TY  - THES
A1  - Sauer, Florian
T1  - Structural studies on the association of filamentous proteins in the human M-Bands
T1  - Strukturelle Studien zur Zusammenlagerung filamentöser Protein in humanen M-Banden
N2  - Cross-striated muscles enable higher animals to perform directed movements and to create mechanical force. The cells of heart and skeletal muscles consist of myofibrils, serial arrays of the smallest contractile subunits, the sarcomeres. Main components of the sarcomeres are the thin and thick filaments, large protein assemblies consisting of mainly actin (thin filaments) and myosin (thick filaments), whose energy-dependent interaction is responsible for the contraction of sarcomeres and so of the whole muscle. The thin filaments are anchored in the sarcomere bordering Z-discs, while the thick filaments are anchored in the M-bands, traverse structures in the sarcomere center. Electron-microscopic studies revealed that the M-bands consist of regular, lattice-like structures that appear to cross-link the thick filaments. A number of proteins could be identified by immune-fluorescence and biochemical binding studies to be present and interact with each other in the M-bands. These data have been integrated into preliminary models of the M-bands. Detailed knowledge of how these proteins interact with each other in the center of the sarcomeres is, however, largely missing. The current study focuses on the structural characterization of the interactions between the titin, myomesin-1, obscurin and obscurin-like 1 (OBSL1), modular filamentous proteins interacting with each other in the M-bands. The high-resolution crystal structure of the titin M10 – OBSL1 Ig1 complex was solved. The structure and additional biophysical data show that titin and OBSL1 as well as titin and obscurin form stable binary complexes through the formation of a small intermolecular ß-sheet. In contrast to previously characterized intermolecular assemblies of sarcomeric proteins, this sheet is formed between parallel non- homologous ß-strands of the interaction partners. The investigation of disease-related variants of the M10 domain by biophysical methods did not allow to draw unambiguous conclusions on a direct connection between impaired OBSL1/obscurin binding and disease development. Two out of four known M10 variants have effects on the correct domain folding and so interfere with the ability to bind obscurin/OBSL1. The two other known variants displayed however only minor effects on fold and binding affinities. It should therefore be further elucidated whether a direct connection between impaired complex formation and disease development exists. -I- Abstract A direct interaction between titin and myomesin-1 could not be confirmed in vitro. Possible explanations for the different results are discussed. While the consequences of the inability of both proteins to interact are unclear, the further characterization of the putative interacting parts of titin and myomesin-1 led to the discovery of two new potential sites of self-assembly on M-band titin and myomesin-1. The crystal structure of titin M4 showed that this domain can form dimeric assemblies through the formation of a disulfide bridge and an intermolecular metal binding site between residues that are unique to this domain. On myomesin-1, in addition to the described C-terminal interaction site, a potential second site of self-assembly was found in its central Fn3-domain segment. The interacting site was mapped to the predicted Fn3 domain My5. The crystal structure of the domain in its dimeric form showed that the interaction is mediated by a mechanism that has previously not been observed in sarcomeric proteins. Two My5 interact with each other by the mutual exchange of an N-terminal ß-strand which complements the Fn3 fold on the binding partner. This type of interaction can be interpreted as misfolding. However, the position of the interacting domain and its mode of interaction allowed the postulation of a model of how myomesin-1 could be integrated in the M-bands. This model is in good agreement with the electron-microscopic appearance of the M-bands.
