TY - JOUR A1 - Čuklina, Jelena A1 - Hahn, Julia A1 - Imakaev, Maxim A1 - Omasits, Ulrich A1 - Förstner, Konrad U. A1 - Ljubimov, Nikolay A1 - Goebel, Melanie A1 - Pessi, Gabriella A1 - Fischer, Hans-Martin A1 - Ahrens, Christian H. A1 - Gelfand, Mikhail S. A1 - Evguenieva-Hackenberg, Elena T1 - Genome-wide transcription start site mapping of Bradyrhizobium japonicum grown free-living or in symbiosis - a rich resource to identify new transcripts, proteins and to study gene regulation JF - BMC Genomics N2 - Background Differential RNA-sequencing (dRNA-seq) is indispensable for determination of primary transcriptomes. However, using dRNA-seq data to map transcriptional start sites (TSSs) and promoters genome-wide is a bioinformatics challenge. We performed dRNA-seq of Bradyrhizobium japonicum USDA 110, the nitrogen-fixing symbiont of soybean, and developed algorithms to map TSSs and promoters. Results A specialized machine learning procedure for TSS recognition allowed us to map 15,923 TSSs: 14,360 in free-living bacteria, 4329 in symbiosis with soybean and 2766 in both conditions. Further, we provide proteomic evidence for 4090 proteins, among them 107 proteins corresponding to new genes and 178 proteins with N-termini different from the existing annotation (72 and 109 of them with TSS support, respectively). Guided by proteomics evidence, previously identified TSSs and TSSs experimentally validated here, we assign a score threshold to flag 14 % of the mapped TSSs as a class of lower confidence. However, this class of lower confidence contains valid TSSs of low-abundant transcripts. Moreover, we developed a de novo algorithm to identify promoter motifs upstream of mapped TSSs, which is publicly available, and found motifs mainly used in symbiosis (similar to RpoN-dependent promoters) or under both conditions (similar to RpoD-dependent promoters). Mapped TSSs and putative promoters, proteomic evidence and updated gene annotation were combined into an annotation file. Conclusions The genome-wide TSS and promoter maps along with the extended genome annotation of B. japonicum represent a valuable resource for future systems biology studies and for detailed analyses of individual non-coding transcripts and ORFs. Our data will also provide new insights into bacterial gene regulation during the agriculturally important symbiosis between rhizobia and legumes. KW - Bradyrhizobium KW - RNA-seq KW - Promoter prediction KW - Genome re-annotation KW - Internal transcription start site KW - Nodule KW - Transcription start site KW - Proteogenomics KW - Antisense RNA Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164565 VL - 17 ER - TY - JOUR A1 - Zukher, Inna A1 - Novikova, Maria A1 - Tikhonov, Anton A1 - Nesterchuk, Mikhail V. A1 - Osterman, Ilya A. A1 - Djordjevic, Marko A1 - Sergiev, Petr V. A1 - Sharma, Cynthia M. A1 - Severinov, Konstantin T1 - Ribosome-controlled transcription termination is essential for the production of antibiotic microcin C JF - Nucleic Acids Research N2 - Microcin C (McC) is a peptide-nucleotide antibiotic produced by Escherichia coli cells harboring a plasmid-borne operon mccABCDE. The heptapeptide MccA is converted into McC by adenylation catalyzed by the MccB enzyme. Since MccA is a substrate for MccB, a mechanism that regulates the MccA/MccB ratio likely exists. Here, we show that transcription from a promoter located upstream of mccA directs the synthesis of two transcripts: a short highly abundant transcript containing the mccA ORF and a longer minor transcript containing mccA and downstream ORFs. The short transcript is generated when RNA polymerase terminates transcription at an intrinsic terminator located in the intergenic region between the mccA and mccB genes. The function of this terminator is strongly attenuated by upstream mcc sequences. Attenuation is relieved and transcription termination is induced when ribosome binds to the mccA ORF. Ribosome binding also makes the mccA RNA exceptionally stable. Together, these two effects-ribosome induced transcription termination and stabilization of the message-account for very high abundance of the mccA transcript that is essential for McC production. The general scheme appears to be evolutionary conserved as ribosome-induced transcription termination also occurs in a homologous operon from Helicobacter pylori. KW - escherichia coli KW - messenger-RNA decay KW - translation KW - expression KW - synthetase KW - enterobacteria KW - inhibitors KW - maturation KW - target KW - stability Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114839 SN - 0305-1048 VL - 42 IS - 19 ER - TY - JOUR A1 - Zingler, G. A1 - Ott, M. A1 - Blum, G. A1 - Falkenhagen, U. A1 - Naumann, G. A1 - Sokolowska-Köhler, W. A1 - Hacker, Jörg T1 - Clonal analysis of Escherichia coli serotype O6 strains from urinary tract infections N2 - A total of 36 Escherichia coli urinary tract isolates (UTI) of serotype 06, with different combinations of capsule ( K) and flagellin ( H) antigens, were analysed according to the outer membrane pattern (OMP), serum resistance properties, mannose-resistant hemagglutination using various types of erythrocytes, and also for the genetic presence and the expression of Pfimbriae. S fimbriae/F1 C fimbriae, Type 1 fimbriae, aerobactin and hemolysin. Twenty selected strains were further analysed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), elaborating genomic profilas by Xba I cleavage and subsequent Southern hybridization to virulence-associated DNA probes. lt could be shown that 06 UTI isolates represent a highly heterogeneaus group of strains according to the occurrence and combination of these traits. Relatedness an the genetic and the phenotypic Ievei was found for some of the strains exhibiting the same 0: K: H: F serotype. DNA Iang-range mapping further indicated some interesting features, according to the copy number and the genomic linkage of virulence genes. KW - Infektionsbiologie KW - E. coli serotype 06 KW - urinary tract infection KW - virulence factors KW - clonal analysis KW - molecular epidemiology Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59786 ER - TY - JOUR A1 - Zingler, G. A1 - Blum, G. A1 - Falkenhagen, U. A1 - Orskov, I. A1 - Orskov, F. A1 - Hacker, Jörg A1 - Ott, M T1 - Clonal differentiation of uropathogenic E. coli isolates of serotype O6:K5 by fimbrial antigen typing and DNA long-range mapping techniques N2 - Escherichia coli isolates of serotype 06: K5 are the most common causative agents of cystitis and pyelonephritis in adults. To answer the question, as to whether strains of this particular serotype represent one special clonal group, out of a collection of 34 serotype 06: K5 isolates [Zingler et al. ( 1990) Zentralbl. Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 274:372-381] 15 strains were selected andanalyzed in detail. The flagellar (H) antigen and the outer membrane protein (OMP) pattern were determined. Furtherserum resistance properties and the genetic presence and expression of other virulence factors, including hemolysin, aerobactin, P fimbriae, S/F1C fimbriae and type 1 fimbriae was evaluated. In~laddition the Xbalmacrorestriction pattern of ten representative isolates was elaborated and the fimbrial (F) antigentype ofthe P fimbriae was determined, to obtain the complete 0: K: H: F pattern. These analyses could clearly show that the 06: K5 isolates do not represent one clonal group. The Xbal-macrorestriction profiles were heterogeneaus and marked differences in the hybridization patterns, using virulenceassociated gene probes in Southern hybridization of long-range-separated genomic DNA, were observed among the strains. However, some of strains showed similarities in the genomic profiles, arguing for clonal groupings among the 06: K5 isolates. lnterstingly the strains grouped tagether exhibited the same fimbrial F typethat many indicate a coincidence of this phenotypic trait with clonality. KW - Infektionsbiologie Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59865 ER - TY - THES A1 - Zdziarski, Jaroslaw Maciej T1 - Bacterial Genome Plasticity and its Role for Adaptation and Evolution of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Strains T1 - Über die Bedeutung der bakteriellen Genomplastizität für die Adaptation und Evolution asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolate N2 - Asymptomatic bacteriuria (ABU) represents the long term bacterial colonization of the urinary tract, frequently caused by Escherichia coli (E. coli), without typical symptoms of a urinary tract infection (UTI). To investigate characteristics of ABU E. coli isolates in more detail, the geno- and phenotypes of eleven ABU isolates have been compared. Moreover, consecutive in vivo re-isolates of the model ABU strain 83972 were characterized with regard to transcriptomic, proteomic and genomic alterations upon long term in vivo persistence in the human bladder. Finally, the effect of the human host on bacterial adaptation/evolution was assessed by comparison of in vitro and in vivo-propagated strain 83972. ABU isolates