TY - THES A1 - Soundararajan, Manonmani T1 - Investigations into the mechanisms behind the antagonistic effects and phage resistance of probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 T1 - Untersuchungen der Mechanismen des antagonistischen Effekts und der Phagenresistenz des probiotischen Escherichia coli-Stammes Nissle 1917 N2 - Gastrointestinal infections account for high morbidity and mortality in humans every year across the globe. The increasing emergence of antibiotic resistance among the gastrointestinal pathogens and the induction of virulence factors by antibiotics makes it highly risky to only depend on antibiotic therapy for intestinal infections. Most of these infections are associated with an imbalance in the gut microbial population whereas the restoration of the balance with probiotic supplements can result in an improvement of the health condition. Probiotics are therefore considered as successful support in the treatment of gastrointestinal infections. E. coli Nissle 1917 (EcN) is the active component of the probiotic medication Mutaflor® and has been used in the treatment of various gastrointestinal disorders for more than 100 years. Several studies have reported antagonistic effects of EcN against enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in vitro and in vivo. However, detailed investigations on the probiotic mechanisms and safety aspects of EcN are a pre-requisite, for administering EcN to treat EHEC infected patients or to use EcN as a prophylactic for the patient’s close contacts. In this regard, the first part of the study aimed to understand the nature and behaviour of EcN in the presence of pathogenic or non-pathogenic E. coli strains. Transcriptomic analysis was deployed to this end. We investigated the changes in EcN’s transcriptome after different time points of coculture with the EHEC strain EDL933 or the K-12 strain MG1655. The transcriptome data reported a strain-specific response in EcN at all the investigated time points (3 h, 5 h, 7 h and 8 h) of coincubation. The alterations in gene regulation of EcN were highly pronounced in initial timepoints (3 h and 5 h) of coincubation with EDL933, which gradually decreased over time. In the presence of MG1655, the alterations were strongly differentially regulated only at later time points (7 h and 8 h). The unique transcriptional response of EcN towards two different E. coli strains, that are genetically more than 98 % identical, was startling. 12 More importantly, this can be considered as a beneficial trait of EcN over a chemical-pharmaceutical preparation like an antibiotic that might act identically on all target cells. Bacteriophages are one of the most abundant members of gut microbiota. On the one hand, the infection of a probiotic strain by a lysogenic phage could transfer genetic material coding for pathogenic factors or antibiotic resistance into an otherwise beneficial probiotic bacterium and thereby converting it into a virulent pathogenic bacterium. On the other hand, infection by a lytic phage could result in bacterial lysis and prevent the bacterium from exerting its probiotic effect. Thus, in order to successfully establish and colonise the gut, it is crucial for any probiotic to be resistant against phage infections. To address this, in the second part of the study, we investigated the phage resistance of EcN towards the lysogenic lambda and the lytic T4 phage. EcN showed complete resistance against tested phages and was also able to inactivate these phages upon coincubation. In the case of lambda phages, the resistance was attributed to the presence of a lambdoid prophage (prophage 3) in the genome of EcN. In addition, the overexpression of one of the early genes of EcN’s prophage 3 (i.e. phage repressor gene pr) in the phage sensitive MG1655 conferred partial protection against lambda phage infection. Moreover, the inactivation was mediated by binding of lambda phages to its receptor LamB. Experiments with lytic T4 phages revealed that the EcN’s K5 polysaccharide capsule was crucial for its T4 phage resistance, while its lipopolysaccharide (LPS) inactivated the T4 phages. Apart from protecting itself, EcN displayed even a protective role for the tested K-12 strains, by interfering with the lysogeny and lysis by these phages. In summary, this work highlights two novel positive traits of the probiotic strain EcN: i) the strain-specific response that was evident from the global transcriptome analysis of EcN when incubated with other E. coli strains, and ii) lytic and lysogenic phage resistance. Both these traits are additional safety aspects for a well-characterised probiotic strain and encourage its application in therapeutics. N2 - Gastrointestinale Infektionen sind jedes Jahr weltweit für eine hohe Morbidität und Mortalität beim Menschen verantwortlich. Das zunehmende Auftreten von Antibiotikaresistenzen bei gastrointestinalen Pathogenen und die Induktion von Virulenzfaktoren durch Antibiotika machen es hoch riskant Darminfektionen ausschließlich mit Antibiotika zu behandeln. Die meisten gastrointestinalen Infektionen sind mit einem Ungleichgewicht in der mikrobiellen Darmpopulation verbunden, während