TY  - THES
A1  - Schütz, Monika
T1  - Dynamik und Funktion der HMG-Proteine
T1  - Dynamics and Function of HMG-proteins
N2  - HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielfältigen Funktionen erfüllen können, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde für die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte für die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erhöhte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivität der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen führten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabhängig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen für die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden können. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine führen zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abhängige Prozesse regulieren können. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen darüber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, übernehmen können. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erklären so, wie diese Proteine ihre vielfältigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abhängiger Prozesse erfüllen können. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschränkte zeitliche Auflösungsvermögen konfokaler Mikroskope der älteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen können, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation möglich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen können. Durch eine erhöhte Verweildauer können auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erhöhte Verweildauer aber auch zur Verdrängung anderer Proteine führen, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren ermöglicht interessante neue Erkenntnisse. Diese müssen aber stets vor dem Hintergrund eines veränderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Klärung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen können, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe häufig überexprimiert sind, von großer Bedeutung.
N2  - HMG proteins are architectural chromatin proteins that regulate different DNA dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. To understand how HMG proteins manage to fulfill their multiple functions they were investigated in vivo with the help of EGFP and DsRed2 fusion proteins. Using photobleaching techniques their dynamic properties were characterized in detail. Furthermore, the expression pattern of HMGN proteins in tumor cell lines was investigated for the first time. As presented in this thesis, it was found that HMGN2 proteins exhibited an elevated expression level in some tumor cells (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) correlating with the tumor differentiation status. In contrast a reduced expression of HMGN1 found in Mammacarcinoma and Non-Hodgkin-Lymphoma correlated with tumor aggressiveness. Therefore the analyses of HMGN expression may be a suitable diagnostic marker at least in the tumors investigated. FRAP analyses with cells expressing EGFP fusion proteins revealed that HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b and HMGB1 move very rapidly through the cell nucleus and only bind transiently to chromatin. It was demonstrated that the decision where HMG proteins bind in vivo is essentially mediated by their specific DNA binding motifs. However, the individual residence times in eu- or heterochromatin and chromosomes are regulated by protein modifications (phosphorylation, acetylation). This has been demonstrated using point mutated and truncated HMGA fusion proteins and by the application of specific drugs as well. FRAP analyses also indicated that the splice variants HMGA1a and HMGA1b exhibit different kinetic properties. This supports the view that both variants have different functions. The kinetic parameters characteristic for each HMG protein lead to a model of a dynamic chromatin network in which all HMG proteins are able to regulate DNA dependent processes via multiple interactions with other proteins as components of a cocktail of dynamic chromatin proteins. In this model, individual residence times of all HMG proteins which are regulated by secondary modifications would determine how long other chromatin modulating proteins could reside on chromatin. Therefore the dynamic parameters of the HMG proteins directly affect the capability of other proteins to modulate chromatin structure, e.g. by modifications of core histones. This explains the multiple functions of HMG proteins in chromatin packaging and function. The kinetic parameters of some rapidly moving members of the HMG protein family, such as HMGB1, are beyond the time resolution capacities of most confocal microscopes. However, novel setups of modern confocal microscopes are now capable to determine the dynamic parameters of HMGB proteins and allow investigations of drug induced effects on HMGB dynamics. Control experiments revealed that other fluorophors such as DsRed2 modulate the dynamic parameters of HMG fusion proteins. Due to an increased residence time of HMG DsRed2 fusion proteins it is possible to monitor even very transient interactions. Moreover, it could be observed that this increased residence time may interfere with binding of other proteins (i.e. proteins which occupy the same binding sites) leading to a reorganization of chromatin. Thus, fusion proteins with DsRed fluorophores may be used as helpful tools to investigate protein functions. However, results should always be considered against the background of DsRed modulated kinetics and thus they should be interpreted very carefully. Taken together the results presented in this thesis provide novel information about the dynamic behaviour of HMG proteins which is crucial to understand how chromatin is modulated during differentiation processes or development of neoplasia. Their transient interactions with DNA or other proteins and the fact that overexpression correlates with tumor progression might be relevant for the development of novel strategies for tumor treatment.
