TY - THES A1 - Böll, Susanne T1 - Ephemere Laichgewässer: Anpassungsstrategien und physiologische Zwänge der Gelbbauchunke (Bombina variegata) in einem Lebensraum mit unvorhersehbarem Austrocknungsrisiko T1 - Temporary ponds: Adaptations and physiological constraints of the yellow-bellied toad (Bombina variegata) living in a habitat with an unpredictable risk of desiccation N2 - Die Gelbbauchunke Bombina variegata gilt als eine typische Pionierart, die bevorzugt vegetationslose, ephemere Gewässer mit hohem Austrocknungsrisiko als Laichgewässer nutzt. Kleinstgewässer dieser Art zeichnen sich durch hohe Fluktuationen abiotischer (Temperatur, Ionenkonzentration, Wasserstand), aber auch biotischer Faktoren (Dichte, Räuberdruck) aus. In Anpassung an das zeitlich und räumlich unvorhersehbare Auftreten dieser Gewässer hat die Gelbbauchunke eine für eine temperate Art außergewöhnlich lange Fortpflanzungsperiode (April - August). Die Weibchen zeigten während der Saison eine kontinuierliche Eientwicklung, die es ihnen erlaubt, opportunistisch mehrfach abzulaichen und damit eine zeitliche Risikostreuung der Gelege zu betreiben. Darüber hinaus nutzt Bombina variegata alle Möglichkeiten der räumlichen Risikostreuung, indem sie ihre Gelege in kleinen Portionen innerhalb von Pfützen, aber auch auf verschiedene Pfützen verteilt. Die hohe Variabilität in den produzierten Eigrößen, besonders zwischen den Gelegen verschiedener Weibchen, ließ auf den ersten Blick eine weitere Strategie zur Risikostreuung vermuten; allerdings war die Eigröße von der Kondition der Weibchen abhängig: während gut konditionierte Weibchen in der Lage waren, sowohl größere Eier als auch größere Gelege zu produzieren, gingen schlechter konditionierte Weibchen einen „trade-off“ zugunsten einer möglichst hohen Fekundität ein. Unter günstigen Bedingungen greift diese Strategie, während die Produktion überdurchschnittlich großer Eier unter Austrocknungsbedingungen von Vorteil ist: Kaulquappen großer Eier hatten eine entsprechend größere Schlupfgröße und zeigten gegenüber Quappen kleinerer Eier eine beschleunigte Entwicklung. Auch bei den Labor- und Freilanduntersuchungen, die sich mit der Frage be-schäftigten, wie Bombina variegata auf kritische Veränderungen des Wasservo-lumens reagiert, war eine enorme Variabilität in den Wachstums- und Entwicklungsverläufen der Kaulquappen der verschiedenen Ansätze zu beobachten, die sich nur bedingt auf abweichende Versuchsbedingungen zurückführen ließ; vielmehr dürfte die qualitative Ausstattung der Quappen eine wesentliche Rolle gespielt haben. Dabei kristallisierten sich in den verschiedenen Versuchen zwei unterschiedliche Entwicklungsstrategien heraus: Kaulquappen, die eine insgesamt relativ lange Entwicklungszeit benötigten, zeigten eine hohe phänotypische Plastizität und reagierten adaptiv auf abnehmende Wasserstände, indem sie ihre Entwicklung auf Kosten ihres Wachstums beschleunigten. Bei Quappen, die im Durchschnitt eine wesentlich schnellere Entwicklungszeit besaßen, war diese per se günstige hohe Entwicklungsrate dagegen fixiert, unabhängig davon, während welcher Entwicklungsphase die Quappen auf veränderte Bedingungen umgestellt wurden. Unter verschlechterten Bedingungen zeigten sie lediglich Wachstumseinbußen. Ähnlich reagierten Kaulquappen auf zunehmende Ionenkonzentrationen bzw. sinkende Wasserstände. Dagegen wirkte sich Ammoniak, Exkretionsprodukt von Amphibienlarven, in erhöhten Konzentrationen stark negativ aus und beeinträchtigte sowohl das Wachstum als auch die Entwicklung der Quappen. Auf Räuber, die im Vergleich zum Austrocknungsrisiko temporärer Gewässer eine eher untergeordnete Rolle spielen, reagierten Bombina variegata-Quappen nur bedingt. Erst nach Fütterung der Libellenlarven mit Unkenquappen schränkten sie vorübergehend ihre Aktivität ein und mieden den räubernahen Bereich, ohne dass dadurch die Entwicklungsgeschwindigkeit oder das Wachstum der Quappen beeinträchtigt wurde; allerdings war eine erhöhte Mortalität zu beobachten. N2 - The yellow-bellied toad, Bombina variegata, lives in highly dynamic habitats, where she predominantly uses shallow pools with no vegetation as breeding sites. These temporary ponds have a high risk of desiccation and show strong fluctuations in abiotic (e.g. temperature, ion concentration, water level) as well as biotic factors (e.g. density, predation pressure). In accordance with the unpredictability of breeding sites in time and space, Bombina variegata has an unusually long breeding season for a temperate zone species lasting from April to August. During this period females showed continuous egg development, allowing for repeated opportunistic spawning bouts as a temporal risk spreading strategy. Besides, B. variegata uses all opportunities of spacial risk spreading by distributing her eggs within as well as between different pools. A high variability of egg sizes, especially between clutches of different females was observed indicating another risk spreading strategy. However, mean egg size was dependent on the condition of the female: while females with an above average condition were able to produce both, large eggs as well as large clutches, females of lower condition were forced to undergo a trade-off, aiming at a high fecundity but at the cost of reduced egg size. This is a successful strategy under favourable conditions, however under drying conditions the pro-duction of large eggs is of major advantage: tadpoles from large eggs had larger hatching sizes and metamorphosed earlier than tadpoles from small eggs. Furthermore, an enormous variability in mean size at metamorphosis and devel-opmental time was observed in a series of lab and field experiments where tad-poles were exposed to varying water volumes. These findings cannot fully be attributed to differences in experimental design, but rather indicate inherent differences of tadpoles of different cohorts. Basically, two developmental strategies were observed: tadpoles exhibiting a long larval period had a high phenotypic plasticity and showed an adaptive trade-off under decreasing water levels, ac-celerating their development at the cost of reduced growth. On the other hand, tadpoles that developed at a faster rate in the first place showed a fixed devel-opment and merely reduced their growth, no matter at which developmental stage the change to unfavourable conditions occurred. Similar results were ob-tained when tadpoles were exposed to increases in ion concentrations or to wa-ter level reductions. However, increased levels of ammonia, the excretion prod-uct of tadpoles, led to a major negative impact on both, growth and development of the tadpoles. In comparison to the risk of desiccation, predators play only a minor role in temporary ponds. Accordingly, Bombina variegata tadpoles reduced their activity and avoided the area of the dragonfly larvae only temporarily, after these were fed with tadpoles. Neither growth nor development of the larvae were impaired; however, a higher mortality was observed. KW - Bombina variegata KW - Risikostreuung KW - phänotypsche Plastizität KW - Entwicklungsgeschwindigkeit KW - Räuberdruck KW - Bombina variegata KW - risk spreading KW - phenotypic plasticity KW - developmental time KW - predation pressure Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5268 ER - TY - THES A1 - Böhme, Linda T1 - Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells T1 - Zelluläre Antwort auf doppelsträngige RNA in Chlamydia trachomatis-infizierten humanen Wirtszellen N2 - Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterien, die für ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abhängig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu können. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zelluläre Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidinsäure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern können. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der frühen bakteriellen Proteinsynthese abhängig und für die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellulären Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unverändert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zelluläre Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopräzipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren gehörenden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen verändert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Veränderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukleäre Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zelluläre Antwort auf dsRNA signifikant verändern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen. N2 - Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections. KW - Chlamydia trachomatis KW - Signaltransduktion KW - Immunreaktion KW - Doppelhelix KW - RNS KW - Apoptosis KW - Apoptose KW - doppelsträngige RNA KW - Immunantwort KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - double-stranded RNA KW - innate immunity KW - signal transduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474 ER - TY - THES A1 - Bögelein, Anna T1 - Einfluss systemischer Therapeutika auf die CXCR4-Expression von Myelomzellen T1 - Influence of therapeutic agents on CXCR4 expression of myeloma cells N2 - Im Zuge der Bemühungen um neue, tumorspezifische Therapieansätze für die Myelomerkrankung hat sich der C-X-C-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) aufgrund seiner zentralen Rolle in der Tumorgenese als vielversprechender Angriffspunkt hervorgetan. Im Sinne eines theranostischen Konzepts wird der Rezeptor mithilfe eines radioaktiv markierten Liganden quantifiziert und anschließend von rezeptorspezifischen Radiotherapeutika als Zielstruktur genutzt. Die CXCR4-Expression ist allerdings ein höchst dynamischer Prozess mit großer inter- und intraindividueller Heterogenität, der u.a. durch eine begleitende Chemotherapie beeinflusst werden kann. Ob sich therapieinduzierte Veränderungen der Rezeptorexpression gezielt nutzen lassen, um die CXCR4-Expression zu optimieren und so die Effektivität der CXCR4-gerichteten Strategien zu steigern, wurde bislang nicht untersucht. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene, in der Myelomtherapie etablierte Substanzen sowohl einzeln als auch in Kombination hinsichtlich ihres Einflusses auf die CXCR4-Expression von MM-Zelllinien und primären MM-Zellen unter in vitro Bedingungen analysiert. In den durchgeführten Experimenten zeigte sich eine hohe Variabilität der CXCR4-Expression der MM-Zellen nach Therapieinduktion, die sich als substanz-, dosis- und zeitabhängig herausstellte. Die Ergebnisse bestätigten das große Potenzial der therapieinduzierten Modulation der CXCR4-Expression. Im weiteren Verlauf sind translationale Forschungsansätze gerechtfertigt, die die Übertragbarkeit der in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die komplexen Vorgänge im lebenden Organismus überprüfen. Langfristiges Ziel ist der Entwurf eines patientenzentrierten, multimodalen Therapiekonzepts, welches das CXCR4-gerichtete theranostische Konzept mit einer individuell angepassten, medikamentösen MM-Therapie kombiniert. N2 - In the course of developing new tumor specific therapeutic approaches for non-yet curable myeloma disease C-X-C chemokine receptor 4 (CXCR4) has emerged as a promising target due to its crucial role in myeloma tumorigenesis. Within a theranostic concept CXCR4 is quantified using radioactively labeled ligands and afterwards targeted by receptor-specific radiopharmaceuticals. However, CXCR4 expression is a very dynamic process with a high inter- and intraindividual heterogeneity which can be influenced by concomitant chemotherapy. Whether therapy induced changes in receptor expression can be used to enhance CXCR4 expression and thus to improve efficacy of CXCR4-based theranostics has not been examined so far. In this context the present study evaluated the effect of several anti-myeloma drugs (bortezomib, cyclophosphamide, dexamethasone, doxorubicin, lenalidomide) on CXCR4 expression of different human myeloma cell lines as well as patient-derived CD138+ plasma cells under in vitro conditions. Findings disclosed a high variability of CXCR4 expression on myeloma cells after drug application which turned out to be substance-, dose- and time-dependent. The results confirmed the high potential of therapy-induced modulation of CXCR4 expression. In further course, translational research approaches are justified to verify the transferability of the in vitro findings to the complex macro- and microenvironment in vivo. Long-term goal is the development of a patient-centered, multimodal therapy concept which combines CXCR4 based theranostics with a personalized drug-based therapy. KW - Plasmozytom KW - In vitro KW - Multiples Myelom KW - Theranostik KW - CXCR4 KW - Gallium-68 Pentixafor Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241746 ER - TY - THES A1 - Böck, Julia T1 - Differenzielle Methylierungsanalysen mittels verschiedener Next-Generation Sequencing-basierter Techniken: Die Bedeutung von differenziell methylierten Regionen in der menschlichen Hirnevolution und bei der Krebsentstehung T1 - Differential methylation analysis via various next-generation sequencing technologies: The impact of differentially methylated regions on human brain evolution and cancer development N2 - Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden. N2 - The increasing complexity of social behavior along the ascending scale of primates, peaking in human spoken language, is accompanied by an impressive expansion of the human brain, particularly of the prefrontal cortex. Hence, prefrontal cortex appears to be one of the most interesting structures of the human brain, at least from an evolutionary perspective. But not only size but also function, in particular the interplay of neurons and glia cells, are suspected to distinguish the human brain from