TY - THES A1 - Stark, Irmgard Katharina T1 - Einfluss von Interferon auf das Infektionsverhalten von Herpes simplex Virus 1 und seiner DUB - Mutante C65A in der Zellkultur T1 - The influence of interferon on infection of Herpes simplex Virus 1 and its DUB – mutant C65A in cell culture N2 - Die Erforschung viraler Proteine ist wichtig, um virale Infektionen besser verstehen und damit therapieren zu können. Die Aufklärung der DUB-Funktion auf dem viralen Herpesprotein pUL36 ermöglicht ein besseres Verständnis des Infektionshergangs und könnte zur Entwicklung eines Enzyminhibitors führen, der nur an diesem Enzym ansetzt, nachdem es sich von den zellulären DUBs unterscheidet (Kattenhorn et al., 2005). In dieser Arbeit konnten die vorherigen Daten, die eine stärkere Hemmung der DUB- Mutante unter Interferoneinfluss zeigten, in unterschiedlichen Assay-Designs bestätigt werden. Auch Versuche mit einem anderen Herpes simplex Virus Strang, bestätigten die vorherigen Daten. Die Ergebnisse zeigen, dass die DUB-Funktion für HSV-1 wichtig ist für die virale Evasion der zellulären Immunantwort. Die genaue Funktion der DUB in der Infektion ist jedoch unklar. Aufgrund der vorbestehenden Datenlage erschien am wahrscheinlichsten, dass die DUB-Funktion vor Eindringen des Herpes Simplex Virus in den Zellkern zum Tragen kommt, womit es nach Abnahme des Interferons nicht zu einer viralen Reaktivierung käme. Deshalb wurden Untersuchungen unternommen, um eine mögliche Reaktivierung nach Abnahme des Interferons näher zu untersuchen. Hierfür wurden zwei verschiedene Experimente entwickelt. Einmal wurde das Interferon direkt nach Infektion und einmal 3 Tage nach Infektion (3dpi) abgenommen. Die Ergebnisse zeigten beide eine stärkere Hemmung der DUB-HSV-1-Mutante unter Interferoneinfluss. Bei Abnahme des Interferons direkt nach Infektion lag bei Wildtyp und Mutante ein leichter Anstieg der Plaquezahlen vor, wobei dieser Effekt von der Dosis des Interferons abhängig war. Eine hohe Interferondosis begünstigte bei beiden eine stärkere Hemmung, allerdings bei beiden auch eine leichte Erhöhung der Plaquezahl nach Abnahme. Bei einer niedrigen Dosis konnte nur eine stärkere Hemmung der DUB-Mutante, jedoch keine Reaktivierung bei Wildtyp und Mutante nach Abnahme des Interferons gezeigt werden. Bei Abnahme drei Tage nach Infektion zeigte sich sowohl bei dem Wildtyp-Virus als auch der DUB- Mutante kein Anstieg in den Plaquezahlen. Es sind, nachdem Deubiquitinierung nicht nur eine Rolle in der Verhinderung des proteosomalen Abbaus von in die Zelle eingedrungenem Virus spielt, sondern auch der Zellregulation, mehrere Szenarien denkbar, die diesen Phänotyp erklären könnten. Die DUB-Funktion könnte zwar den proteosomalen Abbau durch Deubiqutinierung und damit Verhinderung der Markierung des Virus zum zellulären Abbau verhindern. Allerdings könnten sich durch einen langsameren Transport aus der Zelle oder in den Nucleus auch weniger Plaques bei der Mutante als wie beim Wildtyp unter Interferoneinfluss bilden, nachdem das Virus dann leichter Ziel antiviraler Proteine werden könnte. Oder die DUB-Funktion spielt eine Rolle beim Eintritt in den Kern durch Modifikationen anderer Proteine. Virengenome könnten auch durch eine fehlende DUB-Funktion reprimiert werden oder die Zelle durch Apoptose absterben. Interessanterweise konnte keine Hemmung der DUB-Mutante in Interferon behandelten U-2 OS Zellen gezeigt werden, von denen ein Defekt im STING- vermittelten Signalweg bekannt ist. Vielleicht zeigt dies, dass das STING-Protein an dem gezeigten DUB-Phänotyp beteiligt ist. Nachgewiesen ist außerdem bereits eine Funktion des Enzyms bei der zweiten Umhüllung der Kapside bei Pseudorabiesvirus (Möhl, 2011). Weitere Untersuchungen unter Einsatz bspw. von Immunfluoreszenz, Proteasominhibitoren oder weiteren Zelllinien wie Saos-2, sind nötig, um die genaue Funktion zu klären. N2 - The study of viral proteins is important to better understand and thus treat viral infections. Elucidation of DUB function on the viral herpes protein pUL36 provides a better understanding of the infection process and