TY - THES A1 - Ramachandran, Sarada Devi T1 - Development Of Three-Dimensional Liver Models For Drug Development And Therapeutical Applications T1 - Entwicklung eines dreidimensionalen Lebermodels für Wirkstoffentwicklung und therapeutische Anwendungen N2 - Primary human liver cells such as hepatocytes when isolated and cultured in 2D monolayers, de-differentiate and lose their phenotypic characteristics. In order to maintain the typical polygonal shape of the hepatocytes and their polarization with respect to the neighbouring cells and extra cellular matrix (ECM), it is essential to culture the cells in a three-dimensional (3D) environment. There are numerous culturing techniques available to retain the 3D organization including culturing hepatocytes between two layers of collagen and/or MatrigelTM (Moghe et al. 1997) or in 3D scaffolds (Burkard et al. 2012). In this thesis, three different 3D hepatic models were investigated. 1. To reflect the in vivo situation, the hepatocytes were cultured in 3D synthetic scaffolds called Mimetix®. These were generated using an electrospinning technique using biodegradable polymers. The scaffolds were modified to increase the pore size to achieve an optimal cell function and penetration into the scaffolds, which is needed for good cell-cell contact and to retain long-term phenotypic functions. Different fibre diameters, and scaffold thicknesses were analyzed using upcyte® hepatocytes. The performance of upcyte® hepatocytes in 3D scaffolds was determined by measuring metabolic functions such as cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) and MTS metabolism. 2. Apart from maintaining the hepatocytes in 3D orientation, co-culturing the hepatocytes with other non-parenchymal cell types, such as liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and mesenchymal stem cells (MSCs), better reflects the complexity of the liver. Three different upcyte® cell types namely, hepatocytes, LSECs and MSCs, were used to generated 3D liver organoids. The liver organoids were generated and cultured in static and dynamic conditions. Dynamic conditions using Quasi-vivo® chambers were used to reflect the in vivo blood flow. After culturing the cells for 10 days, the structural orientation of cells within the organoids was analyzed. Functional integrity was investigated by measuring CYP3A4 activities. The organoids were further characterized using in situ hybridization for the expression of functional genes, albumin and enzymes regulating glutamine and glucose levels. 3. An ex vivo bioreactor employing a decellularized organic scaffold called a “Biological Vascularized Scaffold” (BioVaSc) was established. Jejunum of the small intestine from pigs was chemically decellularized by retaining the vascular system. The vascular tree of the BioVaSc was repopulated with upcyte® microvascular endothelial cells (mvECs). The lumen of the BioVaSc was then used to culture the liver organoids generated using upcyte® hepatocytes, LSECs and MSCs. The structural organisation of the cells within the organoids was visualized using cell-specific immunohistochemical stainings. The performance of liver organoids in the BioVaSc was determined according to metabolic functions (CYP3A4 activities). This thesis also addresses how in vitro models can be optimized and then applied to drug development and therapy. A comprehensive evaluation was conducted to investigate the application of second-generation upcyte® hepatocytes from 4 donors for inhibition and induction assays, using a selection of reference inhibitors and inducers, under optimized culture conditions. CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 were reproducibly inhibited in a concentration-dependent manner and the calculated IC50 values for each compound correctly classified them as potent inhibitors. Upcyte® hepatocytes were responsive to prototypical CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 inducers, confirming