great apes and other primates. It is plausible to assume that proper brain function is controlled by a coordinated and well balanced transcriptional landscape, orchestrated by the underlying genetic and epigenetic backbone. Using reduced representation bisulfite sequencing (RRBS), we have compared the methylation profiles of neuronal and non-neuronal cells from three human and three chimpanzee prefrontal cortices (Brodmann area 10). Bioinformatic analyses revealed a genome-wide significant enrichment of differentially methylated regions (DMRs) in specific genomic areas. Intraspecific methylation differences between neuronal and non-neuronal cells are about three times more abundant than the interspecific methylation differences. More than 90% of human intraspecific DMRs were hypomethylated in neuronal cells, compared to non-neuronal cells. Intraspecific DMRs showed enrichment of genes associated with different neuropsychiatric disorders. Comparison between humans and chimpanzees yielded enrichments of genes showing human-specific brain histon modification. Interspecific DMRs were much more frequent in non-neuronal cells (n=666) than in neurons (n=96). Approximately 95% of interspecific DMRs in non-neuronal cells were hypermethylated in humans, compared to chimpanzees. It can be assumed that several hundreds of non-neuronal genes underwent a wave of methylation during human brain evolution. The impact of these changes in non-neuronal cells on the extension of the human brain may have been largely underestimated so far. The most prominent genetic cause for inherited breast and ovarian cancer are mutations in the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes (TSG). However, BRCA1/BRCA2 germline mutations explain less than 50% of all familial breast cancers, even for women diagnosed before the age of 40 years. It has also been reported that epigenetic abnormalities, which contribute to changes in gene expression, play an important role in carcinogenesis and breast cancer development. To rapidly quantify the number of epimutations in different TSG, in both a qualitative and quantitative manner, we have developed a deep bisulfite sequencing assay targeting the promoter regions of eight TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1 and RB1) and the estrogene receptor (ESR1) gene, which plays a role in tumor progression. We have analyzed blood samples of two independent BRCA1/BRCA2-mutation negative breast cancer (BC) cohorts and two independent age-matched healthy control cohorts. BC cohort 1 represents patients with early-onset BC and BC cohort 2 patients with a high risk to carry a heterozygous mutation. Since it is well known that tumor suppressor genes are transcriptionally silenced by promoter methylation, alleles with >50% methylated CpGs are considered as functionally relevant epimutations. Compared to ESR1, which is representative for an average promoter, TSG exhibited very low (<1%) average methylation levels and also very low mean epimutation rates (EMR; <0.0001% to 0.1%). With exception of BRCA1, which showed an increased EMR in BC (0.31% vs. 0.06%), there was no significant difference between patients and controls detectable. One of 36 HR BC patients showed a dramatically increased EMR (14.7%) in BRCA1. We identified in approximately one third (15 of 44) of EO BC patients increased rates of single CpG methylation errors in multiple TSG. Both EO and HR BC patients exhibited global underexpression of blood TSG. We propose that epigenetic abnormalities in normal body cells are indicative of disturbed mechanisms for maintaining low methylation and appropriate expression levels and may be associated with an increased BC risk. KW - Epigenetik KW - Gehirn KW - Brustkrebs KW - differenzielle Methylierung KW - familiärer Brustkrebs KW - Next-Generation Sequencing KW - Methylierung KW - Evolution KW - menschliche Hirnevolution Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164220 ER - TY - JOUR A1 - Bässler, Claus A1 - Brandl, Roland A1 - Müller, Jörg A1 - Krah, Franz S. A1 - Reinelt, Arthur A1 - Halbwachs, Hans T1 - Global analysis reveals an environmentally driven latitudinal pattern in mushroom size across fungal species JF - Ecology Letters N2 - Although macroecology is a well‐established field, much remains to be learned about the large‐scale variation of fungal traits. We conducted a global analysis of mean fruit body size of 59 geographical regions worldwide, comprising 5340 fungal species exploring the response of fruit body size to latitude, resource availability and temperature. The results showed a hump‐shaped relationship between mean fruit body size and distance to the equator. Areas with large fruit bodies were characterised by a high seasonality and an intermediate mean temperature. The responses of mutualistic species and saprotrophs were similar. These findings support the resource availability hypothesis, predicting large fruit bodies due to a seasonal resource surplus, and the thermoregulation hypothesis, according to which small fruit bodies offer a strategy to avoid heat and cold stress and therefore occur at temperature extremes. Fruit body size may thus be an adaptive trait driving the large‐scale distribution of fungal species. KW - Fungal traits KW - global biomes KW - latitudinal gradient KW - mean fruit body size KW - saprobic and ectomycorrhizal basidiomycetes Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239808 VL - 24 IS - 4 SP - 658 EP - 667 ER - TY - THES A1 - Busold, Christian T1 - Facilitating functional interpretation of microarray data by integration of gene annotations in Correspondence Analysis T1 - Verbesserte funktionelle Analyse von Microarraydaten mittels Integration von Gen-Annotationen in Korrespondenzanalyse N2 - DNS-Chips (’Microarrays’) haben sich zu einer der Standardmethoden zur Erstellung von genomweiten Expressionsstudien entwickelt. Mittlerweile wurden dazu eine Vielzahl von Methoden zur Identifizierung von differentiell regulierten Genen veröffentlicht. Ungeachtet dessen stellt die abschliessende funktionelle Interpretation der Ergebnisse einen der Engpässe in der Analyse von Chip-Daten dar. Die Mehrzahl der Analysemethoden stellt die signifikant regulierten Gene in Listen dar, aus denen in einem weiteren Schritt gemeinsame funktionelle Eigenschaften abgeleitet werden müssen. Dies stellt nicht nur eine arbeitsintensive Arbeit dar, die mit steigender Anzahl an experimentellen Konditionen immer weniger praktikabel wird, sondern ist auch fehleranfällig, da diese Auswertung im allgemeinen auf dem visuellen Vergleich von Listen beruht. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden für eine rechnergestützte Auswertung von funktionellen Geneigenschaften entwickelt und validiert. Hierzu wurde die ’Gene Ontology’ als Quelle für die Annotationsdaten ausgewählt, da hier die Daten in einem Format gespeichert sind, das sowohl eine leichte menschliche Interaktion sowie die statistische Analyse der Annotationen ermöglicht. Diese Genannotation wurden als Zusatzinformationen in die Korrespondenzanalyse integriert, welches eine simultane Darstellung von Genen, Hybridisierungen und funktionellen Kategorien in einer Grafik ermöglicht. Aufgrund der ständig wachsenden Anzahl an verfügbaren Annotationen und der Tatsache, daß zwischen den meisten experimentellen Bedingungen nur wenige funktionelle Prozesse differentiell reguliert sind, wurden Filter entwickelt, die die Anzahl der dargestellten Annotationen auf eine im gegebenen experimentellen Kontext relevante Gruppe reduzieren. Die Anwendbarkeit der Visualisierung und der Filter wurde auf Datensätzen unterschiedlicher Komplexität getestet: beginnend mit dem gut verstandenen Glukosestoffwechsel im Modellorganismus S. cerevisiae, bis hin zum Vergleich unterschiedlicher Tumortypen im Menschen. In beiden Fällen generierte die Methode gut zu interpretierende Grafiken, in denen die funktionellen Hauptunterschiede durch die dargestellten Annotationen gut beschrieben werden [90]. Während die Integration von Annotationsdaten wie GO die funktionelle Interpretation vereinfacht, fehlt die Möglichkeit zur Identifikation einzelner relevanter Schlüsselgene. Um eine solche Analyse zu ermöglichen, wurden Daten zum Vorkommen von Transskriptionsfaktorbindestellen in den 5’-Bereichen von Genen integriert. Auch diese Methode wurde an Datensätzen von S. cerevisiae und vergleichenden Studien von humanen Krebszelllinien validiert.In beiden Fällen konnten Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die für die beobachteten transkriptionellen Unterschiede von entscheidender Bedeutung sind [206]. Zusammenfassend, ermöglicht die Integration von Zusatzinformationen in die Korrespondenzanalyse eine simultane Visualisierung von Genen, Hybridisierungen und Annotationsdaten in einer einzigen, gut zu interpretierenden Grafik. Dies erlaubt auch in komplexen experimentellen Bedingungen eine intuitive Identifizierung von relevanten Annotationen. Der hier vorgestellte Ansatz, ist nicht auf die gezeigten Datenstrukturen beschränkt, sondern kann auf die Mehrzahl der verfügbaren Annotationsdaten angewendet werden. N2 - DNA microarrays have become a standard technique to assess the mRNA levels for complete genomes. To identify significantly regulated genes from these large amounts of data a wealth of methods has been developed. Despite this, the functional interpretation (i.e. deducing biological hypothesis from the data) still remains a major bottleneck in microarray data analysis. Most available methods display the set of significant genes in long lists, from which common functional properties have to be extracted. This is not only a tedious and time-consuming task, which becomes less and less feasible with increasing numbers of experimental conditions, but is also prone to errors, since it is commonly done by eye. In the course of this work methods have been developed and tested, that allow for a computerbased analysis of functional properties being relevant in the given experimental setting. To this end the Gene Ontology was chosen as an appropriate source of annotation data, because it combines human-readability with computer-accessibility of the annotations term and thus allows for a statistical analysis of functional properties. Here the gene-annotations are integrated in a Correspondence Analysis which allows to visualize genes, hybridizations and functional categories in a single plot. Due to the increasing amounts of available annotations and the fact that in most settings only few functional processes are differentially regulated, several filter criteria have been developed to reduce the number of displayed annotations to a set being relevant in the given experimental setting. The applicability of the presented visualization and filtering have both been validated on datasets of varying complexity. Starting from the well studied glucose-pathway in S. cerevisiae up to the comparison of different tumor types in human. In both settings the method generated well interpretable plots, which allowed for an immediate identification of the major functional differences between the experimental conditions [90]. While the integration of annotation data like GO facilitates functional interpretation, it lacks the capability to identify key regulatory elements. To facilitate such an analysis, the occurrence of transcription factor binding sites in upstream regions of genes has been integrated to the analysis as well. Again this methodology was biologically validated on S. cerevisiae as well human cancer data sets. In both settings TFs known to exhibit central roles for the observed transcriptional changes were plotted in marked positions and thus could be immediately identified [206]. In essence, integration of supplementary information in Correspondence Analysis visualizes genes, hybridizations and annotation data in a single, well interpretable plot. This allows for an intuitive identification of relevant annotations even in complex experimental settings. The presented approach is not limited to the shown types of data, but is generalizable to account for the majority of the available annotation data. KW - Microarray KW - DNS KW - Genexpression KW - Auswertung KW - Microarray Analyse KW - GO-Annotationen KW - funktionelle Analyse KW - Korrespondenzanalyse KW - microarray data analysis KW - GO-annotations KW - functional interpretation KW - correspondence analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21150 ER - TY - THES A1 - Busch, Sebastian T1 - Morphologie und Organisation individueller oktopaminerger Neurone im Gehirn von Drosophila m. T1 - Morphology and Organization of individual octopaminergic neurons in the Drosophila brain N2 - Das biogene Amin Oktopamin moduliert verschiedene Verhaltensweisen in Invertebraten. In verschiedenen Insektenspezies, wie Heuschrecken, Grillen oder Schaben, ist die Funktion und die Architektur des peripheren oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene bekannt. Um die zelluläre Grundlage für die verschiedenen Funktionen von Oktopamin im Zentralnervensystem zu verstehen, ist eine detaillierte Analyse der Architektur des zentralen oktopaminergen Systems notwendig. Innerhalb meiner Doktorarbeit fertigte eine anatomische Karte individueller oktopaminerger Neurone des adulten Hirns von Drosophila an. Ich nutzte die Flp-out Technik, um einzelne oktopaminerge Neurone anzufärben. Anhand ihrer Projektionsmuster konnte ich 28 verschiedene Zelltypen in vier Oktopamin-immunoreaktiven Zellclustern identifizieren. Ihre Morphologie sowie die Verteilung genetischer Marker zeigte, dass die meisten Zelltypen mehrere Neuropile innervieren und dabei eine klare Trennung von Prä- und Postsynaptischen Regionen aufweisen. Die Mehrheit der Zelltypen bildet dendritische Verzweigungen in einer bestimmten Region, der posterioren Slope. Jedoch innerviert jeder Zelltyp stereotyp eine bestimmte Kombination von