TY - THES A1 - Smolan, Willi T1 - Linear Multifunctional PEG-Alternatives for Bioconjugation and Hydrogel Formation T1 - Lineare Multifunktionelle PEG-Alternativen für Biokonjugation und Hydrogelbildung N2 - The objective of this thesis was the synthesis and characterisation of two linear multifunctional PEG-alternatives for bioconjugation and hydrogel formation: i) Hydrophilic acrylate based copolymers containing peptide binding units and ii) hydrophilic polyether based copolymers containing different functional groups for a physical crosslinking. In section 3.1 the successful synthesis of water soluble and linear acrylate based polymers containing oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylate with either linear thioester functional 2-hydroxyethyl acrylate, thiolactone acrylamide, or vinyl azlactone via the living radical polymerisation technique Reversible Addition Fragmentation Chain Transfer (RAFT) and via free-radical polymerisation is described. The obtained polymers were characterized via GPC, 1H NMR, IR and RAMAN spectroscopy. The RAFT end group was found to be difficult to remove from these short polymer chains and accordingly underwent the undesired side reaction aminolysis with the peptide during the conjugation studies. Besides that, polymers without RAFT end groups did not show any binding of the peptide at the thioester groups, which can be improved in future by using higher reactant concentrations and higher amount of binding units at the polymer. Polymers containing the highly reactive azlactone group showed a peptide binding of 19 %, but unfortunately this function also underwent spontaneous hydrolysis before the peptide could even be bound. In all cases, oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylate was used with a relatively high molecular weight (Mn = 480 Da) was used, which eventually was efficiently shielding the introduced binding units from the added peptide. In future, a shorter monomer with Mn = 300 Da or less or hydrophilic N,N’-dialkyl acrylamide based polymers with less steric hindrance could be used to improve this bioconjugation system. Additionally, the amount of monomers containing peptide binding units in the polymer can be increased and have an additional spacer to achieve higher loading efficiency. The water soluble, linear and short polyether based polymers, so called polyglycidols, were successfully synthesized and modified as described in section 3.2. The obtained polymers were characterized using GPC, 1H NMR, 31P{1H} NMR, IR, and RAMAN spectroscopy. The allyl groups which were present up to 20 % were used for radical induced thiol-ene chemistry for the introduction of functional groups intended for the formation of the physically crosslinking hydrogels. For the positively charged polymers, first a chloride group had to be introduced for the subsequent nucleophilic substitution with the imidazolium compound. There, degrees of modifications were found in the range 40-97 % due to the repulsion forces of the charges, decreased concentration of active chloride groups, and limiting solution concentrations of the polymer for this reaction. For the negatively charged polymers, first a protected phosphonamide moiety was introduced with a deprotection step afterwards showing 100 % conversion for all reactions. Preliminary hydrogel tests did not show a formation of a three-dimensional network of the polymer chains which was attributed to the short backbone length of the used polymers, but the gained knowledge about the synthetic routes for the modification of the polymer was successfully transferred to longer linear polyglycidols. The same applies to the introduction of electron rich and electron poor compounds showing π-π stacking interactions by UV-vis spectroscopy. Finally, long linear polyglycidyl ethers were synthesised successfully up to molecular weights of Mn ~ 30 kDa in section 3.3, which was also proven