TY - THES A1 - Steinmetzger, Christian T1 - Fluorogenic Aptamers and Fluorescent Nucleoside Analogs as Probes for RNA Structure and Function T1 - Fluorogene Aptamere und Fluoreszierende Nukleosid-Analoga als Sonden für RNA-Struktur und -Funktion N2 - RNA plays a key role in numerous cellular processes beyond the central dogma of molecular biology. Observing and understanding this wealth of functions, discovering new ones and engineering them into purpose-built tools requires a sensitive means of observation. Over the past decade, fluorogenic aptamers have emerged to fill this niche. These short oligonucleotides are generated by in vitro selection to specifically interact with small organic fluorophores and can be utilized as genetically encoded tags for RNAs of interest. The most versatile class of fluorogenic aptamers is based on derivatives of hydroxybenzylidene imidazolone (HBI), a conditional fluorophore mimicking the chromophore structure found in green and red fluorescent proteins. The respective aptamers are well-known by the “vegetable” nomenclature, including Spinach, Broccoli and Corn, and have found numerous applications for studying RNA function in vitro and in cells. Their success, however, is somewhat overshadowed by individual shortcomings such as a propensity for misfolding, dependence on unphysiologically high concentrations of magnesium ions or, in the case of Corn, dimerization that might affect the function of the tagged RNA. Moreover, most fluorogenic aptamers exhibit limited ligand promiscuity by design, thereby restricting their potential for spectral tuning to a narrow window of wavelengths. This thesis details the characterization of a new fluorogenic aptamer system nicknamed Chili. Chili is derived from an aptamer that was originally selected to bind 4-hydroxy-3,5-dimethoxy¬hydroxy-benzylidene imidazolone (DMHBI), resulting in a green fluorescent complex. Unlike other aptamers of its kind, Chili engages in a proton transfer cycle with the bound ligand, resulting in a remarkably large Stokes shift of more than 130 nm. By means of an empirical ligand optimization approach, several new DMHBI derivatives were found that bind to Chili with high affinity, furnishing complexes up to 7.5 times brighter compared to the parent ligand. In addition, Chili binds to π-extended DMHBI derivatives that confer fluorescence in the yellow–red region of the visible spectrum. The highest affinity and degree of fluorescence turn-on for both green and red fluorogenic ligands were achieved by the incorporation of a unique, positively charged substituent into the HBI scaffold. Supplemented by NMR spectroscopy, kinetic and thermodynamic studies showed that the binding site of Chili is loosely preorganized in the absence of ligand and likely forms a G-quadruplex upon ligand binding. To showcase future applications, Chili was incorporated into a FRET sensor for monitoring the cleavage of an RNA substrate by a 10-23 DNAzyme. Besides aptamers as macromolecular fluorescent complexes, fluorescent nucleobase analogs are powerful small isomorphic components of RNA suitable for studying structure and folding. Here, the highly emissive nucleobase analog 4-cyanoindole (4CI) was developed into a ribonucleoside (r4CI) for this purpose. A new phosphoramidite building block was synthesized to enable site-specific incorporation of 4CI into RNA. Thermal denaturation experiments confirmed that 4CI behaves as a universal nucleobase, i.e. without bias towards any particular hybridization partner. Photophysical characterization established r4CI as a generally useful fluorescent ribonucleoside analog. In this work, it was employed to gain further insight into the structure of the Chili aptamer. Using several 4CI-modified Chili–HBI complexes, a novel base–ligand FRET assay was established to obtain a set of combined distance and orientation restraints for the tertiary structure of the aptamer. In addition to their utility for interrogating structure and binding, supramolecular FRET pairs comprising a fluorescent nucleobase analog donor and an innately fluorogenic acceptor hold great promise for the construction of color-switchable RNA aptamer sensor devices. N2 - Weit über das zentrale Dogma der Molekularbiologie hinaus ist RNA an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt. Um diese Prozesse aufzuklären, sie umfassend zu verstehen und sich zunutze zu machen bedarf es geeigneter Detektionsmethoden für RNA. Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurden fluorogene Aptamere als ideales Werkzeug für diesen Zweck erkannt. Dabei handelt es sich um vergleichsweise kurze Oligonukleotide, die mittels in vitro-Selektion zur spezifischen Bindung bestimmter organischer Fluorophore erzeugt werden. Analog zu fluoreszierenden Proteinen können sie zur Fluoreszenzmarkierung von RNA eingesetzt werden. Die wichtigste Klasse fluorogener Aptamere bindet und aktiviert Derivate des latenten Fluorophors 4-Hydroxybenzylidenimidazolon (HBI), welcher ursprünglich im Kern fluoreszierender Proteine autokatalytisch aus einem Tripeptid-Fragment entsteht und deren spektrale Eigenschaften bestimmt. Vertreter dieser Klasse, namentlich Spinach, Broccoli und Corn, haben sich als alltägliches Werkzeug zur Fluoreszenzmarkierung von RNA etabliert. Diesem Erfolg gegenüber stehen Unzulänglichkeiten, die das Potential einzelner Aptamere begrenzen. Beispielsweise kann es zur Ausbildung inaktiver Faltungszustände der RNA kommen oder die Fluoreszenzaktivierung erfordert eine hohe Magnesiumkonzentration, welche in Zellen nicht frei verfügbar ist. Im Fall des Corn-Aptamers bildet sich ein Homodimer, was unter Umständen die zu untersuchende RNA beeinträchtigen kann. Darüber hinaus ist, aufgrund der spezifischen Fluorophorbindung, jeweils nur geringes Potenzial zur gezielten Beeinflussung spektraler Eigenschaften vorhanden. Kern dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung des neuen Chili-Systems. Chili ist die optimierte Version eines Aptamers, welches einen grün fluoreszierenden Komplex mit 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidenimidazolon (DMHBI) ausbildet. Im Gegensatz zu anderen HBI-bindenden Aptameren vollzieht Chili einen Protonenaustausch mit seinem Liganden, woraus Fluoreszenz-emission mit einer ungewöhnlich hohen Stokes-Verschiebung von über 130 nm resultiert. Die Struktur des ursprünglichen Liganden wurde im Hinblick auf höhere Affinität und stärkere Fluoreszenzemission optimiert, wobei ein bis zu 7.5-facher Gewinn an Helligkeit erzielt wurde. Als besonders vorteilhaft hat sich dafür die Einführung eines positiv geladenen Substituenten herausgestellt, der in dieser Form ein Alleinstellungsmerkmal von Chili ist. Auch stark modifizierte DMHBI-Derivate, die ein größeres konjugiertes System besitzen, werden von Chili gebunden und fluoreszieren daraufhin im gelben bis roten Bereich des sichtbaren Spektrums. Studien zur Ligandenbindungskinetik und thermischen Denaturierung des Aptamers legen nahe, dass die zunächst strukturarme Bindungstasche durch die Aufnahme des Liganden einen G-Quadruplex ausbildet, was ebenfalls durch NMR-spektroskopische Daten bestätigt wird. Als Beispiel für mögliche Anwendungen wurde das Chili-Aptamer eingesetzt, um die Spaltung eines RNA-Substrats durch ein 10-23 DNA-Enzym zu beobachten, wobei FRET zwischen dem Aptamer und einem Fluoreszenzmarker am Substrat als Reporter ausgenutzt wurde. Neben makromolekularen Aptamer-Komplexen können fluoreszierende Nukleobasenanaloga als isomorphe Einheiten in RNA integriert werden, um deren Faltungszustand zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde das fluoreszierende Nukleobasenanalogon 4-Cyanodinol (4CI) in das entsprechende Ribonukleosid (r4CI) umgewandelt und daraus ein neuer Phosphoramiditbaustein zum Einbau des fluoreszierenden von 4CI in RNA synthetisiert. Anhand thermischer Denaturierungs¬experimente wurde gezeigt, dass es sich bei 4CI um eine universelle Base handelt, die ungeachtet des Hybridisierungskontexts toleriert wird. Die photophysikalische Charakterisierung von r4CI zeigte, dass das fluoreszierendes Ribonukleosid-Analogon seine nützlichen Eigenschaften nach dem Einbau in Oligonukleotide beibehält, sodass es zur Strukturanalyse des Chili-Aptamers