Zielregionen im Gehirn. Das deutet stark darauf hin, dass oktopaminerge Neurone kombinatorisch organisiert sind: Jedes individuelle Neuron scheint Komponente eines spezifischen neuronalen Schaltkreises zu sein. Dabei könnte jeder Zelltyp eine Art “Modul” darstellen, das selektiv bestimmte Funktionen in den jeweiligen Zielregionen moduliert. Das oktopaminerge Mittelliniencluster des Subösophagealen Ganglions zeigt eine besondere zelluläre Organisation. Es besteht aus gepaarten und ungepaarten Neuronen, die des Zentralgehirn mit extensiven Verzweigungen versorgen. Um die Ordnung hinter dieser komplexen Organisation zu verstehen, wurden die segmentale Organistion der Mittellinienneurone auf Einzelzellebene analysiert und ihre embryonalen Anlagen verglichen. Letzteres ermöglichte die morphologische Analyse von einzelnen oktopaminergen Mittellinienklonen. OA-VPM und OA-VUM Neurone bilden zusammen drei Subcluster im Subösophagealen Ganglion, die wahrscheinlich die drei gnathalen Neuromere repräsentieren. Alle OA-VUM Neurone stammen von der embryonalen Mittellinie ab. In den mandibularen und maxillaren Neuromeren formen sie morphologisch identische Zelltypen, mit stereotypen Innervationsmustern. OA-VPM Neurone gehen nicht aus der embryonalen Mittellinie hervor und sind nicht segmental dupliziert. Diese Arbeit vermittelt nicht nur einen Eindruck über die Architektur individueller oktopaminerger Neurone, sondern auch über die Organisation des oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene. N2 - The biogenic amine octopamine modulates divers behaviors in invertebrates. In different insect species, such as locusts, crickets, or cockroaches, the function and organization of the peripheral octopaminergic system is understood at single cell level. To understand the basis for the divers octopamine functions within the central nervous system, a detailed morphological analysis of central octopaminergic neurons is necessary. In my Ph.D. I generated an anatomical map of individual octopaminergic neurons in the Drosophila brain. I utilized the Flp-out technique, to label individual octopaminergic neurons. By their projection pattern I categorized 28 different cell types in four octopamine-immunoreactive cell clusters. Their morphology and the distribution of genetic markers indicates that most of the cell types innervate multiple neuropiles and exhibit a clear separation of dendritic and presynaptic regions: The majority of cell types forms spiny ramifications in one particular brain region, the posterior slope. However, each cell type stereotypically innervates a distinct set of target regions throughout the brain. This suggests that octopaminergic neurons are organized in a combinatorial way. Each individual neuron seems to be a component of a specif neuronal circuitry. This way each cell type could represent a modul, which selectively modulates neuronal processes in its respective target regions. The octopaminergic midline cluster of the suboesophageal ganglion shows a special cellular organization. It consists of paired and unpaired neurons, which supply the central brain with extensive ramifications. To understand the rule behind this complex organization, the segmental organization and developmental origin of midline neurons was analyzed at single cell level. The latter was achieved by analyzing the morphology of individual octopaminergic midline clones. OA-VPM and OA-VUM neurons form three subclusters in the suboesophageal ganglion, which most likely represent the three gnathal neuromeres. All OA-VUM neurons derive from the embryonic midline. In the mandibular and maxillary neuromere they form morphologically identical cell types with stereotypic Innervation patterns. OA-VPM neurons do not derive from the embryonic midline and are not segmentally duplicated. This study not only gives an impression of the architecture of individual octopaminergic neurons, but also about the organization of the octopaminergic system at single cell level. KW - Drosophila KW - Gehirn KW - Octopamin KW - Neuroanatomie KW - Nervennetz KW - Drosophila KW - Brain KW - Octopamine KW - Neuroanatomy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36203 ER - TY - THES A1 - Busch, Rhoda T1 - Redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system T1 - Redundanz und Unentbehrlichkeit der NFATc1-Isoformen im adaptiven und natürlichen Immunsystem N2 - Peritonitis is a common disease in man, frequently caused by fungi, such as Candida albicans; however, in seldom cases opportunistic infections with Saccharomyces cerevisiae are described. Resident peritoneal macrophages (prMΦ) are the major group of phagocytic cells in the peritoneum. They express a broad range of surface pattern recognition receptors (PRR) to recognize invaders. Yeast infections are primarily detected by the Dectin-1 receptor, which triggers activation of NFAT and NF-κB pathways. The transcription of the Nfatc1 gene is directed by the two alternative promoters, inducible P1 and relatively constitutive P2 promoter. While the role of P1-directed NFATc1α-isoforms to promote survival and proliferation of activated lymphocytes is well-established, the relevance of constitutively generated NFATc1β-isoforms, mainly expressed in resting lymphocytes, myeloid and non-lymphoid cells, remains unclear. Moreover, former work at our department indicated different roles for NFATc1α- and NFATc1β-proteins in lymphocytes. Our data revealed the functional role of NFATc1 in peritoneal resident macrophages. We demonstrated that the expression of NFATc1β is required for a proper immune response of prMΦ during fungal infection-induced acute peritonitis. We identified Ccl2, a major chemokine produced in response to fungal infections by prMΦ, as a novel NFATc1 target gene which is cooperatively regulated through the NFAT- and canonical NF-κB pathways. Consequently, we showed that NFATc1β deficiency in prMΦ results in a decreased infiltration of inflammatory monocytes, leading to a delayed clearance of peritoneal fungal infection. We could further show that the expression of NFATc1β-isoforms is irrelevant for homeostasis of myeloid and adaptive immune system cells and that NFATc1α- (but not β-) isoforms are required for a normal development of peritoneal B1a cells. In contrast to the situation in myeloid cells, NFATc1β deficiency is compensated by increased expression of NFATc1α-isoforms in lymphoid cells. As a consequence, NFATc1ß is dispensable for activation of the adaptive immune system. Taken together our results illustrate the redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system, indicating a complex regulatory system for Nfatc1 gene expression in different compartments of the immune system and likely beyond that. N2 - Peritonitis ist eine alltägliche Erkrankung des Menschen, die häufig durch Pilze wie Candida albicans verursacht wird. In seltenen Fällen sind opportunistische Infektionen mit Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Residente peritoneale Makrophagen (prMΦ) stellen die größte Gruppe phagozytischer Zellen im Peritoneum dar. Sie exprimieren eine Vielzahl an Oberflächenrezeptoren (PRR), mit denen sie Eindringlinge erkennen. Hefeinfektionen werden dabei vorrangig durch den Dectin-1 Rezeptor erkannt, der die Signalkaskaden von NFAT und NF-κB aktiviert. Die Transkription des Nfatc1 Gens wird von zwei Promotoren gelenkt, dem induzierbaren P1-Promotor und dem relativ konstitutiven P2-Promotor. Während die Funktionen der vom P1-Promotor erzeugten NFATc1α-Isoformen beim Überleben und der Proliferation von aktivierten Lymphozyten wohl bekannt sind, blieb die Rolle der NFATc1β-Isoformen, die vor allem in ruhenden lymphoiden, myeloiden und nicht-lymphoiden Zellen exprimiert sind, bisher ungeklärt. Unser Labor konnte zudem zeigen, dass NFATc1α- und NFATc1β- Proteine unterschiedliche Funktionen in Lymphozyten haben. Unsere Daten lassen die Funktion von NFATc1 in peritonealen Makrophagen erkennen. Wir konnten zeigen, dass während einer pilzinduzierten Peritonitis die Expression von NFATc1β für eine vollständige Immunantwort der prMΦ erforderlich ist. Wir haben Ccl2, das am stärksten von prMΦ als Antwort auf Pilzinfektionen produzierte Chemokin, als neues NFATc1 Zielgen identifiziert, welches kooperativ von den NFATc1- und NF-κB-Signalwegen reguliert wird. Folglich konnten wir zeigen, dass das Fehlen von NFATc1β in prMΦ zu einer Abnahme der eindringenden entzündlichen Monozyten führt, was eine verspätete Abwehr von peritonealen Pilzinfektionen zur Folge hat. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Expression von NFATc1β-Isoformen irrelevant für die Homöostase von myeloiden und adaptiven Immunzellen ist, und dass NFATc1α- (aber nicht β-) Isoformen für die normale Entwicklung von B1a-Zellen erforderlich sind. In lymphoiden Zellen wird das Fehlen von NFATc1β, im Gegensatz zur Situation in myeloiden Zellen, durch eine erhöhte Expression von NFATc1α kompensiert. Demzufolge ist NFATc1β entbehrlich für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse die Redundanz und die Unentbehrlichkeit der NFATc1-Isoformen im adaptiven und natürlichen Immunsystem, welche auf ein komplexes regulatorisches System der Genexpression von NFATc1 in den verschiedenen Kompartimenten des Immunsystems und wahrscheinlich darüber hinaus hinweist. KW - Immunsystem KW - NFATc1 KW - fungal infection KW - Ccl2 KW - Bauchfellentzündung KW - Mykose KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91096 ER - TY - THES A1 - Burgert, Anne T1 - Untersuchung von Sphingolipiden und anderen Membrankonjugaten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie T1 - Analysis of sphingolipids and other membrane conjugates with super-resolution fluorescence microscopy N2 - Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren. Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff. Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%. Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden. Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen. Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen. Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern. Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen. Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten. In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden. In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann. N2 - With single molecule localization microscopy (SMLM) quantification of molecules and the analysis of their distribution becomes possible. In this work various plasma membrane molecules of different eukaryotic and prokaryotic cells were imaged with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) or PALM (photoactivated localization microscopy) and quantified. To use these super-resolution fluorescence microscopy techniques and answer elaborate biological questions, potential sources of artifacts were identified and strategies to circumvent them developed. A possible source of artifacts is an insufficient number of photons emitted by fluorophores. If less photons are detected, determining the localization of one fluorophore is less precise. This can cause a wrong reconstruction of structures or might lead to false conclusions about the distribution of molecules. One possibility to increase the number of photons is to use chemical additives which quench the triplet state of fluorophores. They ensure that the fluorophores relax into the ground state allowing them to become excited again. Different additives, described in literature as triplet quenchers, were tested. The effects of these additives on the triplet state of different fluorophores (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) were analyzed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Cyclooctatetraene (COT) resulted in a decrease of triplet state yield of Al488, Al532 and Al647 by ~ 40-60%, yet the triplet state of Atto655 was unaffected. FCS measurements indicated that COT results in an increased number of emitted photons, but dSTORM measurements could not confirm this finding. Here, COT only revealed a positive effect on the intensity of Al647 (increase by ~ 60%). An explanation for this inconsistency with the FCS results might be the presence of the switching buffer in dSTORM measurements. The buffer is designed to cause a transition of the fluorophores to and stabilize the off-state by removing oxygen from the sample, counteracting the effect of COT. On addition of 5 mM potassium iodide (KI) only Al488 fluorophores showed a decreased triplet state rate (~ 80%) in FCS measurements. This finding was confirmed by dSTORM measurements with low concentrations (~ 0.5 mM) of KI which resulted in a slight intensity increase (~ 10%) of Al488. Higher KI concentration (5 mM) on the other hand showed a reversed effect, resulting in a drop in intensity by ~ 40%. Deuterium oxide (D2O) isn’t a triplet quencher but should minimize non-radiative processes. DSTORM measurements with Atto665 and Al647 revealed, that D2O does not affect the total number of emitted photons per fluorophore. Instead, D2O increased the amount of emitted photons per time. In a nutshell, these results show that dSTORM measurements with Al647 can be improved using COT, and measurements with Al488 by using very low concentrations of KI. If needed, D2O can speed up dSTORM acquisition time considerably, e.g. for life cell measurements. In addition to an insufficient number of collected photons, inappropriate photoswitching rates can induce artifacts in dSTORM measurements as well. This was shown using various biological reference structures. Especially the imaging of plasma membranes is prone to generate artifacts. Plasma membranes exhibit a lot of intrinsically three-dimensional structures with high local emitter densities. In these regions of higher fluorophore densities the likelihood of two close fluorophores emitting at the same time is increased. This in turn can result