represent a heterologous group of organisms. The comparative analysis of different ABU isolates elucidated the remarkable genetic and phenotypic flexibility of E. coli isolates. These isolates could be allocated to all four major E. coli phylogenetic lineages as well as to different clonal groups. Accordingly, they differed markedly in genome content, i.e., the genome size as well as the presence of typical UPEC virulence-associated genes. Multi locus sequence typing suggested that certain ABU strains evolved from UPEC variants that are able to cause symptomatic UTI by genome reduction. Consequently, the high E. coli genome plasticity does not allow a generalized view on geno- and phenotypes of individual isolates within a clone. Reductive evolution by point mutations, DNA rearrangements and deletions resulted in inactivation of genes coding for several UPEC virulence factors, thus supporting the idea that a reduced bacterial activation of host mucosal inflammation promotes the ABU lifestyle of these E. coli isolates. Gene regulation and genetic diversity are strategies which enable bacteria to live and survive under continuously changing environmental conditions. To study adaptational changes upon long term growth in the bladder, consecutive re-isolates of model ABU strain 83972 derived from a human colonisation study and from an in vitro long term cultivation experiment were analysed with regard to transcriptional changes and genome rearrangements. In this context, it could be demonstrated that E. coli, when exposed to different host backgrounds, is able to adapt its metabolic networks resulting in an individual bacterial colonisation strategy. Transcriptome and proteome analyses demonstrated distinct metabolic strategies of nutrients acquisition and energy production of tested in vivo re-isolates of strain 83972 that enabled them to colonise their host. Utilisation of D-serine, deoxy- and ribonucleosides, pentose and glucuronate interconversions were main up-regulated pathways providing in vivo re-isolates with extra energy for efficient growth in the urinary bladder. Moreover, this study explored bacterial response networks to host defence mechanisms: The class III alcohol dehydrogenase AdhC, already proven to be involved in nitric oxide detoxification in pathogens like Haemophilus influenzae, was shown for the first time to be employed in defending E. coli against the host response during asymptomatic bacteriuria. Consecutive in vivo and in vitro re-isolates of strain 83972 were also analysed regarding their genome structure. Several changes in the genome structure of consecutive re-isolates derived from the human colonisation study implied the importance of bacterial interactions with the host during bacterial microevolution. In contrast, the genome structure of re-isolates from the in vitro long term cultivation experiment, where strain 83972 has been propagated without host contact, was not affected. This suggests that exposure to the immune response promotes genome plasticity thus being a driving force for the development of the ABU lifestyle and evolution within the urinary tract. N2 - Asymptomatische Bakteriurie (ABU) stellt eine bakterielle Infektion der Harnblase über einen langen Zeitraum dar, die häufig von Escherichia coli hervorgerufen wird, ohne dass typische Symptome einer Harnwegsinfektion auftreten. Um die Charakteristika von ABU E. coli Isolaten genauer zu untersuchen, wurden die Geno- und Phänotypen von 11 ABU-Isolaten verglichen. Außerdem wurden in mehreren aufeinanderfolgenden in vivo-Reisolaten des Modell-ABU Stammes 83972 die Veränderungen im Transkriptom, Proteom und Genom während einer langfristigen Persistenz in der menschlichen Blase charakterisiert. Schließlich wurde der Effekt des menschlichen Wirtes auf die bakterielle Adaptation durch einen Vergleich von in vitro- mit in vivo-kultivierten Stämmen abgeschätzt. ABU-Isolate stellt eine heterogene Gruppe von Organismen dar. Diese können den vier phylogenetischen Hauptgruppen von E. coli sowie unterschiedlichen klonalen Gruppen zugeordnet werden. Dementsprechend unterscheiden sie sich erheblich bezüglich der Zusammensetzung des Genomes, der Genomgröße und auch der Ausstattung mit UPEC-typischen Virulenz-assoziierten Genen. Multi-Lokus-Sequenz-Typisierung legt nahe, dass bestimmte ABU Stämme sich durch Genomreduktion aus UPEC Stämmen entwickelt haben, die eine Harnwegsinfektion mit charakteristischen Symptomen auslösen konnten. Folglich erlaubt die hohe Genomplastizität von E. coli keine generalisierte Betrachtung einzelner Isolate eines Klons. Genomreduktion über Punktmutationen, Genom-Reorganisation und Deletionen resultierte in der Inaktivierung einiger Gene, die für einige UPEC Virulenz-Faktoren kodieren. Dies stützt die Vorstellung, dass eine verminderte bakterielle Aktivierung der Entzündung der Wirtsschleimhaut den Lebensstil von ABU (bei diesen E. coli-)Isolaten fördert. Genregulation und genetische Diversität sind Strategien, die es Bakterien ermöglichen unter sich fortlaufend ändernden Bedingungen zu leben bzw. zu überleben. Um die anpassungsbedingten Veränderungen bei einem langfristigen Wachstum in der Blase zu untersuchen, wurden aufeinanderfolgende Reisolate, denen eine langfristige in vivo-Kolonisierung im menschlichen Wirt beziehungsweise eine in vitro-Kultivierung vorausgegangen ist, im Hinblick auf Veränderungen Genexpression und Genomorganisation analysiert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass E. coli in der Lage ist, seine metabolischen Netzwerke verschiedenen Wachstumsbedingungen anzupassen und individuelle bakterielle Kolonisierungsstrategien entwickeln kann. Transkriptom- und Proteom-Analysen zeigten verschiedene metabolische Strategien zur Nährstoffbeschaffung und Energieproduktion bei untersuchten in vivo-Reisolaten vom Stamm 83972, die es ihnen ermöglichen, den Wirt zu kolonisieren. Das Zurückgreifen auf D-Serin, Deoxy- und Ribonucleoside sowie die bidirektionale Umwandlung zwischen Pentose und Glucuronat waren hoch-regulierte Stoffwechselwege, die die in vivo-Reisolate mit zusätzlicher Energie für ein effizientes Wachstum in der Blase versorgen. Zudem wurden in dieser Studie die Netzwerke für eine Reaktion auf Abwehrmechanismen des Wirtes erforscht: Erstmals wurde hier die Rolle der Klasse-III-Alkoholdehydrogenase AdhC, bekannt durch ihre Bedeutung bei der Entgiftung von Stickstoffmonoxid, bei der Wirtsantwort während einer asymptomatischen Bakteriurie gezeigt. Aufeinanderfolgende in vivo- und in vitro-Reisolate vom Stamm 83972 wurden ebenfalls bezüglich ihrer Genomstruktur analysiert. Einige Veränderungen in der Genomstruktur der aufeinanderfolgenden Reisolate, die von einer humanen Kolonisierungsstudie stammen, implizieren die Bedeutung einer Interaktion der Bakterien mit dem Wirt bei der Mikroevolution der Bakterien. Dagegen war die Genomstruktur von Reisolaten eines langfristigen in vitro-Kultivierungsexperiments, bei dem sich der Stamm 83972 ohne Wirtskontakt vermehrt hat, nicht von Veränderungen betroffen. Das legt nahe, dass die Immunantwort eine Genomplastizität fördert und somit eine treibende Kraft für den ABU Lebensstil und die Evolution im Harnwegstrakt ist. KW - Escherichia coli KW - Evolution KW - Virulenz KW - Molekulargenetik KW - Asymptomatic Bacteriuria KW - Infection KW - UTI KW - UPEC Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32879 ER - TY - JOUR A1 - Zdziarski, Jaroslaw A1 - Brzuszkiewicz, Elzbieta A1 - Wullt, Bjorn A1 - Liesegang, Heiko A1 - Biran, Dvora A1 - Voigt, Birgit A1 - Gronberg-Hernandez, Jenny A1 - Ragnarsdottir, Bryndis A1 - Hecker, Michael A1 - Ron, Eliora Z. A1 - Daniel, Rolf A1 - Gottschalk, Gerhard A1 - Hacker, Joerg A1 - Svanborg, Catharina A1 - Dobrindt, Ulrich T1 - Host Imprints on Bacterial Genomes-Rapid, Divergent Evolution in Individual Patients N2 - Bacteria lose or gain genetic material and through selection, new variants become fixed in the population. Here we provide the first, genome-wide example of a single bacterial strain’s evolution in different deliberately colonized patients and the surprising insight that hosts appear to personalize their microflora. By first obtaining the complete genome sequence of the prototype asymptomatic bacteriuria strain E. coli 83972 and then resequencing its descendants after therapeutic bladder colonization of different patients, we identified 34 mutations, which affected metabolic and virulence-related genes. Further transcriptome and proteome analysis proved that these genome changes altered bacterial gene expression resulting in unique adaptation patterns in each patient. Our results provide evidence that, in addition to stochastic events, adaptive bacterial evolution is driven by individual host environments. Ongoing loss of gene function supports the hypothesis that evolution towards commensalism rather than virulence is favored during asymptomatic bladder colonization. KW - Proteomanalyse KW - Bakterien Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68594 ER - TY - JOUR A1 - Yu, Sung-Huan A1 - Vogel, Jörg A1 - Förstner, Konrad U. T1 - ANNOgesic: a Swiss army knife for the RNA-seq based annotation of bacterial/archaeal genomes JF - GigaScience N2 - To understand the gene regulation of an organism of interest, a comprehensive genome annotation is essential. While some features, such as coding sequences, can be computationally predicted with high accuracy based purely on the genomic sequence, others, such as promoter elements or noncoding RNAs, are harder to detect. RNA sequencing (RNA-seq) has proven to be an efficient method to identify these genomic features and to improve genome annotations. However, processing and integrating RNA-seq data in order to generate high-resolution annotations is challenging, time consuming, and requires numerous steps. We have constructed a powerful and modular tool called ANNOgesic that provides the required analyses and simplifies RNA-seq-based bacterial and archaeal genome annotation. It can integrate data from conventional RNA-seq and differential RNA-seq and predicts and annotates numerous features, including small noncoding RNAs, with high precision. The software is available under an open source license (ISCL) at https://pypi.org/project/ANNOgesic/. KW - genome annotation KW - RNA-seq KW - transcriptomics Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178942 VL - 7 ER - TY - THES A1 - Wu, Rongxue T1 - Integrins and SPARC : potential implications for cardiac remodeling N2 - Der enorme Umbau des Herzgewebes, wie man ihn nach Drucküberlastung des Ventrikels oder MyokardInfarkt beobachten kann, gilt als eine der kausalen Ursachen des Herzversagens. Die Veränderungen in der Architektur des Herzens beeinflussen die mechanischen Eigenschaften des Herzmuskels, begründet sind sie jedoch in Anpassungsprozessen auf der zellulären Ebene vor allem in einer Modulation der Expression bestimmter Gene. Gemeinsam mit Integrinen, den Transmembran-Rezeptoren, welche die extrazelluläre Umgebung mit dem intrazellulären Zytoskelett verbinden, gehören Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) und matrizelluläre Proteine zu den Schlüsselkomponenten, die den Umbauprozess im Herzen steuern. Aus diesen Gründen hatte diese Doktorarbeit zum Ziel, die Rolle der Integrine für die Regulation der Genexpression und die Leistungsfähigkeit des Herzmuskels während der durch Drucküberlastung oder myokardialen Infarkt (MI) hervorgerufenen Wundheilungsprozesse zu analysieren. Um die Beteiligung von Integrin Beta 1 zu untersuchen, wurde ein experimentelles Modell der Drucküberlastung im Mausherzen (aortic banding; Konstriktion der Aorta; AB) eingesetzt, wobei Mäuse mit einer konditionalen, Herz-spezifischen Deletion des Integrin Beta 1 Gens untersucht wurden. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf die physiologischen Unterschiede und eine veränderte Genexpression im gestressten Herzen in An- oder Abwesenheit von Integrin Beta 1 gelegt. Interessanterweise wurden die Mäuse, welche eine Kombination aus Integrin knock-out Allel und dem Kardiomyozyten-spezifischen konditionalen knock-out Allel von Integrin Beta 1 aufwiesen im normalen Mendelschen Verhältnis geboren und wuchsen normal auf. Obwohl diese Tiere immer noch geringe Mengen von Integrin Beta 1 in ihrem Herzen aufwiesen (exprimiert von nicht-Myozyten), besaßen diese Mäuse eine veränderte Herzfunktion und waren sehr sensitiv gegenüber AB. Im Gegensatz zu der kompensatorischen hypertrophischen Reaktion, die in Wildtyp Mäusen zu beobachten war, zeigte sich in den Integrin Beta 1–defizienten Mausherzen kein Gewebeumbau. Auch die erhöhte Expression von verschiedenen ECM Proteinen, insbesondere die verstärkte Expression des matrizellulären Proteins SPARC, unterblieb nach AB in den Integrin Beta 1–defizienten Tieren. Interessanterweise konnte auch eine transiente Erhöhung der SPARC mRNA während der Umbauprozesse im Herzen in Folge von myokardialem Infarkt (MI) mittels cDNA Makroarrays festgestellt werden. In der Tat fanden sich größere Mengen von SPARC bereits 2 Tage (~2,5-fach erhöht), 7 Tage (~4-fach erhöht) und 1 Monat (~2-fach erhöht) nach MI, während ein spezifischer Inhibitor der Integrin alpha v Untereinheit diese Hochregulation von SPARC in vivo verhinderte. Immunfluoreszenz Untersuchungen von Herzgewebe verdeutlichten, dass sich die erhöhte Expression von SPARC auf das Infarktareal beschränkte, dass die Expression von SPARC nach einer anfänglichen Erhöhung im Verlauf von 1 Monaten wieder auf das Anfangsniveau zurückging und dass die verstärkte Expression von der Einwanderung von Fibroblasten in das ischämische Herzgewebe begleitet war. In vitro stimulierten die Wachstumsfaktoren TGF-Beta 1 und PDGF-BB die Expression von SPARC durch Fibroblasten. Wie sich an Hand von ELISA und Western Blot Untersuchungen feststellen ließ, war die Inhibition von Integrin Beta v nicht in der Lage, die durch TGF-Beta 1 oder PDGF induzierte Sekretion von SPARC zu beeinflussen. Jedoch zeigte sich, dass Vitronektin, ein Ligand von Integrin alpha v, sowohl die Sekretion von TGF-Beta 1 als auch von PDGF-BB durch Kardiomyozyten induzierte und diese Reaktion wurde durch den Integrin alpha v Inhibitor komplett unterdrückt. In funktioneller Hinsicht wirkte SPARC auf die durch ECM Proteine induzierte Migration von Fibroblasten ein, so dass man davon ausgehen kann, dass die lokale Freisetzung von SPARC nach myokardialem Infarkt zur Wundheilung im Herzen beiträgt. Zusammenfassend läßt die Kombination der in vivo und in vitro erhobenen experimentellen Daten den Schluss zu, dass mehrere Integrin Untereinheiten eine entscheidende Rolle während der Gewebeumbildung im Herzen spielen. Integrin-abhängige Genexpressionsereignisse wie beispielsweise die erhöhte Expression von SPARC nach MI sind entscheidend an der Koordination der Wundheilung beteiligt. Diese Prozesse scheinen auf einer komplexen Wechselwirkung und Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen wie Kardiomyozyten und Fibroblasten zu beruhen, um lokal begrenzt eine Heilung und Vernarbung des verletzten Gewebes zu regulieren. Die Aufklärung des fein abgestimmten Wechselspiels zwischen Integrinen matrizellulären Proteinen wie SPARC und Wachstumsfaktoren wird sicherlich zu einem besseren und klinisch nutzbarem Verständnis der molekularen Mechanismen des Gewebeumbaus im Herzen beitragen. N2 - The massive remodeling of the heart tissue, as observed in response to pressure overload or myocardial infarction, is considered to play a causative role in the development of heart failure. Alterations in the heart architecture clearly affect the mechanical properties of the heart muscle, but they are rooted in changes at the cellular level including modulation of gene expression. Together with integrins, the transmembrane receptors linking the extracellular environment to the cytoskeleton, extracellular matrix (ECM) proteins and matricellular proteins are key components of the remodeling process in the heart. Therefore, this thesis was aimed at analysing the role of integrins in the regulation of gene expression and heart muscle performance during cardiac wound repair induced by pressure overload or myocardial infarction (MI). To investigate the contribution of integrin Beta 1, we characterised the response of mice with a conditional, cardiac-specific deletion of the integrin Beta 1 gene in an experimental model of pressure overload by aortic banding (AB). In particular, we measured physiological alterations and gene expression events in the stressed heart in the presence or absence of integrin Beta 1. Interestingly, mice containing a knock-out allele and the ventricular myocyte-specific conditional allele of the integrin Beta 1 gene were born and grew up to adulthood. Though these animals still exhibited minor amounts of integrin Beta1 in the heart (expressed by non-myocytes), these mice displayed abnormal cardiac function and were highly sensitive to AB. Whereas a compensatory hypertrophic response to pressure overload was observed in wildtype mice, the integrin Beta 1-deficient mice were not able to undergo heart tissue remodeling. Furthermore, ECM gene expression was altered and, in particular, the increased expression of the matricellular protein SPARC after AB was abolished in integrin Beta 1–deficient mice. Interestingly, we also found a transient upregulation of SPARC mRNA during heart remodeling after MI using cDNA macroarrays. Indeed, increased SPARC protein levels were observed starting at day 2 (2.55±0.21fold, p<0.01), day 7 (3.72±0.28 fold, p<0.01) and 1 month (1.9±0.16 fold, p<0.01) after MI, which could be abolished by using an integrin alpha v inhibitor in vivo. Immunofluorescence analysis of heart tissue demonstrated that the increased SPARC expression was confined to the infarcted area and occurred together with the influx of fibroblasts into the heart. In vitro, either TGF-Beta 1 or PDGF-BB stimulated SPARC expression by fibroblasts. Inhibition of integrin alpha v did not interfere with TGF-Beta1 or PDGF induced SPARC secretion as determined by ELISA assays or Western blot. However, secretion of TGF-Beta1 and PDGF-BB by cardiomyocytes