TY  - THES
A1  - Meir [geb. Rother], Juliane
T1  - Influence of oncolytic vaccinia viruses on metastases of human and murine tumors
T1  - Einfluss von onkolytischen Vaccinia Viren auf Metastasen von humanen und murinen Tumoren
N2  - Cancer is one of the leading causes of death. 90% of all deaths are caused by the effects of metastases. It is of major importance to successfully treat the primary tumor and metastases. Tumors and metastases often differ in their properties and therefore, treatment is not always successful. In contrast, those therapeutic agents can even promote formation and growth of metastases. Hence, it is indispensable to find treatment options for metastatic disease. One promising candidate represents the oncolytic virus therapy with vaccinia viruses.
The aim of this work was to analyze two cell lines regarding their metastatic abilities and to investigate whether oncolytic vaccinia viruses are useful therapy options. The cell lines used were the human cervical cancer cell line C33A implanted into immune-compromised mice and the murine melanoma cell line B16F10, implanted into immune-competent mice.
The initial point of the investigations was the observation of enlarged lumbar und renal lymph nodes in C33A tumor-bearing mice 35 days post implantation of C33A cells subcutaneously into immune-compromised nude mice. Subsequently, the presence of human cells in enlarged lymph nodes was demonstrated by RT-PCR. To facilitate the monitoring of cancer cell spreading, the gene encoding for RFP was inserted into the genome of C33A cells. In cell culture experiments, it was possible to demonstrate that this insertion did not negatively affect the susceptibility of the cells to virus infection, replication and virus-mediated cell lysis. The analysis of the metastatic process in a xenografted mouse model revealed the continuous progression of lumbar (LN) and renal (RN) lymph node metastasis after C33A-RFP tumor cell implantation. The lymph node volume and the amount of RFP-positive LNs and RNs was increasing from week to week in accordance with the gain of the primary tumor volume. Moreover, the metastatic spread of cancer cells in lymph vessels between lumbar and renal lymph nodes was visualized. Additionally, the haematogenous way of cancer cell migration was demonstrated by RFP positive cancer cells in blood vessels. The haematogenous route of spreading was confirmed by detecting micrometastases in lungs of tumor bearing mice. 
The next step was to investigate whether the recombinant oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 is a suitable candidate to cure the primary tumor and metastases. Therefore, GLV-1h68 was systemically injected into C33A-RFP tumor bearing mice 21 days after tumor cell implantation. It was demonstrated that the volume of the primary tumor was drastically reduced, and the volume and the amount of RFP positive lumbar and renal lymph nodes were significantly decreasing compared to the untreated control group. Subsequently, this process was analyzed further by investigating the colonization pattern in the C33A-RFP model. It was shown that first the primary tumor was colonized with highest detectable virus levels, followed by LN and RN lymph nodes. Histological analyses revealed the proliferative status of tumor cells in the tumor and lymph nodes, the amount of different immune cell populations and the vascular permeability in primary tumors and lymph nodes having an influence on the colonization pattern of the virus. Whereby, the vascular permeability seems to have a crucial impact on the preferential colonization of tumors compared to lymph node metastases in this tumor model. 
C33A turned out to be a useful model to study the formation and therapy of metastases. However, a metastatic model in which the influence of the immune system on tumors and especially on tumor therapy can be analyzed would be preferable. Therefore, the aim of the second part was to establish a syngeneic metastatic mouse model.
Accordingly, the murine melanoma cell line B16F10 was analyzed in immunocompetent mice. First, the highly attenuated GLV 1h68 virus was compared to its parental strain LIVP 1.1.1 concerning infection, replication and cell lysis efficacy in cell culture. LIVP 1.1.1 was more efficient than GLV-1h68 and was subsequently used for following mouse studies. Comparative studies were performed, comparing two different implantation sites of the tumor cells, subcutaneously and footpad, and two different mouse strains, FoxN1 nude and C57BL/6 mice. Implantation into the footpad led to a higher metastatic burden in lymph nodes compared to the subcutaneous implantation site. Finally, the model of choice was the implantation of B16F10 into the footpad of immune-competent C57BL/6 mice. Furthermore, it was inevitable to deliver the virus as efficient as possible to the tumor and metastases. Comparison of two different injection routes, intravenously and intratumorally, revealed, that the optimal injection route was intratumorally. In summary, the murine B16F10 model is a promising model to study the effects of the immune system on vaccinia virus mediated therapy of primary tumors and metastases.