in large artificial clusters due to misinterpretation by the reconstruction software. Taken together, the performed experiments show how important it is to prove dSTORM images and minimize possibility image artifacts. Thus, raw data movies need to be examined carefully and, if necessary, measurements must be repeated with adapted imaging conditions. Since dSTORM is increasingly used for quantification and cluster analysis it is recommended to publish raw data in the Supporting information of the manuscript. Another source of artifacts when imaging molecules with SMLM is the staining procedure. Usually antibodies are used to label biological structures for dSTORM. In the interest of resolution, small antibodies or just fragments of antibodies should be used, especially if cluster analysis is performed. Otherwise reduced resolution or an increase in cross-linking of molecules might occur. In the second part of this study plasma membrane ceramides were investigated. Sphingolipid ceramides regulate various cellular processes. Different stimuli initiate activation of sphingomyelinases (SMase) which synthesize ceramides at the plasma membrane. A rise in ceramide concentration leads to a condensation of them in ceramide-rich platforms (CRPs). So far, only little is known about the distribution and the size of CRPs. Here, plasma membrane ceramides of Jurkat-, U2OS-, HBME- and primary T-cells were stained with an IgG-antibody, imaged using dSTORM and their distribution quantitatively analyzed. Independent of the analyzed cell line, ~ 50% of all ceramides detected in the plasma membrane formed CRPs with a size of ~ 75 nm. On average one CRP consisted of ~ 20 ceramide molecules. Using a titration series the possibility of artificial cluster generation due to antibody staining was ruled out. Treatment of cells with Bacillus cereus sphingomyelinase (bSMase) increased the overall ceramide concentration in the plasma membrane, the number of ceramides in the CRPs as well as the quantity and the size of CRPs. This might result in a higher solubility of membrane components in CRPs which in turn could facilitate accumulation or compartmentation of certain proteins. Accumulation of ceramides in the CRPs could also enable local interaction with other molecules and possibly change the reactivity of some receptors. To investigate plasma membrane ceramides in living cells azido-modified ceramides and copper-free click chemistry were used for labeling. Imaging was performed using confocal laser-scanning microscopy (LSM) and structured illumination microscopy. It was shown that the length of fatty acid chains and the position of the azido group of ceramide analogues play a decisive role in the magnitude of the detected signal in the plasma membrane. These results demonstrate that azido-functionalized ceramides are live-cell compatible, making them an excellent tool to follow cellular reactions. In this study, ceramides were not only analyzed in eukaryotic cells but in bacteria as well. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) are gram-negative bacteria triggering sepsis or meningitis in humans. Using both immunolabeling with anti-ceramide IgG-antibodies and azido-modified ceramides, ceramides were detected for the first time in the membrane of N. meningitidis by dSTORM. Although sphingolipids were reported to exist in various bacterial membranes, studies about ceramides in N. meningitidis have not yet been published. The results obtained here suggest the presence of ceramides in N. meningitidis. The third part of this thesis addresses the interaction between NK cells and Aspergillus fumigatus. The mold can cause invasive aspergillosis in immunocompromised patients which can lead to death. Various studies have already shown that NK cells play a crucial role in the clearance of the fungal infection. Still, the exact mechanism remains unknown. As part of this work the NK cell marker CD56 was identified as a decisive receptor in recognition of the mold. Using LSM and dSTORM measurements in combination with immunocytochemical staining an active transport of the usually homogenous distributed CD56 receptors to the interaction site of NK cells and fungus was detected. Over time CD56 proteins accumulate at these interaction sites while the signal in the rest of the membrane continuously decreases. For the first time this study was able to identify CD56 as an important recognition receptor for A. fumigatus. In the last project binding of anti-N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor encephalitis autoantibodies were investigated in neurons. Patients with this form of encephalitis generate autoantibodies against the NR1 subunit of their own postsynaptic NMDA receptors. Since NMDA receptor encephalitis is often diagnosed too late and treatment options are limited the disease often proves to be fatal. Anti-NMDA receptor encephalitis was described quite recently, explaining why the exact mechanism remains still unknown. For this study purified antibodies from anti-NMDA receptor encephalitis patients were used to stain NMDA receptor transfected HEK cells and hippocampal mouse neurons. These samples were subsequently imaged with dSTORM and analyzed. Measurements on HEK cells confirmed that the autoantibodies bind to the NR1 subunit. Using dSTORM, the binding sites of these antibodies at the neurons were imaged for the first time with super-resolution microscopy. The receptors are densely localized in synapses and more equally distributed at lower density in extrasynaptic regions. Based on Ripley’s H function synaptic clusters with a diameter of ~ 90 nm and ~ 500 localizations were determined while the extrasynaptic smaller clusters have a median diameter of ~ 70 nm and ~ 100 localizations per cluster. These first results form the basis for further investigations on the mechanism of anti-NMDA receptor encephalitis. KW - Ceramide KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - NMDA KW - Neisseria meningitidis KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - Plasmamembran Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145725 ER - TY - THES A1 - Bujok, Brigitte T1 - Thermoregulation im Brutbereich der Honigbiene Apis mellifera carnica T1 - Thermoregulation in the brood region of honeybees (Apis mellifera carnica) N2 - Honigbienen (Apis mellifera carnica) regulieren die Temperatur ihrer Brut in einem sehr engen Temperaturfenster, da vor allem die gedeckelte Brut sehr temperaturempfindlich reagiert (Groh et al. 2004). Die Thermoregulation ist nicht – wie lange angenommen – Beiprodukt von alltäglichen Arbeiten der Bienen im Brutbereich, sondern eine aktive und Energie- und Zeitaufwändige eigene Tätigkeit. Arbeiterinnen ziehen sich mit ihren Beinen an die Brutoberfläche, drücken ihren warmen Thorax auf die Brutdeckel und verharren so für einige Minuten um mit der eigenen Körperwärme die Brut zu temperieren (Bujok et al. 2002). Wie erwartet korrelierte die Thoraxtemperatur einer Arbeiterin mit der Frequenz der abdominalen Atembewegungen, bei sehr hohen Thoraxtemperaturen (über 40°C) erreichten die Bienen Atemfrequenzen von über 8Hz. Eine weitere Methode die Brut effektiv zu wärmen übten Bienen aus, die leere Zellen im gedeckelten Brutbereich besuchen (Kleinhenz et al. 2003). Arbeiterinnen gingen dabei bevorzugt in Zellen, die von möglichst vielen gedeckelten Zellen umgeben waren. Sowohl die Dauer der Zellbesuche, als auch die mittlere Thoraxtemperatur bei Ein- und Austritt der Zelle korrelierten mit der Anzahl der benachbarten Brutzellen – je mehr Brutzellen eine leere Zelle in ihrer direkten Nachbarschaft hatte umso länger dauerte der Besuch einer Biene und umso höher ist die Ein- bzw. Austrittstemperatur der Biene. Mindestes 48 Stunden alte Bienen unterschieden sich signifikant in ihrem Wärmeverhalten von jüngeren Bienen. Tote gedeckelte Brut wurde in manchen Fällen über viele Tage (durchgehend bis 10 Tage) gewärmt, sie unterschied sich in ihrer Temperatur nicht von unbehandelter gedeckelter Brut. In weiteren Versuchen lag die Bruttemperatur von toter Brut zwar unter der eines Kontrollbereiches, die Temperatur lag aber weiterhin im optimalen Bereich von 33,5 bis 35°C (Groh et al. 2004). In diesen Versuchen wurde die tote Brut vor dem Einsetzen in den Beobachtungsstock wieder auf 35°C erwärmt. Wachskegel in gedeckelten Zellen wurden erkannt und ausgeräumt. Aktive Signale, die von der Brut ausgehen scheinen also nicht notwendig für die effektive Bruttemperaturregulierung zu sein. Untersuchungen mittels Laser-Doppler-Vibrometrie zeigten auch keine Hinweise auf eine mechanische Kommunikation zwischen den Puppen und den Arbeiterinnen. Das Brutwärmen scheint eine Aktion zu sein, die von den Bienen nur in Gemeinschaft sinnvoll durchgeführt werden kann. In einigen Fällen kam es während der Puppenphase zu unerklärlichen Abfällen in der Bruttemperatur, die nur durch einen positiven Rückkopplungseffekt seitens der Arbeiterinnen erklärt werden kann. Beim Brutwärmen spielen die Antennen der Arbeiterinnen wahrscheinlich eine wichtige Rolle. Während sich die Bienen beim aktiven Brutwärmen den Brutdeckel annähern sind die Antennenspitzen immer auf die Brutdeckel gerichtet. Fehlen den Arbeiterinnen die Antennen, dann ist die Thermoregulation eingeschränkt oder unzureichend. Die Bruttemperatur korreliert mit der Anzahl der abgetrennten Antennensegmente, je mehr Antennensegmente fehlen, desto weniger gut wird die Temperatur im Brutbereich hoch und konstant gehalten. Zusätzlich scheint es eine Lateralität in der Antennenfunktion zu geben, wurde die rechte Antenne gekürzt wärmten die Bienen die Brut signifikant schlechter, als beim Kürzen der linken Antenne. Durch das Kürzen der Antennen änderte sich auch das Verhalten der Tiere: Kontrollbienen verharrten ruhig im Brutbereich, während Bienen mit gekürzten Antennen teilweise ähnlich warm waren, aber nicht mehr das oben beschriebene aktive Brutwärmeverhalten zeigten. N2 - Honey bees (Apis mellifera carnica) precisely regulate brood temperature in a range between 33 to 35°C, as the development of the larvae, especially the capped brood stages are very sensitive to temperature changes. The heat used for thermoregulation in the brood area is not a by-product of work, but an active time and energy consuming task called brood heating behaviour: worker bees pull their warm thoraces towards the brood caps and remain in that position for about 10 minutes to transfer their body heat to the brood caps and the brood (Bujok et al. 2002). As expected, thoracic temperatures of bees correlated with frequency of abdominal breathing movements; bees with high thoracic temperatures (above 40°C) showed abdominal movements of up to slightly over 8Hz. Honey bee workers use empty cells neighbouring the capped brood cells for brood heating (Kleinhenz et al. 2003). Therefore, bees preferred visiting cells neighboured by numerous brood cells. Both duration of cell visits and thoracic temperature of the bee correlated with the number of neighboured brood cells. Older bees (at least 48h) showed significantly higher thoracic temperatures than younger bees (up to 48h old) immediately before and after their cell visits. Dead capped brood were heated over several days and showed equivalent temperatures to living brood warmed by worker bees. In other cases, the brood temperature was lower, but still in the optimal temperature range of 33.5 to 35°C (Groh et al. 2004). In the experiments, the dead brood was killed by cold then warmed up again to 35°C before putting it into the observation hive. Capped brood cells filled with wax dummies were not heated and immediately cleared out. Mechanical signals from the brood seemed not to be important for the brood heating behaviour of the worker bees; observations with laser-vibrometry showed no signals coming from the brood demanding thermoregulation. The antennae of the bees seem to be very important for effective brood heating, since during brood heating behaviour the antennae point to the capped brood surface. Worker bees with shortened antennae showed inferior brood heating behaviour, while brood temperature correlated with number of missing antenna segments. Additionally, the effectiveness of brood heating seems to be linked to a underlying laterality of the antennas function, when parts of the right antenna were amputated, brood heating was worse than when parts of the left antenna were amputated. With the amputation of the antenna the behaviour of the bees changed: control bees remained very quiet in the capped brood area, while bees with amputated antenna with similarly warm thoraces did not show the typical brood heating behaviour anymore. In some observations brood temperature dropped for some hours and increased again in a way that can only be explained by positive feedback of brood heating of the worker bees. Brood heating appears to be a collective action. KW - Biene KW - Brutbiologie KW - Thermoregulation KW - Honigbiene KW - Temperaturregulierung KW - Brut KW - Thermographie KW - honey bee KW - temperature regulation KW - brood KW - thermography Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15903 ER - TY - JOUR A1 - Buga, Ana-Maria A1 - Scholz, Claus Jürgen A1 - Kumar, Senthil A1 - Herndon, James G. A1 - Alexandru, Dragos A1 - Cojocaru, Gabriel Radu A1 - Dandekar, Thomas A1 - Popa-Wagner, Aurel T1 - Identification of New Therapeutic Targets by Genome-Wide Analysis of Gene Expression in the Ipsilateral Cortex of Aged Rats after Stroke JF - PLoS One N2 - Background: Because most human stroke victims are elderly, studies of experimental stroke in the aged rather than the young rat model may be optimal for identifying clinically relevant cellular responses, as well for pinpointing beneficial interventions. Methodology/Principal Findings: We employed the Affymetrix platform to analyze the whole-gene transcriptome following temporary ligation of the middle cerebral