verwendet werden konnte. Mithilfe 4CI-modifizierter Chili–HBI-Komplexe wurden erstmals intramolekulare FRET-Paare dieser Art erzeugt und zur Bestimmung kombinierter Abstands- und Orientierungsparameter genutzt. Über ihre Verwendung für Struktur- und Bindungsstudien hinaus stellen supramolekulare FRET-Paare aus fluoreszierenden Nukleobasen-Analoga als Donoren und intrinsisch fluorogenen Akzeptoren eine Möglichkeit dar, neue schaltbare Aptamer-basierte Sensoren zu entwickeln, welche auf die Erkennung ihrer Zielspezies mit einem Wechsel der Fluoreszenzemissionswellenlänge reagieren. KW - Aptamer KW - Nucleosidanaloga KW - RNS KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - RNA KW - FRET KW - Nucleoside KW - Nucleinsäuren Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207604 ER - TY - THES A1 - Dietzsch, Julia T1 - Nucleic acid-mediated fluorescence activation and chromophore assembly T1 - Nukleinsäure-vermittelte Fluoreszenzaktivierung und Chromophorassemblierung N2 - Nucleic acids are not only one of the most important classes of macromolecules in biochemistry but also a promising platform for the defined arrangement of chromophores. Thanks to their precise organization by directional polar and hydrophobic interactions, oligonucleotides can be exploited as suitable templates for multichromophore assemblies with predictable properties. To expand the toolbox of emissive, base pairing nucleobase analogs several barbituric acid merocyanine (BAM) chromophores with tunable spectroscopic properties were synthesized and incorporated into RNA, DNA and glycol nucleic acid (GNA) oligonucleotides. A multitude of duplexes containing up to ten BAM chromophores was obtained and analysis by spectroscopic methods revealed the presence of dipolarly coupled merocyanine aggregates with properties strongly dependent on the chromophore orientation toward each other and the backbone conformation. These characteristics were exploited for various applications such as FRET pair formation and polymerase chain reaction (PCR) experiments. The observed formation of higher-order aggregates implies future applications of these new oligonucleotide-chromophore systems as light-harvesting DNA nanomaterials. Besides oligonucleotide templated covalent assembly of chromophores also non-covalent nucleic acid-chromophore complexes are a broad field of research. Among these, fluorogenic RNA aptamers are of special interest with the most versatile ones based on derivatives of the GFP chromophore hydroxybenzylidene imidazolone (HBI). Therefore, new HBI-derived chromophores with an expanded conjugated system and an additional exocyclic amino group for an enhanced binding affinity were synthesized and analyzed in complex with the Chili aptamer. Among these, structurally new fluorogenes with strong fluorescence activation upon binding to Chili were identified which are promising for further derivatization and application as color-switching sensor devices for example. N2 - Nukleinsäuren sind nicht nur eine der wichtigsten Klassen biochemisch relevanter Makromoleküle, sondern stellen auch eine vielversprechende Plattform für die definierte räumliche Organisation kleiner funktioneller Moleküle, wie beispielsweise Chromophore, dar. Oligonu-kleotide können aufgrund ihrer präzise gegliederten Struktur, die durch gerichtete polare und hydrophobe Wechselwirkungen hervorgerufen wird, als nützliche Template für die mehrfache kovalente und nicht-kovalente Anordnung von Chromophoren zu Aggregaten mit vorhersagbaren spektroskopischen Eigenschaften genutzt werden. Obwohl eine Vielzahl solcher Chromophorsysteme bereits in der Literatur beschrieben ist, basieren die meisten Chromophordesigns nur auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Chromophoren und lassen die intrinsische Fähigkeit kanonischer Nukleobasen, komplementäre Basenpaare zu bilden, außen vor. Allerdings liegt es auf der Hand, dass die Berücksichtigung dieser polaren Wechselwirkungen nicht nur zu einer Stabilisierung der Oligonukleotid-Sekundärstruktur führen kann, sondern auch die Interpretation spektroskopischer Effekte vereinfacht. Um das