KW  - HMG-Proteine
KW  - Chromatin
KW  - Genexpression
KW  - Tumor
KW  - HMG
KW  - Dynamik
KW  - Chromatin
KW  - EGFP
KW  - Tumorinstabilität
KW  - HMG
KW  - Dynamics
KW  - Chromatin
KW  - EGFP
KW  - Tumorinstability
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weihrauch, Marc-Andreas Günter
T1  - Butyrat moduliert die Expression der Nicht-Histon-Proteine HMGA1, HMGN1 und HMGN2 in humanen Adenokarzinomzellen des Kolons und des Magens
T1  - Modulation of mRNA expression of high mobility group (HMG) proteins by the short chain fatty acid butyrate in human gastrointestinal carcinoma cells
N2  - In maligne transformierten Zellen fördert die kurzkettige Fettsäure Butyrat Differenzierung, induziert Apoptose und hemmt Proliferation. Dabei moduliert Butyrat die Expression von verschiedenen Zellzyklus- und Apoptoseregulatoren. Wie Butyrat seine Wirkungen auf chromosomaler Ebene vermittelt, ist bisher nicht ausreichend geklärt. Bekannt ist, dass Butyrat Histondeacetylasen nichtkompetetiv hemmt und durch Hyperacetylierung von nukleären Histonproteinen die Chromatinstruktur moduliert. Die „high-mobility-group“ (HMG) Proteine sind neben Histon-Proteinen strukturelle Bestandteile des Chromatins. Die vermehrte Expression des HMGA1-Proteins ist eine Gemeinsamkeit vieler humaner Malignome und die HMGA1-Proteinfamilie wurde selbst als neue Gruppe von Onkogenen erkannt. Die HMGA1 Proteine beeinflussen die Expression zahlreicher Gene und stehen selbst wiederum unter der Kontrolle von Onkogenen, wie z.B. dem c-myc. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Butyrat und der Histon-deacetylase-Inhibitor Trichostatin A die Expression von HMGA1 in humanen Adenokarzinomzellen des Gastrointestinaltraktes modulieren. Butyrat-Konzentrationen von 2mM und 4mM führten erstmals nach 24-stündiger Inkubation zu einer deutlichen Reduktion der mRNA-Expression von HMGA1. In der Magenkarzinomzelllinie 23132/87 und der Kolonkarzinomzelllinie Sw-480 wird die HMGA1 mRNA Expression durch Butyrat zeit- und dosisabhängig reduziert. In der Kolonkarzinomzelllinie Sw-620 konnte für die untersuchten Konzentrationen keine Dosisabhängigkeit festgestellt werden. Auch Trichostatin A bewirkt eine Reduktion der mRNA-Expression von HMGA1 in den untersuchten Zelllinien. Wie Butyrat die Expression von HMGA1 moduliert, ist nicht geklärt. Denkbar ist, dass Butyrat über Modulation vorgeschalteter Signalkaskaden, wie z.B. im Falle des c-myc, die HMGA1-Expression beeinflusst. Aber auch über eine Modulation der Chromatinstruktur durch Hemmung der Histondeacetylasen mit nachfolgenden Veränderungen der Expression verschiedener Gene könnte Butyrat die Expression von HMGA1 beeinflussen. Da die gleiche Wirkung auf die HMGA1-Expression durch den spezifischen Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A vermittelt wird, könnte die Hemmung dieser Enzyme der Mechanismus sein, über den Butyrat seine Wirkungen ausübt. In vitro- und in vivo- Untersuchungen zeigen, dass eine Hemmung der HMGA1-Proteinsynthese die maligne Transformation verhindern, das metastatische Potential verringern und sogar das Wachstum bereits existenter Tumoren verlangsamen kann. Der protektive Effekt von Butyrat hinsichtlich der malignen Transformation und die Wirkung von Butyrat auf bereits maligne transformierte Zellen könnten zumindest teilweise dadurch erklärt werden, dass Butyrat die Expression von HMGA1 in Tumorzellen reduziert und damit dessen malignes Potential vermindert. Auch die Nicht-Histon-Proteine HMGN1 und HMGN2 stellen wichtige strukturelle Elemente des Chromatins dar. Sie werden sowohl in Normalgewebe als auch in maligne transformierten Zellen exprimiert. Auch die untersuchten Zelllinien Sw-480, Sw-620 und 23132/87 exprimieren HMGN1 und HMGN2. Signifikante Unterschiede zwischen der Primärtumorzelllinie Sw-480 und der Metastasenzelllinie Sw-620 des Sw-480 