artery in aged and young rats. The correspondence, heat map, and dendrogram analyses independently suggest a differential, age-group-specific behaviour of major gene clusters after stroke. Overall, the pattern of gene expression strongly suggests that the response of the aged rat brain is qualitatively rather than quantitatively different from the young, i.e. the total number of regulated genes is comparable in the two age groups, but the aged rats had great difficulty in mounting a timely response to stroke. Our study indicates that four genes related to neuropathic syndrome, stress, anxiety disorders and depression (Acvr1c, Cort, Htr2b and Pnoc) may have impaired response to stroke in aged rats. New therapeutic options in aged rats may also include Calcrl, Cyp11b1, Prcp, Cebpa, Cfd, Gpnmb, Fcgr2b, Fcgr3a, Tnfrsf26, Adam 17 and Mmp14. An unexpected target is the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1 in aged rats, a key enzyme in the cholesterol synthesis pathway. Post-stroke axonal growth was compromised in both age groups. Conclusion/Significance: We suggest that a multi-stage, multimodal treatment in aged animals may be more likely to produce positive results. Such a therapeutic approach should be focused on tissue restoration but should also address other aspects of patient post-stroke therapy such as neuropathic syndrome, stress, anxiety disorders, depression, neurotransmission and blood pressure. KW - gamma KW - corticotropin-releasing hormone KW - colony-stimulating factor KW - cerebral ischemia KW - receptor KW - brain KW - protein KW - inhibitor KW - mouse KW - differentiation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130657 VL - 7 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Buellesbach, Jan A1 - Vetter, Sebastian G. A1 - Schmitt, Thomas T1 - Differences in the reliance on cuticular hydrocarbons as sexual signaling and species discrimination cues in parasitoid wasps JF - Frontiers in Zoology N2 - Background Cuticular hydrocarbons (CHC) have been documented to play crucial roles as species- and sex-specific cues in the chemical communication systems of a wide variety of insects. However, whether they are sufficient by themselves as the sole cue triggering sexual behavior as well as preference of con- over heterospecific mating partners is rarely assessed. We conducted behavioral assays in three representative species of parasitoid wasps (Hymenoptera: Pteromalidae) to determine their reliance on CHC as species-specific sexual signaling cues. Results We found a surprising degree of either unspecific or insufficient sexual signaling when CHC are singled out as recognition cues. Most strikingly, the cosmopolitan species Nasonia vitripennis, expected to experience enhanced selection pressure to discriminate against other co-occurring parasitoids, did not discriminate against CHC of a partially sympatric species from another genus, Trichomalopsis sarcophagae. Focusing on the latter species, in turn, it became apparent that CHC are even insufficient as the sole cue triggering conspecific sexual behavior, hinting at the requirement of additional, synergistic sexual cues particularly important in this species. Finally, in the phylogenetically and chemically most divergent species Muscidifurax uniraptor, we intriguingly found both CHC-based sexual signaling as well as species discrimination behavior intact although this species is naturally parthenogenetic with sexual reproduction only occurring under laboratory conditions. Conclusions Our findings implicate a discrepancy in the reliance on and specificity of CHC as sexual cues in our tested parasitioid wasps. CHC profiles were not sufficient for unambiguous discrimination and preference behavior, as demonstrated by clear cross-attraction between some of our tested wasp genera. Moreover, we could show that only in T. sarcophagae, additional behavioral cues need to be present for triggering natural mating behavior, hinting at an interesting shift in signaling hierarchy in this particular species. This demonstrates the importance of integrating multiple, potentially complementary signaling modalities in future studies for a better understanding of their individual contributions to natural sexual communication behavior. KW - chemical communication KW - assortative mating KW - mate recognition KW - prezygotic reproductive isolation KW - speciation KW - Nasonia KW - Trichomalopsis KW - Muscidifurax KW - Pteromalidae KW - Hymenoptera Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-221702 VL - 15 ER - TY - JOUR A1 - Buellesbach, Jan A1 - Diao, Wenwen A1 - Schmitt, Thomas A1 - Beukeboom, Leo W. T1 - Micro‐climate correlations and conserved sexual dimorphism of cuticular hydrocarbons in European populations of the jewel wasp Nasonia vitripennis JF - Ecological Entomology N2 - 1. Protection against desiccation and chemical communication are two fundamental functions of cuticular hydrocarbons (CHCs) in insects. In the parasitoid jewel wasp Nasonia vitripennis (Walker), characterised by a cosmopolitan distribution through largely different environments, CHCs function as universally recognised female sex pheromones. However, CHC uniformity as basis for sexual recognition may conflict with the desiccation protection function, expected to display considerable flexibility through adaptation to different environmental conditions. 2. We compared male and female CHC profiles of N. vitripennis across a wide latitudinal gradient in Europe and correlated their CHC variation with climatic factors associated with desiccation. Additionally, we tested male mate discrimination behaviour between populations to detect potential variations in female sexual attractiveness. 3. Results did not conform to the general expectation that longer, straight‐chain CHCs occur in higher proportions in warmer and drier climates. Instead, unexpected environmental correlations of intermediate chain‐length CHCs (C31) were found exclusively in females, potentially reflecting the different life histories of the sexes in N. vitripennis. 4. Furthermore, we found no indication of population‐specific male mate preference, confirming the stability of female sexual attractiveness, likely conveyed through their CHC profiles. C31 mono‐ and C33 di‐methyl‐branched alkanes were consistently and most strongly associated with sexual dimorphism, suggesting their potential role in encoding the female‐specific sexual signalling function. 5. Our study sheds light on how both adaptive flexibility and conserved sexual attractiveness can potentially be integrated and encoded in CHC profiles of N. vitripennis females across a wide distribution range in Europe. KW - chemical communication KW - climatic factors KW - desiccation resistance KW - sex pheromones KW - sexual dimorphism Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-262770 VL - 47 IS - 1 SP - 38 EP - 51 ER - TY - THES A1 - Buckel, Lisa T1 - Evaluating the combination of oncolytic vaccinia virus and ionizing radiation in therapy of preclinical glioma models T1 - Evaluierung der Kombination von onkolytischem Vaccinia Virus und ionisierender Strahlung in vorklinischen Gliomamodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) verkörpert die aggressivste Form von bösartigen Gehirntumoren und seine Therapie gestaltet sich schwierig. Weitläufige Forschung hat dazu geführt, dass onkolytische Viren zur Verbesserung der Tumorbehandlung untersucht wurden. Gegenwärtig wird eine Vielzahl an verschiedenen onkolytischen Viren untersucht und einige wenige befinden sich bereits in klinischen Studien. Eines der Viren die untersucht werden, ist das Vaccinia-Virus. GLV-1h68, ein onkolytisches Vaccinia- Virus, wurde durch die Einfügung von drei Genkasseten, RUC-GFP Fusion, β- Galaktosidase und β- Glucuronidase in das Genom des LIVP Stammes hergestellt. Da fokale Bestrahlungstherapie aus der Behandlung von Krebs, nicht nur im Falle von Glioblastomen, nicht wegzudenken ist, ist es klinisch relevant, zu untersuchen, wie ein systemisch verabreichtes Vaccinia-Virus mit gezielter ionisierender Strahlung (IR) kombiniert werden könnte, um Therapiechancen zu verbesseren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, wie gezielte IR mit verschiedenen sytemisch injizierten Vaccinia-Virus Stämmen in einem Mausmodell für humane U-87-Glioma kombiniert wurde. Nachdem einleitende Versuche bestätigten, dass IR die virale Erbinformation nicht beschädigt und auch nicht den viralen Tropismus verändert, wurden Tierstudien durchgeführt, die die Interaktion des Vaccinia-Virus mit Bestrahlungtherapie in vivo untersuchten. Wir konnten zeigen, dass eine vorherige Bestrahlung des Tumors, bevor das GLV-1h68-Virus systemisch injiziert wurde, eine erhöhte viraler Replikation im Tumor zur Folge hatte, wie wir durch gesteigerte virale Titer und Markergenexpression belegen konnten. Von wesentlicher Bedeutung ist, dass eine Verabreichung von ausschliesslich GLV-1h68 einen minimalen Einfluss auf das U-87 Tumorwachstum hatte, während die durch die Bestrahlung ausgelöste erhöhte Vermehrung von Virus im Tumor eine Verzögerung des Tumorwachstums sowie ein verlängertes Überleben von Mäusen mit U-87-Xenografts zur Folge hatte. Die Fähigkeit von IR virale Vermehrung zu erhöhen, wurde auch für das weniger attenuierte LIVP 1.1.1-Virus gezeigt. Wenn die Bestrahlung in einem klinisch relevanten fraktionierten Bestrahlungsschema verabreicht wurde, war virale Replikation ebenfalls erhöht. Dies verdeutlicht, dass das Vaccinia-Virus klinisch entweder in eine Bestrahlung mit einer einzelnen Dosis oder in eine konventionelle fraktionierte Bestrahlung integriert werden kann. Die Fähigkeit von fokaler IR, eine selektive Vermehrung von systemisch injizierten onkolytischen Vaccinia-Viren zu ermöglichen, wurde in einem bilateralen Gliomamausmodell bestätigt. In Mausen mit Tumoren an beiden Hinterbeinen, vermehrte sich das systemisch gespritzte Vaccinia-Virus bevorzugt im bestrahlten Tumor. Wir konnten zeigen, wie die Tumorkontrolle darüber hinaus weiter verbessert werden kann, wenn fraktionierte fokale Bestrahlung mit einem Vaccinia-Virus kombiniert wird, das eine anti-angiogenetische Ladung, die den vaskulaeren endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) inhibiert, exprimiert. Unsere Studien konnten zeigen, dass durch die Bestrahlung von U-87 Gliomazellen eine Hochregulation von VEGF-Expression ausgelöst wurde, die Radioresistenz von Endothelzellen konzentrationsabhängig induzierte. Wir konnten zeigen, dass die durch VEGF verursache Radioresistenz umkehrbar ist, wenn zusätzlich aufgereinigtes GLAF-1, einen Vaccinia Virus exprimierten Antikörper, zu den Zellen gegeben wurde. In einem Mausmodell zeigte die Kombination aus fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164, ein Vaccinia-Virus, das ebenfalls einen VEGF Antikörper mit Ähnlichkeit zu GLAF-1 exprimiert, resultierte in der stärksten volumetrischen Tumorantwort. Es wurde ebenfalls eine drastische Abnahme an VEGF im Tumor bereits 3 Tagen nach Virus- Injektion nachgewiesen. Histologische Analyse bestätigte, dass die Blockade von VEGF eine Erniedrigung der Anzahl von Tumorblutgefäßen, zu 30% von Kontrolltumoren, zur Folge hatte. Dieser Wert war niedriger als in allen anderen Behandlungsgruppen. Unsere Versuche mit fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164 konnten zeigen, dass zusätzlich zu der durch Virus und Bestrahlung ausgelösten Tumorzellzerstörung, eine effiziente Degeneration der Tumorblutgefäße möglich war. Dies wurde durch eine erhöhte Virus-Vermehrung als Folge der Bestrahlung, sowie durch Sensitiveren der tumoralen Endothelzellen durch Blockierung von VEGF-A erreicht. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit zeigen, wie fokale Bestrahlungstherapie mit systemisch verabreichten onkolytische Vaccinia-Viren für aggressive, fortgeschrittene Tumore kombiniert werden kann. Es ist denkbar, dass die Tumortherapie weiter verbessert werden kann, wenn ein Vaccinia-Virus benutzt wird, das sich zusätzlich gegen VEGF richtet, so werden zu den Krebszellen zusätzlich Tumorblutgefäße in die Therapie miteinbezogen, um die Sensitivität von Endothelzellen gegen Bestrahlung weiter zu erhöhen. KW - Gliom KW - Vaccinia-Virus KW - Strahlentherapie KW - Kombinationstherapie KW - onkolytische Virotherapie KW - Glioma KW - vaccinia virus KW - ionizing radiation KW - combination therapy KW - oncolytic virotherapy Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85309 ER - TY - JOUR A1 - Buchner, Erich A1 - Blanco Redondo, Beatriz A1 - Bunz, Melanie A1 - Halder, Partho A1 - Sadanandappa, Madhumala K. A1 - Mühlbauer, Barbara A1 - Erwin, Felix A1 - Hofbauer, Alois A1 - Rodrigues, Veronica A1 - VijayRaghavan, K. A1 - Ramaswami, Mani A1 - Rieger, Dirk A1 - Wegener, Christian A1 - Förster, Charlotte T1 - Identification and Structural Characterization of Interneurons of the Drosophila Brain by Monoclonal Antibodies of the Würzburg Hybridoma Library JF - PLoS ONE N2 - Several novel synaptic proteins have been identified by monoclonal antibodies (mAbs) of the Würzburg hybridoma library generated against homogenized Drosophila brains, e.g. cysteine string protein, synapse-associated protein of 47 kDa, and Bruchpilot. However, at present no routine technique exists to identify the antigens of mAbs of our library that label only a small number of cells in the brain. Yet these antibodies can be used to reproducibly label and thereby identify these cells by immunohistochemical staining. Here we describe the staining patterns in the Drosophila brain for ten mAbs of the Würzburg hybridoma library. Besides revealing the neuroanatomical structure and distribution of ten different sets of cells we compare the staining patterns with those of antibodies against known antigens and GFP expression patterns driven by selected Gal4 lines employing regulatory sequences of neuronal genes. We present examples where our antibodies