was induced by vitronectin, a ligand of integrin alpha v, and this response was blocked by the integrin alpga v inhibitor. Functionally, SPARC modulated the migratory response of fibroblasts towards ECM proteins suggesting that the local deposition of SPARC following MI contributes to scar formation. Taken together, our combined in vivo and in vitro data demonstrate that several integrin subunits play critical roles during tissue remodeling in the injured heart. Integrin-dependent gene expression events such as the upregulation of SPARC following MI are critical to orchestrate the healing response. These processes appear to involve complex cross-talk between different cell types such as cardiomyocytes and fibroblasts to allow for locally confined scar formation. The elucidation of the sophisticated interplay between integrins, matricellular proteins such as SPARC, and growth factors will undoubtedly provide us with a better and clinically useful understanding of the molecular mechanisms governing heart remodeling. KW - Integrine KW - Genexpression KW - Herzmuskel KW - Grundsubstanz KW - Extracellular matrix KW - gene expression KW - cardiac remodeling KW - migration Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17531 ER - TY - JOUR A1 - Wirbelauer, J. A1 - Hof, H. A1 - Hacker, Jörg T1 - Die Wirkung von Desacetylcefotaxin, einem Metaboliten von Cefotaxim, in vitro und auf die experimentelle Infektion mit Escherichia coli T1 - Activity of Desacetylcefotaxime, a Metabolite of Cefotaxime, In Vitro and in a Model of Experimental Infection with Escherichia coli N2 - Die MHK-Werte von Desacetylcefotaxim gegen verschiedene, z. T. ampicillinresistente Stämme von Escherichia coH, die mit Hilfe einer Agardilutionsmethode erhoben wurden, waren höher als die von Cefotaxim und Ceftriaxon, jedoch niedriger als die von Cefoxitin. In einem Modell der systemischen Infektion der Maus mit einem plasmidtragenden, betalactamaseproduzierenden Stamm von E. coli führte die Therapie mit Desacetylcefotaxim zu einer starken Reduktion der Keime pro Leber. Im Vergleich zur Therapie mit Cefotaxim trat die protektive Wirkung aber verlangsamt ein. Desacetylcefotaxim ist also kein unnützes Abbauprodukt von Cefotaxim. N2 - The MIC values of desacetylcefotaxime, as determined by an agar dilution method, for several strains of Escherichia coli largely resistant to ampicillin were considerably higher than those of cefotaxime or ceftriaxone respectively. The values were, however, definitely lower than those of cefoxitin. In a mouse model of a systemic infection with a plasmid-bearing, j3-lactamase producing strain of E. coli the therapeutic potency of ampicillin, cefotaxime and desacetylcefotaxime was determined by counting the bacterial numbers per liver at days 1,3 and 7 after subcutaneous infection with about 103 viable bacteria. Desacety1cefotaxime was able to redure thc bacterial load considerably, though with a delay in comparison to cefotaxime. Y1 - 1988 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40348 ER - TY - JOUR A1 - Wintermeyer, E. A1 - Rdest, U. A1 - Ludwig, B. A1 - Debes, A. A1 - Hacker, Jörg T1 - Characterization of legiolysin (lly); responsible for hemolytic activity, colour production and fluorescence of Legionella pneumophila N2 - No abstract available KW - Infektionsbiologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59706 ER - TY - THES A1 - Winkelmann, Julia T1 - Molekulare Charakterisierung Saposin-ähnlicher Proteine von Entamoeba histolytica SCHAUDINN T1 - Molecular characterization of saposin-like proteins of Entamoeba histolytica SCHAUDINN N2 - Saposin-ähnliche Proteine (SAPLIPs) sind membraninteragierende Proteine, die sich durch die konservierte Position von drei Disulfidbrücken, einer typischen alpha-helikalen Proteinfaltung und der Fähigkeit mit Lipiden zu interagieren, auszeichnen. Ihre zellulären Funktionen sind äußerst vielfältig. Bis zum Beginn des Genomsequenzierungsprojektes waren die Amoebapores die einzigen bekannten und charakterisierten SAPLIPs von Entamoeba histolytica, dem Erreger der humanen Amöbenruhr. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Aktivität stellen sie für diesen parasitischen Einzeller, der sich von phagozytierten Bakterien ernährt, wichtige Effektormoleküle dar. Sie können aber auch cytolytisch auf Wirtszellen wirken und werden deshalb als bedeutender Pathogenitätsfaktor angesehen. Die theoretische computergestützte Datenbankanalyse nach Abschluss der Genomsequenzierung ergab, dass es 16 weitere Gene kodierend für SAPLIPs zusätzlich zu den drei Amoebapore-Genen gibt. Die Sequenzen der neuen SAPLIPs sind abgesehen von dem Cysteinmotiv divers und auch die Größe der Proteine ist sehr unterschiedlich (77 - 1009 Aminosäuren). Alle besitzen sie jedoch eine einzige, C-terminal gelegene SAPLIP Domäne. Außer der SAPLIP-Domäne konnten keine weiteren bekannten funktionellen oder strukturellen Domänen in den relevanten Datenbanken identifiziert werden, die auf mögliche Funktionen hätten hinweisen können. Alle SAPLIP-Gene werden gleichzeitig in axenisch kultivierten Trophozoiten transkribiert wie durch reverse Transkriptions-PCR gezeigt wurde. Die vergleichende transkriptionelle Analyse im Mikroarray ergab, dass nach Kontakt mit menschlichen Kolonzellen keine Hochregulierung dieser Gene mit Ausnahme des Amoebapore A Gens stattfindet. Für die parallele Klonierung der verschiedenen SAPLIP-Domänen wurde ein ”Expressionsscreening” in E.coli mit dem grün fluoreszierenden Protein als Reporterprotein etabliert, das die erfolgreiche Klonierung und Expression eines Fragments aufgrund der Fluoreszenz der Bakterienkolonie bereits auf der Ebene der Transformation anzeigt. Die rekombinant exprimierte und bis zur Homogenität gereinigte SAPLIP-Domäne von SAPLIP 12 wies Amoebapore-ähnliche Aktivitäten auf. Unter Verwendung von Liposomen konnte porenbildende Aktivität nachgewiesen werden, wobei diese Aktivität stark an einen sauren pH-Wert gebunden ist. Die SAPLIP-Domäne 12 ist aber auch antibakteriell und dieses sogar mit vergleichbarer Selektivität wie Amoebapore A, nämlich Zelllyse von gram-positiven B. megaterium war nachweisbar, jedoch nicht von gram-negativen E. coli. Strukturell unterscheiden sich die SAPLIP-Domäne 12 und Amoebapore A bezüglich der Exposition positiver Ladungsansammlungen auf der Proteinoberfläche und des Fehlens des für den Mechanismus der Amoebapores essentiellen Histidinrestes an entsprechender Position in der Sequenz. Darüber hinaus übt die SAPLIP-Domäne 12 eine im Vergleich zum Amoebapore A geringere spezifische Aktivität aus. Diese Eigenschaften weisen darauf hin, dass es sich um einen anderen Wirkungsmechanismus handeln könnte. Für die SAPLIP-Domäne 12 wäre eine über die positiven Ladungen der Proteinoberfläche vermittelte Interaktion mit den negativ geladenen Phospholipidköpfen von Membranen denkbar, die bei Erreichen einer bestimmten Konzentration in einer Störung der Lipidordnung und letztendlich in der Auflösung der Membranstruktur resultieren könnte. SAPLIP 3 ähnelt den Amoebapores in der Größe und molekularen Architektur und kann somit als funktionelle Einheit angesehen werden, es unterscheidet sich aber durch eine hohe negative Nettoladung von den Amoebapores. Außerdem ist das rekombinante SAPLIP 3 nicht antibakteriell und die Membraninteraktionen dieses SAPLIPs unterscheiden sich grundlegend von denjenigen, die für die Amoebapores beschrieben sind. SAPLIP 3 zerstört nicht einfach die Liposomenstruktur wie von den porenbildenden Amoebapores bekannt, sondern es vermittelt die Fusion von multilamellaren Liposomen unter Freisetzung des Liposomeninhalts. Diese Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit anionischer Lipide und von einem sauren pH-Wert. Die Fähigkeit zur Vesikelfusion sowie die Verteilung der negativen Ladungen von SAPLIP 3 auf der Proteinoberfläche ähneln Merkmalen des humanen Saposin C. Neben der Funktion als Cofaktor von Exohydrolasen, die im Sphingolipid Katabolismus involviert sind, wird angenommen, dass die Fähigkeit von Saposin C, Vesikel zu fusionieren, wichtig für die Reorganisation der humanen lysosomalen Kompartimente ist. Die Saposin C-ähnlichen Charakteristika von SAPLIP 3 geben Grund zu der Annahme, dass es bereits in einem so basalen Organismus wie der Amöbe ein Protein mit Saposin-ähnlichen membranfusionierenden Aktivitäten gibt und dass dieses SAPLIP entsprechende Funktionen während endo- und exozytotischer Transportprozesse in der Amöbe übernehmen könnte. N2 - Saposin-like proteins (SAPLIPs) are membrane-interacting proteins that are characterized by the conserved position of three disulphide bonds, a typical alpha-helical fold and the ability to interact with lipids. Their cellular functions are extremely diverse. Until the beginning of the genome-sequencing project, the amoebapores were the only known and characterized SAPLIPs of Entamoeba histolytica, which is the causative agent of human amoebiasis. Due to their antimicrobial activity, these proteins are important effector molecules of this unicellular parasite, which feeds on phagocytozed