TY  - THES
A1  - Kraus, Amelie Johanna
T1  - H2A.Z – a molecular guardian of RNA polymerase II transcription in African trypanosomes
T1  - H2A.Z – eine molekulare Wächterin der RNA Polymerase II Transkription in Afrikanischen Trypanosomen
N2  - In eukaryotes, the enormously long DNA molecules need to be packaged together with histone proteins into nucleosomes and further into compact chromatin structures to fit it into the nucleus. This nuclear organisation interferes with all phases of transcription that require the polymerase to bind to DNA. During transcription – the process in which the hereditary information stored in DNA is transferred to many transportable RNA molecules - nucleosomes form a physical obstacle for polymerase progression. Thus, transcription is usually accompanied by processes mediating nucleosome destabilisation, including post-translational histone modifications (PTMs) or exchange of canonical histones by their variant forms. To the best of our knowledge, acetylation of histones has the highest capability to induce chromatin opening. The lysine modification can destabilise histone-DNA interactions within a nucleosome and can serve as a binding site for various chromatin remodelers that can modify the nucleosome composition. For example, H4 acetylation can impede chromatin folding and can stimulate the exchange of canonical H2A histone by its variant form H2A.Z at transcription start sites (TSSs) in many eukaryotes, including humans. As histone H4, H2A.Z can be post-translationally acetylated and as acetylated H4, acetylated H2A.Z is enriched at TSSs suggested to be critical for transcription. However, thus far, it has been difficult to study the cause and consequence of H2A.Z acetylation.
Even though, genome-wide chromatin profiling studies such as ChIP-seq have already revealed the genomic localisation of many histone PTMs and variant proteins, they can only be used to study individual chromatin marks and not to identify all factors important for establishing a distinct chromatin structure. This would require a comprehensive understanding of all marks associated to a specific genomic locus. However, thus far, such analyses of locus-specific chromatin have only been successful for repetitive regions, such as telomeres.
In my doctoral thesis, I used the unicellular parasite Trypanosoma brucei as a model system for chromatin biology and took advantage of its chromatin landscape with TSSs comprising already 7% of the total T. brucei genome (humans: 0.00000156%). Atypical for a eukaryote, the protein-coding genes are arranged in long polycistronic transcription units (PTUs). Each PTU is controlled by its own ~10 kb-wide TSS, that lies upstream of the PTU. As observed in other eukaryotes, TSSs are enriched with nucleosomes containing acetylated histones and the histone variant H2A.Z. This is why I used T. brucei to particularly investigate the TSS-specific chromatin structures and to identify factors involved in H2A.Z deposition and transcription regulation in eukaryotes. To this end, I established an approach for locus-specific chromatin isolation that would allow me to identify the TSSs- and non-TSS-specific chromatin marks. Later, combining the approach with a method for quantifying lysine-specific histone acetylation levels, I found H2A.Z and H4 acetylation enriched in TSSs-nucleosomes and mediated by the histone acetyltransferases HAT1 and HAT2. Depletion of HAT2 reduced the levels of TSS-specific H4 acetylation, affected targeted H2A.Z deposition and shifted the sites of transcription initiation. Whereas HAT1 depletion had only a minor effect on H2A.Z deposition, it had a strong effect on H2A.Z acetylation and transcription levels. My findings demonstrate a clear link between histone acetylation, H2A.Z deposition and transcription initiation in the early diverged unicellular parasite T. brucei, which was thus far not possible to determine in other eukaryotes. Overall, my study highlights the usefulness of T. brucei as a model system for studying chromatin biology. My findings allow the conclusion that H2A.Z regardless of its modification state defines sites of transcription initiation, whereas H2A.Z acetylation is essential co-factor for transcription initiation. Altogether, my data suggest that TSS-specific chromatin establishment is one of the earliest developed mechanisms to control transcription initiation in eukaryotes.