that they have functional AhR, CAR and PXR mediated CYP regulation. A panel of 11 inducers classified as potent, moderate or non-inducers of CYP3A4 and CYP2B6 were tested. Three different predictive models for CYP3A4 induction, namely the Relative Induction Score (RIS), AUCu/F2 and Cmax,u/Ind50 were analyzed. In addition, PXR (rifampicin) and CAR-selective (carbamazepine and phenytoin) inducers of CYP3A4 and CYP2B6 induction, respectively, were also demonstrated. Haemophilia A occurs due to lack of functional Factor VIII (FVIII) protein in the blood. Different types of cells from hepatic and extrahepatic origin produce FVIII. Supernatants harvested from primary LSECs were evaluated for the presence of secreted functional FVIII. In order to increase the FVIII production, different upcyte® endothelial cells such as blood outgrowth endothelial cells (BOECs), LSECs and mvECs were transduced with lentiviral particles carrying a FVIII transgene. Also, to reflect a more native situation, primary mvECs were selected and modified by transducing them with FVIII lentivirus and investigated as a potential method for generating this coagulation factor. N2 - Primäre humane Leberzellen wie beispielsweise Hepatozyten de-differenzieren und verlieren ihre phänotypischen Eigenschaften, wenn man sie isoliert und in 2D Monoschicht kultiviert. Um die typische, polygonale Form der Hepatozyten und ihre Polarisation gegenüber den benachbarten Zellen und der extrazellulären Matrix (EZM) zu erhalten, ist es essentiell die Zellen in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu kultivieren. Es sind zahlreiche Techniken verfügbar, um die 3D-Organisation zu erhalten wie beispielsweise die Kultur von Hepatozyten zwischen zwei Schichten von Kollagen und/oder MatrigelTM (Moghe et al. 1997) oder in einem 3D Gerüst (Burkard et al. 2012). In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene, hepatische 3D Modelle untersucht. 1. Um die in vivo Situation widerzuspiegeln, wurden die Hepatozyten in einer synthetischen 3D Matrix namens Mimetix® kultiviert. Diese wurde aus biologisch abbaubaren Polymeren elektrogesponnen. Die Matrix wurde modifiziert indem die Poren vergrößert wurden, um eine optimale Besiedlung des Zellgerüsts und dadurch eine gesteigerte Zellfunktionalität zu erreichen. Dies wird sowohl für die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten wie auch für den Erhalt der phänotypischen Funktionen über einen längeren Zeitraum hin benötigt. Unterschiedliche Faserdurchmesser und Matrixschichtdicken wurden mittels upcyte® Hepatozyten analysiert. Die Leistungsfähigkeit der upcyte® Hepatozyten wurde durch die Messung metabolischer Funktionen bestimmt, wie beispielsweise Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) und MTS Metabolismus. 2. Abgesehen vom Erhalt der 3D Orientierung der Hepatozyten, hilft eine Ko-Kultur der Hepatozyten mit anderen nicht-parenchymalen Zelltypen wie beispielsweise leber-sinusoidalen Endothelzellen (LSECs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) die Komplexität der Leber darzustellen. Drei unterschiedliche upcyte® Zelltypen, das heißt Hepatozyten, LSECs und MSCs wurden eingesetzt, um 3D Leberorganoide zu generieren. Die Leberorganoide wurden in statischen Zellkulturbedingungen generiert und dynamischen Bedingungen kultiviert. Durch den Quasi-vivo Bioreaktor als dynamisches Zellkultursystem wurde der Blutstrom in vivo widergespiegelt. Nach einer Kulturdauer von 10 Tagen wurde die strukturelle Organisation der Zellen innerhalb der Organoide analysiert. Die Funktionalität wurde durch Messungen der CYP3A4 Enzymaktivitäten untersucht. Darüber hinaus wurden die Organoide mittels in situ Hybridisierung auf die Expression von funktionalen Genen, Albumin sowie Glutamin- und Glukose-regulierende Enzyme hin analysiert. 