bacteria. However, they also exert cytolytic activity against host cells and therefore, they are considered to be a major pathogenicity factor of the amoeba. The theoretical computer-based data base analysis after the completion of genome sequencing revealed 16 genes coding for SAPLIPs in addition to the three amoebapore genes. The sequences of the novel SAPLIPs are diverse apart from the cysteine motif and furthermore, the sizes of the proteins are highly different (77 – 1009 amino acid residues). They all contain a single, C-terminally located SAPLIP domain. Beside the SAPLIP domain, no other functional or structural domains were identified in the relevant databases that would have pointed to possible functions. All SAPLIP-genes are transcribed in axenically cultured trophozoites at the same time as shown by reverse transcription PCR. The comparative transcriptional analysis using microarrays revealed that after six hours of contact with human cells and their phagocytosis none of these genes, with the exception of the amoebapore A gene, was upregulated. In order to clone the different fragments in parallel, an expression screening in E. coli with the green fluorescent protein as reporter protein was established, which indicates the successful cloning and expression of a fragment by the fluorescence of the bacterial colony already at the level of transformation. The SAPLIP domain 12, which has been recombinantly expressed and purified to homogeneity, exerts amoebapore-like activities. Using liposomes, pore-forming activity was detected, which is strongly dependent on acidic pH. Furthermore, the SAPLIP domain 12 is antibacterial even with similar selectivity as amoebapore A in that cell lysis of gram-positive B. megaterium was detectable but not of gram-negative E. coli. Structurally, the SAPLIP domain 12 differs from the amoebapores by exposing patches of positive charges on the protein surface und by lacking a histidine residue at a corresponding position in its sequence, which has been shown to be essential for the mechanism of amoebapore A. Moreover, the SAPLIP domain 12 displays a lower specific activity. These features indicate that this SAPLIP domain may act by means of another mechanism. It may interact with the negatively charged phospholipid head groups of membranes by its positively charged protein surface and after reaching a certain threshold concentration, possibly resulting in a disturbance of the lipid order and finally in the disintegration of the membrane structure. SAPLIP 3 resembles the amoebapores in size and molecular architecture and could therefore be considered as a functional unit, but it differs from the amoebapores by a highly negative net charge. Besides, the recombinant protein is not antibacterial and the membrane interactions of this SAPLIP are completely different from those described for the amoebapores. SAPLIP 3 does not simply destroy the liposome structure as known from the pore-forming amoebapores but induces leaky fusion of multilamellar liposomes. This activity is dependent on the presence of negatively charged lipids and on acidic pH. The capability of vesicle fusion as well as the negative charge distribution of SAPLIP 3 resembles features of the human saposin C. Beside its function as a cofactor of exohydrolases, which are involved in the sphingolipid catabolism, saposin C is considered to be involved in the reorganization of human lysosomal compartments due to its fusogenic activity. The saposin C-like characteristics of SAPLIP 3 suggest that a protein with saposin-like membrane fusogenic activity already exists in such a basal organism like an amoeba and that this SAPLIP fulfils corresponding functions during endo- and exocytotic transport processes in the amoeba. KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapor-Proteine KW - Molekularbiologie KW - Saposin-ähnliche Proteine KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapores KW - Membraninteraktionen KW - Saposin-like proteins KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapores KW - membrane interactions Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15927 ER - TY - JOUR A1 - Wilms, Ina A1 - Overlöper, Aaron A1 - Nowrousian, Minou A1 - Sharma, Cynthia M. A1 - Narberhaus, Franz T1 - Deep sequencing uncovers numerous small RNAs on all four replicons of the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens JF - RNA Biology N2 - Agrobacterium species are capable of interkingdom gene transfer between bacteria and plants. The genome of Agrobacterium tumefaciens consists of a circular and a linear chromosome, the At-plasmid and the Ti-plasmid, which harbors bacterial virulence genes required for tumor formation in plants. Little is known about promoter sequences and the small RNA (sRNA) repertoire of this and other α-proteobacteria. We used a differential RNA sequencing (dRNA-seq) approach to map transcriptional start sites of 388 annotated genes and operons. In addition, a total number of 228 sRNAs was revealed from all four Agrobacterium replicons. Twenty-two of these were confirmed by independent RNA gel blot analysis and several sRNAs were differentially expressed in response to growth media, growth phase, temperature or pH. One sRNA from the Ti-plasmid was massively induced under virulence conditions. The presence of 76 cis-antisense sRNAs, two of them on the reverse strand of virulence genes, suggests considerable antisense transcription in Agrobacterium. The information gained from this study provides a valuable reservoir for an in-depth understanding of sRNA-mediated regulation of the complex physiology and infection process of Agrobacterium. KW - regulatory RNA KW - plant-microbe interaction KW - deep sequencing KW - RNA-seq KW - small RNA Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127101 VL - 9 IS - 446-457 ER - TY - JOUR A1 - Will, Antje A1 - Blank, Christine A1 - Röllinghoff, Martin A1 - Moll, Heidrun T1 - Murine epidermal Langerhans cells are potent stimulators of an antigen-specific T cell response to Leishmania major, the cause of cutaneous leishmaniasis N2 - Cutaneous leishmaniasis is initiated by the bite of an infected sandfly and inoculation of Leishmania major parasites into the mammalian skin. Macrophages are known to playa central role in the course of infection because they are the prime host cells and funetion as antigen-presenting eells (APC) for induetion of the eell-mediated immune response. However, in addition to maerophages in the dermis. the skin eontains epidermal Langerhans eells (LC) which ean present antigen (Ag) to T cells. Therefore, using a murine model of cutaneous leishmaniasis, we analyzed the ability of epidermal cells to induce a T eell response to L.major. The results demonstrated that freshly isolated LC, but not cuItured LC, are highly active in presenting L.major Ag in vitro to T cells from primed mice and to a L.major-specific T cell clone. Furthermore, freshly isolated LC had the ability to retain L.major Ag in immunogenic form for at least 2 days. Their efficiency was much greater than that of irradiated spleen cells, a standard population of APC. LC stimulated both T cell proliferation and production of the Iymphokines interleukin (IL)-2 and IL-4. The response was Ag specific and could be induced by lysate of L. major parasites and by live organisms. The data suggest that epidermal LC are important APC in eutaneous leishmaniasis. They may perform a critical funetion by eapturing L.major Ag in the skin and presenting it either to quiescent T eells circulating through the draining lymph node or locally to T effector cells infiltrating the cutaneous lesion. KW - Immunologie Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45872 ER - TY - JOUR A1 - Wheeler, Nicole E. A1 - Barquist, Lars A1 - Kingsley, Robert A. A1 - Gardner, Paul P. T1 - A profile-based method for identifying functional divergence of orthologous genes in bacterial genomes JF - Bioinformatics N2 - Motivation: Next generation sequencing technologies have provided us with a wealth of information on genetic variation, but predi cting the functional significance of this variation is a difficult task. While many comparative genomics studies have focused on gene flux and large scale changes, relatively little attention has been paid to quantifying the effects of single nucleotide polymorphisms and indels on protein function, particularly in bacterial genomics. Results: We present a hidden Markov model based approach we call delta-bitscore (DBS) for identifying orthologous proteins that have diverged at the amino acid sequence level in a way that is likely to impact biological function. We benchmark this approach with several widely used datasets and apply it to a proof-of-concept study of orthologous proteomes in an investigation of host adaptation in Salmonella enterica. We highlight the value of the method in identifying functional divergence of genes, and suggest that this tool may be a better approach than the commonly used dN/dS metric for identifying functionally significant genetic changes occurring