apparently stain the same cells in different Gal4 lines suggesting that the corresponding regulatory sequences can be exploited by the split-Gal4 technique for transgene expression exclusively in these cells. The detection of Gal4 expression in cells labeled by mAbs may also help in the identification of the antigens recognized by the antibodies which then in addition to their value for neuroanatomy will represent important tools for the characterization of the antigens. Implications and future strategies for the identification of the antigens are discussed. KW - cell staining KW - drosophila melanogaster KW - gene expression KW - hybridomas KW - immune serum KW - library screening KW - monoclonal antibodies KW - neurons Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97109 ER - TY - JOUR A1 - Buchheim, Mark A. A1 - Keller, Alexander A1 - Koetschan, Christian A1 - Förster, Frank A1 - Merget, Benjamin A1 - Wolf, Matthias T1 - Internal Transcribed Spacer 2 (nu ITS2 rRNA) Sequence-Structure Phylogenetics: Towards an Automated Reconstruction of the Green Algal Tree of Life JF - PLoS ONE N2 - Background: Chloroplast-encoded genes (matK and rbcL) have been formally proposed for use in DNA barcoding efforts targeting embryophytes. Extending such a protocol to chlorophytan green algae, though, is fraught with problems including non homology (matK) and heterogeneity that prevents the creation of a universal PCR toolkit (rbcL). Some have advocated the use of the nuclear-encoded, internal transcribed spacer two (ITS2) as an alternative to the traditional chloroplast markers. However, the ITS2 is broadly perceived to be insufficiently conserved or to be confounded by introgression or biparental inheritance patterns, precluding its broad use in phylogenetic reconstruction or as a DNA barcode. A growing body of evidence has shown that simultaneous analysis of nucleotide data with secondary structure information can overcome at least some of the limitations of ITS2. The goal of this investigation was to assess the feasibility of an automated, sequence-structure approach for analysis of IT2 data from a large sampling of phylum Chlorophyta. Methodology/Principal Findings: Sequences and secondary structures from 591 chlorophycean, 741 trebouxiophycean and 938 ulvophycean algae, all obtained from the ITS2 Database, were aligned using a sequence structure-specific scoring matrix. Phylogenetic relationships were reconstructed by Profile Neighbor-Joining coupled with a sequence structure-specific, general time reversible substitution model. Results from analyses of the ITS2 data were robust at multiple nodes and showed considerable congruence with results from published phylogenetic analyses. Conclusions/Significance: Our observations on the power of automated, sequence-structure analyses of ITS2 to reconstruct phylum-level phylogenies of the green algae validate this approach to assessing diversity for large sets of chlorophytan taxa. Moreover, our results indicate that objections to the use of ITS2 for DNA barcoding should be weighed against the utility of an automated, data analysis approach with demonstrated power to reconstruct evolutionary patterns for highly divergent lineages. KW - RBCL Gene-sequences KW - Colonial volvocales chlorophyta KW - 26S RDNA Data KW - Land plants KW - Molecular systematics KW - Secondary structure KW - Nuclear RDNA KW - DNA KW - Barcodes KW - Dasycladales chlorophyta KW - Profile distances Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140866 VL - 6 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Bucher, Hannes T1 - Pre-clinical modeling of viral- and bacterial-induced exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease T1 - Prä-klinische Modellierung von viral und bakteriell induzierten Exazerbationen von Chronisch Obstruktiver Lungenerkrankung N2 - Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) exacerbations are a considerable reason for increased morbidity and mortality in patients. Infections with influenza virus (H1N1), respiratory syncytial virus (RSV) or nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are important triggers of exacerbations. To date, no treatments are available which can stop the progression of COPD. Novel approaches are urgently needed. Pre-clinical models of the disease are crucial for the development of novel therapeutic options. In order to establish pre-clinical models which mimic aspects of human COPD exacerbations, mice were exposed to cigarette smoke (CS) and additionally infected with H1N1, RSV and/or NTHi. Clinically relevant treatments such as the corticosteroids Fluticasone propionate and Dexamethasone, the phosphodiesterase-4 (PDE-4) inhibitor Roflumilast and the long-acting muscarinic receptor antagonist Tiotropium were tested in the established models. Furthermore, a novel treatment approach using antibodies (Abs) directed against IL-1α, IL-1β or IL-1R1 was examined in the established CS/H1N1 model. Levels of IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, KC, TNF-α, RANTES, IL-17, MCP-1, MIP 1α and MIP-1β were measured in lung homogenate. Numbers of total cells, neutrophils and macrophages were assessed in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. Hematoxylin- and eosin- (H&E-) stained lung slices were analyzed to detect pathological changes. Quantitative polymerase-chain-reaction (qPCR) was used to investigate gene expression of ICAM-1 and MUC5 A/C. The viral/bacterial load was investigated in lung homogenate or BAL fluid. In addition to the in vivo studies, the effects of the above mentioned treatments were investigated in vitro in H1N1, RSV or NTHi-infected (primary) human bronchial epithelial cells using submerged or air-liquid-interface (ALI) cell culture systems. Four pre-clinical models (CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi) were established depicting clinically relevant aspects of COPD exacerbations such as increased inflammatory cells and cytokines in the airways and impaired lung function. In the CS/H1N1 model, Tiotropium improved lung function and was superior in reducing inflammation in comparison to Fluticasone or Roflumilast. Moreover, Fluticasone increased the loss of body-weight, levels of IL-6, KC and TNF-α and worsened lung function. In CS/RSV-exposed mice Tiotropium but not Fluticasone or Roflumilast treatment reduced neutrophil numbers and IL-6 and TNF α levels in the lung. The viral load of H1N1 and RSV was significantly elevated in CS/virus-exposed mice and NCI-H292 cells after Fluticasone and Dexamethasone treatment. The results from these studies demonstrate that Tiotropium has anti-inflammatory effects on CS/virus-induced inflammation and might help to explain the observed reduction of exacerbation rates in Tiotropium-treated COPD patients. Furthermore, the findings from this work indicate that treatment with Fluticasone or Dexamethasone might not be beneficial to reduce inflammation in the airways of COPD patients and supports clinical studies that link treatment with corticosteroids to an increased risk for pneumonia. Testing of anti-IL-1α, anti-IL-1β or anti-IL-1R1 Abs in the CS/H1N1 model suggests that, in line with clinical data, antagonization of IL-1β is not sufficient to reduce pulmonary inflammation and indicates a predominant role of IL-1α in CS/virus-induced airway inflammation. In line with the in vivo findings, anti-IL-1α but not anti-IL-1β Abs reduced levels of TNF-α and IL-6 in H1N1-infected primary human bronchial epithelial ALI cell culture. Blocking the IL-1R1 provided significant inhibitory effects on inflammatory cells in vivo but was inferior compared to inhibiting both its soluble ligands IL-1α and IL-1β. Concomitant usage of Abs against IL-1α/IL-1β revealed strong effects and reduced total cells, neutrophils and macrophages. Additionally, levels of KC, IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1α and MIP-1β were significantly reduced and ICAM-1 mRNA expression was attenuated. These results suggest that combined inhibition of IL-1α/IL-1β might be beneficial to reduce inflammation and exacerbations in COPD patients. Moreover, combined targeting of both IL-1α/IL-1β might be more efficient compared to inhibition of the IL-1R1. As in the CS/virus models, corticosteroid treatment failed to reduce inflammatory cells in the CS/NTHi and CS/H1N1/NTHi models, increased the loss of body-weight and the bacterial load. Furthermore, Roflumilast administration had no significant effects on cell counts or cytokines. However, it improved compliance in the CS/NTHi model. Treatment with Azithromycin reduced the bacterial load in the CS/NTHi model and reduced numbers of total cells, neutrophils, macrophages and levels of KC and TNF-α in the CS/H1N1/NTHi model. In conclusion, the established CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi models depict clinically relevant aspects of human COPD exacerbations in mice and provide the opportunity to investigate underlying disease mechanisms and to test novel therapies. N2 - Exazerbationen von Chronisch Obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sind ein bedeutender Grund für erhöhte Morbidität und Mortalität von Patienten. Infektionen mit Influenza Virus (H1N1), Respiratory Syncytial Virus (RSV) oder nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) gelten als wichtige Auslöser von Exazerbationen. Bis heute gibt es keine Therapien, welche die Progression von COPD verhindern können. Neue Therapieansätze werden daher dringend benötigt. Prä-klinische Modelle spielen bei der Entwicklung neuer Therapien eine entscheidende Rolle. Um Aspekte einer humanen COPD-Exazerbation abzubilden, wurden Mäuse Zigarettenrauch (CS) ausgesetzt und zusätzlich mit H1N1, RSV und/oder NTHi infiziert. Klinisch relevante Behandlungen, z.B. die Kortikosteroide Fluticasonpropionat und Dexamethason, der Phosphodiesterase 4 (PDE-4) Inhibitor Roflumilast und der muskarinische Rezeptorantagonist Tiotropium, wurden in den etablierten Modellen getestet. Zudem wurde ein neuer therapeutischer Ansatz untersucht bei dem IL-1α, IL-1β neutralisierende bzw. IL-1R1 blockierende Antikörper (Ak) zum Einsatz kamen. Die Mengen von IFN-γ, IL-1β, IL 2, IL-6, KC, TNF-α, RANTES, IL-17, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β wurden im Lungenhomogenat gemessen. Die Gesamtzellzahl und die Anzahl von Neutrophilen und Makrophagen wurden in bronchoalveolärer Lavage (BAL) Flüssigkeit bestimmt. Hematoxylin- und Eosin- (H&E-) gefärbte Lungenschnitte wurden analysiert, um pathologische Veränderungen zu detektieren. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde genutzt, um die Genexpression von ICAM-1 und MUC5 A/C zu untersuchen. Die Virus /Bakterienlast wurde in BAL Flüssigkeit oder Lungenhomogenat gemessen. Darüber hinaus wurden die Effekte der oben genannten Behandlungen in vitro in H1N1, RSV oder NTHi infizierten (primären) humanen bronchialen Epithelzellen in „submerged“ oder „air-liquid-interface (ALI)“ Zellkultur-Systemen untersucht. Vier prä-klinische Modelle (CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi) wurden etabliert, die relevante Aspekte einer Exazerbation, wie beispielsweise den Einstrom inflammatorischer Zellen, erhöhte Zytokinlevel oder verminderte Lungenfunktion abbilden. Im CS/H1N1-Modell verbesserte Tiotropium die Lungenfunktion und zeigte stärker anti-entzündliche Effekte als Fluticason oder Roflumilast. Zudem verstärkte Fluticason den Gewichtsverlust, erhöhte die Level von IL-6 und TNF-α und verschlechterte die Lungenfunktion. Im CS/RSV-Modell reduzierte Tiotropium, aber nicht Fluticason oder Roflumilast die Zahl der Neutrophilen sowie IL-6 und TNF-α Mengen. Die Menge von H1N1 und RSV war in den CS/Virus-Modellen sowie in NCI-H292 Zellen nach Fluticason- oder Dexamethason-Behandlung signifikant erhöht. Die Ergebnisse dieser Studien demonstrieren anti-inflammatorische Effekte von Tiotropium auf CS/Virus-induzierte Entzündung und könnten helfen, reduzierte Exazerbationshäufigkeiten in mit Tiotropium behandelten Patienten zu erklären. Zudem könnten die Resultate dieser Arbeit darauf hindeuten, dass die Behandlung mit Kortikosteroiden nicht geeignet ist, um Entzündung in COPD-Patienten zu reduzieren, und könnten dabei helfen, das in klinischen Studien festgestellte erhöhte Risiko von Pneumonien bei Behandlung mit Kortikosteroiden zu erklären. Im Einklang mit klinischen Daten deutet die Testung von anti-IL-1α, anti-IL-1β oder anti IL-1R1 Ak im CS/H1N1-Modell darauf hin, dass die Neutralisation von IL-1β nicht ausreicht, um die Entzündung in der Lunge zu reduzieren, und impliziert eine prädominierende Rolle von IL-1α in CS/H1N1-induzierter Atemwegsentzündung. Konform mit den in vivo Ergebnissen, reduzierten anti-IL-1α, aber nicht anti-IL-1β Ak, TNF-α und IL-6 in H1N1-infizierter primärer humaner bronchialer epithelialer ALI-Zellkultur. Die Blockade von IL-1R1 zeigte in vivo signifikante inhibitorische Effekte auf inflammatorische Zellen, die verglichen mit der Neutralisation seiner löslichen Liganden IL-1α/IL-1β allerdings unterlegen waren. Die kombinierte Neutralisation von IL-1α/IL-1β war sehr effektiv und reduzierte die Gesamtzellzahl sowie die Zahl der Neutrophilen und Makrophagen in der Lunge. Zusätzlich wurden die Level von KC, IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β signifikant reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kombinierte Inhibition von IL-1α/IL-1β geeignet sein könnte, um Entzündung und Exazerbationen in COPD-Patienten zu reduzieren. Zudem könnte IL-1α/IL-1β-Neutralisation effektiver sein als IL-1R1-Blockade. Wie in den CS/Virus-Modellen wurden inflammatorische Zellen durch Kortikosteroid-Behandlung im CS/NTHi- und CS/H1N1/NTHi-Modell nicht reduziert, verstärkten zudem den Gewichtsverlust und erhöhten die Bakterienmenge. Roflumilast zeigte keine Effekte auf Zellzahlen und Zytokine. Allerdings verbesserte die Behandlung damit die Compliance im CS/NTHi-Modell. Die Behandlung mit Azithromycin reduzierte die Bakterienmenge im CS/NTHi-Modell und reduzierte die Gesamtzellzahl und Anzahl von Neutrophilen und Makrophagen, sowie die Level von KC und TNF-α im CS/H1N1/NTHi-Modell. Zusammenfassend bilden die etablierten CS/H1N1-, CS/RSV-, CS/NTHi-, CS/H1N1/NTHi-Modelle klinisch relevante Aspekte von humanen COPD-Exazerbationen ab und ermöglichen die Erforschung von Krankheitsmechanismen und neuen Therapieansätze. KW - Obstruktive Ventilationsstörung KW - COPD KW - Exacerbation KW - Tiotropium KW - Influenza KW - NTHi KW - Preclinical KW - Model KW - Treatment KW - Exazerbation KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144368 ER - TY - THES A1 - Bucher, Daniel T1 - An Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction T1 - Eine elektrophysiologische Untersuchung synaptische Transmission an der neuromuskulären Endplatte von Drosophila-Larven N2 - In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo. N2 - Thema dieser Arbeit war die elektrophysiologische Untersuchung synaptischer Transmission, untersucht an einer Modellsynapse in Invertebraten, der neuromuskulären Synapse von Drosophila- Larven des dritten Larvalstadiums. Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde die synaptische Funktion an der neuromuskulären Synapse von Nullmutanten für verschiedene synaptische Proteine charakterisiert (das synapse associated protein of 47 kDa (Sap-47156), Synapsin (Syn97), eine bis dahin uncharakterisierte Drosophila SR-Proteinkinase (SRPK3), und eine Mutante mit einem starken neurodegenerativen Phänotyp (Loe)). Intrazelluläre Ableitungen wurden von Muskel 6 und 7 des Hautmuskelschlauches durchgeführt, um die Amplitude und Frequenz der spontanen Freisetzung von Neurotransmitter aus einzelnen synaptischen Vesikeln (miniature excitatory junction potentials oder mEJPs) zu messen. Außerdem wurden Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) bei verschiedenen Frequenzen und verschiedenen Kalziumkonzentrationen gemessen, um zu erforschen, ob die synaptische Transmission in den genannten Mutanten verändert ist. Zusätzlich wurde die Struktur und die Morphology der präsynaptischen Boutons immunhistochemisch untersucht. Dabei wurden monoklonal Antikörper gegen verschiedene Proteine der synaptischen Vesikel (SAP-47, CSP und Synapsin) und gegen das Aktive Zone Protein Bruchpilot benutzt. Die synaptische Physiologie war in den genannten Nullmutanten für synaptische Proteine nicht verändert, im Vergleich zu den wildtypischen Kontrollen, während Löchrig-Mutanten Defekte der synaptischen Übertragung zeigten, die im Einklang standen mit einem Defekt des Recyclings synaptischer Vesikel. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die elektrophysiologische Charakterisierung von heterolog exprimierten Licht-aktivierbaren Proteinen an der neuromuskulären Synapse von Drosophila. Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein Licht gesteuerter Ionenkanal und eine Licht-aktivierbare Adenylatcyclase (PAC) wurden mit Hilfe des UAS-Gal4-Systems an der larvalen, neuromuskulären Synapse exprimiert. Wenn ChR2-exprimierende Larven mit kurzen (100ms) Lichtpulsen beleuchtet wurden, konnten einzelne EJPs von den Muskeln 15, 16 und 17 abgeleitet werden. Längere Lichtpulse (10 Sekunden) führten zu einer Serie von EJPs mit einer Frequenz von ca. 25 Hz. Larven, die PAC exprimierten zeigten, in Präparationen in denen die Motoneurone vom Ventralganglion gelöst wurden, nach einminütiger Belichtung mit Blaulicht einen signifikanten Anstieg der mEJP-Frequenz. Auch die EJPs waren in einer Umgebung mit geringer Kalziumkonzentration (0,2 mM) signifikant erhöht, wenn PAC durch Blaulicht stimuliert wurde. Wurden die Motoneurone intakt gelassen, führte die Stimulation der PAC durch Blaulicht zu EJPs in den Muskeln 6 und 7, die im Einklang standen mit RP3 Motoneuronaktivität. Beide Proteine (ChR2 und PAC) erwiesen sich daher als nützliche, zuverlässige Werkzeuge, um die neurale Aktivität in vivo zu manipulieren. KW - Drosophila KW - synapse KW - elektrophysiologie KW - Drosophila KW - synapse KW - electrophysiology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27784 ER - TY - THES A1 - Brüning, Tanja T1 - Biomechanik des Wachslaufens bei Crematogaster (Decacrema)-Partnerameisen von Macaranga-Bäumen T1 - Biomechanics of waxrunning in Crematogaster (Decacrema) ant-partners of Macaranga-trees N2 - Durch die vorliegende Arbeit konnte die große Bedeutung biomechanischer Faktoren für die Ökologie und Evolution von Insekten-Pflanzen-Interaktionen, am Beispiel des Ameisenpflanzen-Mutualismus’ Crematogaster (Decacrema)-Macaranga aufgezeigt werden. Viele Macaranga-Ameisenpflanzen besitzen Sproßachsen mit einem Überzug epikutikulärer Wachskristalle. Nur die Ameisenpartner wachsbereifter Pflanzen können sich problemlos auf den Oberflächen ihrer Wirtspflanzen fortbewegen. Durch die rutschigen, wachsbereiften Sproßachsen werden generalistische Ameisenarten ferngehalten und damit die wachslaufenden Ameisenpartner vor Fraßfeinden und Konkurrenz geschützt. Die Wachsbarrieren fördern zudem die Wirtsspezifität innerhalb dieser Ameisen-Pflanzen-Symbiose und funktionieren so als ökologischer Isolationsmechanismus. Die mechanische Barrierefunktion der Wachsbereifung birgt eine Vielzahl ökologischer Konsequenzen für beide Mutualismuspartner. Ziel dieser Arbeit war es, die proximaten Einzelmechanismen dieser ökologisch wichtigen Barriere aufzuklären, d. h. die Ursache der Rutschigkeit wachsbereifter Macaranga-Oberflächen und den Mechanismus der Wachslauffähigkeit der spezialangepaßten Crematogaster (Decacrema)-Ameisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mehrere Mechanismen der Rutschigkeit wachsbereifter Macaranga-Sproßoberflächen für Insekten aufgezeigt werden. Durch die Fortbewegung von Insekten auf epikutikulären Wachskristallen werden Kristalle aus ihrem Verbund herausgebrochen und kontaminieren die Insektentarsen. Auf der Oberfläche der Haftorgane (Arolien) werden die Wachskristalle durch die Haftflüssigkeit partiell angelöst. Hierdurch entsteht ein amorpher Schmierfilm, der wahrscheinlich zu einer Verschlechterung der Haftleistung führt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß unabhängig vom Abbrechen der Kristalle und der Kontamination der Tarsen auch die Mikrorauhigkeit der Macaranga-Oberflächen zu einer Rutschigkeit der Sproßachse führen kann. Sie besitzt einen entscheidenden Einfluß auf die Haft- und Lokomotionsfähigkeit von Insekten. Die Rauhigkeit von Oberflächen führt zu einer Reduzierung der effektiven Kontaktfläche des Aroliums und verringert dadurch die Haftkräfte von Insekten. Die genannten Mechanismen der Rutschigkeit schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern können einen synergistischen, bzw. additiven Effekt haben. Bei der Untersuchung der Wachslauffähigkeit der spezialisierten Macaranga-Partnerameisen zeigte sich, daß der unterschiedliche Lauferfolg verschiedener Crematogaster (Decacrema)-Morphospezies nicht auf einer größeren Haftung beruht, sondern vor allem auf einer günstigeren Laufkinematik der Wachsläufer. Durch morphometrische Untersuchungen an acht Crematogaster (Decacrema)-Arten konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Wachsläufer längere Beine haben als Nichtwachsläufer. Diese längeren Beine können zu einem mechanischen Vorteil beim Klettern auf senkrechten Oberflächen führen, da sie zum einen ein weiteres Herumgreifen um den Ast ermöglichen und zum anderen aufgrund des längeren Hebelarms die auf die Vorderbeine wirkenden Zugkräfte reduzieren. Amputationsexperimente zeigten eindeutig, daß die prätarsalen Krallen entscheidend für das Laufen auf wachsbereiften Macaranga-Oberflächen sind, die prätarsalen Haftorgane (Arolien) hingegen nicht. Es ist zu vermuten, daß die Krallen durch das Eintauchen der Krallenspitzen in die Wachskristallschicht Halt finden, wodurch sie theoretisch auf senkrechten Oberflächen jeden Durchmessers Halt finden können. Obwohl quantitative Unterschiede in der Krallenmorphologie (Höhe, Länge und Krümmungsdurchmesser) zwischen Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern und -Nichtwachsläufern nachgewiesen werden konnten, bleibt unklar, ob diese überhaupt eine Rolle für die unterschiedliche Wachslauffähigkeit spielen oder ob eher das Bewegungsmuster während des Einsatzes der Krallen entscheidend ist. Auch bei Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern kommt es zu einem Abbrechen von Wachskristallen und einer Kontamination der Tarsen. Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufer zeigen im Vergleich zu -Nichtwachsläufern ein bisher nicht in der Literatur beschriebenes, Putzverhalten der Vorderbeine. Dieses Putzverhalten ist zeitsparend und effektiv in die Lokomotion der Tiere eingebunden und schließt selektiv nur die Reinigung der laufoberflächenkontaktierenden Tarsussegmente ein. Die hier beschriebenen Unterschiede in Morphologie, Kinematik und Verhalten zwischen Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern und -Nichtwachsläufern bringen funktionelle Vorteile der Wachsläufer auf den von ihnen besiedelten, wachsbereiften Macaranga-Pflanzenoberflächen mit sich. Die epikutikuläre Wachsbereifung kann als biomechanischer Schlüsselmechanismus angesehen werden, der im Rahmen der Evolution zu diesen vielschichtigen Veränderungen geführt hat. Die vorliegende Arbeit konnte zugrundeliegende biomechanische Faktoren, die auf beiden Seiten des Mutualismus’ eine Rolle spielen, aufklären. N2 - The present study illustrates the significance of biomechanical factors in the ecology and evolution of insect-plant interactions on the example of the ant-plant mutualism between Crematogaster (Decacrema) ants and -Macaranga trees. Many Macaranga ant-plants possess stems which are covered by epicuticular wax crystals. Only ant partners of waxy plants can move without any difficulty on the surfaces of their host plants. The slippery stems keep away generalist ant species and protect the waxrunning ants from predators and competitors and functions as an ecological isolation mechanism. The mechanical barrier function of the epicuticular wax crystal layer has several ecological consequences for both mutualistic partners. The goal of this study was to clarify the proximate mechanisms underlying this ecologically important barrier. In particular, I investigated why waxy Macaranga surfaces are slippery and how specially adapted Crematogaster (Decacrema) ants are capable of climbing the slippery waxy stems. In this study, several mechanisms underlying the slipperiness of waxy Macaranga stem surfaces were discovered. When moving on waxy stems, insects detach crystals from the compound structure and contaminate their tarsi. The adhesive secretion leads to a partial dissolution of the crystals on the surface of the adhesive pad (arolium). The resulting amorphous substance presumably results in reduced attachment. I showed that independent of detaching wax crystals and tarsal contamination, the slipperiness of the stem surface can also be caused by the microscopic surface roughness of waxy Macaranga surfaces. Microroughness has a major influence on adhesive and locomotive abilities of insects, because it reduces the adhesive pads’ effective contact area and their attachment forces. These mechanisms of slipperiness listed above do not exclude each other, but may have a synergistic or additive effect. The investigation of the waxrunning behaviour suggests that the difference in waxrunning capacity between Crematogaster (Decacrema) morphospecies does not rely on superior adhesion but on morphological and kinematic adaptations. Morphometric analysis of eight Crematogaster (Decacrema) species showed that waxrunners have longer legs than non-waxrunners. Longer legs may be a mechanically advantageous for vertical climbing, because on the one hand a branch can be encompassed further as well as the detachment forces acting on front legs can be reduced by having a larger lever arm. Kinematic analysis of climbing ants demonstrated that this effect is enhanced by the fact that waxrunners spread their legs more out during climbing. Furthermore, during vertical climbing of waxy surfaces the experimentally proved increased distance between front and hind legs of waxrunners can enhance the ant’s stability on these surfaces. Amputation experiments clearly showed that the pretarsal claws are crucial for running on waxy Macaranga surfaces. In contrast, adhesive pads were seldom in contact with the surface, and if so, with only little contact area. In addition, no effect of attachment enhancement could be demonstrated for adhesive pads. It can be assumed that claws attach by inserting their tips into the wax crystal layer, so that the ants are theoretically capable of attaching to any vertical surface, no matter which diameter the object has. Although I found quantitative differences in claw morphology (height, length and radius of curvature) between Crematogaster (Decacrema) waxrunners and non-waxrunners, it is still unclear if these parameters play a role for waxrunning ability or whether the movement pattern during claw usage is the decisive factor. Even Crematogaster (Decacrema) waxrunners break off wax crystals and have contaminated tarsi. I found that only the Crematogaster (Decacrema) waxrunners show a yet undocumented front leg grooming behaviour. This grooming behaviour is time saving and integrated effectively into the running pattern. The described differences in morphology, kinematics and behaviour between waxrunning und non-waxrunning Crematogaster (Decacrema) ants result in a functional advantage of waxrunners on their waxy host plants. The epicuticular wax layer represents a biomechanical key mechanism which has lead to complex changes during evolution. The presented study was able to clarify underlying biomechanical factors on both sides of this ant-plant