could lead to the development of an enzyme inhibitor that targets only this enzyme after it is different from cellular DUBs (Kattenhorn et al., 2005). In this work, previous data showing greater inhibition of the DUB- mutant under interferon influence were confirmed in different assay designs. Also, experiments with a different herpes simplex virus strand, confirmed the previous data. The results indicate that DUB function for HSV-1 is important for viral evasion of the cellular immune response. However, the exact function of DUB in infection is unclear. Based on the preexisting data, it seemed most likely that DUB function would come into play before herpes simplex virus enters the nucleus, which would mean that viral reactivation would not occur after interferon depletion. Therefore, studies were undertaken to further investigate a possible reactivation after decrease of interferon. Two different experiments were developed for this purpose. Once the interferon was withdrawn immediately after infection and once 3 days after infection (3dpi). The results both showed a stronger inhibition of the DUB-HSV-1 mutant under interferon influence. When interferon was decreased immediately after infection, a slight increase in plaque counts was present in both wild type and mutant, although this effect was dependent on the dose of interferon. A high dose of interferon promoted greater inhibition in both, but also a slight increase in plaque numbers after decrease in both. A low dose showed only greater inhibition of the DUB mutant but no reactivation in wild type and mutant after decrease of interferon. When decreased three days after infection, there was no increase in plaque counts for either the wild-type virus or the DUB- mutant. Given that deubiquitination plays a role not only in preventing proteosomal degradation of virus that has entered the cell but also in cell regulation, several scenarios are conceivable that could explain this phenotype. To be sure, DUB function could prevent proteosomal degradation by deubiqutinating and thereby preventing the virus from being labeled for cellular degradation. However, slower transport out of the cell or into the nucleus could also result in fewer plaques forming in the mutant than in the wild type under interferon influence, after which the virus could more easily become a target of antiviral proteins. Alternatively, DUB function may play a role in entry into the nucleus through modifications of other proteins. Viral genomes could also be repressed by a lack of DUB function or the cell could die by apoptosis. Interestingly, no inhibition of the DUB mutant was shown in interferon-treated U-2 OS cells, which are known to have a defect in the STING-mediated signaling pathway. Perhaps this indicates that the STING protein is involved in the DUB phenotype shown. Furthermore, a function of the enzyme in the second envelope of capsids in pseudorabies virus has already been demonstrated (Möhl, 2011). Further studies using e.g. immunofluorescence, proteasome inhibitors or additional cell lines such as Saos-2, are necessary to clarify the exact function. KW - Herpes simplex Virus DUB C65A KW - DUB Mutante KW - Herpes simplex virus C65A KW - Interferon KW - Zellkultur Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351950 ER - TY - THES A1 - Hausmann, Dominikus T1 - Die Bedeutung von cFLIPlong für die Todesrezeptor-abhängige Regulation der Apoptose in HaCaT-Keratinozyten T1 - Significance of cFLIPlong in death-receptor-dependent regulation of apoptosis in HaCaT N2 - Die Todesrezeptoren der TNF-Familie sind neben der Vermittlung von Apoptosesignalen auch in der Lage, nicht-apoptotische intrazelluläre Signalwege zu beeinflussen. Der Caspase-8-Inhibitor cFLIPlong inhibiert dosisabhängig die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 am TRAIL-DISC (death inducing signalling complex) und hemmt die Aktivierung des NF-kappa-B-Signalweges über die Modulation der Rekrutierung und Spaltung des für die NF-kappa-B-Aktivierung notwendigen RIP (receptor interactin protein)am DISC. N2 - TNF-derived death-receptors