N2  - Die quergestreifte Muskulatur befähigt höhere Tiere zur zielgerichteten Bewegung und Ausübung mechanischer Kraft. Herz- und Skelettmuskelzellen bestehen aus Myofibrillen, die wiederum aus aneinandergereihten, kleinen kontrahierenden Untereinheiten, den Sarkomeren aufgebaut sind. Hauptbestandteile der Sarkomere sind die dünnen und dicken Filamente, große Proteinkomplexe die hauptsächlich aus Aktin (dünne Filamente) und Myosin (dicke Filamente) bestehen und deren energieabhängige Interaktion für die Kontraktion der Sarkomere und damit des gesamten Muskels verantwortlich sind. Die dünnen Filamente sind in den Sarkomer-begrenzenden Z-Scheiben und die dicken Filamente in der M-Bande im Zentrum der Sarkomere verankert. Elektronenmikroskopische Studien zeigten, dass die M-Banden aus regelmäßigen, gerüstartigen Strukturen bestehen, die die dicken Filamente querzuvernetzen scheinen. Durch Immunfluoreszenz und Bindungstudien konnte eine Anzahl an Proteinen identifiziert werden, die neben Myosin am Aufbau dieses Gerüsts beteiligt sein könnten. Basierend auf diesen Daten wurden vorläufige Modelle des Aufbaus der M-Banden postuliert. Eine detaillierte Charakterisierung der Interaktionen dieser Proteine auf struktureller Ebene hat bisher jedoch nicht stattgefunden. Die hier präsentierte Arbeit beschäftigt sich mit der strukturellen Charakterisierung der Interaktionen zwischen den Proteinen Titin, Myomesin-1, Obscurin und OBSL1 in den M-Banden von Wirbeltiersarkomeren. Die hochaufgelöste Kristallstruktur des Titin M10 – OBSL1 Komplexes wurde gelöst. Die Struktur und zusätzliche biophysikalische Daten zeigen, dass der C- Terminus von Titin und die N-termini von OBSL1 bzw. Obscurin stabile, binäre Komplexe ausbilden. Im Gegensatz zu schon bekannten Komplexen zwischen Ig- ähnlichen Domänen sarkomerer Proteine, wird die Interaktion hier durch die Ausbildung eines intermolekularen ß-Faltblattes zwischen parallel orientierten ß- Strängen, vermittelt. Die Untersuchung von Varianten der M10 Domäne, die mit der Entwicklung von erblichen Muskelkrankheiten in Zusammenhang gebracht werden, ließen keine eindeutigen Schlussfolgerungen darüber zu, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Beeinträchtigung der Bindung an Obscurin/OBSL1 und der Entwicklung der - III - Zusammenfassung Krankheiten besteht. Zwei der vier bekannten M10 Varianten haben Auswirkungen auf die korrekte Faltung der Domäne, weshalb sie Obscurin und OBSL1 nicht binden können. Die beiden anderen Varianten zeigten jedoch nur geringfügige Auswirkungen auf Faltung und Affinität zu Obscurin und OBSL1. Es sollte daher weiter untersucht werden, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Bindung an Obscurin oder OBSL1 und der Entstehung vor Muskelkrankheiten besteht. Eine direkte Interaktion zwischen Titin und Myomesin-1 in vitro konnte nicht bestätigt werden. Verschiedene Erklärungen die zu den Unterschieden zwischen den hier gezeigten negativen und den an anderer Stelle beschrieben positiven Ergebnissen der Bindungsstudien geführt haben könnten, werden diskutiert. Die Konsequenzen der möglichen ‘Unfähigkeit’ Titins mit Myomesin-1 zu interagieren sind momentan unklar. Die weitere Charakterisierung der vermeintlichen Bindungspartner führte jedoch zur Entdeckung zweier neuer Selbstbindungsstellen auf Titin und Myomesin-1. Die Kristallstruktur der Ig-ähnlichen Domäne M4 von Titin zeigte, dass diese durch einer intermolekularen Disulfidbrücke und einer Zinkkoordinierungsstelle, Dimere bilden kann. Zusätzlich zu der beschrieben C-terminalen, wurde eine mögliche zweite Selbstbindungsstelle auf Myomesin-1 im zentralen Fn3-Domänensegment des Proteins entdeckt. Der für die Bindung verantwortliche Bereich konnte auf die Fn3 Domäne My5 eingegrenzt werden. Die Kristallstruktur der Domäne in ihrer dimeren Form zeigte, dass die Interaktion durch einen zuvor bei Muskelproteinen nicht beschriebenen Mechanismus vermittelt wird. Zwei My5-Domänen interagieren durch den gegenseitigen Austausch eines N-terminalen ß-Stranges, der die Faltung des Bindunspartners komplementiert. Diese Art von Proteininteraktion kann als Resultat der Fehlfaltung der Domäne interpretiert werden. Die Position der interagierenden Domäne und die Art der Interaktion erlaubten es jedoch, ein Modell aufzustellen, das erklären könnte, wie Myomesin-1 in die M-banden eingebaut ist. Dieses Modell stimmt mit dem elektronenmikroskopischen Erscheinungsbild der M-Banden gut überein.
