TY  - THES
A1  - Klingler, Philipp
T1  - Exploration of proteasome interactions with human platelet function
T1  - Untersuchung von Proteasom-Wechselwirkungen mit der Funktion humaner Thrombozyten
N2  - Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes. They play a fundamental role in hemostasis, but there is rising evidence that they are also involved in immunological processes. Despite absence of a nucleus, human platelets are capable of de novo protein synthesis and contain a fully functional proteasome system, which is, in nucleated cells, involved in processes like cell cycle progression or apoptosis by its ability of protein degradation. The physiological significance of the proteasome system in human platelets is not yet fully understood and subject of ongoing research.
Therefore, this study was conducted with the intention to outline the role of the proteasome system for functional characteristics of human platelets. For experimentation, citrated whole blood from healthy donors was obtained and preincubated with proteasome inhibitors. In addition to the commonly used bortezomib, the potent and selective proteasome inhibitor carfilzomib was selected as a second inhibitor to rule out agent-specific effects and to confirm that observed changes are related to proteasome inhibition.
Irreversibly induced platelet activation and aggregation were not affected by proteasome blockade with bortezomib up to 24 hours. Conversely, proteasome inhibition led to enhanced threshold aggregation and agglutination up to 25 %, accompanied by partial alleviation of induced VASP phosphorylation of approximately 10-15 %. Expression of different receptors were almost unaffected. Instead, a significant increase of PP2A activity was observable in platelets after proteasome blockade, accompanied by facilitated platelet adhesion to coated surfaces in static experiments or flow chamber experiments.
Carfilzomib, used for the first time in functional experimentation with human platelets in vitro, led to a dose-dependent decrease of proteasome activity with accumulation of poly ubiquitylated proteins. Like bortezomib, carfilzomib treatment resulted in enhanced threshold aggregation with attenuated VASP phosphorylation.
As the main conclusion of this thesis, proteasome inhibition enhances the responsiveness of human platelets, provided by an alleviation of platelet inhibitory pathways and by an additional increase of PP2A activity, resulting in facilitated platelet adhesion under static and flow conditions. The proteasome system appears to be involved in the promotion of inhibitory counterregulation in platelets. The potential of proteasome inhibitors for triggering thromboembolic adverse events in patients must be clarified in further studies, in addition to their possible use for targeting platelet function to improve the hemostatic reactivity of platelets.
N2  - Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente, welche aus Megakaryozyten gebildet werden. Sie spielen eine fundamentale Rolle in der Hämostase, aber es gibt immer mehr Hinweise, dass Thrombozyten auch in immunologischen Prozessen involviert sind. Trotz Fehlen eines Zellkerns haben humane Thrombozyten die Fähigkeit zur de novo Proteinsynthese und besitzen außerdem ein voll funktionstüchtiges Proteasomsystem, welches in kernhaltigen Zellen über den Proteinabbau an Prozessen wie dem Fortschreiten des Zellzyklus oder der Apoptose beteiligt ist. Die physiologische Bedeutung des Proteasomsystems in humanen Thrombozyten ist nicht vollständig geklärt und ist aus diesem Grund Gegenstand aktueller Forschung.
Daher war es Ziel dieser Studie, die Rolle des Proteasomsystems für die funktionellen Eigenschaften humaner Thrombozyten zu erforschen. Für die Experimente wurde Citrat-Vollblut von gesunden Spendern gewonnen und mit Proteasom-Hemmstoffen vorinkubiert. Es wurde neben dem gängigen Bortezomib der potente und selektive Proteasom-Inhibitor Carfilzomib als zweiter Inhibitor eingesetzt, um substanzspezifische Effekte auszuschließen und zu bestätigen, dass die beobachteten Veränderungen auf der Proteasom-Inhibition beruhen.
Die irreversibel induzierte Thrombozytenaktivierung und -aggregation wurde durch die Hemmung des Proteasoms mit Bortezomib bis zu 24 Stunden nicht beeinflusst. Allerdings führte die Proteasom-Hemmung zu einer verstärkten Schwellenwertaggregation und -agglutination um bis zu 25 % sowie zu einer partiellen Abschwächung der induzierten VASP-Phosphorylierung um etwa 10-15 %. Die Expression verschiedener Rezeptoren blieb nahezu unbeeinflusst. Stattdessen konnte unter Proteasom-Inhibition eine erhöhte Enzymaktivität der PP2A beobachtet werden, begleitet von einer erleichterten Thrombozytenadhäsion an beschichteten Oberflächen bei statischen Versuchen ober bei Flusskammerversuchen.