N2  - In Eukaryoten muss die genomische DNA zusammen mit Histonproteinen zu Nukleosomen und weiter zu kompakten Chromatinstrukturen verpackt werden, damit sie in den Zellkern passt. Diese Organisation behindert die Transkription bei jedem Schritt, bei dem die Polymerase an der DNA bindet. Während der Transkription – dem Prozess bei dem die in der DNA gespeicherte Erbinformation in viele transportable RNA Molekülen umgewandelt wird – stellen Nukleosomen ein physikalisches Hindernis für das Vorankommen der Polymerase dar. Aus diesem Grund wird die Transkription üblicherweise von Prozessen begleitet, die für die Destabilisierung der Nukleosomen sorgen, wie zum Beispiel post-translationale Modifizierung (PTM) der Histone oder der Austausch von kanonischen Histonproteinen durch eine ihrer Varianten. Soweit bisher bekannt ist Histonacetylierung am besten dafür geeignet, eine offene Chromatinstruktur bereit zu stellen. Die Lysinmodifizierung kann Interaktionen zwischen der DNA und den Histonen innerhalb eines Nukleosomes destabilisieren und als Andockstelle für einige Proteinkomplexe sogenannte Chromatin-Modellierer fungieren, die die Zusammensetzung eines Nukleosomes verändern können. Zum Beispiel, kann Acetylierung am Histon H4 das „Zusammenfalten“ des Chromatins erschweren und den Austausch von kanonischem H2A mit ihrer Variante H2A.Z an den Transkriptiosinitiationsstellen (TSSen) in vielen eukaryotischen Organismen, Menschen eingeschlossen, stimulieren. Wie Histon H4, kann auch H2A.Z post-translationell acetyliert werden und wie acetyliertes H4, findet man auch acetyliertes H2A.Z vor allem an TSSen. Deswegen geht man davon aus, dass es sehr wichtig für die Transkriptioninitiierung ist. Allerdings war es bisher nicht möglich, die Ursache und Wirkung von H2A.Z Acetylierung genauer zu untersuchen.
Genom-weite Chromatinprofilstudien wie z.B. ChIP-Seq ermöglichen es die genomische Lokalisierung von vielen Histon-Modifizierungen und -Varianten zu bestimmen. Dennoch reichen sie nicht dafür aus alle Faktoren, die für die Bildung einer bestimmten Chromatinstruktur notwendig sind, gleichzeitig herauszufinden. Das würde voraussetzen, dass man alle Merkmale der genomischen Stelle kennt. Bisher waren Analysen von spezifischen Chromatinstellen nur erfolgreich, wenn das Chromatin von einer repetitiven Region, wie z.B. Telomeren, stammt.
In meiner Doktorarbeit verwendete ich den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei als Modelsystem für Chromatinbiologie. Dabei machte ich mir dessen Chromatinorganisation zunutze, die eher untypisch für einen eukaryotische Organismus ist. TSSen machen hier ungefähr 7% des gesamten Genoms aus (Mensch: 0.00000156%). Protein-kodierende Gene sind in langen polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTE) angeordnet. Jede dieser Einheiten besitzt eine eigene TSS, die vor der PTE liegt, und bis zu 10 kb lang sein kann. Jedoch, wie in anderen Eukaryoten, sind an den TSSen Nukleosomen angereichert, die sich durch acetylierte Histone und den Einbau der Histonvariante H2A.Z auszeichnen. Aus diesen Gründen verwendete ich T. brucei, um während meiner Doktorarbeit die Chromatinstrukturen, die TSSen auszeichnen, genauer zu untersuchen und die Faktoren, die bei der H2A.Z Positionierung und dadurch bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten eine Rolle spielen, herauszufinden. Dafür etablierte ich zuerst eine Methode, mit der man Chromatin von einer bestimmten genomischen Stelle isolieren kann und die es mir ermöglichen würde, die Merkmale von TSS-spezifischen und -unspezifischen Chromatin zu identifizieren. Später konnte ich das entwickelte Protokoll mit einer