-5Rα-Protein wurde durch Alanin ersetzt, um so die Protein-Heterogenität durch Cystein-Oxidationsprodukte zu verringern. Die affinitätschromatographische Aufreinigung des Rezeptorproteins war ebenfalls entscheidend, um eine hohe Kristallqualität zu erreichen. Die Verwendung verschiedener Additivsubstanzen zusätzlich zu der initialen Kristallisationsbedingungen führte letztlich zur Bildung für die Strukturanalyse geeigneter Einzelkristallen des binären Komplexes (hIL-5Rα/hIL-5). Ihre Messung ergab Beugungsdaten mit einer maximalen Auflösung von 2.5Å. Eine erste Strukturanalyse zeigt klar, dass die Liganden-bindende Domäne des IL-5Rα Rezeptors eine bisher unbekannte, neuartige Rezeptor-Architektur aufweist, die keinerlei Ähnlichkeit zu bisher bekannten Zytokinrezeptor-strukturen der Klasse I hat. Die Struktur des Komplexes zeigt zudem, dass das Liganden-bindende Epitop von IL-5Rα über alle drei extrazelluläre Domänen verteilt ist und eine Topologie aufweist, in der zusätzlich zu dem Zytokin-Erkennungsmotiv (CRM) die erste Fn-III Domäne von hIL-5Rα benötigt wird, um den Liganden hochaffin binden zu können. In einem zweiten Projekt wurde ein prokaryotisches Expressionssystem für murines Interleukin-5 (mIL-5) entwickelt, welches die Produktion von mIL-5 und eines mIL-5 Antagonisten für funktionelle Studien in einem Mausmodell ermöglichen sollte. Da eine rekombinante Produktion von mIL-5 in E.coli bisher nicht erfolgreich war, wurde ein Fusionsproteinsystem entwickelt, welches die Produktion großer Mengen von mIL-5 Protein erlaubt. Es wurde eine chemische Spaltung mit Cyanbromid (CNBr) durchgeführt, um das Monomer aus dem Fusionsprotein freizusetzen. Das so erhaltene mIL-5 Monomer wurde gereinigt und renaturiert. Nach Rückfaltung zeigt das dimere Protein in TF-1 Zellen eine mit den Literaturwerten vergleichbare biologische Aktivität. Das so erhaltene mIL-5 Protein wurde kristallisiert und mittels Röntgenbeugung analysiert. Auf diese Weisen konnten Beugungsdaten von mIL-5 Kristallen mit einer maximalen Auflösung von 2.5Å erhalten werden. Die Struktur weist ähnlich wie das humane IL-5 ein symmetrisches Vier-Helix Bündel auf. Die Struktur-/Funktionsanalyse ermöglichte daraufhin, definierte mIL-5-Antagonisten zu entwickeln, die sich derzeit noch in der Untersuchung befinden. Zusammengefasst tragen die hier präsentierten Ergebnisse dazu bei, die molekularen Grundlagen der spezifischen IL-5 und IL-5R Bindung sowie Interaktionen ähnlichen Liganden-Rezeptor-Typen zu verstehen. Letztendlich besteht die Hoffnung, dass diese und ähnliche Arbeiten ein weiteres wichtiges Puzzlestück darstellen bei dem Versuch, neue und innovative pharmakologische Therapieansätze zu entwickeln, die bei dem für die Pathophysiologie von Asthma wichtigen Schlüsselmolekül IL-5 angreifen. KW - Functional Studies KW - Interleukin-5 KW - structure analysis KW - Strukturanalyse KW - Interleukin-5 KW - Functional Studies KW - Interleukin-5 KW - structure analysis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27319 ER - TY - THES A1 - Mezger, Markus T1 - Interaktion zwischen dem humanen Cytomegalievirus, Aspergillus fumigatus, dendritischen Zellen und neutrophilen Granulozyten T1 - Interaction of the human cytomegalovirus, Aspergillus fumigatus, dendritic cells and polymorphonuclear neutrophils N2 - Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen. N2 - Patients after allogenic stem cell transplantation (alloSCT) have an increased risk to suffer from viral and fungal infections, which are mainly caused by the human cytomegalovirus (HCMV) and the mold Aspergillus fumigatus. Due to their localization in tissues under lung epithelia and the gastrointestinal tract, dendritic cells (DCs) are considered to be the first cells coming into close contact with HCMV and A. fumigatus for the activation of innate and adaptive immune mechanisms. Within the scope of this dissertation, the role of human monocyte-derived DCs in the abatement of HCMV and A. fumgatus was analyzed. In order to work with HCMV, a cell culture system for effective culturing of the clinical relevant HCMV strain TB40E had to be established first. The viral particles up-cleaned from lung fibroblasts were used for infection of DCs and successful infection was approved by different staining methods. For this reason, it was possible to determine a time-dependent expression profile of class I interferons (IFN-alpha, IFN-beta), selected cytokines (CXCL10, CXCL11, Rantes) and immunoreceptors (TLR3, DC-SIGN). A RNA interference (RNAi) system for human DCs was established to significantly knock-down expression of TLR3 without the induction of an unwanted pro-inflammatory cytokine response. Stimulation experiments with the synthetic polymer poly I:C (which resembles dsRNA of infectious viruses) identified TLR3 as a receptor