TY - THES A1 - Kappenberger, Jeannette Sarah T1 - Biochemical characterization of the TFIIH translocase XPB from \(Chaetomium\) \(thermophilum\) T1 - Biochemische Charakterisierung der TFIIH Translokase XPB aus \(Chaetomium\) \(thermophilum\) N2 - DNA repair and gene expression are two major cellular processes that are fundamental for the maintenance of biological life. Both processes require the enzymatic activity of the super family 2 helicase XBP, which is an integral subunit of the general transcription factor TFIIH. During transcription initiation, XPB catalyzes the initial melting of promoter DNA enabling RNA polymerase II to engage with the coding DNA strand and start gene transcription. In nucleotide excision repair, XPB acts in concert with the other TFIIH helicase XPD causing strand separation around a lesion site. Mutations within the genes encoding XPB or other TFIIH subunits are associated with different cancer types as well as with the autosomal recessive disorders Xeroderma Pigmentosum and trichothiodystrophy and rarely combined features of Xeroderma Pigmentosum and Cockayne syndrome. In the last few years, great progress has been made towards unraveling the structure of TFIIH and its individual subunits including XPB. These structural insights tremendously improved our understandings with respect to the molecular interactions within this intriguing protein complex. However, the underlying regulation mechanisms that functionally control XPB during transcription and repair remained largely elusive. We thus executed the biochemical characterization of this protein to investigate the functional network that regulates XPB within the scaffold of TFIIH. Due to their enhanced stability compared to the human proteins, we utilized the proteins that originate from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum for this purpose as a model organism for eukaryotic TFIIH. The present work provides novel insights into the enzymatic function and regulation of XPB. We could show that both, DNA and the TFIIH subunit p52 stimulate XPB’s ATPase activity and that the p52-mediated activity is further boosted by p8, another subunit within TFIIH. Surprisingly, DNA can activate XPB’s ATPase activity to a greater extent than its TFIIH interaction partners p52/p8, but when both, i.e. p52/p8 and DNA are present at the same time, p52 dominates the activation and the enzymatic speed is maintained at the level observed through the sole activation of p52/p8. We thus defined p52 as the master regulator of XPB that simultaneously activates and represses XPB’s enzymatic activity. Based on a correlative mutagenesis study of the main interface between p52 and XPB that was set into context with recent structural data, a model for the p52-mediated activation and speed limitation of XPB’s ATPase was proposed. The research on XPB’s ATPase was expanded with the investigation of the inhibition mechanism of XPB’s ATPase via the natural compound Triptolide. Furthermore, we investigated XPB’s DNA translocase function and could observe that XPB can only perform its translocase movement when it is fully incorporated into core TFIIH and this translocase movement is further enhanced by the nucleotide excision repair factor XPA. Fluorescence polarization measurements with nucleotide analogues revealed that XPB displays the highest affinity towards DNA in the ADP + Pi bound state and its binding is weakened when ADP is bound or the nucleotide is dissociated from the enzyme, suggesting a movement on the DNA during the distinct states of the ATPase cycle. Finally, the well-known and highly conserved RED motif was found to be the crucial element in XPB to enable this translocase movement. Combined, the data presented in this work provide novel insights into the intricate regulation network that controls XPB’s enzymatic activity within TFIIH and furthermore show that XPB’s enzymatic activity is tightly controlled by various factors. N2 - DNA Reparatur und Genexpression sind zwei fundamentale zelluläre Prozesse die unabdingbar für die Aufrechterhaltung des biologischen Lebens sind. Beide Prozesse benötigen die Enzymaktivität der Superfamilie 2 Helikase XPB, welche eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors TFIIH darstellt. Während der Transkriptions-Initiation katalysiert XPB das initiale Aufschmelzen der Promoter-DNA und befähigt dadurch die RNA-Polymerase II dazu an den codierenden DNA Strang zu binden und die Genexpression zu starten. In der Nukleotid-Exzisions-Reparatur agiert XPB zusammen mit der zweiten TFIIH Helikase, XPD, und bewirkt die Öffnung des DNA Stranges an der Stelle des DNA-Schadens. Mutationen des XPB-Gens oder der Gene der anderen TFIIH Untereinheiten sind mit verschiedenen Krebsarten, sowie den autosomal rezessiv vererbten Krankheiten Xeroderma Pigmentosum und Trichothiodystrophie assoziiert. In seltenen Fällen kann eine kombinierte Form von Xeroderma Pigmentosum und Cockayne Syndrom auftreten. In den letzten Jahren wurde mittels der Cryo-EM die Strukturaufklärung von TFIIH und seinen Untereinheiten einschließlich XPB signifikant vorangebracht. Diese neuen strukturellen Einsichten haben unser Verständnis über den molekularen