Kolonkarzinoms waren nicht feststellbar. Sowohl Butyrat als auch Trichostatin A senken in den untersuchten Karzinomzelllinien die Expression von HMGN1- bzw. HMGN2-mRNA, wobei dieser Effekt teilweise zeit- und dosisabhängig ist. Da die gleiche Wirkung auf die Expression von HMGN1 und HMGN2 durch den spezifischen Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A vermittelt wird, könnte die Hemmung der Histondeacetylasen auch in diesem Fall der Mechanismus sein, über den Butyrat seine Wirkungen ausübt. Es gibt zunehmend Hinweise, dass HMGN1 und HMGN2 und die Modulation ihrer Expression eine bedeutende Rolle bei der Regulation zellulärer Vorgänge, wie z.B. Transkription und Replikation, haben. Nachdem in den letzten Jahren gezeigt wurde, welche Bedeutung Veränderungen der Chromatinstruktur durch Modifikation der Histonproteine für die Karzinogenese haben, ist zu vermuten, dass auch die Modulation der Chromatinbestandteile HMGN1 und HMGN2 in diesem Zusammenhang von Bedeutung sein könnte. Über die Bedeutung der HMGN-Expression, deren Modulation bzw. die der posttranslationalen Modifikation in humanen Karzinomen ist bis jetzt wenig bekannt. Von Bedeutung könnte dabei z.B. die kürzlich nachgewiesene Butyrat-induzierte Hyperacetylierung von HMGN2 sein. Unklar ist noch das unterschiedliche Ausmaß der Acetylierung der HMGN-Proteine in verschieden differenzierten Karzinomen, der Vergleich zwischen Normalgewebe und maligne transformierten Zellen und die Dynamik der Acetylierung in der Tumorprogression. Denkbar ist, dass zumindest ein Teil der bekannten Wirkungen von Butyrat auf einer Modulation dieser Chromatinbestandteile mit nachfolgend veränderter Genexpression beruht.
N2  - Butyrate, a short-chain-fatty-acid (SCFA), is generated by anaerobic fermentation of undigested carbohydrates within the colon. In human carcinoma cells butyrate causes apoptosis, differentiation and growth inhibition. The molecular mechanisms by which butyrate mediates its effects are not yet fully understood. The family of non-histone nuclear proteins (high-mobility-group (HMG) proteins) is divided into three subfamilies, HMG-B, HMG-A and HMG-N, respectively. HMG-N proteins bind to chromatin and induce structural changes that affect DNA-dependent activities, such as transcription and replication. The HMG-A proteins are involved in gene expression during development and immune response. In normal epithelial cells HMG-A protein expression is low, however, HMG-A is overexpressed in several human carcinomas. In this study we examined the effects of butyrate on HMG protein expression in human gastrointestinal carcinoma cells. Treatment of human gastrointestinal carcinoma cells with butyrate and Trichostatine A led to a significant reduction of HMG-mRNA levels. The effect was observed in all examined cell lines, independent of origin or degree of differentiation. Butyrate mediates a wide range of effects in vitro and in vivo, such as inhibition of colon carcinogenesis and induction of apoptosis and differentiation. Modulation of the expression of transcription factors as well as the induction of changes within chromatin structure and composition are potential pathways of butyrate action. Butyrate is known to induce acetylation of core histones and non-histone nuclear proteins. Alterations of the chromatin structure caused by histone hyperacetylation or deacetylation may play an important role in changes of gene expression patterns and may consequently promote cancerogenesis. Modulation of HMG-mRNA expression constitutes an additional step in the modification of the chromatin structure. Therefore, it may at least in part be responsible for the wide range of butyrate associated effects.
KW  - Butyrat
KW  - Histon
KW  - HMG
KW  - Kolonkarzinom
KW  - butyrate
KW  - histone
KW  - HMG
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9150
ER  -