by GPC, 1H NMR, IR and RAMAN spectroscopy. This applies to the homopolymerisation of ethoxyethyl glycidyl ether, allyl glycidyl ether and their copolymerisation with an amount of the allyl compound ~ 10 %. Attempts for higher molecular weights up to 100 kDa showed an uncontrolled polymerisation behaviour and eventually can be improved in future by choosing a lower initiation temperature. Also, the allyl side groups were modified via radical induced thiol-ene chemistry to obtain positively charged functionalities via imidazolium moieties (85 %) and negatively charged functionalities via phosphonamide moieties (100 %) with quantitative degree of modifications. Hydrogel tests have still shown a remaining solution by using long linear polyglycidols carrying negative charges with long/short linear polyglycidols carrying positive charges. The addition of calcium chloride led to a precipitate of the polymer instead of a three-dimensional network formation representing a too high concentration of ions and therefore shielding water molecules with prevention from dissolving the polymer. These systems can be improved by tuning the polymers structure like longer polymer chains, longer spacer between polymer backbone and charge, and higher amount of functional groups. The objective of the thesis was partly reached containing detailed investigated synthetic routes for the design and characterisation of functional polymers which could be used in future with improvements for bioconjugation and hydrogel formation tests. N2 - Das Ziel dieser Arbeit war es zwei lineare multifunktionale PEG-Alternativen für die Bioconjugation und Hydrogelbildung herzustellen und zu charakterisieren: i) Wasserlösliche Acrylat-basierte Copolymere mit Peptidbindungseinheiten und ii) wasserlösliche Polyether-basierte Copolymere mit verschiedenen funktionalen Gruppen für eine physikalische Vernetzung. In Abschnitt 3.1 wurde die erfolgreiche Synthese von wasserlöslichen und linearen Acrylat-basierten Polymeren, die Oligo(ethylen glycol) methyl ether acrylat mit jeweils 2-Hydroxyethyl acrylate modifiziert mit linearem Thioester, Thiolactonacrylamid und Vinylazlacton enthielten, mittels der lebenden Polymerisationstechnik Reversible Additions-Fragmentierungs Kettenübertragung (RAFT) und mittels freier radikalischer Polymerisation durch GPC, 1H NMR, IR und RAMAN Spektroskopie bewiesen. Es erwies sich als schwer die RAFT-Endgruppe von den kurzen Polymerketten zu entfernen und führte zur Nebenreaktion Aminolyse mit dem Peptid während des Konjugationsprozesses. Außerdem zeigten Polymere ohne RAFT-Endgruppen keine Peptidbindung an den Thioestergruppen, was durch höhere Konzentration der Reaktanten und größeren Anteil an Peptidbindungseinheiten am Polymer in Zukunft verbessert werden könnte. Polymere mit Azlaktongruppen zeigten eine Bindung von 19 %, wobei dies eine sehr reaktive Gruppe ist und vor der Peptidbindung noch hydrolysieren kann. In allen Fällen wurde Oligo(ethylen glycol) methyl ether acrylat mit Mn = 480 Da verwendet, welches die Peptidbindungsstellen abschirmen kann. Daher können in Zukunft Monomere mit Mn = 300 Da oder N,N’-Dialkylacrylamid-basierte Monomere mit weniger sterischer Hinderung für dieses System verwendet werden. Zusätzlich kann der Anteil an Monomeren mit Peptidbindungseinheiten im Polymer und zusätzlicher Seitenkette erhöht werden, um höhere Bindungseffektivitäten zu erreichen. Die erfolgreiche Synthese und Modifikation von wasserlöslichen, linearen und kurzen Polyether-basierten Polymeren, sogenannten Polyglycidolen, konnte in Abschnitt 3.2 mittels GPC, 1H NMR, 31P{1H} NMR, IR und RAMAN Spektroskopie bewiesen werden. Die Allylgruppe, die bis zu 20 % vorhanden war, wurde für die radikalisch induzierte Thiol-En Chemie zur Einführung von funktionellen Gruppen verwendet. Für die positiv geladenen Polymere, wurde zuerst eine Chloridgruppe generiert, die anschließend für die nukleophile