Carfilzomib, welches erstmals für funktionelle Experimente mit menschlichen Thrombozyten in vitro eingesetzt wurde, führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der Proteasom-Aktivität mit einer Akkumulation von poly ubiquitylierten Proteinen. Wie Bortezomib mündete die Behandlung mit Carfilzomib in einer verstärkten Schwellenwertaggregation und abgeschwächter VASP-Phosphorylierung.
Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Arbeit ist, dass die Inhibition des Proteasoms die Reaktivität humaner Thrombozyten erhöht, gekennzeichnet durch eine Abschwächung der hemmenden Signalwege der Thrombozyten und durch eine zusätzliche Erhöhung der PP2A-Enzymaktivität, was zu einer erleichterten Thrombozytenadhäsion unter statischen Verhältnissen und unter Flussbedingungen führt. Das Proteasomsystem scheint an der Förderung der hemmenden Gegenregulation in Thrombozyten beteiligt zu sein. Das Potenzial von Proteasom Inhibitoren, thromboembolische Nebenwirkungen bei Patienten auszulösen, muss in weiteren Studien geklärt werden, ebenso wie ihr möglicher Einsatz für die gezielte Beeinflussung der Thrombozytenfunktion zur Verbesserung der hämostatischen Reaktivität der Thrombozyten.
KW  - Thrombozyt
KW  - Proteasom
KW  - Platelet
KW  - Proteasome
KW  - Bortezomib
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321089
ER  - 
TY  - THES
A1  - Turakhiya, Ankit
T1  - Functional characterization of the role of ZFAND1 in stress granule turnover
T1  - Funktionelle Charakterisierung der Rolle von ZFAND1 im Umsatz von Stressgranula
N2  - Protein quality control systems are critical for cellular proteostasis and survival under stress conditions. The ubiquitin proteasome system (UPS) plays a pivotal role in proteostasis by eliminating misfolded and damaged proteins. However, exposure to the environmental toxin arsenite results in the accumulation of polyubiquitylated proteins, indicating an overload of the UPS. Arsenite stress induces the rapid formation of stress granules (SGs), which are cytoplasmic assemblies of mRNPs stalled in translation initiation. The mammalian proteins ZFAND2A/B (also known as AIRAP and AIRAPL, respectively) bind to the 26S proteasome, and ZFAND2A has been shown to adapt proteasome activity to arsenite stress. They belong to a small subfamily of AN1 type zinc finger containing proteins that also comprises the unexplored mammalian member ZFAND1 and its yeast homolog Cuz1. 
In this thesis, the cellular function of Cuz1 and ZFAND1 was investigated. Cuz1/ZFAND1 was found to interact with the ubiquitin-selective, chaperone-like ATPase Cdc48/p97 and with the 26S proteasome. The interaction between Cuz1/ZFAND1 and Cdc48/p97 requires a predicted ubiquitin-like domain of Cuz1/ZFAND1. In vivo, this interaction was strongly dependent on acute arsenite stress, suggesting that it is a part of the cellular arsenite stress response. Lack of Cuz1/ZFAND1 caused a defect in the clearance of arsenite induced SG clearance. ZFAND1 recruits both, the 26S proteasome and p97, to arsenite-induced SGs for their normal clearance. In the absence of ZFAND1, SGs lack the 26S proteasome and p97, accumulate defective ribosomal products and become aberrant. These aberrant SGs persist after arsenite removal and undergo degradation via autophagy. ZFAND1 depletion is epistatic to the expression of pathogenic mutant p97 with respect to SG clearance, suggesting that ZFAND1 function is relevant to the multisystem degenerative disorder, inclusion body myopathy associated with Paget’s disease of bone and frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis (IBMPFD/ALS).
N2  - Systeme zur Sicherung der Proteinqualität sind von essentieller Bedeutung für die zelluläre Proteostase und das Überleben unter Stressbedingungen. Dabei spielt das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) eine entscheidende Rolle: Es beseitigt fehlgefaltete und beschädigte Proteine. Sind Zellen dem Umweltgift Arsenit ausgesetzt, kommt es zu einer Akkumulation von polyubiquitinierten Proteinen, was auf eine Überlastung des UPS hinweist. Dieser durch Arsenit verursachte Stress bewirkt eine schnelle Bildung von Stressgranula (SGs), einer cytoplasmatischen Ansammlung von mRNPs, die in der Initiation der Translation blockiert sind. Die Säuger Proteine ZFAND2A/B (auch bekannt als AIRAP und AIRAPL) binden an das 26S Proteasom. Zusätzlich wurde gezeigt, dass ZFAND2A die Aktivität des Proteasoms an durch Arsenit verursachten Stress, anpasst. Diese Proteine gehören zu einer kleinen Unterfamilie von Zinkfinger von AN1-type enthaltenden Proteinen, zu der auch das bislang nicht erforschte Säuge Protein ZFAND1 und sein Hefehomolog Cuz1 gehören.