in recently diverged organisms. KW - Host adaptation KW - Salmonella-enteritidis KW - Sequence identity KW - Rapid evolution KW - Variants KW - Cystic-fibriosis KW - Strains KW - Pathogenicity KW - Typhimurium KW - Yersinia Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186502 VL - 32 IS - 23 ER - TY - JOUR A1 - Westermann, Alexander J. A1 - Venturini, Elisa A1 - Sellin, Mikael E. A1 - Förstner, Konrad U. A1 - Hardt, Wolf-Dietrich A1 - Vogel, Jörg T1 - The major RNA-binding protein ProQ impacts virulence gene expression in Salmonella enterica serovar Typhimurium JF - mBio N2 - FinO domain proteins such as ProQ of the model pathogen Salmonella enterica have emerged as a new class of major RNA-binding proteins in bacteria. ProQ has been shown to target hundreds of transcripts, including mRNAs from many virulence regions, but its role, if any, in bacterial pathogenesis has not been studied. Here, using a Dual RNA-seq approach to profile ProQ-dependent gene expression changes as Salmonella infects human cells, we reveal dysregulation of bacterial motility, chemotaxis, and virulence genes which is accompanied by altered MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling in the host. Comparison with the other major RNA chaperone in Salmonella, Hfq, reinforces the notion that these two global RNA-binding proteins work in parallel to ensure full virulence. Of newly discovered infection-associated ProQ-bound small noncoding RNAs (sRNAs), we show that the 3′UTR-derived sRNA STnc540 is capable of repressing an infection-induced magnesium transporter mRNA in a ProQ-dependent manner. Together, this comprehensive study uncovers the relevance of ProQ for Salmonella pathogenesis and highlights the importance of RNA-binding proteins in regulating bacterial virulence programs. IMPORTANCE The protein ProQ has recently been discovered as the centerpiece of a previously overlooked “third domain” of small RNA-mediated control of gene expression in bacteria. As in vitro work continues to reveal molecular mechanisms, it is also important to understand how ProQ affects the life cycle of bacterial pathogens as these pathogens infect eukaryotic cells. Here, we have determined how ProQ shapes Salmonella virulence and how the activities of this RNA-binding protein compare with those of Hfq, another central protein in RNA-based gene regulation in this and other bacteria. To this end, we apply global transcriptomics of pathogen and host cells during infection. In doing so, we reveal ProQ-dependent transcript changes in key virulence and host immune pathways. Moreover, we differentiate the roles of ProQ from those of Hfq during infection, for both coding and noncoding transcripts, and provide an important resource for those interested in ProQ-dependent small RNAs in enteric bacteria. KW - Hfq KW - noncoding RNA KW - ProQ KW - RNA-seq KW - bacterial pathogen KW - posttranscriptional control Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177722 VL - 10 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Westermann, Alexander J. A1 - Barquist, Lars A1 - Vogel, Jörg T1 - Resolving host-pathogen interactions by dual RNA-seq JF - PLoS Pathogens N2 - The transcriptome is a powerful proxy for the physiological state of a cell, healthy or diseased. As a result, transcriptome analysis has become a key tool in understanding the molecular changes that accompany bacterial infections of eukaryotic cells. Until recently, such transcriptomic studies have been technically limited to analyzing mRNA expression changes in either the bacterial pathogen or the infected eukaryotic host cell. However, the increasing sensitivity of high-throughput RNA sequencing now enables “dual RNA-seq” studies, simultaneously capturing all classes of coding and noncoding transcripts in both the pathogen and the host. In the five years since the concept of dual RNA-seq was introduced, the technique has been applied to a range of infection models. This has not only led to a better understanding of the physiological changes in pathogen and host during the course of an infection but has also revealed hidden molecular phenotypes of virulence-associated small noncoding RNAs that were not visible in standard infection assays. Here, we use the knowledge gained from these recent studies to suggest experimental and computational guidelines for the design of future dual RNA-seq studies. We conclude this review by discussing prospective applications of the technique. KW - Medicine KW - RNA sequencing KW - Salmonellosis KW - Transcriptome analysis KW - Gene expression KW - Bacterial pathogens KW - Salmonella KW - Host cells KW - Lysis (medicine) Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171921 VL - 13 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Westermann, Alexander J. T1 - Dual RNA-seq of pathogen and host T1 - Duale RNA-Sequenzierung eines Pathogens und seines Wirts N2 - The infection of a eukaryotic host cell by a bacterial pathogen is one of the most intimate examples of cross-kingdom interactions in biology. Infection processes are highly relevant from both a basic research as well as a clinical point of view. Sophisticated mechanisms have evolved in the pathogen to manipulate the host response and vice versa host cells have developed a wide range of anti-microbial defense strategies to combat bacterial invasion and clear infections. However, it is this diversity and complexity that makes infection research so challenging to technically address as common approaches have either been optimized for bacterial or eukaryotic organisms. Instead, methods are required that are able to deal with the often dramatic discrepancy between host and pathogen with respect to various cellular properties and processes. One class of cellular macromolecules that exemplify this host-pathogen heterogeneity is given by their transcriptomes: Bacterial transcripts differ from their eukaryotic counterparts in many aspects that involve both quantitative and qualitative traits. The entity of RNA transcripts present in a cell is of paramount interest as it reflects the cell’s physiological state under the given condition. Genome-wide transcriptomic techniques such as RNA-seq have therefore been used for single-organism analyses for several years, but their applicability has been limited for infection studies. The present work describes the establishment of a novel transcriptomic approach for infection biology which we have termed “Dual RNA-seq”. Using this technology, it was intended to shed light particularly on the contribution of non-protein-encoding transcripts to virulence, as these classes have mostly evaded previous infection studies due to the lack of suitable methods. The performance of Dual RNA-seq was evaluated in an in vitro infection model based on the important facultative intracellular pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium and different human cell lines. Dual RNA-seq was found to be capable of capturing all major bacterial and human transcript classes and proved reproducible. During the course of these experiments, a previously largely uncharacterized bacterial small non-coding RNA (sRNA), referred to as STnc440, was identified as one of the most strongly induced genes in intracellular Salmonella. Interestingly, while inhibition of STnc440 expression has been previously shown to cause a virulence defect in different animal models of Salmonellosis, the underlying molecular mechanisms have remained obscure. Here, classical genetics, transcriptomics and biochemical assays proposed a complex model of Salmonella gene expression control that is orchestrated by this sRNA. In particular, STnc440 was found to be involved in the regulation of multiple bacterial target mRNAs by direct base pair interaction with consequences for Salmonella virulence and implications for the host’s immune response. These findings exemplify the scope of Dual RNA-seq for the identification and characterization of novel bacterial virulence factors during host infection. N2 - Die Infektion einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem bakteriellen Pathogen ist eines der komplexesten Beispiele einer Domänen-überschreitenden Wechselwirkung zweier Organismen. Infektionsprozesse sind in höchstem Maße relevant, sowohl in der Grundforschung als auch von einem klinischen Blickwinkel aus betrachtet. Im Laufe der Evolution entstanden komplizierte Mechanismen, die es einem Pathogen erlauben, die Wirtsantwort zu manipulieren. Umgekehrt haben potentielle Wirtszellen eine Reihe von anti-mikrobiellen Verteidigungsstrategien entwickelt, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen und letztlich zu beseitigen. Es sind jedoch genau diese Verschiedenheit und Komplexität, welche die Infektionsforschung so anspruchsvoll und technisch schwer analysierbar machen. Gängige Analysemethoden wurden zumeist entweder für bakterielle oder aber eukaryontische Organismen entwickelt. Dagegen werden Techniken benötigt, welche es erlauben, mit den mitunter extremen Unterschieden zwischen Wirt und Pathogen umzugehen, die