Aufbau des TFIIH Komplexes entscheidend verbessert. Jedoch sind die Regulationsmechanismen, die XPB auf funktionaler Ebene kontrollieren, noch größtenteils unbekannt. Um das funktionelle Netzwerk, das XPB innerhalb von TFIIH reguliert, zu erforschen, haben wir die biochemische Charakterisierung von XPB verfolgt. Aufgrund ihrer erhöhten Stabilität gegenüber den humanen Proteinen wurden für diese Analyse die Proteine des thermophilen Pilzes Chaetomium thermophilum als Modellorganismus für TFIIH verwendet. Die vorgelegte Arbeit liefert neue Erkenntnisse über die enzymatische Funktion und Regulation von XPB. Wir konnten zeigen, dass sowohl DNA, als auch die TFIIH Untereinheit p52 die ATPase Aktivität von XPB stimulieren und dass die p52-vermittelte Aktivierung durch p8, eine weitere Untereinheit von TFIIH, noch weiter verstärkt wird. In Gegenwart von DNA beobachtet man jedoch die höchste ATPase Aktivität. Wenn beide Aktivatoren, also p52/p8 und DNA, gleichzeitig anwesend waren, dominierte die niedrige p52-vermittelte Aktivierung gegenüber der DNA-vermittelten Aktivierung. Das p52-Protein agiert also als Aktivator und Deaktivator indem es die enzymatische Aktivität des XPB-Proteins gleichzeitig aktiviert und hemmt und kann damit folglich als Hauptregulator von XPB bezeichnet werden. Basierend auf einer korrelativen Mutagenese-Analyse der Interaktionsfläche zwischen p52 und XPB sowie auf den aktuellsten Strukturdaten, wurde ein Modell für die p52-vermittelte Aktivierung und Geschwindigkeitsregulierung von XPBs ATPase generiert. Des Weiteren wurde der Einfluss des Naturproduktes Triptolid auf die Hemmung der enzymatischen Aktivität des XPB Proteins untersucht. Darüber hinaus haben wir die doppelsträngige DNA-Translokase-Aktivität von XPB analysiert und konnten feststellen, dass die Translokation nur erfolgen kann, wenn XPB vollständig in den Kern-TFIIH-Komplex integriert ist. Der Nukleotid-Exzisions-Reparatur- Faktor XPA stimulierte diese Translokase-Aktivität zusätzlich. Fluoreszenz-Polarisations-Messungen mit Nukleotid-Analoga zeigten, dass XPB die höchste Affinität für DNA im ADP + Pi gebundenen Zustand aufweist und dass diese Bindung gelockert wird, wenn ADP gebunden oder das Nukleotid dissoziiert ist. Dies deutet auf einen Bewegungsmechanismus auf der DNA während der verschiedenen Stadien des ATPase-Zyklus hin. Abschließend konnten wir zeigen, dass das hochkonservierte RED-Motiv eine entscheidende Rolle für die Translokase Bewegung des XPB-Proteins einnimmt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit neue Erkenntnisse, die unser Verständnis des Regulierungsnetzwerkes, das die enzymatische Aktivität von XPB innerhalb von TFIIH steuert, entscheidend vorangebracht haben. KW - DNS-Reparatur KW - Xeroderma pigmentosum KW - Helicasen KW - Transkriptionsfaktor KW - Nucleotide Excision Repair Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244096 ER - TY - THES A1 - Nair, Radhika Karal T1 - Structural and biochemical characterization of USP28 inhibition by small molecule inhibitors T1 - Strukturelle und biochemische Charakterisierung der Hemmung von USP28 durch niedermolekulare Inhibitoren N2 - Ubiquitination is an important post-translational modification that maintains cellular homeostasis by regulating various biological processes. Deubiquitinases (DUBs) are enzymes that reverse the ubiquitination process by catalyzing the removal of ubiquitin from a substrate. Abnormal expression or function of DUBs is often associated with the onset and progression of various diseases, including cancer. Ubiquitin specific proteases (USPs), which constitute the largest family of DUBs in humans, have become the center of interest as potential targets in cancer therapy as many of them display increased activity or are overexpressed in a range of malignant tumors or the tumor microenvironment. Two related members of the USP family, USP28 and USP25, share high sequence identities but play diverse biological roles. USP28 regulates cell proliferation, oncogenesis, DNA damage repair and apoptosis, whereas USP25 is involved in the anti-viral response, innate immunity and ER-associated degradation in addition to carcinogenesis. USP28 and USP25 also exhibit different oligomeric states – while USP28 is a constitutively active dimer, USP25 assumes an auto-inhibited tetrameric structure. The catalytic domains of both USP28 and USP25 comprise the canonical, globular USP-domain but contain an additional, extended insertion site called USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID) that mediates oligomerization of the proteins. Disruption of the USP25 tetramer leads to the formation of an activated dimeric protein. However, it is still not clear what triggers its activation. Due to their role in maintaining and stabilizing numerous oncoproteins, USP28 and USP25 have emerged as interesting candidates for anti-cancer therapy. Recent advances in small-molecular inhibitor development have led to the discovery of relatively potent inhibitors of USP28 and USP25. This thesis focuses on the structural elucidation of USP28 and the biochemical characterization of USP28/USP25, both in complex with representatives of three out of the eight compound classes