In dieser Arbeit wurde die zelluläre Funktion von Cuz1 und ZFAND1 untersucht. Es zeigte sich, dass Cuz1/ZFAND1 mit dem 26S Proteasom und der Ubiquitin-selektiven, Chaperon-ähnlichen ATPase Cdc48/p97 interagiert. Die Interaktion zwischen Cuz1/ZFAND1 und Cdc48/p97 benötigt eine vorhergesagte Ubiquitin-ähnliche Domäne von Cuz1/ZFAND1. Diese Interaktion ist in vivo stark von akutem Arsenitstress abhängig, was darauf hindeutet, dass sie Teil der zellulären Stressantwort gegen Arsenit ist. Fehlt Cuz1/ZFAND1, so kommt es zu einer Störung bei der Beseitigung der von Arsenit verursachten SGs. Normalerweise rekrutiert ZFAND1 sowohl das 26S Proteasom als auch p97 zu diesen SGs, um sie zu entfernen. Wenn ZFAND1 jedoch fehlt, sind auch p97 und das 26S Proteasom nicht an den SGs lokalisiert. Dadurch sammeln sich dort defekte ribosomale Produkte an, und die SGs werden abnormal. Auch nach Entfernung des Arsenitstresses bestehen diese abnormalen SGs fort und werden schließlich über Autophagie abgebaut. Bei der Beseitigung der SGs ist das Fehlen von ZFAND1 epistatisch zu der Expression einer pathogenen p97-Mutante, was darauf hinweirt, dass ZFAND1 bei der degenerativen Multisystemerkrankung Einschlusskörper-Myopathie assoziiert mit Pagets Erkrankung der Knochen und frontotemporaler Demenz und Amyotrophe Lateralsklerose (IBMPFD/ALS) eine Rolle spielt.
KW  - ubiquitin
KW  - ZFAND1
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163751
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nair, Radhika Karal
T1  - Structural and biochemical characterization of USP28 inhibition by small molecule inhibitors
T1  - Strukturelle und biochemische Charakterisierung der Hemmung von USP28 durch niedermolekulare Inhibitoren
N2  - Ubiquitination is an important post-translational modification that maintains cellular homeostasis by regulating various biological processes. Deubiquitinases (DUBs) are enzymes that reverse the ubiquitination process by catalyzing the removal of ubiquitin from a substrate. Abnormal expression or function of DUBs is often associated with the onset and progression of various diseases, including cancer. Ubiquitin specific proteases (USPs), which constitute the largest family of DUBs in humans, have become the center of interest as potential targets in cancer therapy as many of them display increased activity or are overexpressed in a range of malignant tumors or the tumor microenvironment. 
Two related members of the USP family, USP28 and USP25, share high sequence identities but play diverse biological roles. USP28 regulates cell proliferation, oncogenesis, DNA damage repair and apoptosis, whereas USP25 is involved in the anti-viral response, innate immunity and ER-associated degradation in addition to carcinogenesis. USP28 and USP25 also exhibit different oligomeric states – while USP28 is a constitutively active dimer, USP25 assumes an auto-inhibited tetrameric structure. The catalytic domains of both USP28 and USP25 comprise the canonical, globular USP-domain but contain an additional, extended insertion site called USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID) that mediates oligomerization of the proteins. Disruption of the USP25 tetramer leads to the formation of an activated dimeric protein. However, it is still not clear what triggers its activation. 
Due to their role in maintaining and stabilizing numerous oncoproteins, USP28 and USP25 have emerged as interesting candidates for anti-cancer therapy. Recent advances in small-molecular inhibitor development have led to the discovery of relatively potent inhibitors of USP28 and USP25. This thesis focuses on the structural elucidation of USP28 and the biochemical characterization of USP28/USP25, both in complex with representatives of three out of the eight compound classes reported as USP28/USP25-specific inhibitors. The crystal structures of USP28 in complex with the AZ compounds, Vismodegib and FT206 reveal that all three inhibitor classes bind into the same allosteric pocket distant from the catalytic center, located between the palm and the thumb subdomains (the S1-site). Intriguingly, this binding pocket is identical to the UCID-tip binding interface in the USP25 tetramer, rendering the protein in a locked, inactive conformation. Formation of the binding pocket in USP28 requires a shift in the helix α5, which induces conformational changes and local distortion of the binding channel that typically accommodates the C-terminal tail of Ubiquitin, thus preventing catalysis and abrogating USP28 activity. The key residues of the USP28-inhibitor binding pocket are highly conserved in USP25. Mutagenesis studies of these residues accompanied by biochemical and biophysical assays confirm the proposed mechanism of inhibition and similar binding to USP25. 