for triggering expression of IFN-beta. However, whether there is a direct activation of TLR3 through dsRNA intermediates, possibly emerging during replication of HCMV, can not be answered to date definitively, because TLR3 small interfering RNA (siRNA) transfection prior to HCMV infection did not result in minor expression of IFN-beta. Gene expression pattern of DCs after co-cultivation with living A. fumigatus germ tubes was studied by whole genome microarray analysis and real-time PCR, demonstrating an upregulation of a broad spectrum of cytokines (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), chemokines (IL-8, CCL20, CXCL10), co-stimulatory molecules (CD40, CD80, CD83, CD86), prostaglandin synthesis genes (PTGS2), as well as genes involved in fungal recognition (PTX-3, TLR2, TLR4) and cytoskeleton organization / phagocytosis. As the sentries of the immune system, DCs must recognize fungi at an early step of infection. Pathogen detection is mediated by different receptors comprising TLRs, C-type lectins and Pentraxines (PTX), but only little is known about their relevance for DCs. Using specific siRNAs, expression of TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN), Pentraxin-3 (PTX-3) and caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) was significantly diminished, respectively. In contrast to control experiments with TLR4 siRNA and LPS stimulation, A. fumigatus induced expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-12) was not reduced when TLR2 and TLR4 expression was knocked-down by specific siRNAs prior to infection. However, using siRNAs directed against Dectin-1 allowed demonstration of an interaction between Dectin-1 and A. fumigatus germlings, Candida albicans germ tubes and Zymosan. In an independent approach, cytokine secretion could be blocked by anti-Dectin-1 antibody treatement prior to fungal exposure. In conclusion, Dectin-1 was identified as an important fungal receptor on DCs whereas TLR2 and TLR4 seemed to play a negligible role. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in various cellular receptor genes are associated with the susceptibility to and severity of infectious diseases. In this study, genetic polymorphisms in genes encoding for virus entry receptors have been analyzed for their association to HCMV reactivation and disease in patients after allogeneic stem cell transplantation. A comparison of different genotyping methods highlighted the advantages of the Light Cycler system, the cycle-suequencing and the matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS) when using small quantities of patients’ DNA. Two markers (rs735240, rs2287886) in the promoter region of DC-SIGN were found to be significantly associated with an increased susceptibility to HCMV. In addition, three SNPs (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 elevated the risk for the development of invasive aspergillosis. Screening of patients after alloSCT for the presence of these defined genetic polymorphisms may help to predict the individual risk to suffer from HCMV and A. fumigatus after alloSCT. KW - Aspergillus fumigatus KW - Cytomegalie-Virus KW - Dendritische Zelle KW - Granulozyt KW - SNP KW - Microarray KW - Toll-like-Rezeptoren KW - RNS-Interferenz KW - Aspergillus fumigatus KW - human cytomegalovirus KW - dendritic cell KW - polymorphonuclear neutrophil KW - SNP KW - Microarray KW - Toll-like Receptor KW - RNA interference Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27254 ER - TY - THES A1 - Aichinger, Eric T1 - Risikoberechnung bei der Muskeldystrophie Duchenne und der Muskeldystrophie Becker T1 - Risk estimation in families with Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy N2 - Risikoberechnung in Familien mit Muskeldystrophie Duchenne oder Muskeldystrophie Becker. Unter Berücksichtigung eines Keimzellmosaiks, heterogener Neumutationsraten und der Möglichkeit homozygot betroffener Frauen. N2 - Risk estimation in families with Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy. Regarding germline mosaicism, specific mutation rates and homozygote affected women. KW - Risikoberechnung KW - Duchenne KW - Becker KW - Keimzellmosaik KW - Mutationsrate KW - Risk estimation KW - Duchenne KW - Becker KW - germline mosaicism KW - mutation rate Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27000 ER - TY - THES A1 - Froese, Alexander T1 - The Popeye domain containing gene 2 (Popdc2): Generation and functional characterization of a null mutant in mice and promoter analysis T1 - Das Popeye domain containing 2 (Popdc2) Gen : Herstellung und funktionelle Charakterisierung einer Nullmutante in Mäusen und die Analyse des Promoters N2 - In the present study a knockout mouse model of the Popeye domain containing gene 2 (Popdc2) was generated and functionally