sich in etlichen zellulären Eigenschaften und Prozessen manifestieren. Eine Klasse zellulärer Makromoleküle, die diese Heterogenität zwischen Wirt und Pathogen widerspiegelt, sind ihre jeweiligen Transkriptome: Bakterielle Transkripte unter-scheiden sich von ihren eukaryontischen Pendants in vielerlei Hinsicht, was sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte miteinschließt. Die Gesamtheit zellulärer Transkripte ist von größter Bedeutung, da sie den physiologischen Zustand der jeweiligen Zelle unter den gegebenen Bedingungen reflektiert. Aus diesem Grund werden Genom-weite Transkriptom-techniken wie etwa die RNA-Sequenzierung seit etlichen Jahren erfolgreich angewandt, um biologische Prozesse zu untersuchen – jedoch ist deren Eignung für Infektionsstudien in starkem Maße limitiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines neuartigen Ansatzes, „Duale RNA-Sequenzierung“ genannt, der Transkriptomstudien mit der Infektionsbiologie kompatibel macht. Mithilfe dieser Technologie wurde hier im Besonderen versucht, die Rolle nicht-proteinkodierender RNA-Moleküle für die Virulenz zu beleuchten, da die Charakterisierung dieser RNA-Klassen bisherigen Infektionsstudien weitgehend verwehrt blieb. Die Anwendbar-keit der Dualen RNA-Sequenzierung wurde innerhalb eines In-vitro-Infektionsmodells getestet, welches auf dem wichtigen, fakultativ intrazellulären Pathogen Salmonella enterica serovar Tyhimurium und verschiedenen humanen Zelllinien basiert. Die Duale RNA-Sequenzierung zeigte sich dabei in der Lage alle wesentlichen bakteriellen sowie humanen Transkriptklassen zu erfassen und erwies sich als reproduzierbar. Im Zuge dieser Experimente wurde ein Gen für eine zuvor kaum beschriebene kleine nicht-kodierende RNA (STnc440) als eines der am stärksten induzierten Gene intrazellulärer Salmonellen identifiziert. Interessanterweise hatten vorherige Studien gezeigt, dass die Inaktivierung dieses Gens zu einem Virulenzdefizit innerhalb unterschiedlicher Tiermodelle für Salmonellose führt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen blieben jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische, Transkriptom- sowie biochemische Analysen eingesetzt um das komplexe Regulationsnetzwerk dieser kleinen RNA erstmals näher zu beleuchten. Im Einzelnen konnte gezeigt werden, dass STnc440 die Expression mehrerer bakterieller mRNAs durch das Ausbilden zwischen-molekularer Basenpaarungen reguliert, was weitreichende Konsequenzen sowohl für die Virulenz des Pathogens als auch die Immunantwort des Wirts hat. Diese Ergebnisse veranschaulichen das Potential der Dualen RNA-Sequenzierung für das Auffinden und Charakterisieren neuer bakterieller Virulenzfaktoren während der Wirtsinfektion. KW - Transkriptomanalyse KW - Dual RNA-seq KW - Salmonella enterica KW - Wirtszelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112462 ER - TY - THES A1 - Wencker, Freya Dorothea Ruth T1 - The methionine biosynthesis operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Role of concerted RNA decay in transcript stability and T-box riboswitch turnover T1 - Das Methioninbiosynthese-Operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Der Einfluss von koordiniertem RNA Abbau auf Transkriptstabilität und T-Box-Riboswitch-Prozessierung N2 - Methionine is the first amino acid of every newly synthesised protein. In combination with its role as precursor for the vital methyl-group donor S-adenosylmethionine, methionine is essential for every living cell. The opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is capable of synthesising methionine de novo, when it becomes scarce in the environment. All genes required for the de novo biosynthesis are encoded by the metICFE-mdh operon, except for metX. Expression is controlled by a hierarchical network with a methionyl-tRNA-specific T-box riboswitch (MET-TBRS) as centrepiece, that is also referred to as met leader (RNA). T-box riboswitches (TBRS) are regulatory RNA elements located in the 5’-untranslated region (5’-UTR) of genes. The effector molecule of T-box riboswitches is uncharged cognate tRNA. The prevailing mechanism of action is premature termination of transcription of the nascent RNA in the absence of the effector (i.e. uncharged cognate tRNA) due to formation of a hairpin structure, the Terminator stem. In presence of the effector, a transient stabilisation of the alternative structure, the Antiterminator, enables transcription of the downstream genes (‘read-through’). Albeit, after the read-through the thermodynamically more stable Terminator eventually forms. The Terminator and the Antiterminator are two mutually exclusive structures. Previous work of the research group showed that in staphylococci the MET-TBRS ensures strictly methionine-dependent control of met operon expression. Uncharged methionyl-tRNA that activates the system is only present in sufficient amounts under methionine-deprived conditions. In contrast to other bacterial TBRS, the staphylococcal MET-TBRS has some characteristic features regarding its length and predicted secondary structure whose relevance for the function are yet unkown. Aim of the present thesis was to experimentally determine the structure of the met leader RNA and to investigate the stability of the met operon-specific transcripts in the context of methionine biosynthesis control. Furthermore, the yet unknown function of the mdh gene within the met operon was to be determined. In the context of this thesis, the secondary structure of the met leader was determined employing in-line probing. The structural analysis revealed the presence of almost all highly conserved T-box riboswitch structural characteristics. Furthermore, three additional stems, absent in all T-box riboswitches analysed to date, could be identified. Particularly remarkable is the above average length of the Terminator stem which renders it a potential target of the double-strand-specific endoribonuclease III (RNase III). The RNase III-dependent cleavage of the met leader could be experimentally verified by the use of suitable mutants. Moreover, the exact cleavage site within the Terminator was determined. The unusual immediate separation of the met leader from the met operon mRNA via the RNase III cleavage within the Terminator stem induces the rapid degradation of the met leader RNA and, most likely, that of the 5’-region of the met mRNA. The met mRNA is degraded from its 5’-end by the exoribonuclease RNase J. The stability of the met mRNA was found to vary over the length of the transcript with an instable 5’-end (metI and metC) and a longer half-life towards the 3’-end (metE and mdh). The varying transcript stability is reflected by differences in the available cellular protein levels. The obtained data suggest that programmed mRNA degradation is another level of regulation in the complex network of staphylococcal de novo methionine biosynthesis control. In addition, the MET-TBRS was studied with regard to a future use as a drug target for novel antimicrobial agents. To this end, effects of a dysregulated methionine biosynthesis on bacterial growth and survival were investigated in met leader mutants that either caused permanent transcription of the met operon (‘ON’) or prevented operon transcription (‘OFF’), irrespective of the methionine status in the cell. Methionine deprivation turned out to be a strong selection pressure, as ‘OFF’ mutants acquired adaptive mutations within the met leader to restore met operon expression that subsequently re-enabled growth. The second part of the thesis was dedicated to the characterisation of the Mdh protein that is encoded by the last gene of the met operon and whose function is unknown yet. At first, co-transcription and -expression with the met operon could be demonstrated. Next, the Mdh protein was overexpressed and purified and the crystal structure of Mdh was solved to high resolution by the Kisker research group (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg). Analysis of the structure revealed the amino acid residues crucial for catalytic activity, and zinc was identified as a co-factor of Mdh. Also, Mdh was shown to exist as a dimer. However, identification of the Mdh substrate was, in the context of this thesis, (still) unsuccessful. Nevertheless, interactions of Mdh with enzymes of the met operon could be demonstrated by employing the bacterial two-hybrid system. This fact and the high conservation of mdh/Mdh on nucleotide and amino acid level among numerous staphylococcal species suggests an important role of Mdh within the methionine metabolism that should be a worthwhile subject of future research. N2 - Methionin ist die erste Aminosäure in jedem neu gebildeten Protein. Zusammen mit seiner Funktion als Vorläufermolekül für die Synthese des essenziellen Methylgruppendonors S-Adenosylmethionin ist Methionin damit für jede lebende Zelle unverzichtbar. Staphylococcus aureus, ein opportunistisches Humanpathogen, ist in der Lage, Methionin de novo zu synthetisieren, wenn es nicht in ausreichender Menge in der Umgebung vorhanden ist. Mit