Substitution mit einer Imidazolkomponente verwendet wurde. Dabei wurden Substitutionsgrade von 40-97 % gefunden, was an den Abstoßungskräften der Ladungen, verringerter Konzentration der aktiven Chloridgruppen und der begrenzten Löslichkeitskonzentration bei dieser Reaktion liegt. Für die negativ geladenen Polymere wurde zuerst eine geschützte Phosphonamidgruppe eingeführt, die anschließend entschützt wurde und bei allen Reaktionen einen Umsatz von 100 % zeigte. Vorläufige Hydrogeltests zeigten keine Bildung eines dreidimensionales Netzwerks der Polymerketten aber es wurden Erkenntnisse über die synthetischen Routen für die Modifikation der Polymere für den Transfer auf lange lineare Polyglycidole gewonnen. Das gleiche gilt für die Einführung von elektronreichen und elektronarmen Komponenten, die eine π-π Stapelwechselwirkung mittels UV-vis Spektroskopie zeigte. Letztlich wurden lange lineare Polyglycidole bis zu Molmassen von Mn ~ 30 kDa erfolgreich in Abschnitt 3.3 hergestellt und mittels GPC, 1H NMR, IR and RAMAN Spektroskopie bewiesen. Dies gilt für die Homopolymerisation von Ethoxyethyl glycidyl ether, Ally glycidyl ether und deren Copolymerisation mit einem Anteil der Allylkomponente von ~ 10 %. Versuche um höhere Molekulargewichte bis zu 100 kDa zeigten ein unkontrolliertes Polymerisationsverhalten, welches durch eine niedrigere Initiierungstemperatur weiter verbessert werden kann. Ebenso wurden die Allylseitengruppen mittels radikalisch induzierter Thiol-En Chemie modifiziert, um positivgeladene Funktionalitäten durch Imidazolgruppen (85 %) und negativgeladene Funktionalitäten durch Phosphonamidgruppen (100 %) in quantitativen Umsätzen einzuführen. Hydrogeltests von langen linearen Polyglycidolen, die negativ geladene Gruppen haben, mit langen/kurzen linearen Polyglycidolen, die positiv geladene Gruppen haben, haben eine verbleibende Lösung gezeigt. Die Zugabe von Calciumchlorid führte zum Ausfall des Polymers anstatt zu einem dreidimensionalen Netzwerk repräsentiert durch eine zu hohe Ionenkonzentration. Dies führte zu einer Abschirmung der Wassermoleküle vom Polymer und verhinderte, dies aufzulösen. Das System kann verbessert werden, indem die Polymerstruktur variiert wird, z.B. durch längere Polymerketten, größere Abstände zwischen Polymerhauptkette und Ladung und einen größeren Anteil an funktionellen Gruppen. Das Ziel der Arbeit wurde teilweise erreicht, welches detailliert untersuchte Syntheserouten für das Design und die Charakterisierung von funktionellen Polymeren beinhaltet, welche in Zukunft mit Verbesserungen für Bioconjuations- und Hydrogelformulierungstests verwendet werden können. KW - Wasserlösliche Polymere KW - Ringöffnungspolymerisation KW - Hydrogel KW - polyglycidol KW - RAFT KW - polymer-peptide-conjugate KW - ring opening polymerisation KW - thiol-ene Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-278734 ER - TY - THES A1 - Liebscher [geb. Blöhbaum], Julia T1 - Side chain functional poly(2-oxazoline)s for biomedical applications T1 - Seitenkettenfunktionalisierte Poly(2-oxazoline) für biomedizinische Anwendungen N2 - The aim of the thesis was to develop water soluble poly(2-oxazoline) (POx) copolymers with new side group functionalities, which can be used for the formation of hydrogels in biomedical applications and for the development of peptide-polymer conjugates. First, random copolymers of the monomer MeOx or EtOx with ButEnOx and EtOx with DecEnOx were synthesized and characterized. The vinyl functionality brought into the copolymer by the monomers ButEnOx and DecEnOx would later serve for post-polymerization functionalization. The synthesized copolymers were further functionalized with thiols via post-polymerization functionalization using a newly developed synthesis protocol or with a protected catechol molecule for hydrogel formation. For the formation of peptide-polymer conjugates, a cyclic thioester, namely thiolactone acrylamide