characterized. The Popdc2 null mutants were viable with an apparent normal life span. ß-galactosidase staining to visualize the expression of the Popdc2-LacZ transgene revealed the presence of the Popdc2 in heart, bladder, smooth and skeletal muscles. In the heart LacZ was found to be present in cardiac myocytes with elevated levels in the myocytes of the cardiac conduction system. Holter ECGs records of the heart function of the 8 months (but not in 3 and 6 months) old mutant and WT littermates revealed a pronounced sinus bradycardia in the mutant mice in response to three different stress regimens: isoproterenol infusion, mental stress and a physical exercise. Histological examination of the Popdc2 null mutants SAN revealed structural alterations as was detected by HCN4 staining. Moreover, volume measurements using 3-D reconstructions of serial sections stained with HCN4 antibody revealed a volume reduction of about 30% in the mutant SAN. Taken together data presented in this study suggest that the Popdc2 KO mouse line may serve as an animal model of human sick sinus syndrome. In the second part of this thesis the Popdc2 gene promoter was analyzed. Three transcription factors binding sites were predicted in the promoter region and characterized. N2 - Im Vordergrund dieser Arbeit stand die Generierung und Analyse der Popdc2 Knockout Maus. Die Expression des Popdc2-LacZ Konstruktes war vorwiegend im Herz, der Blase, sowie in der glatten und Skelett Muskulatur detektierbar/sichtbar. Der Herzrhythmus 8 Monate alter Popdc2 Mutanten und WT Nachkommen wurde anhand von Elektrokardiogrammen (EKGs) untersucht. Bei dieser Analyse wurden die Mäuse verschiedenen Stresssituationen ausgesetzt, d.h. Injektion von Isoproterenol, mentaler bzw. physikal. Stress. Die Aufzeichnung der EKG-Kurve erfolgte direkt nach der Stressinduktion über eine Zeitspanne von 6 Minuten. Es konnte gezeigt werden, dass die Mäuse eine ausgeprägte Sinus Bradykardie entwickelten. Anhand histologischer Schnitte 8 Monate alter Popdc2 KO SAN Mäuse konnten strukturelle Veränderungen im Vergleich zum WT aufgedeckt werden. Auf der Grundlage serieller Schnitte, gefärbt mit HCN4 Antikörper, wurden 3D-Rekonstruktionen erzeugt. Dabei stellte sich heraus, dass das Volumen des SAN in Popdc2 Mutante um 30% gegenüber dem Wildtyp verringert ist. Auf Grund der hier vorgestellten Daten scheint die Popdc2 KO Maus ein nützliches Tiermodell im Hinblick auf menschl. Sinus-Erkrankungen zu sein. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Popdc2 Promotor Analyse. In Promotorregion konnten drei Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren charakterisiert werden. Um weitere Faktoren, die eine Rolle bei der Popdc2 Genregulation spielen könnten, zu identifizieren sind weiterführende Studien unerlässlich. KW - Herz KW - Herzrhythmusstörung KW - Transgene Tiere KW - Popdc2 KW - KO Mäuse KW - Bradikardia KW - Popdc2 KW - KO mice KW - Heart KW - Bradycardia Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26473 ER - TY - THES A1 - Robubi, Armin T1 - RAF Kinases: Pathway, Modulation and Modeling T1 - RAF Kinase: Signalweg, Modulation und Modellierung N2 - The Ras/RAF/MEK/ERK cascade is a central cellular signal transduction pathway involved in cell proliferation, differentiation, and survival where RAF kinases are pivotal kinases implicated in cancer. The development of specific irreversible kinase inhibitors is a rewarding but difficult aim. CI-1033 was developed to irreversibly inhibit erbB receptor tyrosine kinases by reacting to the Cys113 residue (p38alpha MAP kinase numbering) of the kinase domain. In this study we tried a similar approach to target the RAF oncoproteins which posses a similar cysteine at position 108 in the hinge region between the small n-lobe and the large c-lobe of the kinase domain. A novel synthetic approach including a lyophilization step allowed us the synthesis of a diphenyl urea compound with an epoxide moiety (compound 1). Compound 1 possessed inhibitory activity in vitro. However our time kinetics experiments and mass spectroscopic studies clearly indicate that compound 1 does not react covalently with the cysteine residue in the hinge region. Moreover, in cell culture experiments, a strong activation of the RAF signaling pathway was observed, an effect which is known from several other RAF kinase inhibitors and is here reported for the first time for a diphenyl urea compound, to which the clinically used unspecific kinase inhibitor BAY 43-9006 (Sorafinib, Nexavar) belongs. Although activation was apparently independent on B- and C-RAF hetero-oligomerization in vitro, in vivo experiments support such a mechanism as the activation did not occur in starved knockout cells lacking either B-RAF or C-RAF. Furthermore, we developed a mathematical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade demonstrating how stimuli induce different signal patterns and thereby different cellular responses, depending on cell type and the ratio between B-RAF and C-RAF. Based on biochemical data for activation and dephosphorylation, we set up differential equations for a dynamical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. We find a different signaling pattern and response result for B-RAF (strong activation, sustained signal) and C-RAF (steep activation, transient signal). We further support the significance of such differential modulatory signaling by showing different RAF isoform expression in various cell lines and experimental testing of the predicted kinase activities in B-RAF, C-RAF as well as mutated versions. Additionally the effect of the tumor suppressor DiRas3 (also known as Noey2 or ARHI) on RAF signaling was studied. I could show that DiRas3 down-regulates the mitogenic pathway by inhibition of MEK, a basis for a refined model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. N2 - Die Ras/RAF/MEK/ERK Kaskade ist ein zentraler zellulärer Signalweg, der bei der Regulierung der Proliferation, Differenzierung und Überleben der Zelle eine entscheide Rolle spielt. Dabei kommt den RAF Kinasen eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese zu. Die Entwicklung von spezifischen irreversiblen Kinasehemmern stellt einen attraktiven, jedoch schwierigen Ansatz zur Tumorsupression dar. CI-1033 wurde erfolgreich mit dem Ziel entwickelt, ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen irreversibel zu inhibieren, indem es kovalent mit dem Cys113 (p38alpha MAP Kinase Nummerierung) in der Kinase-Domäne reagiert. In dieser Arbeit wird ein vergleichbarer Ansatz gegen die RAF-Onkoproteine verfolgt, die einen analogen Cystein-Rest in der Position 108 aufweisen. Dieser ist in der Hinge-Region zwischen dem kleinen n-lobe und dem großen c-lobe der Kinase-Domäne lokalisiert. Ein neuer synthetischer Ansatz, der einen Lyophilisierungsschritt mit einschloss, erlaubte hierfür die Synthese einer Diphenylharnstoff-Verbindung mit einer Epoxidgruppe (Verbindung 1). Verbindung 1 zeigt in vitro tatsächlich eine inhibitorische Aktivität gegen RAF-Kinasen. Jedoch zeigen unsere zeitkinetischen Experimente, sowie unsere massenspektrometrischen Analysen, dass Verbindung 1 keine kovalente Bindung mit dem Cystein-Rest in der Hinge-Region bildet. Außerdem stellten wir in Zellkulturexperimenten eine starke Aktivierung des RAF-induzierten Signalweges fest; ein Effekt, der bereits für andere RAF-Kinase-Inhibitoren beschrieben wurde, jedoch hier erstmalig auch für eine Diphenylharnstoff-Verbindung, zu der auch BAY 43-9006 (Sarafinib, Nexavar) gehört. BAY 43-9006 ist ein unspezifischer, für die Behandlung von Krebs zugelassener, Kinase Inhibitor. Obwohl die Aktivierung in vitro scheinbar unabhängig von einer Heterooligomerisierung von B-RAF und C-RAF war, unterstützen in vivo Experimente einen solchen Mechanismus, da in gehungerten knockout Zellen, in denen B-RAF oder C-RAF fehlte, keine Aktivierung beobachtet werden konnte. Des Weiteren zeigten wir in einem mathematischen Modell, wie abhängig vom B-RAF/C-RAF-Verhältnis verschiedene Zellantworten durch unterschiedliche Stimuli induzierbar werden. Basierend auf biochemischen Daten über Aktivierung und Dephosphorylierung sowie auf den Differentialgleichungen unseres Rechenmodells fanden wir eine unterschiedliche Signalkinetik für B-RAF (starke Aktivierung, anhaltendes Signal) und C-RAF (schwache Aktivierung, transientes Signal). Die Bedeutung dieser differenzierten Signalmodifikation wurde auch durch unterschiedliche Expression der RAF Isoformen in verschiedenen Zelllinien und durch die experimentelle Messung der Kinaseaktivität von B- und C-RAF sowie mutierte Formen überprüft. Zusätzlich wurde der Effekt des Tumorsupressorproteins DiRas3 (auch bekannt als Noey2 oder ARHI) auf den RAF-Signalweg untersucht. Wir konnten zeigen, dass DiRas3 den mitogenen Signalweges durch Inhibierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase Kinase (MEK) negativ reguliert, eine Basis für ein verfeinertes Modell der Ras/RAF/MEK/ERK Kaskade. KW - Systembiologie KW - RAf KW - BAY 43-9006 KW - Sorafinib KW - Nexavar KW - DiRas3 KW - Noey2 KW - ARHI KW - Diphenylharnstoff KW - Krebs KW - Melanom KW - Kinase Inhibitor KW - RAF KW - BAY 43-9006 KW - Sorafinib KW - Nexavar KW - DiRas3 KW - Noey2 KW - ARHI KW - diphenyl urea KW - cancer KW - melanoma KW - kinase inhibitor Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26953 ER - TY - THES A1 - Drechsler, Patrick Hans T1 - Mechanics of adhesion and friction in stick insects and tree frogs T1 - Mechanik der Adhäsion und Reibung von Stabheuschrecken und Baumfröschen N2 - Many arthropods and vertebrates can cling to surfaces using adhesive