N2  - Weltweit ist Krebs eine der häufigsten Todesursachen des Menschen. Allerdings wird angenommen, dass ca. 90 % dieser Todesfälle nicht auf den Primärtumor zurückzuführen sind, sondern durch den direkten und indirekten Einfluss von Metastasen verursacht werden. Deshalb ist es wichtig, eine Therapieform zu wählen, die sowohl den Primärtumor als auch Metastasen bekämpft. Bei den derzeit eingesetzten Behandlungsmethoden für Metastasen handelt es sich weitestgehend um die gleichen Therapieformen die auch zur Bekämpfung des Primärtumors eingesetzt werden. Allerdings unterscheiden sich Primärtumor und Metastasen häufig in ihren Eigenschaften, weshalb die Therapie oft keinen Erfolg bei Metastasen zeigt und im schlimmsten Fall sogar deren Neubildung und Wachstum fördern kann. Deswegen ist es von immenser Bedeutung, neue Therapieformen zu entwickeln, die speziell auch auf die Wirksamkeit gegen Metastasen zugeschnitten sind. Eine vielversprechende Möglichkeit hierfür stellt die onkolytische Virustherapie dar.
Das Hauptziel dieser Arbeit war es, zwei verschiedene Tumorzelllinien hinsichtlich ihrer metastatischen Fähigkeiten zu untersuchen und anschließend zu überprüfen, ob onkolytische Vaccinia Viren zur Therapie dieser Metastasen beitragen können. Bei den hierfür untersuchten Zelllinien handelte es sich um die menschliche Zervixkarzinomzelllinie C33A, implantiert in immunsupprimierte Mäuse und um die murine Melanomzelllinie B16F10, implantiert in immunkompetente Mäuse.
Ausgangspunkt der Untersuchungen im ersten Teil der Arbeit, bildete die Beobachtung, dass nach der subkutanen Implantation von C33A-Zellen in die abdominale Flanke von immunsupprimierten Nacktmäusen die lumbalen und renalen Lymphknoten der tumortragenden Mäuse vergrößert waren. Die Untersuchung dieser vergrößerten Lymphknoten mittels RT-PCR, unter zu Hilfenahme von spezifischen Primern für humanes β-Aktin, wies tatsächlich humane Zellen in allen lumbalen und der Hälfte der renalen Lymphknoten nach. Darum sollte im nächsten Schritt das metastatische Verhalten dieser Zellen genauer untersucht werden. Hierfür wurde mittels lentiviraler Transduktion, das für das rotfluoreszierende Protein kodierende Gen in C33A-Zellen integriert. In Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass die Insertion sich nicht negativ auf die Infektion, Replikation und Zelllyse der Viren auswirkte. Anschließende Mausexperimente zeigten den Verlauf der Metastasierung der lumbalen und renalen Lymphknoten. Sowohl das Volumen als auch die Anzahl an RFP positiven Lymphknoten nahm nach Implantation von Woche zu Woche zu und korrelierte mit der Zunahme des Primärtumorvolumens. Darüber hinaus konnte die Migration der Tumorzellen in Lymphgefäßen zwischen dem lumbalen und renalem Lymphknotenpaar mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Zusätzlich konnte die Metastasierung über die Blutbahn nachgewiesen werden, da sich RFP positive Zellen in dem Blutgefäß neben dem Lymphgefäß, das die lumbalen und renalen Lymphknoten miteinander verbindet, befanden. Die hämatogene Verbreitung wurde auch dadurch bestätigt, dass in den Lungen der tumortragenden Mäuse Mikrometastasen detektiert werden konnten.
Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob das rekombinante Vaccinia Virus GLV-1h68 in der Lage ist, nicht nur den primären Tumor zu bekämpfen, sondern auch Metastasen. Dafür wurde tumortragenden Mäusen systemisch eine einzelne Dosis GLV-1h68 21 Tage nach Tumorzellimplantation injiziert. Daraufhin reduzierte sich nicht nur das Volumen des Primärtumors innerhalb von weiteren 21 Tagen auf die Ausgangsgröße, sondern auch das Volumen und die Anzahl der RFP positiven lumbalen und renalen Lymphknoten nahm ab, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Analyse der Kolonisierungsdynamik von Primärtumor und  Metastasen durch GLV 1h68 zeigte, dass zuerst der Primärtumor kolonisiert wurde, gefolgt von LN und RN. Des Weiteren war der virale Titer in Tumoren zu jedem Zeitpunkt höher als in den metastasierten Lymphknoten. Histologische Untersuchungen des tumorösen Gewebes zeigten, dass der proliferative Status der Tumorzellen, die Menge verschiedener Immunzellpopulationen und die vaskuläre Permeabilität einen Einfluss auf die Kolonisierung durch GLV-1h68 haben. Dabei wird angenommen, dass vor allem die vaskuläre Permeabilität den größten Einfluss auf die Kolonisierungsreihenfolge hat. 
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass C33A ein hilfreiches Model ist, um die Bildung von Metastasen sowie die onkolytische Virustherapie dieser in einem immunsupprimierten Model zu untersuchen. Aus klinischer Sicht allerdings wäre es wünschenswert, ein Model zu haben, in dem auch der Einfluss des Immunsystems auf die Tumortherapie untersucht werden kann. Deswegen war das Ziel im zweiten Teil der Arbeit die murine Melanomazelllinie B16F10 im immunkompetenten Mausmodell als metastatisches System zu etablieren. Als erstes wurde in Zellkulturexperimenten überprüft, wie geeignet GLV-1h68 ist, um die murinen Zellen zu infizieren, in ihnen zu replizieren und sie anschließend zu lysieren und mit dem parentalen Virus LIVP 1.1.1 verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass LIVP 1.1.1 effizienter und geeigneter ist als GLV-1h68. Deswegen wurde in weiteren Versuchen das parentale Virus LIVP 1.1.1 verwendet. Bevor diese Experimente durchgeführt wurden, wurden Studien durchgeführt, bei denen 2 verschiedene Implantationsstellen, subkutan und in die Fußsohle, und 2 verschiedene Mausstämme, FoxN1 nude und C57BL/6,  verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass nach Implantation in die Fußsohle mehr Lymphknotenmetastasen entstanden als nach subkutaner Implantation. Im weiteren Verlauf wurde die Implantation von B16F10 Zellen in die Fußsohle von C57BL/6 Mäusen bevorzugt, um eine verlässliches Metastasenmodel zu generieren. Im Folgenden wurden zwei verschiedene Injektionswege untersucht, intravenös und intratumoral, wobei sich die intratumoral Injektion als geeigneter erwies, um effizient so viel Virus wie möglich in Tumore und Metastasen zu bringen. Generell handelt es sich hierbei um ein geeignetes Model, um die Wirkungen des Immunsystems auf Vaccinia Virus vermittelte Therapie von Primärtumor und Lymphknotenmetastasen zu untersuchen.
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Metastase
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - onkolytische Virustherapie
KW  - oncolytic virus therapy
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118530
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kierstein, Katharina
T1  - Postoperative Morbidität und Überleben nach laserchirurgischer pulmonaler Metastasenresektion
T1  - Postoperative morbidity and overall survival after laser surgery for pulmonary metastasectomy
N2  - Hintergrund und Zielsetzung:
Eine zunehmende Anzahl von Studien belegt, dass Patienten mit pulmonaler Metastasierung extrathorakaler Tumore von einer chirurgischen Sanierung profitieren. Dabei werden bevorzugt nicht anatomische, Gewebe sparende Resektionen der suspekten Herde durchgeführt.
Ziel dieser Arbeit war es, die Eigenschaften der laserchirurgischen Technik bei atypischen Keilresektionen zu analysieren sowie Langzeitergebnisse und Vor- oder Nachteile bezüglich Überleben und Morbidität gegenüber konventionellen Techniken zu untersuchen. 