3. Es wurde ein ex vivo Bioreaktor etabliert, dessen Grundlage ein dezellularisiertes Zellgerüst namens ‚Biological Vascularized Scaffold‘ (BioVaSc) bildet. Hierfür wurde das Jejunum vom Dünndarm des Hausschweins chemisch dezellularisiert, wobei gleichzeitig das vaskuläre System erhalten wurde. Dieses Gefäßsystem wurde dann mit upcyte® humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMECs) besiedelt. Das Lumen der BioVaSc wurde anschließend benutzt, um darin die Leberorganoide, die aus den upcyte® Hepatozyten, LSECs und MSCs generiert wurden, zu kultivieren. Die strukturelle Organisation der Zellen innerhalb der Organoide wurde mittels zell-spezifischer, immunhistochemischer Färbungen visualisiert. Die Funktionalität der Leberorganoide in der BioVaSc wurde anhand von metabolischer Aktivität (CYP3A4 Enzymaktivität) bestimmt. Diese Arbeit beschäftigt sich auch mit der Fragestellung, wie in vitro Modelle optimiert werden können, um sie schlussendlich für die Wirkstoffentwicklung aber auch zelltherapeutische Anwendungen einsetzen zu können. Eine umfassende Untersuchung wurde durchgeführt, um zu untersuchen inwiefern 4 Donoren der zweiten upcyte® Hepatozyten Generation für Inhibitions- und Induktionsstudien geeignet sind. Hierfür wurde eine Auswahl an Referenzinhibitoren und – induktoren unter optimierten Kulturbedingungen eingesetzt. CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 konnten durch den Einsatz von Inhibitoren reproduzierbar, konzentrationsabhängig inhibiert werden und die berechneten IC50-Werte klassifizierte jede Substanz korrekt als potenten Inhibitor. Upcyte® Hepatozyten reagierten auf proto-typische CYP1A2-, CYP2B6-, CYP2C9- und CYP3A4-Induktoren, wodurch eine funktionale AhR-, CAR- und PXR-vermittelte Regulation der jeweiligen CYP Enzymaktivität bestätigt werden konnte. Eine Sammlung von 11 Induktoren, die für CYP2B6 sowie CYP3A4 als potent, moderat potent und nicht potent klassifiziert sind wurden analysiert. Drei unterschiedliche Vorhersage-Modelle für die Induktion von CYP3A4 wurden analysiert, der (I) ‚Relative Induction Score (RIS), (II) AUCu/F2 und (III) Cmax,u. Darüber hinaus wurden PXR-selektive (Rifampicin) und CAR-selektive (Carbamazepin und Phenytoin) Induktoren für eine CYP3A4- und CYP2B6-Induktion gezeigt. Hämophilie A tritt aufgrund eines Mangels an funktionalem Faktor VIII protein (FVIII) im Blut auf. Verschiedene Zelltypen hepatischen und extra-hepatischen Ursprungs produzieren FVIII. Zellkulturüberstände von primären LSECs wurden abgenommen und hinsichtlich des Vorhandenseins von sekretiertem FVIII untersucht. Um die FVIII-Produktion zu steigern, wurden unterschiedliche upcyte® Endothelzellen, wie beispielsweise ‚blood outgrowth endothelial cells‘ (BOECs), LSECs und HDMECs, mit lentiviralen Partikeln, die ein FVIII Transgen tragen transduziert. Um eine nativere Situation widerzuspiegeln, wurden primäre HDMECs ausgewählt, um sie mittels Transduktion von FVIII lentiviralen Partikeln zu modifizieren, zu selektionieren und im Anschluss hinsichtlich ihres Potentials zur Bildung des Koagulationsfaktors FVIII zu untersuchen. KW - 3-D liver model KW - drug development KW - Therapeutical application KW - Leberepithelzelle KW - Dimension 3 KW - Zellkultur Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113155 ER - TY - THES A1 - Reuter, Miriam T1 - Der Einfluss des Multityrosinkinaseinhibitors Sunitinib auf die Proliferation und Steroidbiosynthese von Nebennierenkarzinomzellen in vitro T1 - Influence of Multi-Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib on Proliferation and Steroidogenesis of Adrenocortical Cancer Cells in vitro N2 - Tyrosinkinaseinhibitoren nehmen in der modernen Onkologie einen wachsenden Stellenwert ein. Sunitinib wirkt als Multityrosinkinaseinhibitor einerseits antiangiogenetisch, andererseits auch direkt antiproliferativ auf Tumorzellen. Im Tierversuch sind unter Sunitinib adrenotoxische Wirkungen beschrieben. Für das Nebennierenkarzinom, eine sehr seltene Tumorerkrankung mit schlechter Prognose, werden dringend neue Therapieoptionen benötigt. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Sunitinib auf die Proliferation von Nebennierenkarzinomzellen in vitro und auf deren Steroidbiosynthese untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Sunitinib dosisabhängig auf die beiden Nebennierenkarzinomzelllinien NCI-h295(R) und SW-13 antiproliferativ wirkt (SW-13: unter 0,1 µM Sunitinib 96 ± 7 %; 1 µM 90 ± 9 %*; 5 µM 62 ± 6 %*, Kontrollen 100 ± 9 %, ab 1 µM p<0,05). Steroidanalysen in den Zellkulturüberständen von NCI-h295-Zellen mittels Isotopenverdünnungs-/Gaschromatographie-Massenspektrometrie belegen eine Abnahme der Cortisolsekretion (1 μM 90,1 ± 1,5 %*, 5 μM 57,2 ± 0,3 %*, Kontrollen 100 ± 2,4 %), während bestimmte Vorläuferhormone akkumulieren. Der beobachtete Anstieg der Quotienten von 17-OH-Pregnenolon zu 17-OH-Progesteron und DHEA zu Androstendion belegt eine partielle Hemmung der Steroidsynthese auf Ebene der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (HSD3B2). Nachdem eine direkte Hemmung des Enzyms HSD3B2 mittels Hefe-Mikrosomen-Assay ausgeschlossen werden konnte, bestätigte sich auf RNA- mittels Real-Time-PCR und Proteinebene mittels Western Blot eine dosisabhängige Hemmung der Transkription und Translation des Enzyms (mRNA: 1 μM 47 ± 7 %*; 5 μM 33 ± 7 %*; 10 μM 27 ± 6 %*; Protein: 1 μM 82 ± 8 %; 5 μM 63 ± 8 %*; 10 μM 55 ± 9 %*). Auch für CYP11B1 zeigte sich eine dosisabhängige Transkriptionshemmung durch Sunitinib, andere Enzyme wie CYP11A1 dagegen werden nicht beeinflusst. Wenn sich diese in vitro Effekte bei Patienten unter Sunitinib-Therapie bestätigen sollten, könnte es bei einzelnen Patienten zu einer klinisch relevanten Nebenniereninsuffizienz kommen. Eine eindeutige Wirksamkeit von Sunitinib als Therapieoption beim Nebennierenkarzinom konnte im Rahmen der SIRAC-Studie nicht bestätigt werden. Hier ist jedoch anzumerken, dass wahrscheinlich eine gravierende Medikamenteninteraktion mit Mitotane zu einer Reduktion des Effekts von Sunitinib beigetragen hat. N2 - Tyrosine kinase inhibitors are commonly used in modern oncology. Sunitinib as a multi tyrosine kinase inhibitor has antiangiogenetic but also direct anti-tumor activity. Animal experiments pointed to an adrenotoxic effect of sunitinib. New therapies are urgently needed in treatment of advanced adrenocortical cancer. Therefore the effect of sunitinib on proliferation and steroidogenesis was examined in this work. Sunitinib reduced dose-dependently cell viability of both NCI-H295 and SW13 cells (SW13: 0.1 μM 96 ± 7%, 1 μM 90 ± 9%*, 5 μM 62 ± 6%*, controls 100 ± 9%; *p < 0.05). To determine sunitinib effects on steroidogenesis, we measured steroid hormones in cell culture supernatant by gas chromatography-mass spectrometry. We observed a pronounced decrease of cortisol secretion (1 μM 90.1 ± 1.5%*, 5 μM 57.2 ± 0.3%*, controls 100 ± 2.4%) and a concomitant increase in the 17-hydroxypregnenolone/17-hydroxyprogesterone and DHEA/4-androstenedione ratios, indicating specific inhibition of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3B2). In yeast microsome assay, no direct inhibition of HSD3B2 by sunitinib was detected. Sunitinib induced down-regulation of HSD3B2 mRNA and protein in NCI-H295 cells (mRNA: 1 μM 47 ± 7%*; 5 μM 33 ± 7%*; 10 μM 27 ± 6%*; protein: 1 μM 82 ± 8%; 5 μM 63 ± 8%*; 10 μM 55 ± 9%*). CYP11B1 was down-regulated at mRNA but not at protein level while CYP11A1 remained unchanged. If these in vitro effects prove true in vivo, it seems possible that several patients with sunitinib therapy may suffer from clinical relevant adrenal insufficiency as adverse effect. The SIRAC study could not confirm a definitely efficacy of sunitinib in adrenocortical cancer, probably due to a relevant drug interaction between mitotane and sunitinib. KW - Nebennierenrindenkarzinom KW - Sunitinib KW - Zellkultur KW - Steroidogenese KW - Tyrosinkinaseinhibitor KW - HSD3B2 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-129537 ER - TY - THES A1 - Bellwon, Patricia T1 - Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing T1 - Evaluierung der Kinetik anhand von in vitro Systemen - Ein Beitrag um die Anzahl von Tierversuchen zur Toxizitätsprüfung zu reduzieren N2 - The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling. This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day. Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors. Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling. Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions. Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo. Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies. N2 - Die Erlassung von Richtlinien und Verordnungen durch die EU führte zu der Entwicklung von alternativen Testmethoden als Ersatz von Tierversuchen zur Risikobewertung von Xenobiotika. Des Weiteren weisen hohe Ausfallraten von Arzneimitteln in der späten Entwicklungsphase auf die Notwendigkeit hin, die bisher verwendeten Testmethoden der präklinischen Phase zu verbessern. Diese Punkte wurden in dem im siebten Rahmenprogramm der EU finanzierten Projekt „Predict-IV“ aufgegriffen. Ziel des Projektes war es, die Vorhersage der Arzneimittelsicherheit durch integrierte „omics“-Technologien, angewendet an etablierten in vitro Ansätzen, zu verbessern. Dabei standen drei Zielorgane bzgl. Arzneimittel-induzierter Organtoxizität im Mittelpunkt: Leber, Niere und zentrales Nervensystem, die jeweils durch Zelllinien oder primäre Zellen vertreten waren. Um die in vitro generierten Dynamik-Daten mit der in vivo Situation in Korrelation zu bringen, muss die Kinetik der Testsubstanz berücksichtigt und die Ergebnisse mit Hilfe von physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung extrapoliert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Kinetik-Daten der gewählten Testsubstanzen (Cyclosporin A, Adefovir dipivoxil und Cisplatin) in vitro zu erheben und bzgl. ihrer Zuverlässigkeit sowie ihrer Relevanz verglichen mit in vivo Daten zu beurteilen. Hierfür wurden kultivierte Zellen täglich bzw. jeden zweiten Tag für zwei Wochen mit zwei verschiedenen Konzentrationen (toxisch und nicht toxisch) des Arzneimittels behandelt. Der Gehalt des applizierten Arzneimittels oder die Hauptmetaboliten wurden mittels LC MS/MS oder ICP-MS in Vehikel, Medium und Zellen sowie die vom Plastik adsorbierte Menge in Proben bestimmt, die am ersten und letzten Behandlungstag zu fünf unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurden. Eine eindeutige Bioakkumulation von Cyclosporin A wurde in primären Rattenhepatozyten nach Behandlung mit der hohen Konzentration festgestellt. Eine effiziente CYP3A4- und CYP3A5-vermittelte Biotransformation von Cyclosporin A wurde für primäre humane Hepatozyten sowie HepaRG Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmten mit der in vivo Situation überein. Ratten sind aufgrund ihrer geringen CYP3A Aktivität schlechte Tiermodelle für CYP3A-Biotransformationsstudien. Des Weiteren wurden Interassay-Schwankungen bei primären human Hepatozyten bemerkt, die auf die biologische Variabilität der CYP3A4- sowie CYP3A5-Aktivität zwischen den menschlichen Spendern zurückzuführen sind. Rattenhepatozyten und HepaRG Zellen hingegen wiesen Interassay-Schwankungen auf, die durch unterschiedliche Cyclosporin A Behandlungskonzentrationen zwischen den Replikaten verursacht wurden. Die Cyclosporin A Biotransformation war in HepaRG Zellen am stärksten ausgeprägt, was durch stabile und wesentlich höhere CYP3A4- und CYP3A5-Aktivität in HepaRG Zellen zu erklären ist. Zusätzlich wurden die in vitro Clearance-Werte bestimmt und auf in vivo Clearance-Werte extrapoliert. Alle extrapolierten Werte waren zu hoch geschätzt (primäre Rattenhepatozyten: 10fach, primäre human Hepatpzyten: 2fach, HepaRG Zellen: 2fach). Diese Ergebnisse sollten mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung sowie durch weitere Experimente überprüft werden, um zu ermitteln, ob diese hohen Schätzungen für jedes System konstant sind und somit durch die Einführung von weiteren Skalierungsfaktoren verringert werden können. Kultivierte Gehirnzellen, primäre Nervenzellkulturen der Kortex von Mäusen und primäre Hirnzellaggregate der Ratte, zeigten schnell erreichte Cyclosporin A Gleichgewichtskonzentrationen. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Verteilung von Cyclosporin A zwischen der wässrigen und organischen Phase hin, wobei biologische Prozesse nur eine untergeordnete Rolle spielen. Daher scheint die intrazelluläre Cyclosporin A Aufnahme Transporter-vermittelt zu sein. Ergebnisse der Transporter Experimente, die an einer künstlichen Membran und Caco-2 Zellen durchgeführt wurden, unterstützten diese Hypothese. Messungen der Plastikbindung von Cyclosporin A zeigten signifikante, aber für jedes Zellsystem unterschiedliche, Adsorptionsraten, die mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung berücksichtigt werden sollten. Die Kinetik von Adefovir dipivoxil machte auf die Nachteile von in vitro Versuchen aufmerksam. Für die intrazelluläre Aufnahme von Adefovir sind aktive Transportproteine nötig, die jedoch in der Nierenzelllinie RPTEC/TERT1 nicht funktionell vorhanden sind. Daher war die Aufnahme von Adefovir auf die passive Diffusion von Adefovir dipivoxil beschränkt, das aber auch zeitabhängig unter den experimentellen Konditionen zerfiel. Die an RPTEC/TERT1 Zellen untersuchte Kinetik von Cisplatin deutete auf eine intrazelluläre Platin-Anreicherung hin, die jedoch nicht in einer signifikanten Bioakkumulation resultierte. Möglicherweise sind innerhalb von 14 Tagen die Gleichgewichtskonzentrationen von Cisplatin noch nicht erreicht. Die Kinetikprofile von Cisplatin in Medium ließen einen aktiven, von der basolateralen zur apikalen Seite gerichteten Cisplatin Transport erkennen, wie schon in vivo beschrieben, wobei die Geschwindigkeit dieser Transportprozesse in vitro langsamer zu sein scheint als in der intakte Niere. Daher müssen die generierten Daten zur Schätzung von zellulären Prozessen modelliert werden, um durch anschließende Extrapolation mit in vivo Daten verglichen werden zu können. Abschließend bleibt zu sagen, dass das experimentelle Design vorteilhaft war. Wiederholte tägliche Administration von zwei unterschiedlichen Konzentrationen eines Medikaments ermöglichte die Erfassung von Bioakkumulation bei toxischen Konzentrationen sowie Biotransformation/Export bei nicht-toxischen Konzentrationen. Potenzielle Fehler, die zu einer Fehlinterpretation führen könnten, wurden durch die exakte Bestimmung der tatsächlich applizierten Arzneimittelmenge reduziert, da nicht immer die applizierte Konzentration mit der Nominalkonzentration übereinstimmt. Darüber hinaus erwies es sich als Vorteil, die Arzneimittelkonzentrationen in den einzelnen Kompartimenten (Medium, Zellen und Plastik) zu bestimmen. Somit konnten zum einen Erkenntnisse über die Verteilung der Substanz gewonnen werden und zum anderen Fehleinschätzungen von zellulären Prozessen, z.B. Biotransformation, verhindert werden, was letzten Endes bei die Interpretation von Kinetik-Daten behilflich ist. Jedoch, wurden auch die Grenzen von in vitro Ansätzen deutlich. Für eine korrekte Extrapolation ist es unverzichtbar, dass die untersuchten in vitro Systeme funktionierende Proteine aufweisen, die bei der untersuchten Arzneimittel-induzierten Toxizität eine Schlüsselrolle übernehmen. Abschließend kann festgehalten werden, dass es, unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile, von Nutzen sein kann diesen Versuchsansatz der Langzeitbehandlung zu validieren und darüber hinaus auf Co Kultursysteme sowie Organ-Chips anzuwenden hinsichtlich der Entwicklung von Alternativmethoden für Toxizitätsstudien bei wiederholter Gabe. KW - cell culture KW - pharmacokinetics KW - repeated dose KW - in vitro KW - toxicity testing KW - Zellkultur KW - In vitro KW - Pharmakokinetik KW - Toxizitätstest Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122693 ER -