pads on their legs. These pads are either smooth and characterised by a specialised, soft cuticle or they are hairy, i.e. densely covered with flexible adhesive setae. Animals climbing with adhesive organs are able to control attachment and detachment dynamically while running. The detailed mechanisms of how tarsal pads generate adhesive and frictional forces and how forces are controlled during locomotion are still largely unclear. The aim of this study was to clarify the attachment mechanism of smooth adhesive pads as present in many insects and tree frogs. To understand the function of these fluid-based adhesive systems, I characterized their performance under standardized conditions. To this end, experiments were conducted by simultaneously measuring adhesion, friction, and contact area in single adhesive pads. The first result of this study showed that friction in stick insect attachment pads is anisotropic: Attachment pads regularly detached when slid away from the body. Further analyses of "immobilized" arolia revealed that this anisotropy is not caused by an increased shear stress in the proximal direction, but by the instability of the tarsus when pushed distally. In the second part of this study, I analysed the role of the pad secretion present in insects and tree frogs. In stick insects, shear stress was largely independent of normal force and increased with velocity, seemingly consistent with the viscosity effect of a continuous fluid film. However, measurements of the remaining force two minutes after a sliding movement showed that adhesive pads could sustain considerable static friction in insects and tree frogs. Repeated sliding movements and multiple consecutive pull-offs of stick insect single legs to deplete adhesive secretion showed that on a smooth surface, friction and adhesion strongly increased with decreasing amount of fluid in insects. In contrast, stick insect pull-off forces significantly decreased on a rough substrate. Thus, the secretion does not generally increase attachment but does so only on rough substrates, where it helps to maximize contact area. When slides with stick insect arolia were repeated at one position so that secretion could accumulate, sliding shear stress decreased but static friction remained clearly present. This suggests that static friction in stick insects, which is biologically important to prevent sliding, is based on non-Newtonian properties of the adhesive emulsion rather than on a direct contact between the cuticle and the substrate. % Analogous measurements in toe pads of tree frogs showed that they are also able to generate static friction, even though their pads are wetted by mucus. In contrast to the mechanism proposed for insects, static friction in tree frogs apparently results from the very close contact of toe pads to the substrate and boundary lubrication. In the last section of this study, I investigated adhesive forces and the mode of detachment by performing pull-off measurements at different velocities and preloads. These experiments showed that preload has only an increasing effect on adhesion for faster pull-offs. This can be explained by the viscoelastic material properties of the stick insect arolium, which introduce a strong rate-dependence of detachment. During fast pull-offs, forces can spread over the complete area of contact, leading to forces scaling with area. In contrast, the pad material has sufficient time to withdraw elastically and peel during slow detachments. Under these conditions the adhesive force will concentrate on the circumference of the contact area, therefore scaling with a length, supporting models such as the peeling theory. The scaling of single-pad forces supported these conclusions, but large variation between pads of different stick insects did not allow statistically significant conclusions. In contrast, when detachment forces were quantified for whole insects using a centrifuge, forces scaled with pad contact area and not with length. N2 - Viele Arthropoden und Vertebraten können sich mit Hilfe tarsaler Haftorgane an Oberflächen festhalten. Diese Organe sind entweder glatt, mit einer spezialisierten, weichen Cuticula oder haarig, d.h. dicht besetzt mit mikroskopisch kleinen, biegsamen Hafthaaren. Mit Haftorganen kletternde Tiere können während des Laufens Haftkräfte dynamisch kontrollieren. Die genaueren Mechanismen, mit denen Adhäsions- und Reibungskräfte erzeugt werden und mit denen die Kräfte während des Laufens schnell kontrolliert werden können, sind allerdings noch immer weitgehend unklar. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Haftmechanismus von glatten Haftorganen bei Insekten und Baumfröschen näher aufzuklären. Um die Funktion dieser flüssigkeitsbasierten Haftsysteme zu verstehen, charakterisierte ich ihr Adhäsions- und Reibungsverhalten unter standardisierten Bedingungen. Dazu führte ich Experimente an einzelnen Haftorganen durch, bei denen ich gleichzeitig Adhäsion, Reibung, und Kontaktfläche erfasste. Das erste Ergebnis dieser Arbeit war, dass die Reibung von Insektenhaftorganen von der Bewegungsrichtung abhängt. Ein Haftorgan, das vom Körper weg bewegt wird (distale Richtung), löst sich meist von der Oberfläche ab. Weitere Untersuchungen an Haftorganen bei fixiertem Tarsus zeigten, dass die Richtungsabhängigkeit nicht durch eine erhöhte Scherspannung in der proximalen Richtung hervorgerufen wird, sondern durch die Instabilität des Tarsus, wenn der Fuß vom Körper weg bewegt wird. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchte ich die Rolle des Haftsekrets bei Stabheuschrecken und Baumfröschen. Bei Stabheuschrecken war die Scherspannung unabhängig von der Normalkraft und nahm mit der Bewegungsgeschwindigkeit zu, scheinbar in Einklang mit der viskosen Reibung eines durchgehenden Flüssigkeitsfilms. Jedoch ergaben Scherspannungsmessungen bei Stabheuschrecken und Fröschen selbst zwei Minuten nach einer Gleitbewegung ein beträchtliches Maß an statischer "Rest"-Reibung. Um den Einfluss geringer werdender Haftflüssigkeit zu untersuchen, wurden wiederholte Gleitversuche sowie aufeinanderfolgende Ablöseversuche auf glatten Oberflächen durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass sowohl die Reibungs- als auch die Adhäsionskraft mit abnehmender Flüssigkeitsmenge anstieg. Im Gegensatz hierzu nahm die Adhäsionskraft auf rauen Oberflächen mit abnehmender Haftflüssigkeitsmenge ab. Demzufolge führte die Haftflüssigkeit nur auf rauen Oberflächen zu einer Vergrößerung der Kontaktfläche und zu einer Erhöhung der Adhäsionskraft. Reibungskräfte auf glatten Oberflächen wurden bei Stabheuschrecken umso geringer, je häufiger Reibungsversuche an ein und der selben Stelle durchgeführt wurden (um die Menge an Haftflüssigkeit zu erhöhen). Dennoch blieb immer eine statische Reibung vorhanden. Das Vorhandensein von statischer Reibung ist biologisch wichtig um das unfreiwillige Ausrutschen zu verhindern. Meine Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Haftreibung bei Insekten nicht auf direkte Kontakte zwischen Cuticula und Untergrund zurückzuführen ist, sondern auf die (scherverdünnende) nicht-Newtonschen Eigenschaften des zweiphasigen Haftsekrets. Analoge Messungen an Haftzehen von Baumfröschen zeigten, dass auch diese statische Reibungskräfte erzeugen können, obwohl sie von einem flüssigen Schleim benetzt sind. Im Gegensatz zu dem bei Insekten gefundenen Mechanismus, entsteht bei Fröschen die statische Reibung wahrscheinlich durch Trockenreibung und den sehr nahen Kontakt zur Oberfläche. Im letzten Teil dieser Arbeit untersuchte ich Adhäsionskräfte und den Ablösevorgang durch Haftkraftmessungen bei verschiedenen Geschwindigkeiten und Normalkräften. Diese Experimente zeigten, dass die Normalkraft nur bei schnellem Ablösen zu höheren Adhäsionskräften führt. Dies ist durch die viskoelastischen Materialeigenschaften der Stabheuschrecken-Arolien erklärbar, die zu einer starken Geschwindigkeitsabhängigkeit des Ablösevorgangs führen. Bei schnellem Ablösen breiten sich die Kräfte über die gesamte Kontaktzone aus, was zu einer Flächenskalierung der Adhäsion führt. Im Gegensatz dazu hat das Haftorgan bei einem langsamen Ablöseprozess genügend Zeit, sich elastisch zurückzuziehen und abzuschälen. Unter diesen Bedingungen konzentriert sich die Kraft am Rand der Kontaktzone, wodurch die Adhäsionskräfte mit einer Länge skalieren, wie z.B. von der "peeling" Theorie vorhergesagt. Die Skalierung von Einzelbein-Haftkräften bestätigte diese Schlußfolgerungen, aber die starke Variation zwischen verschiedenen Stabheuschrecken erlaubte es nicht, diese statistisch abzusichern. Im Gegensatz dazu zeigten die Haftkräfte ganzer Insekten, welche mit Hilfe einer Zentrifuge gemessen wurden, eine deutliche Flächenskalierung. KW - Biomechanik KW - Adhäsion KW - Flüssigkeitsreibung KW - Reibung KW - Frosch KW - Insekten KW - Carausius morosus KW - Haftung KW - Schubspannung KW - Emulsion KW - Schälen KW - Haftmechanismen KW - Haftorgane KW - Haftflüssigkeit KW - Litoria caerulea KW - Scherspannung KW - Wet adhesion model KW - biomechanics KW - adhesion KW - friction KW - attachment structure KW - adhesive fluid KW - wet adhesion KW - shear stress KW - emulsion KW - attachment devices KW - peeling Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26836 ER - TY - THES A1 - Kleinhenz, Marco T1 - Wärmeübertragung im Brutbereich der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Heat transfer in the brood area of honeybees (Apis mellifera) N2 - In dieser Arbeit untersuche ich das Verhalten von Arbeiterbienen beim Brutwärmen, die Wärmeübertragung von den Bienen auf die