KW  - Muskelkontraktion
KW  - Quergestreifte Muskulatur
KW  - Titin
KW  - Myomesin
KW  - Obscurin
KW  - Röntgenkristallographie
KW  - muscle
KW  - titin
KW  - myomesin
KW  - obscurin
KW  - crystallography
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72410
N1  - PhD student at EMBL-Hamburg. Supervisor: Dr. Matthias Wilmanns
ER  - 
TY  - THES
A1  - Arbeiter, Anja Katrin
T1  - Charakterisierung der Bindung des Stressproteins Alpha-B-Crystallin an kardiale Myofibrillen unter Ischämie
T1  - Characterization of the binding of the stress protein Alpha-B-crystallin to cardiac myofibrils under ischemia
N2  - Prolongierte Ischämieperioden des Herzens führen zu struktureller Schädigung der Kardiomyozyten, d.h. einer Desorganisation und Zerstörung des kontraktilen und plasmalemmalen Zytoskeletts, welche sich final durch Verlust an Kontraktilität und Ruptur der Plasmamembran manifestieren. Stressproteine können an die Komponenten des Zytoskelettes binden und durch Konformationsschutz der ischämischen Schädigung entgegenwirken. In vorangegangenen Untersuchungen wurde gezeigt, dass es unter Ischämie zu einer Translokation des konstitutiv in hoher Konzentration vorkommenden kardialen Stressproteins aB-Crystallin vom Zytosol an die Myofibrillen kommt. Dabei führen bereits kurzdauernde Ischämieperioden zu einer kompletten Umverteilung von aB-Crystallin in die Z/I-Region des Sarkomers. Es war das Ziel dieser Arbeit, diese Bindung von aB-Crystallin an Strukturproteine im Z/I-Banden Bereich näher zu charakterisieren und aB-Crystallin ultrastrukturell zu lokalisieren. Durch Immunogoldmarkierung konnte aB-Crystallin ultrastrukturell im Herzen unter globaler Ischämie in einer Linie parallel zur Z-Scheibe etwa in der Mitte der halben I-Bande lokalisiert werden. Diese Zone entspricht dem Bereich, der als N-Linie bezeichnet wird. In der Frage der in vivo-Bindungspartner von aB-Crystallin waren daher in erster Linie Komponenten der I-Bande, d.h. Aktin und Titin in Betracht zu ziehen. Z-Scheiben Proteine wie a-Actinin treten dagegen in den Hintergrund. Um Anhaltspunkte über die Bindungsstärke des Stressproteins aB-Crystallin an kardiale Myofibrillen unter Ischämie zu erhalten, wurden ischämische Myofibrillen aus dem Rattenherz mit hochmolaren Salzlösungen und chaotropen Substanzen behandelt. Dabei konnte eine sehr hohe Bindungsaffinität von aB-Crystallin an die Myofibrillen festgestellt werden. Die myofibrilläre Bindung zeigte sich resistent gegenüber 1M KCl, 1M NaSCN und 2M Harnstoff, erst 2M NaSCN und 4M Harnstoff, die eine Zerstörung der myofibrillären Integrität bewirken, vermögen die aB-Crystallin-Bindung zu lösen. Aktin dagegen ließ sich bereits durch 0,5M NaSCN-Lösung von den Myofibrillen extrahieren, Bedingungen, unter denen aB-Crystallin noch fest an die Myofibrillen gebunden blieb. Aktin scheidet somit als in vivo-Bindungspartner von aB-Crystallin aus. Dieses Ergebnis immunhistochemischer Untersuchungen konnte auch mit biochemischer Methodik (Immunreplikanalyse) verifiziert werden. Titin zeigte sich wie aB-Crystallin resistent gegenüber den meisten der oben aufgeführten Salzlösungen. Eine deutliche Extraktion von Titin aus den Myofibrillen konnte erst durch Behandlung mit 2M NaSCN sowie 4M Harnstofflösung beobachtet werden, das Extraktionsverhalten entsprach somit dem von aB-Crystallin. Einen Hinweis auf eine Assoziation von aB-Crystallin mit Titin lieferte der Nachweis von aB-Crystallin in isolierten Titinfraktionen aus ischämischen Herzen. Der direkte Beweis für eine aB-Crystallin-Titin-Interaktion konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erbracht werden. Bindungsstudien, die zwischen ausgewählten nativen, in vitro translatierten Titindomänen und aus der Linse isoliertem aB-Crystallin durchgeführt wurden, waren negativ. Dies ist möglicherweise dadurch bedingt, dass aB-Crystallin erst unter Ischämie mit Titin interagiert und in vitro Kofaktoren benötigt werden. Durch eine Bindung an I-Banden Abschnitte des Titinmoleküls könnte aB-Crystallin eine kardioprotektive Funktion erfüllen, indem es unter Ischämie stabilisierend auf das Filamentsystem einwirkt.