Methode zur Quantifizierung von Lysin-spezifischen Histonacetylierung kombinieren. Dadurch konnte ich herausfinden, dass Nukleosomen an trypanosomischen TSSen stark acetyliertes H2A.Z und H4 enthalten und dass für diese Modifizierungen die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 verantwortlich sind. Eine Reduzierung der HAT2-Levels führte zu einer Reduzierung von H4 Acetylierung, verschlechterte die gezielte H2A.Z Positionierung und führte dazu, dass die Transkriptioninitiierung sich verlagerte. Wohingegen eine Reduzierung von HAT1, die zwar nur einen kleinen Einfluss auf die H2A.Z Positionierung hatte, eine sehr starke Verringerung von acetyliertem H2A.Z und der Transkriptionsrate zur Folge hatte. Durch meine Ergebnisse konnte ich zeigen, dass in T. brucei, einem evolutionär divergenten eukaryotischem Organismus, die Prozesse der Histonacetylierung, H2A.Z Positionierung und Transkriptionsinitiierung sehr stark miteinander verbunden sind. Meine Arbeit ist des weiteren ein Beweis dafür, dass T. brucei ein sehr wichtiger Modellorganismus für die Forschung an Chromatin ist. Insgesamt erlauben meine Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass H2A.Z, egal ob modifiziert oder nicht, ein Herausstellungsmerkmal für TSSen ist, während acetyliertes H2A.Z essentiell für die Transkriptionsinitiierung darstellt. Zusammengefasst, weisen die Daten meiner Doktorarbeit darauf hin, dass die Etablierung von bestimmten Chromatinstrukturen an TSSen eines der frühesten entwickelten Mechanismen zur Kontrolle der Transkriptionsinitiierung in Eukaryoten ist.
KW  - Chromatin
KW  - Histone
KW  - Histonacetyltransferase
KW  - Transcription
KW  - Acetylation
KW  - H2A.Z
KW  - Trypanosoma Brucei
KW  - Histone Acetylation
KW  - Transcription
KW  - Chromatin
KW  - Histone
KW  - Histone modification
KW  - Histone variant
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250568
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eisenhuth, Nicole Juliana
T1  - Novel and conserved roles of the histone methyltransferase DOT1B in trypanosomatid parasites
T1  - Neue und konservierte Rollen der Histonmethyltransferase DOT1B in Parasiten der Ordnung Trypanosomatida
N2  - The family of trypanosomatid parasites, including the human pathogens Trypanosoma brucei and Leishmania, has evolved sophisticated strategies to survive in harmful host environments. While Leishmania generate a safe niche inside the host’s macrophages, Trypanosoma brucei lives extracellularly in the mammalian bloodstream, where it is constantly exposed to the attack of the immune system. Trypanosoma brucei ensures its survival by periodically changing its protective surface coat in a process known as antigenic variation. The surface coat is composed of one species of ‘variant surface glycoprotein’ (VSG). Even though the genome possesses a large repertoire of different VSG isoforms, only one is ever expressed at a time from one out of the 15 specialized subtelomeric ‘expression sites’ (ES). Switching the coat can be accomplished either by a recombination-based exchange of the actively-expressed VSG with a silent VSG, or by a transcriptional switch to a previously silent ES. 
The conserved histone methyltransferase DOT1B methylates histone H3 on lysine 76 and is involved in ES regulation in T. brucei. DOT1B ensures accurate transcriptional silencing of the inactive ES VSGs and influences the kinetics of a transcriptional switch. The molecular machinery that enables DOT1B to execute these regulatory functions at the ES is still elusive, however. To learn more about DOT1B-mediated regulatory processes, I wanted to identify DOT1B-associated proteins. 