gedeckelte Brut, die thermophysikalischen Eigenschaften des Brutnests und spezielle Aspekte des Brutnestaufbaus, die für dieses Thema relevant sind und bisher nicht untersucht wurden. Meine Arbeit umfasst Verhaltensbeobachtungen und thermografische Messungen an individuellen Bienen, die Simulation des Heizverhaltens von Arbeiterinnen und das Messen der Temperaturänderungen in der Wabe, die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und der Zellwände (Wärmeleitfähigkeit und Durchlässigkeit für Wärmestrahlung), die Auswertung von Brutzelltemperaturen als Ergebnis des Verhaltens von Arbeiterbienen, die Analyse der Anzahl und der räumlichen Verteilung von Brutlücken (Auswertung in 2-D und 3-D bezüglich beider Wabenseiten) und die Entwicklung spezifischer Computersoftware, die zur Erarbeitung dieser Ergebnisse unverzichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung und Beschreibung eines bemerkenswerten, bislang unbekannten Verhaltens der Honigbiene: Die Aufrechterhaltung hoher Thoraxtemperaturen (TTh) bei Langzeitbesuchen in offenen Zellen („Lücken“) die verstreut in der gedeckelten Brutfläche vorkommen. Hier zeige ich, dass die Aufrechterhaltung der hohen TTh nicht auf den Zellinhalt (z. B. offene Brut) bezogen ist - in den meisten Fällen waren die besuchten Zellen ohnehin leer - sondern auf die direkt benachbarte gedeckelte Brut, mit der diese Zellen über gemeinsame Zellwände in Kontakt stehen. Dieses Verhalten liefert eine Erklärung für Langzeitzellbesuche von sehr langer Dauer ohne erkennbare Aktivität, die in früheren Arbeiten beschrieben aber nicht völlig verstanden wurden, und es rehabilitiert die scheinbar „faulen“ Bienen im Zellinnern. Diesem Verhalten kommt eine große Bedeutung für das Brutwärmen zu, da sich der aufgeheizte Thorax tief in der Wabe (fast an der Mittelwand) befindet wo der Wärmeverlust an die Luft minimiert ist und von wo bis zu 6 umliegende Puppenzellen gleichzeitig gewärmt werden können. Im Vergleich zum Brutwärmeverhalten an der Wabenoberfläche (Andrücken des Thorax an die Brutdeckel), wo nur 1 oder Teile von 3 Brutdeckeln mit dem Thorax in Berührung stehen, ist das Wärmen im Zellinnern mit derselben TTh bis zu 2,6-fach effizienter. Die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und die Simulation des Brutwärmeverhaltens unter kontrollierten Bedingungen zeigen, dass sich die Wabe langsam aufwärmt und eher ein lokal begrenztes Wärmen als eine rasche Wärmeausbreitung über eine große Fläche begünstigt. Der Einflussbereich eines einzelnen Zellbesuchers hängt von seiner TTh und der Dauer des Zellbesuchs ab. Anstiege der Bruttemperatur in bis zu 3 Zellen Abstand zum Zellbesucher sind nachweisbar. Das hier beschriebene Brutwärmeverhalten im Innern von Lücken (offenen Zellen) bietet nicht nur neue Einsichten in das Bienenverhalten. Es ermöglicht auch eine Neubewertung der Lücken und ihrer Nützlichkeit für die Bienen. Eine von mir entwickelte Computersoftware („CombUse 2.0“) ermöglicht es, das Vorkommen und die räumliche Verteilung von Lücken mit hoher Genauigkeit auf der Ebene einzelner Zellen zu erfassen und auszuwerten. Die räumliche Verteilung der Lücken in der gedeckelten Brutfläche zeigt, dass schon bei geringen Lückenhäufigkeiten von ca. 4 bis 10 %, die in gesunden Kolonien normal sind, eine überraschend große Zahl gedeckelter Brutzellen (88 % bis 99 %, wenn die dreidimensionale Verteilung berücksichtigt wird) im Einflussbereich von Brut wärmenden Zellbesuchern sind. Obwohl das Brutwärmeverhalten im Zellinnern schwer zu entdecken und zu beobachten ist, führen die in dieser Arbeit präsentierten Daten zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen wichtigen Bestandteil der Nestklimatisierung bei Honigbienen handelt. N2 - In this thesis I investigate the behaviour of worker bees while incubating brood, heat transfer from bees to the sealed brood, the thermophysical properties of the brood nest and special aspects of brood nest architecture that are relevant for this topic but have not been investigated so far. My work comprises behavioural observations and thermographic measurements of individual bees, simulation of worker bees’ heating behaviour and measurement of temperature changes within the brood comb, the measurement of thermophysical properties of the brood comb and cell walls (thermal conductivity and transmission of thermal radiation), the analysis of brood cell temperatures as a result of the behaviour of worker bees, the analysis of the number and spatial distribution of brood gaps (analysis in 2-D and 3-D with regard to both sides of a comb) and the engineering of specific computer software which was indispensable to achieve these results. One major result of this work is the discovery and description of a very remarkable, hitherto unknown behaviour of the honeybee: the