This work provides valuable insights into the inhibition mechanism of the small molecule compounds specifically for the DUBs USP28 and USP25. The USP28-inhibitor complex structures offer a framework to develop more specific and potent inhibitors.
N2  - Ubiquitinierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die zelluläre Homöostase aufrechterhält, indem sie verschiedene biologische Prozesse reguliert. Deubiquitinasen (DUBs) sind Enzyme, die den Ubiquitinierungsprozess umkehren, indem sie die Entfernung von Ubiquitin von einem Substrat katalysieren. Eine abnorme Expression oder Funktion von DUBs wird häufig mit dem Auftreten und Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), die im Menschen die größte Familie der DUBs bilden, sind als potenzielle Ziele in der Krebstherapie von besonderem Interesse, da viele von ihnen in bösartigen Tumoren oder deren Mikroumgebung abnormal aktiv oder überexprimiert sind. 

Die zwei eng verwandten Mitglieder der USP-Familie, USP28 und USP25, weisen eine hohe Sequenzidentität auf, sind aber an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. USP28 reguliert die Zellproliferation, die Onkogenese, die Reparatur von DNA-Schäden und die Apoptose, während USP25 eine Rolle bei der antiviralen Reaktion, der angeborenen Immunität, dem ER-assoziierten Abbau und der Carcinogenese spielt. USP28 und USP25 weisen auch unterschiedliche oligomere Zustände auf. Während USP28 ein konstitutiv aktives Dimer bildet, tritt USP25 als auto-inhibiertes Tetramer auf. Strukturell bestehen die katalytischen Domänen sowohl von USP28 als auch von USP25 aus der kanonischen globulären USP-Domäne enthalten jedoch eine zusätzliche Insertion, die als „USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID)“ bezeichnet wird und die Oligomerisierung der Proteine vermittelt. Die Dissoziation des USP25 Tetramers in Dimere führt zu einem aktivierten USP25-Protein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, was seine Aktivierung auslöst. 

Aufgrund ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung und Stabilisierung zahlreicher Onkoproteine haben sich USP28 und USP25 als interessante Kandidaten für die Entwicklung von Medikamenten in der Krebstherapie erwiesen. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren haben zur Entdeckung von relativ potenten Inhibitoren von USP28 und USP25 geführt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Strukturaufklärung von USP28 und die biochemische Charakterisierung von USP28/USP25, beide im Komplex mit Vertretern von drei der acht Verbindungsklassen, die als USP28/USP25-spezifische Inhibitoren bekannt sind. Die Kristallstrukturen von USP28 im Komplex mit den AZ-Verbindungen, Vismodegib und FT206 zeigen, dass alle Inhibitoren in einer ähnlichen Region an USP28 binden - einer allosterischen Tasche, die in der Nähe des katalytischen Zentrums liegt und sich zwischen der Handflächen- und der Daumen-Subdomäne befindet. Diese Bindungstasche ist identisch mit der Position, an der der „UCID-tip“ im USP25-Tetramer bindet und das Protein in eine verschränkte, inaktive Konformation versetzt. Die Bildung der Bindungstasche in USP28 erfordert eine Verschiebung der α5-Helix, die zu Konformationsänderungen und einer lokalen Verzerrung des Bindungskanalsführt, der normalerweise den C-terminus des Ubiquitin-Moleküls bindet und so die Katalyse verhindert und die Aktivität von USP28 hemmt. Die Schlüsselreste der USP28-Inhibitor-Bindungstasche sind in USP25 hoch konserviert. Mutagenese-Studien dieser Aminosäuren, begleitet von biochemischen und biophysikalischen Analysen, bestätigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Hemmung und eine ähnliche Bindung der Inhibitoren an USP25. 

Diese Arbeit liefert wertvolle Einblicke in den Hemmungsmechanismus der Kleinmolekülverbindungen, die spezifisch für die DUBs USP28 und USP25 entwickelt worden sind. Die Strukturen der USP28-Inhibitor-Komplexe bieten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung spezifischerer und wirksamerer Inhibitoren.
KW  - USP
KW  - Inhibition
KW  - enzyme
KW  - crystallography
KW  - Unique Selling Proposition
KW  - Inhibition
KW  - Enzym
KW  - Kristallographie
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281742
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kawan, Mona
T1  - The membrane trafficking protein myoferlin is a novel interactor of p97
T1  - Das Membrantransportprotein Myoferlin ist ein neuer Interaktor von p97
N2  - p97 uses the energy of ATP hydrolysis to unfold and thereby segregate proteins. It is involved in various cellular processes such as proteasomal degradation, DNA damage repair, autophagy, and endo-lysosomal trafficking. The specificity for these processes is controlled by more than 30 regulatory cofactors.