N2  - Prolonged ischemic periods of the heart lead to structural damage of the cardiomyocytes, i.e. disorganization and destruction of the cellular cytoskeleton with final loss of contractility and rupture of the plasma membrane. Stress proteins can bind to components of the cellular cytoskeleton and play a protective role during various kinds of stresses. Previous studies showed a translocation of the cardiac stress protein áB crystallin from the cytosol, there occurring in constitutive high concentrations, to the myofibrils under ischemia. Already short ischemic periods lead to a complete translocation of áB crystallin into the Z/I region of the myofibrils. The purpose of the present study was to identify the localization of áB crystallin during ischemia at the ultrastructural level and to obtain further information about myofibrillar components that may serve as binding sites for áB crystallin during ischemia. Under global ischemia áB crystallin could be located by immunogold-labelling in the heart in a narrow zone of the I-band parallel to the Z-disk (area of the N2-line).The restriction of áB crystallin to this N2-line indicates binding of áB crystallin to either titin or components of actin filaments. Actin filaments and actin associated proteins such as tropomyosin or troponin complex are not likely candidates for áB crystallin binding because actin became completely extracted of the myofibrils after treatment of cryostat sections of ischemic rat myocardium with 0,5M NaSCN, conditions where áB crystallin and titin remained unchanged.The myofibrillaric binding of áB crystallin and titin resisted extraction with 1M KCl, 1M NaSCN and 2M urea, only 2M NaSCN and 4M urea, which cause a destruction of the myofibrillaric integrity, were able to disrupt the áB crystallin binding. These results of immunocytochemistry could be verified biochemically (immunoblotting). They indicate association of áB crystallin with titin the only remaining non-actin or actin-binding cytoskeletal component of I-bands outside Z-disks. Further evidence for binding of áB crystallin to titin was obtained by dot-blot assays in which biotinylated áB crystallin was demonstrated to bind to a titin-enriched fraction of pig myocardium immobilized on nitrocellulose. Furthermore this titin-enriched fraction was shown to copurify with áB crystallin. However dot-blot binding studies between several in-vitro translated titin domains and purified áB crystallin did not show any detectable binding. These negative results obtained by in vitro binding studies do not exclude interaction between titin fragments and áB crystallin in vivo. The absence of in vitro interaction is possibly due to a different three dimensional structure of the in vitro expressed titin fragments or to the absence of specific ischemia-induced cofactors. Binding of áB crystallin to titin during cardiac ischemia could serve to stabilize titin against denaturation and might provide an endogenous mechanism to delay ischemic damage by stabilizing this critical I-band region of titin with its elastic properties.
KW  - aB-Crystallin
KW  - Titin
KW  - Stressprotein
KW  - Ischämie
KW  - Myokard
KW  - aB-crystallin
KW  - titin
KW  - stress protein
KW  - ischemia
KW  - myocardium
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4337
ER  -