and an azlactone precursor, whose synthesis was newly developed, were attached to the side chain of P(EtOx-co-ButEnOx) copolymers. The application of the functionalized thiol copolymers as hydrogels using thiol-ene chemistry for cross-linking was demonstrated. The swelling behavior and mechanical properties were characterized. The hydrophilicity of the network as well as the cross-linking density strongly influenced the swelling behavior and the mechanical strength of the hydrogels. All hydrogels showed good cell viability results. The hydrogel networks based on MeOx and EtOx were loaded with two dyes, fluorescein and methylene blue. It was observed that the uptake of the more hydrophilic dye fluorescein depended more on the ability of the hydrogel to swell. In contrast, the uptake of the more hydrophobic dye methylene blue was less dependent on the swelling degree, but much more on the hydrophilicity of the network. For the potential application as cartilage glue, (biohybrid) hydrogels were synthesized based on the catechol-functionalized copolymers, with and without additional fibrinogen, using sodium periodate as the oxidizing agent. The system allowed for degradation due to the incorporated ester linkages at the cross-linking points. The swelling behavior as well as the mechanical properties were characterized. As expected, hydrogels with higher degrees of cross-linking showed less swelling and higher elastic modulus. The addition of fibrinogen however increased the elasticity of the network, which can be favorable for the intended application as a cartilage glue. Biological evaluation clearly demonstrated the advantage of degradable ester links in the hydrogel network, where chondrocytes were able to bridge the artificial gap in contrast to hydrogels without any ester motifs. Lastly, different ways to form peptide-polymer conjugates were presented. Peptides were attached with the thiol of the terminal cysteine group to the vinyl side chain of P(EtOx-co-ButEnOx) copolymers by radical thiol-ene chemistry. Another approach was to use a cyclic thioester, thiolactone, or an azlactone functionality to bind a model peptide via native chemical ligation. The two latter named strategies to bind peptides to POx side chains are especially interesting as one and in the case of thiolactone two free thiols are still present at the binding site after the reaction, which can, for example, be used for further thiol-ene cross-linking to form POx hydrogels. In summary, side functional poly(oxazoline) copolymers show great potential for numerous biomedical applications. The various side chain functionalities can be introduced by an appropriate monomer or by post-polymerization functionalization, as demonstrated. By their multi-functionality, hydrogel characteristics, such as cross-linking degree and mechanical strength, can be fine-tuned and adjusted depending on the application in the human body. In addition, the presented chemoselective and orthogonal reaction strategies can be used in the future to synthesize polymer conjugates, which can, for example, be used in drug delivery or in tissue regeneration. N2 - Das Ziel der Arbeit war es, wasserlösliche Poly(2-oxazolin) (POx) Copolymere mit neuen Seitenkettenfunktionalitäten zu entwickeln, welche zur Synthese von Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen und zur Entwicklung von Peptid-Polymer Konjugaten genutzt werden können. Zunächst wurden Copolymere aus den Monomeren MeOx oder EtOx mit ButEnOx und EtOx mit DecEnOx synthetisiert und anschließend charakterisiert. Die Monomere wurden statistisch miteinander copolymerisiert, indem sie zusammen zum Start der Reaktion in das Reaktionsgefäß gegeben wurden. Die Vinyl Funktionalität, die durch die Monomere ButEnOx und DecEnOx eingebracht wurde, kann später zur nachträglichen Funktionalisierung am Polymer verwendet werden. Die synthetisierten Copolymere wurden weiterhin mit