bekannte Spektrum emittierender Nukleobasen-Analoga zu erweitern und den zusätz-lichen Einfluss dieser polaren Wechselwirkungen auszunutzen, wurden im Zuge dieser Arbeit verschiedene, strukturell unterschiedliche Barbitursäure-Merocyanin-Chromophore (BAM) entworfen. Die Barbitursäure-Akzeptoreinheit dieser künstlichen Nukleobasensurrogate ähnelt der Watson-Crick-Basenpaarungsseite der natürlichen T- und U-Nukleobasen und soll somit die Basenpaarung mit Adenosin ermöglichen. Durch die Kombination dieses Akzeptors mit unterschiedlich aufgebauten aromatischen Donoreinheiten, wie zum Beispiel Indol und Benzothiazol, konnten Merocyanine mit interessanten spektroskopischen Eigenschaften erhalten werden. Da die Konstitution des Nukleinsäurerückgrates einen starken Einfluss auf die Strukturparameter und die thermodynamische Stabilität der resultierenden Duplexstruktur hat, wurden die synthetisierten BAM-Chromophore in Phosphoramiditbausteine für die kovalente Assemblierung innerhalb verschiedener Oligonukleotidsysteme umgewandelt. Neben der Synthese entsprechender DNA- und RNA-Nukleotide wurden die BAM-Chromophore auch als Glykolnukleinsäure-Bausteine (GNA) mit einem azyklischen Rückgrat hergestellt. Der erfolgreiche Einbau der erhaltenen künstlichen Nukleoside konnte durch Festphasensynthese erreicht werden, wobei über 100 modifizierte Einzelstränge erhalten werden konnten. Die Hybridisierung der künstlichen Oligonukleotid-Einzelstränge mit ihren jeweiligen Gegensträngen führte zu einer Vielzahl kurzer Duplexstrukturen mit bis zu zehn BAM-Chromophoren in unterschiedlicher Anordnung. Mithilfe verschiedenster spektroskopischer Methoden konnte ein Einblick in die strukturelle Organisation der Merocyanine innerhalb dieser Systeme erhalten werden, wobei sich die Bildung dipolar-gekoppelter Merocyanin-Dimere und -Multimere zeigte. Die hierfür erforderliche ungewöhnliche \textit{syn}-Konformation der BAM-Chromophore wurde weiterhin durch Oligonukleotid-NMR bestätigt. Erstaunlicherweise wiesen die spektroskopischen und thermodynamischen Eigenschaften BAM-modifizierter Nukleinsäuren eine starke Abhängigkeit von der Chromophororientierung und der Konformation des Rückgrates auf. Dieser Effekt konnte für verschiedene Anwendungen wie die Bildung von FRET-Paaren und die Verwendung als internes fluoreszentes Stop-Nukleotid in Polymerasekettenreaktionen ausgenutzt werden. Mithilfe von Rasterkraftmikroskopie wurde außerdem die Bildung von Aggregaten höherer Ordnung beobachtet, was eine zukünftige Verwendung dieser neuen Oligonukleotid-Chromophor-Systeme als Materialien für Lichtsammelkomplexe oder für die DNA-Nanotechnologie denkbar macht. Ein weiteres großes Forschungsfeld neben kovalenten Chromophoranordnungen mit Oligonukleotiden als Templat sind nicht-kovalente Nukleinsäure-Chromophorkomplexe. Insbesondere fluorogene RNA-Aptamere sind hier von großer Bedeutung wobei die wichtigsten auf der Fluoreszenzaktivierung von Derivaten 4-Hydroxybenzylidenimidazolon-Fluorophors (HBI), dem Chromophor des natürlich vorkommenden grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beruhen. Allerdings zeigen viele der berichteten Aptamer-Ligand-Systeme signifikante Nachteile wie unter anderem unspezifische Bindung, eine starke Tendenz zu Photoisomerisierung oder ineffiziente Zellpermeabilität. Deshalb wurden im Zuge dieser Arbeit neue, von HBI abgeleitete Chromophore mit einem vergrößerten konjugierten $\uppi$-System und einer zusätzlichen exozykli-schen Aminogruppe für eine erhöhte Bindungsaffinität synthetisiert und im Komplex mit dem bekannten Chili-Aptamer untersucht. Einige dieser strukturell neuen Chromophore zeigten einen starken Anstieg der Emission bei Bindung an dieses Aptamer und wurden daher weiter charakterisiert. Sie stellen eine vielversprechende Möglichkeit für weitere Derivatisierung und die zukünftige Anwendung beispielsweise als schaltbare Aptamer-basierte Fluoreszenzsensoren dar. KW - Nucleinsäuren KW - Merocyanine KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - Aptamer KW - Exziton KW - Fluoreszenzaktivierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259761 ER -