Methoden
Im Zeitraum von Juni 2006 bis Dezember 2010 wurden an der Universitätsklinik Würzburg mit Hilfe eines Martin® Nd:YAG MY40 1.3 Lasers 115 atypische Keilresektionen bei 82 Patienten mit pulmonalen Metastasen durchgeführt. Insgesamt wurden 507 suspekte Rundherde entfernt, im Durchschnitt 4 Herde pro Patient. 
Retrospektiv wurden die Morbidität und die Komplikationsraten in diesem Kollektiv untersucht sowie die Überlebenszeitanalyse anhand der Kaplan-Meier-Methode durchgeführt. Der Beobachtungszeitraum betrug 3 bis 7 Jahre. 

Ergebnisse
Eine komplette Resektion (Resektionsgrad R0) wurde in 86,7% der Fälle pathologisch bestätigt, bei 9,9% der Patienten zeigte sich ein maligner Lymphknotenbefall. 
Die 1-, 3- und 5-Jahres Überlebensraten im Gesamtkollektiv betrugen 78,9%, 62,7% und 46,3%, wobei das Überleben nach kompletter Resektion deutlich besser war als nach R1- oder R2- Resektion (54,3% vs 16,7% nach 5 Jahren). Prognostisch günstig zeigte sich das Vorhandensein einer singulären Metastase im Vergleich zu einem multiplen Befall. Es gab keinen Überlebensvorteil bei Patienten mit 2-3 oder 4-10 Metastasen (31% vs 37% nach 5 Jahren). Die Komplikationsrate war mit 14,6% ähnlich wie bei konventionellen Techniken ohne schwerwiegende Vorfälle. Postoperativ schätzten nachsorgende Fachärzte die Lebensqualität und Lungenfunktion der Patienten zum Großteil als gut bis sehr gut ein. 

Zusammenfassung
Die Laserchirurgie zeigt sich als schonende und komplikationsarme, dabei präzise und effektive Technik bei der Entfernung von Lungenmetastasen. Das 5–Jahres–Überleben in Würzburg war im Vergleich zu historischen Kollektiven von Patienten nach atypischer Keilresektion in konventioneller Staplertechnik signifikant höher. Vor allem Patienten mit multiplem oder rezidivierendem Befall profitieren von der Lasertechnik.
N2  - Objective:
Recent studies confirm, that patients suffering from extrathoracic tumors with metastasis to the lung benefit from a surgical therapy, preferably in the form of non-anatomical pulmonary wedge resections.
The aim of this study was to analyse the benefits and disadvantages of the increasingly popular lasersurgical technique and to examine, if any impact on survival can be noted in comparison to conventional techniques like resection with a surgical stapler.

Patients and methods:
Between June 2006 and Dezember 2010, 82 patients underwent a total of 115 pulmonary metastasectomies at the University clinic of Würzburg. All resections were performed using a Martin® Nd:YAG MY40 1.3 laser. A total of 507 nodules has been removed, with an average of 4 nodules per patient. 
In a retrospective analysis the morbdity and complication rates have been investigated, as well as the overall survival in comparison to historical collectives. The follow-up period ranged between 3 to 7 years. 

Results:
Complete resections have been achieved in 86,7%, the pathological examination comfirmed lymph node involvement in 9,9%.
The 1-, 3- and 5-years Kaplan-Meier survival rates (Kaplan-Meier) were 78,9%, 62,7% and 46,3% respectivly. The 5-year survival after R0-resection was significantly higher than after incomplete resections (54,3% vs 16,7%). 
The presence of singular metastasis was found to be an independent prognostic factor. No difference in survival has been noted comparing patients with 2-3 malign lesions to patients with 4-10 lesions (31% vs 37% after 5 years).
Considering the total complication rate of 14,6% laser surgery seems comparable to stapler resection in that regard. No major complications have occured. The postoperative quality of living and lung function were considered „good“ or „very good“ in the majority of cases.

Conclusion:
Laser surgery seems to be a tissue sparing, accurate and effective resection technique for pulmonary metastasis with less morbidity. The 5-year survival in Würzburg was significantly higher when compared to other collectives consisting of patients resected with the stapler. Especially patients with multiple lesions or recurrent disease benefit from laser surgery.
KW  - Laserchirurgie
KW  - pulmonal
KW  - Metastase
KW  - Nd:YAG 1318nm
KW  - Metastasektomie
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137888
ER  -