Ausnahme von MetX sind alle für die Methioninsynthese benötigten Enzyme im metICFE-mdh-Operon kodiert. Die Expression des Operons wird durch ein komplexes hierarchisches Netzwerk reguliert, dessen zentrales Steuerelement ein Methionyl-tRNA-spezifischer T-Box-Riboswitch (MET-TBRS) ist, der auch als met-leader (RNA) bezeichnet wird. T-Box Riboswitches (TBRS) sind regulatorische RNA-Elemente, die in der untranslatierten Region am 5'-Ende (5'-UTR) ihrer zu kontrollierenden Gene liegen. Sie nutzen unbeladene tRNAs als Effektormoleküle. Die Funktionsweise der meisten TBRS beruht auf dem vorzeitigen Abbruch der Transkription der naszierenden mRNA, der durch die Ausbildung einer Haarnadelstruktur (Terminator) im Transkript herbeigeführt wird, wenn das Effektormolekül (i.e. unbeladene tRNA) fehlt. Sobald passende unbeladene tRNA verfügbar ist und bindet, wird eine alternative Struktur, der Antiterminator, kurzzeitig stabilisiert, der die Transkription und damit ein "Durchlesen" in die stromabwärtsliegenden Gene ermöglicht. Terminator und Antiterminator sind zwei sich gegenseitig ausschließende Strukturen, wobei der Terminator die thermodynamisch deutlich stabilere Struktur des TBRS ist, die sich dementsprechend auch in den vollständigen Transkripten erneut ausbildet. Bisherige Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass in Staphylokokken der MET-TBRS die Kontrolle der Methioninsynthese in strikter Abhängigkeit von Methionin gewährleistet. Unbeladene Methionyl-tRNA, die nur unter Methioninmangelbedingungen in ausreichenden Konzentrationen vorliegt, aktiviert das System. Im Unterschied zu anderen bakteriellen TBRS weist der Staphylokokken-MET-TBRS (met-leader) hinsichtlich seiner Länge und vorhergesagten Struktur einige Besonderheiten auf, deren Bedeutung für die Funktion bislang unklar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Struktur der met-leader-RNA experimentell zu bestimmen und die Stabilität met-Operon-spezifischer Transkripte im Kontext der Methioninbiosynthesekontrolle zu untersuchen. Ebenso sollte die bisher unbekannte Funktion des mdh-Genes im Operon aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Sekundärstruktur der met-leader-RNA mit Hilfe des so genannten In-line Probings bestimmt. Die Sekundärstruktur weist neben fast allen hochkonservierten Strukturmerkmalen eines T-Box-Riboswitches auch drei zusätzliche Haarnadelstrukturen auf, die bisher in keinem anderen T-Box-Riboswitch gefunden wurden. Besonders auffällig ist die überdurchschnittliche Länge des met-leader-Terminators, der dadurch zur potentiellen Zielstruktur für die Doppelstrang-spezifische Endoribonuklease RNase III wird. Mittels geeigneter Mutanten konnte die RNase III-abhängige Prozessierung der met-leader-RNA experimentell bewiesen werden. Ebenso wurde die exakte Schnittstelle im Terminator bestimmt. Die ungewöhnliche Prozessierung des Terminators durch die RNase III spaltet die met-leader-RNA von der met-mRNA ab, was den raschen weiteren Abbau der met-leader-RNA und sehr wahrscheinlich auch den der met-mRNA einleitet. So wird die met-mRNA durch die Exoribonuklease RNase J vom 5'-Ende her abgebaut, wobei die Stabilität bezogen auf die Gesamtheit des Moleküls stark variiert: Das 5'-Ende mit den Genen metI und metC wird äußerst schnell degradiert, während das 3'-Ende mit metE und mdh deutlich stabiler ist. Die variierende mRNA-Stabilität spiegelt sich auch in Unterschieden hinsichtlich der verfügbaren zellulären Proteinmengen wider. Die Daten legen daher nahe, dass programmierte mRNA-Degradation eine weitere Ebene im komplexen Kontrollnetzwerk darstellt, durch die in Staphylokokken die Methioninbiosynthese sehr exakt den jeweiligen Bedürfnissen angepasst wird. Des Weiteren wurde der MET-TBRS im Hinblick auf eine zukünftige Nutzung als Angriffspunkt für neue antibakterielle Wirkstoffe untersucht. Dazu wurden die Auswirkungen einer dysregulierten Methioninbiosynthese auf das bakterielle Wachstum und Überleben mit Hilfe von met-leader-Mutanten analysiert, die entweder zu einer permanenten Aktivierung („ON“) oder Deaktivierung („OFF“) der met-Operon-Transkription, unabhängig vom Methioninstatus in der Zelle, führten. Es zeigte sich, dass Methioninmangel einen starken Selektionsdruck darstellt, da die „OFF“-Mutanten in der Lage waren, durch den Erwerb von adaptiven Mutationen innerhalb der met-leader-Sequenz, das met-Operon erneut zu aktivieren und wieder zu wachsen. Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung des Mdh-Proteins, das im letzten Gen des met-Operons kodiert ist und dessen Funktion derzeit gänzlich unbekannt ist. Zunächst konnte die Kotranskription und -expression von mdh mit dem met-Operon gezeigt werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Kisker (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg) wurden anhand von Kristallstrukturanalysen die Aminosäuren identifiziert, die entscheidend für die katalytische Aktivität des Mdh-Enzyms sind, wobei Zink als ein Kofaktor fungiert. Ebenso zeigte sich, dass Mdh als Dimer vorliegt. Allerdings ist die Identifizierung des Mdh-Substrates im Rahmen dieser Arbeit (noch) nicht gelungen. Mittels eines bakteriellen Zwei-Hybridsystems wurde jedoch nachgewiesen, dass Mdh mit den anderen Enzymen des met-Operons interagiert. Dies und die hohe Konservierung von mdh/Mdh auf Nukleotid- und Aminosäureebene in verschiedenen Staphylokokkenarten legt eine wichtige Funktion von Mdh im Methioninstoffwechsel nahe, die lohnenswerter Gegendstand weiterer Untersuchungen sein sollte. KW - Staphylococcus aureus KW - RNA Abbau KW - Methioninbiosynthese KW - MET-T-box riboswitch KW - riboswitch KW - methionine biosynthesis KW - RNA decay Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207124 ER - TY - JOUR A1 - Wencker, Freya D. R A1 - Marincola, Gabriella A1 - Schoenfelder, Sonja M. K. A1 - Maaß, Sandra A1 - Becher, Dörte A1 - Ziebuhr, Wilma T1 - Another layer of complexity in Staphylococcus aureus methionine biosynthesis control: unusual RNase III-driven T-box riboswitch cleavage determines met operon mRNA stability and decay JF - Nucleic Acids Research N2 - In Staphylococcus aureus, de novo methionine biosynthesis is regulated by a unique hierarchical pathway involving stringent-response controlled CodY repression in combination with a T-box riboswitch and RNA decay. The T-box riboswitch residing in the 5′ untranslated region (met leader RNA) of the S. aureus metICFE-mdh operon controls downstream gene transcription upon interaction with uncharged methionyl-tRNA. met leader and metICFE-mdh (m)RNAs undergo RNase-mediated degradation in a process whose molecular details are poorly understood. Here we determined the secondary structure of the met leader RNA and found the element to harbor, beyond other conserved T-box riboswitch structural features, a terminator helix which is target for RNase III endoribonucleolytic cleavage. As the terminator is a thermodynamically highly stable structure, it also forms posttranscriptionally in met leader/ metICFE-mdh read-through transcripts. Cleavage by RNase III releases the met leader from metICFE-mdh mRNA and initiates RNase J-mediated degradation of the mRNA from the 5′-end. Of note, metICFE-mdh mRNA stability varies over the length of the transcript with a longer lifespan towards the 3′-end. The obtained data suggest that coordinated RNA decay represents another checkpoint in a complex regulatory network that adjusts costly methionine biosynthesis to current metabolic requirements. KW - allelic replacement KW - expression KW - translation KW - mechanism KW - acid KW - endoribonuclease KW - antitermination KW - transcription KW - proteins KW - geometry Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259029 VL - 49 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Weinmann, Erik T1 - Ein neues Konjugationsssystem in Legionella pneumophila Corby T1 - A new System for Conjugation in Legionella pneumophila Corby N2 - In dieser Arbeit wurde in Legionella pneumophila Corby ein bislang nicht in L. pneumophila beschriebener Bereich im Genom kloniert und sequenziert, der für ein putatives Konjugations- Typ IV Sekretionssystem kodiert. Alle für ein Typ IV Sekretionssystem notwendigen Gene sind vorhanden. Zum einen kodieren diese ein „mating pair formation“ System, also Proteine für die Pilusgenese und energieabhängigen Transport von Substraten aus der Bakterienzelle. Konjugationsexperimente zeigen, dass es sich bei den „DNA transfer and replication“ Genen trb/tra System um einen funktionierenden Mechanismus zur Mobilisierung von DNA handelt. N2 - This study explains a System for gene transfer in Legionella pneumophila, which is abscent in the recently published Legionella pneumophila genomes. All genes needed for energy dependent transfer of genetic material are included in this gene cluster. Mating experiments show that those genes are able to mobilize DNA in E.coli strains. KW - Legionella KW - Bakterielle Konjugation KW - Gentransfer KW - Legionella KW - Legionella pneumophila KW - Conjugation Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29485 ER -