reported as USP28/USP25-specific inhibitors. The crystal structures of USP28 in complex with the AZ compounds, Vismodegib and FT206 reveal that all three inhibitor classes bind into the same allosteric pocket distant from the catalytic center, located between the palm and the thumb subdomains (the S1-site). Intriguingly, this binding pocket is identical to the UCID-tip binding interface in the USP25 tetramer, rendering the protein in a locked, inactive conformation. Formation of the binding pocket in USP28 requires a shift in the helix α5, which induces conformational changes and local distortion of the binding channel that typically accommodates the C-terminal tail of Ubiquitin, thus preventing catalysis and abrogating USP28 activity. The key residues of the USP28-inhibitor binding pocket are highly conserved in USP25. Mutagenesis studies of these residues accompanied by biochemical and biophysical assays confirm the proposed mechanism of inhibition and similar binding to USP25. This work provides valuable insights into the inhibition mechanism of the small molecule compounds specifically for the DUBs USP28 and USP25. The USP28-inhibitor complex structures offer a framework to develop more specific and potent inhibitors. N2 - Ubiquitinierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die zelluläre Homöostase aufrechterhält, indem sie verschiedene biologische Prozesse reguliert. Deubiquitinasen (DUBs) sind Enzyme, die den Ubiquitinierungsprozess umkehren, indem sie die Entfernung von Ubiquitin von einem Substrat katalysieren. Eine abnorme Expression oder Funktion von DUBs wird häufig mit dem Auftreten und Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), die im Menschen die größte Familie der DUBs bilden, sind als potenzielle Ziele in der Krebstherapie von besonderem Interesse, da viele von ihnen in bösartigen Tumoren oder deren Mikroumgebung abnormal aktiv oder überexprimiert sind. Die zwei eng verwandten Mitglieder der USP-Familie, USP28 und USP25, weisen eine hohe Sequenzidentität auf, sind aber an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. USP28 reguliert die Zellproliferation, die Onkogenese, die Reparatur von DNA-Schäden und die Apoptose, während USP25 eine Rolle bei der antiviralen Reaktion, der angeborenen Immunität, dem ER-assoziierten Abbau und der Carcinogenese spielt. USP28 und USP25 weisen auch unterschiedliche oligomere Zustände auf. Während USP28 ein konstitutiv aktives Dimer bildet, tritt USP25 als auto-inhibiertes Tetramer auf. Strukturell bestehen die katalytischen Domänen sowohl von USP28 als auch von USP25 aus der kanonischen globulären USP-Domäne enthalten jedoch eine zusätzliche Insertion, die als „USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID)“ bezeichnet wird und die Oligomerisierung der Proteine vermittelt. Die Dissoziation des USP25 Tetramers in Dimere führt zu einem aktivierten USP25-Protein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, was seine Aktivierung auslöst. Aufgrund ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung und Stabilisierung zahlreicher Onkoproteine haben sich USP28 und USP25 als interessante Kandidaten für die Entwicklung von Medikamenten in der Krebstherapie erwiesen. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren haben zur Entdeckung von relativ potenten Inhibitoren von USP28 und USP25 geführt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Strukturaufklärung von USP28 und die biochemische Charakterisierung von USP28/USP25, beide im Komplex mit Vertretern von drei der acht Verbindungsklassen, die als USP28/USP25-spezifische Inhibitoren bekannt sind. Die Kristallstrukturen von USP28 im Komplex mit den AZ-Verbindungen, Vismodegib und FT206 zeigen, dass alle Inhibitoren in einer ähnlichen Region an USP28 binden - einer allosterischen Tasche, die in der Nähe des katalytischen Zentrums liegt und sich zwischen der Handflächen- und der Daumen-Subdomäne befindet. Diese Bindungstasche ist identisch mit der Position, an der der „UCID-tip“ im USP25-Tetramer bindet und das Protein in eine verschränkte, inaktive Konformation versetzt. Die Bildung der Bindungstasche in USP28 erfordert eine Verschiebung der α5-Helix, die zu Konformationsänderungen und einer lokalen Verzerrung des Bindungskanalsführt, der normalerweise den C-terminus des Ubiquitin-Moleküls bindet und so die Katalyse verhindert und die Aktivität von USP28 hemmt. Die Schlüsselreste der USP28-Inhibitor-Bindungstasche sind in USP25 hoch konserviert. Mutagenese-Studien dieser Aminosäuren, begleitet von biochemischen und biophysikalischen Analysen, bestätigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Hemmung und eine ähnliche Bindung der Inhibitoren an USP25. Diese Arbeit liefert wertvolle Einblicke in den Hemmungsmechanismus der Kleinmolekülverbindungen, die spezifisch für die DUBs USP28 und USP25 entwickelt worden sind. Die Strukturen der USP28-Inhibitor-Komplexe bieten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung spezifischerer und wirksamerer Inhibitoren. KW - USP KW - Inhibition KW - enzyme KW - crystallography KW - Unique Selling Proposition KW - Inhibition KW - Enzym KW - Kristallographie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281742 ER -