Using two complementary approaches, specifically affinity purification and proximity-dependent biotin identification (BioID), I identified several novel DOT1B-interacting candidates. To validate these data, I carried out reciprocal co-immunoprecipitations with the most promising candidates. An interaction of DOT1B with the Ribonuclease H2 protein complex, which has never been described before in any other organism, was confirmed. Trypanosomal Ribonuclease H2 maintains genome integrity by resolving RNA-DNA hybrids, structures that if not properly processed might initiate antigenic variation. I then investigated DOT1B’s contribution to this novel route to antigenic variation. Remarkably, DOT1B depletion caused an increased RNA-DNA hybrid abundance, accumulation of DNA damage, and increased VSG switching. Deregulation of VSGs from throughout the silent repertoire was observed, indicating that recombination-based switching events occurred. Encouragingly, the pattern of deregulated VSGs was similar to that seen in Ribonuclease H2-depleted cells. Together these data support the hypothesis that both proteins act together in modulating RNA-DNA hybrids to contribute to the tightly-regulated process of antigenic variation.
The transmission of trypanosomatid parasites to mammalian hosts is facilitated by insect vectors. Parasites need to adapt to the extremely different environments encountered during transmission. To ensure their survival, they differentiate into various specialized forms adapted to each tissue microenvironment. Besides antigenic variation, DOT1B additionally affects the developmental differentiation from the mammalian-infective to the insect stage of Trypanosoma brucei. However, substantially less is known about the influence of chromatin-associated proteins such as DOT1B on survival and adaptation strategies of related Leishmania parasites. To elucidate whether DOT1B’s functions are conserved in Leishmania, phenotypes after gene deletion were analyzed. As in Trypanosoma brucei, generation of a gene deletion mutant demonstrated that DOT1B is not essential for the cell viability in vitro. DOT1B deletion was accompanied with a loss of histone H3 lysine 73 trimethylation (the lysine homologous to trypanosomal H3K76), indicating that Leishmania DOT1B is also solely responsible for catalyzing this post-translational modification. As in T. brucei, dimethylation could only be observed during mitosis/cytokinesis, while trimethylation was detectable throughout the cell cycle in wild-type cells. In contrast to the trypanosome DOT1B, LmxDOT1B was not essential for differentiation in vitro. However, preliminary data indicate that the enzyme is required for effective macrophage infection. 
In conclusion, this study demonstrated that the identification of protein networks and the characterization of protein functions of orthologous proteins from related parasites are effective tools to improve our understanding of the parasite survival strategies. Such insights are a necessary step on the road to developing better treatments for the devastating diseases they cause.
N2  - Vertreter der Familie der Trypanosomatidae einschließlich der humanpathogenen Trypanosoma brucei und Leishmania Arten entwickelten eine Reihe von ausgeklügelten Strategien, um in ihren Wirten zu überleben. Während sich Leishmanien eine sichere Nische in den Makrophagen ihrer Wirte aufbauen, lebt Trypanosoma brucei ausschließlich extrazellulär im Blutkreislauf der Säugetiere. Dort ist der Parasit ständig dem Angriff des Immunsystems ausgesetzt. Um sein Überleben zu sichern, wechselt er regelmäßig seine variablen Oberflächenproteine (VSG), eine Strategie, die auch als antigene Variation bekannt ist. Obwohl das Genom des Parasiten über ein enormes Repertoire an VSG Genen verfügt, wird immer nur eine einzige Art von einer von 15 spezialisierten telomerproximalen Expressionsstellen (ES) transkribiert. Um die VSG-Zelloberfläche zu wechseln, können Trypanosomen das VSG Gen der aktiven ES gegen ein inaktives VSG aus dem gigantischen Repertoire mittels Rekombination eintauschen. Eine weitere Möglichkeit ist der Transkriptionswechsel zu einer zuvor stillen ES.
Die konservierte Histonmethyltransferase DOT1B katalysiert die Methylierung von Histon H3 am Lysin 76 und ist an der ES-Regulation beteiligt. DOT1B gewährleistet den transkriptionell inaktiven Status der ES und beeinflusst die Kinetik eines transkriptionellen ES Wechsels. Die molekularen Komponenten, die DOT1B diese regulatorischen Funktionen an der ES ermöglichen, sind jedoch noch unbekannt. Um mehr über die von DOT1B vermittelten Mechanismen zu erfahren, ist es notwendig, DOT1B-assoziierte Proteine zu identifizieren. 