Thiolen oder mit funktionellen Catecholgruppen ausgestattet, um Hydrogele herzustellen. Um Peptid-Polymer Konjugate zu bilden, wurden zyklische Thioester, genauer Thiolacton acrylamid und ein Azlacton Präkursor, dessen Synthese neu entwickelt wurde, an die Seitenkette von P(EtOx-co-ButEnOx) Copolymere angebunden. Im Folgenden wurde die Anwendung der thiol funktionalisierten Copolymere als Hydrogele, welche mittels radikalischer Thiol-ene Chemie vernetzt wurden, präsentiert. Das Quellverhalten und die mechanischen Eigenschaften wurden analysiert. Sowohl die Hydrophilie des Netzwerkes als auch die Vernetzungsdichte beeinflusste das Quellverhalten und die mechanische Festigkeit stark. Alle Hydrogele zeigten gute Zellverträglichkeit. Die Hydrogele basierend auf MeOx und EtOx wurden außerdem mit den Farbstoffen Fluorescein und Methylenblau beladen. Es wurde beobachtet, dass von den beiden Farbstoffen die Aufnahme des hydrophileren Farbstoffs Fluorescein stärker vom Quellungsgrad des Hydrogels abhing. Hingegen war die Aufnahme des hydrophoberen Farbstoffs Methylenblau weniger davon abhängig wie sehr das Hydrogel quellen konnte, sondern stärker von der Hydrophilie des Hydrogel-Netzwerkes. Um die potenzielle Anwendung als Knorpelkleber zu testen, wurden (biohybrid) Hydrogele basierend auf Catechol-funktionalisiertem Copolymeren mit und ohne zusätzliches Fibrinogen und dem Oxidationsmittel Natriumperiodat hergestellt. Das System war durch die eingebauten Ester Vernetzungspunkte abbaubar. Das Quellverhalten und die mechanischen Eigenschaften wurden charakterisiert. Wie zu erwarten, zeigten Hydrogele mit stärkerer Vernetzung eine geringe Quellung und einen höheren elastischen Modulus. Die Zugabe von Fibrinogen jedoch erhöhte die Elastizität des Netzwerkes, welches förderlich für die avisierte Anwendung als Knorpelkleber sein kann. Die biologische Auswertung zeigte, dass die Ester-haltigen, abbaubaren Vernetzungspunkte von großem Vorteil sind. Die Chondrozyten konnten ohne Probleme den Defektspalt überbrücken, was nicht möglich war, sobald keine Ester Funktionalitäten im Hydrogel eingebunden waren. Zuletzt wurden verschiedene Möglichkeiten Peptid-Polymer Konjugate zu synthetisieren präsentiert. Zum einen wurden Peptide mit der Thiolgruppe des endständigen Cysteins an die Vinyl Seitenkette der P(EtOx-co-ButEnOx) Copolymere mittels radikalischer Thiol-en Chemie angebunden. Des Weiteren wurde ein zyklischer Thioester, das Thiolacton, und eine Azlacton Funktionalität verwendet, um ein Modell Peptid mittels nativer chemischer Ligation zu binden. Die zwei zuletzt genannten Strategien, um Peptide an Polymere zu binden, sind besonders interessant, da hier ein beziehungsweise im Fall der Thiolacton Funktionalität zwei freie Thiole an der Bindungsstelle nach der Reaktion entstehen. Diese könnten genutzt werden, um zum Beispiel über Thiol-en Chemie Peptid-haltige Hydrogele herzustellen. Zusammenfassend zeigen seitenkettenfunktionale Poly(oxazolin) Copolymere ein großes Potenzial für biomedizinische Anwendungen. Die vielen verschiedenen Seitenkettenfunktionalitäten können durch das passende Monomer oder durch Post-Polymerisationsfunktionalisierung eingebracht werden, wie in dieser Arbeit gezeigt. Durch ihre Multifunktionalität können Hydrogel Charakteristika, wie der Vernetzungsgrad und die mechanische Festigkeit, fein eingestellt und angepasst werden, je nach Anwendungsbereich im menschlichen Körper. Die entwickelten chemoselektiven und orthogonalen Reaktionswege können in der Zukunft genutzt werden, um Polymer Konjugate zu synthetisieren, welche zum Beispiel für das Drug Delivery oder im Bereich der Geweberegneration zum Einsatz kommen. KW - Polymere KW - Ringöffnungspolymerisation KW - Hydrogel KW - hydrogel KW - poly(2-oxazoline)s KW - ring-opening polymerization KW - polymer-peptide-conjugate KW - thiol-ene KW - Dihydrooxazole Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203960 ER -