Interactions of p97 with cofactors and target proteins are known to be highly dynamic and transient. To identify new interaction partners and to uncover novel cellular functions of p97, the interactome of endogenous p97 was determined by using in cellulo crosslinking followed by immunoprecipitation and mass spectrometry. Myoferlin (MYOF) was identified as a novel interactor of p97 and the interaction was validated in reciprocal immunoprecipitation experiments for different cell lines.
The ferlin family member MYOF is a tail-anchored membrane protein containing multiple C2 domains. MYOF is involved in various membrane repair and trafficking processes such as the endocytic recycling of cell surface receptors. The MYOF interactome was determined by mass spectrometry. Among others, the p97 cofactor PLAA, CD71 and Rab14 were identified as common interactors of p97 and MYOF. Immunoprecipitation experiments with PLAA KO cells revealed that the interaction between MYOF and p97 depends on PLAA. Immunofluorescence microscopy showed a co-localization of MYOF with Rab14 and Rab11, which are both involved in endocytic recycling pathways. Furthermore, immunofluoroscence experiments revealed that MYOF and the p97 cofactor PLAA are localized to Rab14- and Rab5-positive endosomal compartments. 
Using p97 inhibitors and p97 trapping mutants, the presence of p97 at MYOF-positive and Rab14-positive structures could be demonstrated. Consistent with this finding, the endocytic recycling of transferrin was delayed upon inhibition of p97. Taken together, this work identified MYOF as a novel interactor of p97 and suggests a role for p97 in the recycling of endocytic cargo.
N2  - p97 nutzt die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um Proteine zu entfalten und dadurch zu trennen. Es ist an verschiedenen zellulären Prozessen wie dem proteasomalen Abbau, der Reparatur von DNA-Schäden, der Autophagie und dem endo-lysosomalen Transport beteiligt. Die Spezifität für diese Prozesse wird durch mehr als 30 regulatorische Cofaktoren gesteuert. 
Wechselwirkungen von p97 mit Cofaktoren und Zielproteinen sind bekanntermaßen hochdynamisch und treten oft nur vorübergehend auf. Um neue Interaktionspartner zu identifizieren und neue zelluläre Funktionen von p97 aufzudecken, wurde das Interaktom von endogenem p97 unter Verwendung von in cellulo crosslinking, gefolgt von IP und Massenspektrometrie bestimmt. Dabei wurde MYOF als neuartiger Interaktor von p97 entdeckt und diese Interaktion wurde in reziproken IP-Experimenten und für verschiedene Zelllinien bestätigt.
MYOF gehört der Ferlin Familie an und besitzt mehrere C2-Domänen sowie eine Trans-membrandomäne. MYOF ist bekanntermaßen an verschiedenen Membranreparatur- und Transportvorgängen wie beispielsweise dem endozytischen Recycling von Zelloberflächenrezeptoren beteiligt. Das Interaktom von MYOF wurde durch Massenspektrometrie bestimmt. Dabei wurden unter anderem der p97 Cofaktor PLAA, CD71 und Rab14 als gemeinsame Interaktoren von p97 und MYOF identifiziert. Durch IP-Experimente mit PLAA KO Zellen wurde eine Abhängigkeit der Interaktion zwischen MYOF und p97 von PLAA nachgewiesen. Mit IF-Mikroskopie konnte eine Kolokalisation von MYOF mit Rab14 und Rab11, die beide an endosomalen Recycling-Wegen beteiligt sind, beobachtet werden. Des Weiteren zeigten IF-Experimente, dass MYOF und der p97-Cofaktor PLAA an Rab14- und Rab5-positiven endosomalen Kompartimenten lokalisiert sind. 
Durch die Verwendung von p97-Inhibitoren oder p97 Mutanten, die ATP nicht hydrolysieren können und so verstärkt Substrate anreichern, konnte gezeigt werden, dass p97 an MYOF-positiven und Rab14-positiven Strukturen nachgewiesen werden kann. In Übereinstimmung mit diesem Befund wurde das endozytische Recycling von Transferrin durch die Inhibierung von p97 verzögert. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass MYOF ein neuer Interaktor von p97 ist, und deutet auf eine Rolle von p97 beim Recycling von endozytischer Fracht hin.
KW  - Endosom
KW  - p97
KW  - Myoferlin
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281218
ER  -