Durch die Anwendung von komplementären biochemischen Proteinaufreinigungsmethoden gelang es mir, mehrere potentielle Proteininteraktionen zu DOT1B zu entdecken. Um die Daten zu validieren, führte ich weitere Proteinaufreinigungen mit den vielversprechendsten Kandidaten durch. Eine Interaktion zwischen DOT1B und der Ribonuklease H2 konnte bestätigt werden - eine Interaktion, die noch nie zuvor in anderen Organismen beschrieben wurde. In Trypanosomen gewährleistet Ribonuklease H2 die Genomintegrität, indem das Enzym RNA-DNA-Hybride auflöst. Diese Strukturen können zudem, wenn sie nicht richtig prozessiert werden, antigene Variation initiieren. In dieser Studie wurde daher außerdem DOT1B’s Beitrag zu diesem Weg der Initiation der antigenen Variation analysiert. In der Tat konnte gezeigt werden, dass DOT1B RNA-DNA-Hybride moduliert und die Genomintegrität sowie VSG-Wechselrate beeinflusst. Die Tatsache, dass in DOT1B-Mutanten VSG Isoformen von den unterschiedlichsten Genomregionen exprimiert wurden, deutet darauf hin, dass rekombinations-basierte Ereignisse dem VSG-Wechsel zu Grunde lagen. Da in den DOT1B-Mutanten ähnliche VSG exprimiert wurden wie in Ribonuklease H2-Mutanten, kann vermutet werden, dass beide Proteine bei der Modulation der RNA-DNA-Hybride zusammenwirken, um antigene Variation zu regulieren.  
Trypanosomen und Leishmanien werden mittels Insektenvektoren auf den nächsten Säugerwirt übertragen. Sie müssen daher nicht nur im Säugerwirt überleben, sondern sich auch an die extrem unterschiedliche Umgebung im Vektor anpassen. Dafür differenzieren sich die Parasiten in speziell angepasste Zellstadien. Zusätzlich zu der antigenen Variation beeinflusst DOT1B die Entwicklungsdifferenzierung in Trypanosoma brucei. In Leishmanien hingegen ist über den Einfluss von chromatin-assoziierten Proteinen wie DOT1B auf die Überlebens- und Anpassungsstrategien wesentlich weniger bekannt. Um herauszufinden, ob die Funktionen von DOT1B in Leishmanien konserviert sind, wurden Phänotypen nach Gendeletion analysiert. Wie auch in Trypanosoma brucei konnte gezeigt werden, dass DOT1B für das Überleben der Parasiten nicht essentiell ist. Die Deletion von DOT1B ging mit einem Verlust der Trimethylierung von Histon H3 am Lysin 73 (dem zum trypanosomalen H3K76 homologen Lysin) einher, was darauf hinweist, dass DOT1B auch in Leishmanien allein für die Katalyse dieser posttranslationalen Modifikation verantwortlich ist. Wie in Trypanosoma brucei konnte eine Dimethylierung nur in der Mitose/Zytokinese beobachtet werden, wobei die Trimethylierung während des gesamten Zellzyklus in Wildtyp-Zellen nachweisbar war. Im Gegensatz zum trypanosomalen DOT1B war LmxDOT1B für die Differenzierung in vitro entbehrlich. Vorläufige Daten zeigen jedoch, dass das Enzym für eine wirksame Makrophageninfektion wesentlich ist.
Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass die Identifizierung von Proteinnetzwerken und die Charakterisierung von Funktionen orthologer Proteine aus verwandten Parasiten wirksame Werkzeuge sind, um unser Verständnis der Überlebensstrategien der Parasiten zu verbessern. Solche Erkenntnisse sind ein notwendiger Schritt auf dem Weg zu effektiveren Behandlungsmethoden für die verheerenden Krankheiten, die diese Parasiten verursachen.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Leishmania
KW  - Chromatin
KW  - Histon-Methyltransferase
KW  - DNA repair
KW  - developmental differentiation
KW  - DOT1
KW  - Ribonuclease H2
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219936
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weisert, Nadine
T1  - Characterization of telomere-associated proteins in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
T1  - Charakterisierung Telomer-assoziierter Proteine in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
N2  - The unicellular pathogen Trypanosoma brucei is the causative agent of African 
trypanosomiasis, an endemic disease prevalent in sub-Saharan Africa. Trypanosoma brucei alternates between a mammalian host and the tsetse fly vector. The extracellular parasite survives in the mammalian bloodstream by periodically exchanging their ˈvariant surface glycoproteinˈ (VSG) coat to evade the host immune response. This antigenic variation is achieved through monoallelic expression of one VSG variant from subtelomeric ˈbloodstream 
form expression sitesˈ (BES) at a given timepoint. During the differentiation from the bloodstream form (BSF) to the procyclic form (PCF) in the tsetse fly midgut, the stage specific surface protein is transcriptionally silenced and replaced by procyclins. Due to their subtelomeric localization on the chromosomes, VSG transcription and silencing is partly regulated by homologues of the mammalian telomere complex such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 as well as by ˈtelomere-associated proteinsˈ (TelAPs) like TelAP1. To gain more insights into transcription regulation of VSG genes, the identification and characterization of other TelAPs is critical and has not yet been achieved. In a previous study, two biochemical approaches were used to identify other novel TelAPs. By using ˈco-immunoprecipitationˈ (co-IP) to enrich possible interaction partners of TbTRF and by affinity chromatography using telomeric repeat oligonucleotides, a listing of TelAP candidates has been conducted. With this approach TelAP1 was identified as a novel component of the telomere complex, involved in the kinetics of transcriptional BES silencing during BSF to PCF differentiation. To gain further insights into the telomere complex composition, other previously enriched proteins were characterized through a screening process using RNA interference to deplete potential candidates. VSG expression profile changes and overall proteomic changes after depletion were analyzed by mass spectrometry. With this method, one can gain insights into the functions of the proteins and their involvement in VSG expression site regulation. To validate the interaction of proteins enriched by co-IP with TbTRF and TelAP1 and to identify novel interaction proteins, I performed reciprocal affinity purifications of the four most promising candidates (TelAP2, TelAP3, PPL2 and PolIE) and additionally confirmed colocalization of two candidates with TbTRF via immunofluorescence (TelAP2, TelAP3). TelAP3 colocalizes with TbTRF and potentially interacts with TbTRF, TbTIF2, TelAP1 and TelAP2, as well as with two translesion polymerases PPL2 and PolIE in BSF. PPL2 and PolIE seem to be in close contact to each other at the telomeric ends and fulfill different roles as only PolIE is involved in VSG regulation while PPL2 is not. TelAP2 was previously characterized to be associated with telomeres by partially colocalizing with TbTRF and cells show a VSG derepression phenotype when the protein was depleted. Here I show that TelAP2 interacts with the telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2 as well as with the telomere-associated protein TelAP1 in BSF and that TelAP2 depletion results in a loss of TelAP1 colocalization with TbTRF in BSF.  
In conclusion, this study demonstrates that characterizing potential TelAPs is effective in gaining insights into the telomeric complex's composition and its role in VSG regulation in Trypanosoma brucei. Understanding these interactions could potentially lead to new therapeutic targets for combatting African trypanosomiasis.