mutualism. KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - Mutualismus KW - Kutikularwachs KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - Wachslaufen KW - Mutualismus KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - waxrunning KW - mutualism Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21772 ER - TY - THES A1 - Brühlmann, David T1 - Tailoring Recombinant Protein Quality by Rational Media Design T1 - Der Einfluss von Zellkulturmedien auf Qualitätsattribute von rekombinanten Proteinen N2 - Nowadays, more than half of the biotherapeutics are produced in mammalian cell lines as a result of correct protein folding and assembly as well as their faculty to bring about a variety of post-translational modifications. The widespread progression of biosimilars has moved the focus in mammalian cell-culture process development. Thereby, the modulation of quality attributes of recombinant therapeutic proteins has increasingly gained importance from early process development stages. Protein quality directly shapes the clinical efficacy and safety in vivo, and therefore, the control of the complex post-translational modifications, such as glycosylation (e.g. high mannose, fucosylation, galactosylation and sialylation), charge variants, aggregates and low-molecular-weight species formation, is pivotal for efficient receptor binding and for triggering the desired immune responses in patients. In the frame of biosimilar development, product quality modulation methods using the potential of the host cell line are particularly sought after to match the quality profile of the targeted reference medicinal product (RMP) as closely as possible. The environment the cell is dwelling in directly influences its metabolism and the resulting quality profile of the expressed protein. Thereby the cell culture medium plays a central role in upstream manufacturing. In this work, concentration adjustment of selected media components and supplementation with a variety of compounds was performed to alter various metabolic pathways, enzyme activities and in some cases the gene expression levels of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in culture. The supplementation of cell culture medium with the trisaccharide raffinose in fed-batch cultures entailed an increase of the abundance of high mannose glycans in two different CHO cell lines. Raffinose especially favored mannose 5 glycans. At the same time, it impaired cell culture performance, induced changes on the intracellular nucleotide levels and even varied the expression levels of glycosylation-related genes. Supplementation with a number of galactosyltransferase inhibiting compounds, in particular fluorinated galactose analogs (alpha- and beta-2F-peracetyl-galactose), consistently decreased the production of galactosylated monoclonal antibodies (mAb). By means of targeted addition during the culture rather than at the beginning, the inhibition was further increased, while limiting detrimental effects on both growth and productivity. High-throughput screening in 96-deepwell plates showed that spermine and L-ornithine also reduced the level of galactosylation. On the other hand, exploratory screening of a variety of potentially disulfide-bridge-reducing agents highlighted that the inherent low-molecular-species level of the proprietary platform cell culture process was likely due to favored reduction. This hypothesis was reinforced by the observation that supplementation of cysteine and N-acetylcysteine promoted fragmentation. Additionally, fragmentation decreased with higher protein expression. At that point, aiming to improve the efficiency in process development, a rational experimental design method was developed to identify and to define the optimal concentration range of quality modulating compounds by calling on a combination of high throughput fed-batch testing and multivariate data analysis. Seventeen medium supplements were tested in five parallel 96-deepwell plate experiments. The selection process of promising modulators for the follow-up experiment in shake tubes consisted in a three-step procedure, including principal component analysis, quantitative evaluation of their performance with respect to the specifications for biosimilarity and selection following a hierarchical order of decisions using a decision tree. The method resulted in a substantial improvement of the targeted glycosylation profile in only two experimental rounds. Subsequent development stages, namely validation and transfer to industrial-scale facilities require tight control of product quality. Accordingly, further mechanistic understanding of the underlying processes was acquired by non-targeted metabolomic profiling of a CHO cell line expressing a mAb cultured in four distinct process formats. Univariate analysis of intra- and extracellular metabolite and temporal glycosylation profiles provided insights in various pathways. The numerous of parameters were the main driver to carry out principal component analysis, and then, using the methodology of partial-least-square (PLS) projection on latent structures, a multivariate model was built to correlate the extracellular data with the distinct glycosylation profiles. The PLS observation model proved to be reliable and showed its great benefit for glycan pattern control in routine manufacturing, especially at large scale. Rather than relying on post-production interpretation of glycosylation results, glycosylation can be predicted in real-time based on the extracellular metabolite levels in the bioreactor. Finally, for the bioactivity assessment of the glycan differences between the biosimilar and the reference medicinal product (RMP), the health agencies may ask for in the drug registration process, extended ranges of glycan variants need to be generated so that the in vitro assays pick up the changes. The developed glycosylation modulator library enabled the generation of extreme glycosylation variants, including high mannose, afucosylated, galactosylated as well as sialic acid species of both a mAb and an antibody fusion molecule with three N-glycosylation sites. Moreover, to create increased variety, enzymatic glycoengineering was explored for galactosylation and sialylation. The glyco variants induced significant responses in the respective in vitro biological activity assays. The data of this work highlight the immense potential of cell culture medium optimization to adjust product quality. Medium and feed supplementation of a variety of compounds resulted in reproducible and important changes of the product quality profile of both mAbs and a fusion antibody. In addition to the intermediate modulation ranges that largely met the requirements for new-biological-entity and biosimilar development, medium supplementation even enabled quick and straightforward generation of extreme glycan variants suitable for biological activity testing. N2 - Mehr als die Hälfte der Biotherapeutika werden heutzutage aufgrund korrekter Proteinfaltung und korrektem Zusammenbau in tierischen Zelllinien hergestellt, welche zudem die Fähigkeit besitzen, verschiedene posttranslationale Modifikationen zu bewerkstelligen, hergestellt. Der ausgeprägte Aufschwung von Biosimilars hat den Entwicklungsschwerpunkt von Zellkulturverfahren verlagert. Dabei hat die Modulierung der Qualitätsattribute von rekombinanten Proteinen bereits in frühen Entwicklungsstadien eine wichtige Bedeutung erlangt. Die Qualitätsattribute beeinflussen die klinische Wirksamkeit und die In-Vivo-Sicherheit direkt. Somit ist die Regulierung der posttranslationalen Modifikationen, einschließlich der Glykosylierung (mannosereiche, fukosylierte, galaktosylierte und sialylierte Glykane), der Ladungsvarianten, sowie die Bildung von Aggregaten und niedermolekularen Spezien, für effiziente Rezeptorbindung und das Auslösen der gewünschten Immunantwort in Patienten entscheidend. Im Rahmen der Biosimilarentwicklung werden Methoden zur Anpassung der Produktqualität innerhalb des Potentials der Wirtszelle gesucht, um sie möglichst genau dem Referenzarzneimittel anzugleichen. Die Umgebung, in der die Zelle verweilt, beeinflusst ihren Metabolismus und das resultierende Produktqualitätsprofil. Dabei spielen Medien eine zentrale Rolle in der Zellkultur. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden durch Adjustierung von ausgewählten Medienbestandteilen und Ergänzung mit einer Vielfalt von Stoffen diverse Stoffwechselwege, Enzymaktivitäten und in einigen Fällen das Genexpressionsniveau von kultivierten Chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO) verändert. Die Ergänzung von Zellkulturmedium mit Raffinose, ein Trisaccharid, führte zu einer Erhöhung des mannosereichen Glykosylierungsmusters in zwei unterschiedlichen CHO-Zelllinien. Raffinose begünstigte hauptsächlich Mannose-5-Spezien. Gleichzeitig wurde die Zellkulturleistung beeinträchtigt und zudem intrazelluläre Nukleotidkonzentrationen sowie das Expressionsniveau von Glykosylierungsgenen verändert. Ergänzung mit mehreren Inhibitoren der Galaktosyltransferase, insbesondere fluorierte Galaktosenachbildungen (Alpha- und Beta-2F-Peracetyl-Galaktose), verringerte stetig die Produktion von galaktosylierten monoklonalen Antikörpern (mAb). Durch gezielte Zugabe im Verlauf der Kultur, statt bereits am Anfang, wurde die Inhibition weiter erhöht, und dabei die Einwirkung auf das Zellwachstum und die Produktivität beschränkt. Ein Hochdurchsatz-Screening in 96-Deep-Well-Platten zeigte, dass Spermin und L-Ornithin auch das Ausmaß der Galaktosylierung reduzierte. Andererseits zeigten erste Nachforschungen anhand eines Screenings einer Auswahl von potenziellen Disulfidbrücken-Reduktionsmittel, dass wahrscheinlich begünstigte Reduktion das inhärente Niedermolekular-Speziesniveau des firmeneigenen Zellkulturplattformverfahrens verursacht. Die Hypothese wurde durch die Beigabe von Cystein und N-Acetylcystein bekräftigt. Diese Stoffe begünstigten die Fragmentierung, wohingegen sie bei höherer Proteinexpression abnahm. Mit dem Ziel die Entwicklungseffizienz zu steigern, wurde daraufhin zur Identifikation von qualitätsverändernden Stoffen und Bestimmung der optimalen Konzentrationsbereichen eine rationale Versuchsanordnungsmethode entwickelt. Dazu wurde eine Kombination von Hochdurchsatz-Fed-Batch-Tests und multivariater Datenanalyse herbeigezogen. Siebzehn Mediumergänzungsstoffe wurden in fünf parallelen 96-Deep-Well-Platten-Experimenten getestet. Das Auswahlverfahren von erfolgsversprechenden Modulatoren fürs Nachfolgeexperiment in Schüttelröhrchen umfasste drei Schritte: Hauptkomponentenanalyse, quantitative Evaluierung der Leistung der Modulatoren hinsichtlich der Biosimilaritätsspezifikationen und die Auswahl in Anlehnung an eine hierarchische Entscheidungsreihenfolge mit Hilfe eines Entscheidungsbaums. Die Methode führte in nur zwei Versuchsreihen zu einer erheblichen Annäherung an das gewünschte Glykosylierungsprofil. Anschließende Entwicklungsschritte (Validierung und Transfer in die großtechnische Anlage) erforden eine rigorose Kontrolle der Produktqualität. Demzufolge konnte dank der Non-Targeted Metabolomics Analyse von vier verschiedenen Herstellungsverfahren einer mAb exprimierenden CHO-Zelllinie weitere mechanistische Kenntnisse der zugrunde liegenden Vorgängen gewonnen werden. Univariate Analysen der intra- und extrazellulären Stoffwechselprodukte und die zeitliche Glykosylierungsprofile lieferten einen Einblick in verschiedene Stoffwechselwege. Die Vielzahl von Parametern führte dazu, nach dem Prinzip der Hauptkomponentenanalyse vorzugehen, und dann anhand der Partial Least Squares (PLS)-Projektion auf latente Strukturen ein multivariates Modell zu erstellen, das die extrazellulären Daten mit den individuellen Glykosylierungsprofilen korreliert. Das PLS Beobachtungsmodell stellte sich als verlässlich heraus und zeigte seinen außerordentlichen Nutzen zur Regulierung der Glykanen in der Routineherstellung, insbesondere in der Großanlage. Anstatt sich auf Glykosylierungsresultate nach dem Ende der Produktion zu verlassen, kann die Glykosylierung, basierend auf den Niveaus der extrazellulären Stoffwechselprodukte im Bioreaktor, in Echtzeit vorausgesagt werden. Schließlich können im Rahmen des Arzneigenehmigungsverfahrens Gesundheitsbehörden verlangen, die Glykanunterschiede zwischen dem Biosimilar und dem Referenzarzneimittel zu untersuchen. Damit der biologische Test die Unterschiede nachweisen kann, muss eine erweiterte Palette von Glykanvarianten hergestellt werden. Die entwickelte Glykosylierungsmodulierungsbibliothek ermöglichte, extreme Varianten für mannosereiche, afukosylierte, galaktosylierte und sialylierte Glykane von mAb und einem Antikörperfusionsmolekül mit drei N-Glykosylierungsstellen zu generieren. Für erhöhte Variantenvielfalt wurde die enzymatische Glykoengineering Technologie für die Galaktosylierung und Sialylierung untersucht. Die Glykanvarianten erzeugten signifikante Antworten in der jeweiligen In-Vitro-Bestimmung der biologischen Aktivität. Die Ergebnisse unterstreichen das immense Potential von Zellkulturmediumoptimierung zur Anpassung der Produktqualität. Ergänzung des Mediums und der Nährstofflösung brachte reproduzierbare und beträchtliche Veränderungen der Produktqualität von mAb und eines Fusionsantikörpers hervor. Zusätzlich zu den intermediären Modulierungsbereichen, die mehr als ausreichend den Anforderungen für die Entwicklung von neuen biologischen Wirkstoffen und Biosimilars genügen, ermöglichte die Mediumergänzung auf schnelle und einfache Art und Weise selbst extreme Glykanvarianten zu bilden, die für die Bestimmung der biologischen Aktivität geeignet waren. KW - CHO cell culture KW - product qualitymodulation KW - media design KW - metabolism KW - glycosylation KW - high throughput KW - Zellkultur KW - CHO-Zelle KW - Produktivität KW - Nährboden KW - Stoffwechsel Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147345 ER -