TY - THES A1 - Förster, Sabrina T1 - Regulation des Kaliumausstroms im ABA- und Jasmonatvermittelten Stomaschluss T1 - Regulation of Potassium Efflux in the ABA- and Jasmonate-controlled Stomatal Closure N2 - Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden. N2 - Stomata are microscopically small pores in the leaf surface of land plants, through which the leaf tissue is supplied with CO2. To protect the plant from both desiccation and infection by pathogens, a mechanism evolved to adjust the pore width to the plant’s needs by movement of the surrounding guard cells. A dense signaling network controls these movements and is able to integrate external as well as internal stimuli. Stomatal closure is osmotically driven by the loss of turgor in guard cells caused by efflux of ions such as K+. In this work, we investigated the regulation by phosphorylation of the main K+ efflux channel for stomatal closure, GORK. The following results were obtained with electrophysiological measurements via the DEVC- technique: GORK is phosphorylated by OST1 in a Ca2+- independent and by CBL1/9-CIPK5 as well as CBL1-CIPK23 in a Ca2+-dependent manner. CBL1 anchors CIPK5 at the plasma membrane and must bind Ca2+ for activation of CIPK5. CIPK5 requires both ATP binding and a conformational change for phosphorylation of GORK. For the first time it was shown that the PP2C phosphatase ABI2 interacts directly with an ion channel and inhibits its activity. ABI2 also interacts with the kinases OST1, CIPK5 and CIPK23, implying a control by ABI2 over channel activity in multiple ways. OST1 and ABI2 link GORK regulation with the ABA signaling pathway. Guard cells of gork1-2, cbl1/cbl9 and cipk5-2 are insensitive to MeJA, but not to ABA. This represents a direct connection between JA signal transduction and Ca2+ signaling. In this work, further hints could be found for the complex interplay of the phytohormones ABA, JA and the effector Coronatine of Pseudomonas. Here it was shown for the first time that guard cells respond differently to MeJA and the phytotoxin Coronatine, based on incubation time. Depending on the temporal sequence of perception, ABA and Coronatine act antagonistically on the pore width. Jasmonate signal transduction in guard cells leads to a minor synthesis of ABA as well as protein degradation via the ubiquitin/ 26S proteasome system and initiates stomatal closure requiring ABA receptors (PYR/PYLs). This work describes the JA-controlled regulation of the potassium efflux channel GORK as well as some differential aspects of ABA, JA and Coronatine triggered stomatal movements. KW - Ackerschmalwand KW - Stomata KW - Arabidopsis thaliana KW - Phophorylierung KW - Phytohormon KW - Spaltöffnung KW - Kaliumkanal KW - Abscisinsäure KW - Jasmonsäure KW - Pflanzenhormon Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115455 ER - TY - THES A1 - Kollert, Sina T1 - Kaliumkanäle der K2P-Familie kontrollieren die Aktivität neuronaler Zellen - TRESK als Regulator inflammatorischer Hyperalgesie T1 - Potassium channels of the K2P-family control the activity of neuronal cells - TRESK as regulator of inflammatory hyperalgesia N2 - Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen. Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann. Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen. Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert. In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten. N2 - Pain sensation is essential for survival. Chronic pain lost its physiological function and is categorized as a disease. Pain sensation is initiated by nociception. The cell bodies of nociceptive neurons are located in dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia (TG). In DRG neurons TRESK two-pore-domain potassium channels (K2P) constitute the major current component of the standing outward current IKSO. A prominent physiological role of TRESK channels has been attributed to the regulation of pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. histamine, bradykinin, serotonin and lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociceptive signaling by activation of their G-protein coupled receptors (GPCR) or ionic channels. By means of RT-PCR and a newly developed antibody the co-expression of TRESK channels, channels of the transient-receptor-potential (TRP) cation channel family and LPA receptors in DRG neurons were demonstrated. Recombinant co-expression of TRESK channels and LPA2 receptors in Xenopus oocytes revealed an almost 10 fold activation of basal K+ currents upon LPA application with an EC50 of 0.2 µM LPA. Using mutant TRESK[PQAVAD] or application of the phospholipase C (PLC) inhibitor U73122 blocked current augmentation by LPA indicating cellular signaling via PLC pathway and calcineurin binding to TRESK channels. TRESK was the only member of the K2P family that showed a LPA induced activation of current. TREK- und TASK-1 currents were inhibited through LPA. In small diameter DRG neurons nociception results from TRPV1 channel activation by painful stimuli including the inflammatory substance LPA or activation of TRPA1 channels during inflammation. When TRESK and TRP channels are co-expressed in Xenopus oocytes cationic inward and outward currents were simultaneously activated by LPA. Under these conditions the reversal potential of ramp recordings was intermediate to recordings from oocytes expressing only the K+ or the unspecific cation channel. Principally this finding demonstrates that TRESK activation by an inflammatory substance dampens noxious excitation induced by the same agent. DRG-like F11 cells lacking endogenous TRESK channels generate action potential upon current stimulation. However when TRESK channels were recombinantly expressed in F11 cells, they exhibit a shift of the reversal potential to more negative values, a larger outward current and a loss of voltage-gated sodium currents. Accordingly, depolarizing pulses failed to elicit action potentials. In patch-clamp recordings from primary cultured DRG neurons of TRESK[wt] mice IKSO currents increased after application of LPA by over 20 % whereas under these conditions IKSO currents of neurons from TRESK[ko] mice decreased moderately by about 10 %. In TRPV1 positive neurons LPA application induced in TRESK[wt] neurons not only an activation of the IKSO but also an increase of the inward (TRPV1) current. In contrast, in TRESK[ko] neurons LPA only activated an inward (TRPV1) current. Under current-clamp conditions LPA application elicited spike trains in DRG neurons, with higher frequency in cells of TRESK[ko] mice than in cells of TRESK[wt] animals. In addition, upon depolarizing pulses (100 pA) excitability was differentially modulated by LPA in these genotypes. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. It is evident that the output of sensory neurons is strongly controlled by the activity and the expression of TRESK channels, which therefore are good candidates for the pharmacological treatment of pain disorders. KW - Kaliumkanal KW - Schmerz KW - Entzündungschmerz KW - Nozizeptor KW - Entzündung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119077 ER -