are not only involved in transducing apoptosis-signalling but also modulate non-apoptotic pathways. Cellular FLICE-inhibitory protein cFLIPlong is able to block processing of initiator-caspases in the TRAIL-DISC dependent on the FLIP/Casp-8- level. It also interacts with NF-kappa-B-signalling pathways by modulating the recruitment and processing of receptor-interacting-protein RIP in the TRAIL-DISC-complex. KW - Apoptosis KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Interferon KW - Bcl-2-Proteinfamilie KW - Caspasen KW - Fas-Ligand KW - Onkologie KW - HaCaT KW - TRAIL KW - RIP KW - TRAIL-Rezeptor KW - cFLIP KW - Nuklearfaktor KW - apoptosis KW - NF-kappa-B KW - cFLIP KW - RIP KW - TRAIL-receptor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75892 ER - TY - THES A1 - Heinze, Britta T1 - Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen Pneumoviren in einem in vivo Modell T1 - Characterization of the innate immune response against pneumoviruses in an in vivo model N2 - In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte. N2 - In this thesis the PVM mouse model was used to unveil the role of type I and type III interferone response for the pathogenesis of pneumoviral infection. First, recombinant PVM dNS-mutants with single or combined deletions of the NS-genes were generated and replication efficiency characterization was analyzed in interferon-competent cells as well as in interferon-incompetent cells. A major point was to elucidate the NS-proteins of PVM as interferon antagonists. In interferon-competent cells the replication of rPVM dNS-mutants were significantly attenuated. These attenuation of all three rPVM dNS-mutants was almost completely reversed when interferon-incompetent cells were infected. Induction of type I and type III interferons was determined in different cell types after infection with rPVM dNS-mutants with differences in intensity of interferon induction. Thus, NS1- and NS2-proteins were clearly identified as interferon antagonists. To analyze the protective capacity of type I and type III interferons with respect to replication and pathology of PVM, mice lacking functional receptors for either or both interferons were infected with rPVM or the respective dNS-mutants. The results indicated that both type I and type III interferons which one restricted replication and pathology of PVM, with the former playing the greater role. Interestingly, the replication and virulence of wild-type PVM were completely unaffected by the presence or absence of functional receptors to type I and type III interferon, indicating that both systems are strongly suppressed during infection. However, pretreatment of mice with type I interferon were protective against lethal rPVM challenge, whereas pretreatment with type III interferon delayed but did not prevent death. Finally, the PVM-NS-proteins appeared to delay apoptosis independently of its IFN-antagonistic activity that may contribute to the limited pathogenicity of the viruses in type I/type III receptor deficient mice. In the last part type I interferon producing cells in a pneumoviral infection in vivo should be identified. It was documented that type I interferon producing cells are virusinfected cells as well as uninfected cells. Surprisingly, in vitro only few cells produced type I interferon during rPVM-GFP7 dNS1dNS2 infection. Because the commercially available interferon antibodies are not qualified for intracellular tissue staining it was not possible to identify in vivo the interferon producing cells, but by inventing a new method it was possible to verify the binding of type I interferon to the cell surface receptor of ciliated epithelial cells, alveolar macrophages and presumably Clara cells and type I and type II pneumocytes. KW - Interferon KW - RS-Virus KW - Immunreaktion KW - Lungenentzündung KW - Apoptosis KW - Tiermodell KW - Toll-like-Rezeptoren KW - PVM KW - Nichtstrukturproteine KW - IFNAR KW - Interferonrezeptor KW - PVM KW - interferon KW - IFNAR KW - receptor KW - apoptosis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56454 ER -