N2  - Der einzellige Pathogen Trypanosoma brucei ist der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis, eine endemische Krankheit vertreten in der Sub-Sahara Zone Afrikas. Trypanosoma brucei wechselt zwischen einem Säugerwirt und dem Insektenvektor, der Tsetse-Fliege. Der im Blutstrom des Säugers vorkommende, extrazelluläre Parasit ändert seinen Oberflächenmantel bestehend aus dem ˈvariablen Oberflächenproteinˈ (VSG) in periodischen Abständen, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen. Diese antigenetische Variation wird durch die monoallelische Expression einer einzelnen VSG-Variante, lokalisiert auf den ˈBlutstromform Expressionsseitenˈ (BES), zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht. Diese stadienspezifischen Oberflächenproteine werden während der Differenzierung der ˈBlutstromformˈ (BSF) zur ˈprozyklischen Formˈ (PCF) im Mitteldarm der Tsetse-Fliege stillgelegt und durch Prozykline ersetzt. Wegen der subtelomeren Lokalisation wird die VSG Transkription und Stilllegung teilweise durch Homologe des Säuger Telomerkomplexes TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1 als auch durch Telomer-assoziierte Proteine (TelAPs) wie TelAP1 reguliert. Um Einblicke in die Transkriptionsregulation der VSG Gene zu erhalten, ist die Identifikation und Charakterisierung anderer Telomer-assoziierter Proteine von großem Interesse. 
In einer vorherigen Studie wurden zwei komplementäre biochemische Versuchsansätze verwendet, um weitere neue TelAPs zu identifizieren. Es wurde eine ko-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner von TbTRF zu identifizieren, sowie eine Affinitätschromatographie unter Verwendung telomerischen Wiederholungseinheiten. Hierdurch wurde eine Liste von potenziellen Kandidaten generiert. Mit diesem Ansatz wurde TelAP1 als neue Komponente des Telomerkomplexes identifiziert, welches an der Kinetik der transkriptionellen BES-Stilllegung während der Differenzierung von BSF zu PCF beteiligt ist.
Um weitere Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes zu erhalten, wurden zuvor angereicherte Proteine durch einen Screening-Prozess unter Verwendung von RNA-Interferenz charakterisiert. Nach der Depletion von 21 Proteinen wurden massenspektrometrische Analysen der VSG Expressionsprofiländerungen sowie allgemeine Veränderungen des Proteomenprofils analysiert. Mit dieser Methode können Erkenntnisse über die Funktion der jeweiligen Proteine und ihrer Beteiligung an der Regulierung der antigenetischen Variation von T. brucei gewonnen werden. Um die Interaktionen von Proteinen zu validieren, welche bei den Co-Immunpräzipitationen mit TbTRF und TelAP1 angereichert wurden, habe ich eine reziproke Affinitätschromatographie mit vier der vielversprechendsten Kandidaten durchgeführt (TelAP2, TelAP3, PPL2 und PolIE). Zusätzlich bestätigte ich die Co-lokalisation von zwei Kandidaten mit TbTRF via Immunfluoreszenzaufnahmen (TelAP2, TelAP3). TelAP3 ko-lokalisiert mit TbTRF und TelAP1 und interagiert potenziell mit TbTRF, TbTIF2, TelAP1 und TelAP2 als auch mit den zwei Transläsionspolymerasen PPL2 und PolIE in BSF. PPL2 und PolIE stehen in engem Kontakt zueinander und nehmen an den Telomerenden unterschiedliche Funktionen ein, da nur PolIE an der VSG Regulation beteiligt ist.
TelAP2 wurde in einer vorherigen Publikation als Telomer-assoziiertes Protein durch partielle Co-Lokalisation mit TbTRF identifiziert und Zellen zeigen nach der Depletion von TelAP2 eine Derepression von zuvor stillgelegten VSGs. In dieser Studie zeige ich, dass TelAP2 mit den Telomer-bindenden Proteinen TbTRF und TbTIF2 sowie mit dem telomerassoziierten Protein TelAP1 in BSF interagiert und dass die Depletion von TelAP2 zu dem Verlust der Co-Lokalisation von TelAP1 mit TbTRF in BSF führt. 
Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Charakterisierung potenzieller TelAPs dazu beiträgt, Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes und dessen Rolle bei der VSG-Regulation in Trypanosoma brucei zu gewinnen. Das Verständnis dieser Interaktionen könnte möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten zur Bekämpfung der afrikanischen Trypanosomiasis führen.
KW  - Telomer <Molekulargenetik>
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - telomere-associated protein
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352732
ER  -