maintenance of high thorax temperatures (TTh) during long-time visits to open cells (“gaps”) which are scattered at low rates among the sealed brood. Here I show that the maintenance of high TTh is not related to the contents of the visited cells (anyway, they were empty in most cases) but to the presence of sealed brood which is directly adjacent to and sharing common cell walls with the visited cell. The discovery of this behaviour casts a positive light on apparently “lazy” bees and provides an explanation for long-time cell-visits with durations of several ten minutes which were described but not fully understood in earlier works by other authors. Moreover, this behaviour is of high relevance for brood incubation itself because the heated thorax is deep in the comb (almost down to the middle wall) where heat loss to the air is minimized and where up to 6 surrounding pupa cells can be warmed simultaneously. In comparison to specific brood incubation behaviour on the comb surface (pressing the thorax onto the brood caps), where only one or parts of three brood caps may be in touch with a heated thorax, heating inside cells with the same TTh is up to 2,6 times more efficient. The measurement of thermophysical properties of the brood comb and the simulation of worker heating under controlled conditions show that the comb warms up slowly and supports local heating rather than a rapid spread of heat all over the area. The radius-of-influence of a single cell visitor depends on its TTh and on the duration of the cell visit. Increases of brood temperature as far as three cells away from the cell visitor may be detected. The brood incubation behaviour via gaps (i.e. open cells) which I describe in this work does not only give new insights into bee behaviour. It also allows a reconsideration of the gaps them¬selves and their usefulness to the bees. A specific computer software (“CombUse 2.0”) which I developed for this work allowed me to register and analyze the spatial distribution of gaps with high precision on the level of cells, in contrast to rough estimations of brood areas and gap numbers which are commonly used in bee-breeding and population assessments. The analysis of the spatial distribution of gaps in the sealed brood area shows that even at small proportions of gaps (ca. 4 to 10 %, common to healthy colonies), a surprisingly large number (88 % to 99 %, if the three-dimensional distribution of gaps is considered) of sealed brood cells is within the reach of brood incubating worker bees visiting these gaps. Although brood incubation behaviour inside cells is very difficult to detect and observe, the data presented in this work strongly suggest that heating inside cells is an important part of nest climate control and other aspects of social life in honeybee colonies. KW - Biene KW - Bienenzelle KW - Carnica-Biene KW - Biene KW - Bienenbrut KW - Thermoregulation KW - Wabe KW - Verhalten KW - honeybee KW - behaviour KW - thermoregulation KW - brood KW - comb Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26866 ER - TY - THES A1 - Höfling, Christine T1 - Gentherapie bei Fanconi Anämie T1 - gene therapy in fanconi anemia N2 - Unter Fanconi Anämie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erhöhter spontaner Chromosomenbrüchigkeit, sowie erhöhter Anfälligkeit für toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer Anämie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unmöglich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zukünftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden können. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zukünftig wieder an Bedeutung verlieren wird. N2 - Fanconi anemia (FA) is an inherited autosomal recessive disease, which is accompanied by increased spontaneous chromosomal breackage, and increased susceptibility to DNA-crosslinking agents such as mitomycin C (MMC) or diepoxybutane (DEB).There are various treatment options to improve life expectancy and quality of life of Fanconi anemia patients. Therapeutic options include administration of androgens or growth factors, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), but also somatic gene therapy. Gene therapy experiments at FA fail in advanced aplastic anemia (bone marrow failure) because getting the necessary quantities of CD34 positive blood stem cells for successful transduction is difficult, if not impossible. With further improvements, HSCT will become the treatment of choice, even though this does not eliminate the life-long thread of solid tumors in FA-patients. KW - Gentherapie KW - Fanconi-Anämie KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Stammzelltransplantation KW - gene therapy KW - fanconi anemia KW - stem cell transplantation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26363 ER -