die Wiederherstellung des Gleichgewichts mit Probiotika zu einer Verbesserung des Gesundheitszustands führen kann. Daher gelten Probiotika als hilfreiche Unterstützung bei der Behandlung von Magen-Darm-Infektionen. E. coli Nissle 1917 (EcN) ist der aktive Bestandteil des probiotischen Medikaments Mutaflor® und wird seit mehr als 100 Jahren zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt. Mehrere Studien haben über die antagonistische Wirkung von EcN gegenüber enterohämorrhagischer E. coli (EHEC) sowohl in vitro als auch in vivo berichtet. Detaillierte Untersuchungen zu den probiotischen Mechanismen und Sicherheitsaspekten von EcN sind jedoch Voraussetzung für eine mögliche Verabreichung von EcN zur Behandlung von EHEC-infizierten Patienten oder für die Verwendung von EcN als Prophylaxe für den engsten Umkreis der infizierten Patienten. In dieser Hinsicht zielte der erste Teil dieser Studie darauf ab, die Natur und das Verhalten von EcN in Gegenwart von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterienstämmen zu verstehen. Zu diesem Zweck wurden die Veränderungen im Transkriptom von EcN nach verschiedenen Zeitpunkten der Co-Kultur mit dem EHEC-Stamm EDL933 oder dem K-12 Stamm MG1655 untersucht. Die Transkriptomdaten zeigten eine stammspezifische Reaktion von EcN zu allen untersuchten Zeitpunkten (3 h, 5 h, 7 h und 8 h) der Co-Inkubation. Die Veränderungen in der Genregulation von EcN waren zu den primären Zeitpunkten der Co-Kultur mit EDL933 (3 h und 5 h) sehr ausgeprägt und nahmen im Laufe der Zeit allmählich ab. Während der Co-Kultur mit MG1655 hingegen, kam es erst zu späteren Zeitpunkten zu einer starken Veränderung in der Genregulation (7 h und 8 h). Diese einzigartige transkriptionelle Reaktion von EcN auf zwei verschiedene E. coli Stämme, die genetisch zu mehr als 98 % identisch sind, war verblüffend. Diese Eigenschaft von EcN kann als vorteilhaft gegenüber einem chemisch-pharmazeutischen Präparat wie einem Antibiotikum angesehen werden, welches auf alle Zielzellen identisch wirken könnte. Bakteriophagen sind einer der häufigsten Bestandteile der Darm Mikrobiota. Durch die Infektion eines probiotischen Stammes mit einem lysogenen Phagen ist es möglich, dass genetisches Material, das für pathogene Faktoren oder Antibiotikaresistenzen kodiert, übertragen wird und das Probiotikum dadurch zu einem virulent pathogenen Bakterium umgewandelt wird. Darüber hinaus könnte die Infektion durch einen lytischen Phagen zur Lyse des Probiotikums führen wodurch seine probiotische Wirkung unterbunden werden würde. Für eine erfolgreiche Besiedlung des Darms ist es daher für Probiotika entscheidend gegenüber Phagen Infektionen resistent zu sein. Um dieses Problem anzugehen, wurde im zweiten Teil der Studie die Phagen Resistenz von EcN gegenüber dem lysogenen Phagen Lambda und dem lytischen Phagen T4 untersucht. EcN zeigte eine vollständige Resistenz gegenüber den getesteten Phagen und konnte darüber hinaus die Phagen während der Co-Inkubation inaktivieren. Bei den Lambda-Phagen konnte die Resistenz auf das Vorhandensein eines Lambda-Prophagen (Prophage 3) im Genom von EcN zurückgeführt werden. Dies wurde durch das Ergebnis, dass die Überexpression eines der frühen Gene von EcNs Prophagen 3 (dem Phagen-Repressor pr) im Phagen sensitiven K-12 Stamm MG1655 zu einem partiellen Schutz gegenüber einer Lambda-Phagen Infektion führte, gestützt. Die Inaktivierung der Lambda-Phagen hingegen wurde durch die Bindung der Phagen an EcNs Rezeptor LamB vermittelt. Experimente mit lytischen T4-Phagen konnten aufzeigen, dass die K5-Polysaccharid Kapsel von EcN entscheidend für seine T4-Phagenresistenz ist, EcNs Lipopolysaccharid (LPS) wiederum die T4-Phagen inaktiviert. Abgesehen davon, dass EcN sich selbst vor Phagen Infektionen schützt, konnte gezeigt werden, dass EcN eine Phagen initiierte Lysogenie oder Lyse der getesteten K-12-Stämme verhindert. Zusammenfassend hebt diese Arbeit zwei neue positive Eigenschaften des probiotischen Stammes EcN hervor: i) die stammspezifische Reaktion, die sich aus der globalen Transkriptomanalyse von EcN während der Inkubation mit anderen E. coli-Stämmen ergab, und ii) die lytische und lysogene Phagenresistenz. Beide Merkmale sind zusätzliche Sicherheitsaspekte eines bereits gut charakterisierten probiotischen Stammes und unterstützen seine therapeutische Anwendung. KW - E. coli Nissle KW - lambdoid phage resistance KW - lytic phage resistance KW - K5 capsule KW - LPS KW - Probiotic KW - phage resistance KW - gastrointestinal infection Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215256 ER - TY - THES A1 - Seo, Ean Jeong T1 - Construction of recombinant E. coli Nissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins T1 - Konstruktion von rekombinanten E. coli Nissle 1917 (EcN) Stämmen, die Defensine exprimieren bzw. sekretieren N2 - Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren. N2 - The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Rekombinante DNS KW - Genexpression KW - Defensine KW - Probiotic KW - Recombinant defensins KW - E. coli Nissle 1917 KW - HBD2 KW - HD5 KW - Antimicrobial activity KW - Secretion Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72005 ER -