TY - THES A1 - Semeniak, Daniela T1 - Role of bone marrow extracellular matrix proteins on platelet biogenesis and function T1 - Die Rolle der extrazellulären Matrixproteine des Knochenmarks auf die Thrombozytenbiogenes und -funktion N2 - Platelets, small anucleated blood cells responsible for hemostasis, interact at sights of injury with several exposed extracellular matrix (ECM) proteins through specific receptors. Ligand binding leads to activation, adhesion and aggregation of platelets. Already megakaryocytes (MKs), the immediate precursor cells in bone marrow (BM), are in constant contact to these ECM proteins (ECMP). The interaction of ECMP with MKs is, in contrast to platelets, less well understood. It is therefore important to study how MKs interact with sinusoids via the underlying ECMP. This thesis addresses three major topics to elucidate these interactions and their role in platelet biogenesis. First, we studied the topology of ECMP within BM and their impact on proplatelet formation (PPF) in vitro. By establishing a four-color immunofluorescence microscopy we localized collagens and other ECMP and determined their degree of contact towards vessels and megakaryocytes (MKs). In in vitro assays we could demonstrate that Col I mediates increased MK adhesion, but inhibits PPF by collagen receptor GPVI. By immunoblot analyses we identified that the signaling events underyling this inhibition are different from those in platelet activation at the Src family kinase level. Second, we determined the degree of MK-ECM interaction in situ using confocal laser scanning microscopy of four-color IF-stained femora and spleen sections. In transgenic mouse models lacking either of the two major collagen receptors we could show that these mice have an impaired association of MKs to collagens in the BM, while the MK count in spleen increased threefold. This might contribute to the overall unaltered platelet counts in collagen receptor-deficient mice. In a third approach, we studied how the equilibrium of ECMP within BM is altered after irradiation. Collagen type IV and laminin-α5 subunits were selectively degraded at the sinusoids, while the matrix degrading protease MMP9 was upregulated in MKs. Platelet numbers decreased and platelets became hyporesponsive towards agonists, especially those for GPVI activation. Taken together, the results indicate that MK-ECM interaction differs substantially from the well-known platelet-ECM signaling. Future work should further elucidate how ECMP can be targeted to ameliorate the platelet production and function defects, especially in patients after BM irradiation. N2 - Thrombozyten, kleine kernlose Zellen, die für die Hämostase verantwortlich sind, interagieren an verletzten Gefäßwänden mit exponierten extrazellulären Matrixproteinen (EZMP) durch Oberflächenrezeptoren. Durch die Ligandenbindung werden die Thrombozyten aktiviert, adhärieren und aggregieren schlussendlich. Schon Megakaryozyten (MKs), die unmittelbaren Vorläuferzellen im Knochenmark (KM), stehen ebenfalls mit EZMP im ständigen Kontakt. Im Gegensatz zur Thrombozyteninteraktion ist die Interaktion der MKs mit EZMP jedoch nicht sehr gut untersucht. Aus diesem Grund ist es wichtig zu verstehen wie MKs mit Sinusoiden durch die darunterliegenden EZMP interagieren. Diese Doktorarbeit beleuchtet dazu drei Hauptthemen, die zu einem besseren Verständnis dieser Interaktion und dessen Rolle in der Thrombozytenbildung beitragen. In einem ersten Themenblock klärten wir die Topologie verschiedener EZMP des Knochenmarks und deren Rolle bei der Proplättchenbildung auf. Durch die Etablierung einer Vierfarben-Immunfluoreszenzmikroskopie, lokalisierten wir verschiedene Kollagene und andere EZMP im KM und bestimmten deren Kontakt zu Gefäßen und MKs. In in vitro-Ansätzen konnten wir demonstrieren, dass Kollagen Typ I eine erhöhte Adhäsion von MKs vermittelt, aber die Proplättchenbildung durch den Kollagenrezeptor GPVI inhibiert. Mittels Immunoblotanalysen identifizierten wir eine Signalkaskade, die von der Thrombozytenaktivierung auf der Ebene der Src family Kinasen abweicht. In einem zweiten Themenkomplex bestimmten wir in situ den Grad an Interaktion von MKs mit EZMP mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie von vierfach immunfluoreszenzgefärbten Femora- und Milzschnitten. In transgenen Mäusen, denen einer der zwei Hauptkollagenrezeptoren fehlen, konnten wir zeigen, dass MKs dieser Mäuse eine veränderte Assoziation zu Kollagenen im Knochenmark aufweisen, während die MK-Anzahl in der Milz um das Dreifache anstieg. Dies könnte insgesamt zur unbeeinflussten Thrombozytenzahl in diesen Mäusen beitragen. In einem dritten Themenkomplex untersuchten wir wie das Gleichgewicht im Knochenmark nach Bestrahlung beeinflusst ist. Spezifisch Kollagen Typ IV und laminin-α5 waren an den Sinusoiden degradiert, während die Expression der matrixabbauenden Protease MMP-9 in MKs hochreguliert war. Die Thrombozytenzahl sank und sie wurden hyporesponsiv auf Agonisten, speziell auf diejenigen für die GPVI-Aktivierung. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Interaktion von MKs mit EZMP sich substantiell von der Thrombozyten-EZMP vermittelten Signaltransduktion unterscheidet. Zukünftige Untersuchungen sollen weiter beleuchten wie EZMP gezielt beeinflusst werden können um Defekte in der Thrombozytenproduktion und –funktion abzumildern, besonders in Patienten nach Bestrahlung. KW - Knochenmark KW - Thrombozyt KW - Extracellular matrix proteins KW - platelet biogenesis KW - Extrazelluläre Matrix KW - Megakaryocytes KW - platelets Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155857 ER - TY - THES A1 - Gerner, Frank T1 - Functional analysis of polarization and podosome formation of murine and human megakaryocytes T1 - Funktionale Untersuchungen der Polarisation und Podosomenbildung muriner und humaner Megakaryozyten N2 - In mammals, blood platelets are produced by large bone marrow (BM) precursor cells, megakaryocytes (MK) that extend polarized cell protrusions (proplateles) into BM sinusoids. Proplatelet formation (PPF) requires substantial cytoskeletal rearrangements that have been shown to involve the formation of podosomes, filamentous actin (F-actin) and integrin-rich structures. However, the exact molecular mechanisms regulating MK podosome formation, polarization and migration within the BM are poorly defined. According to current knowledge obtained from studies with other cell types, these processes are regulated by Rho GTPase proteins like RhoA and Cdc42. In this thesis, polarization and podosome formation were investigated in MKs from genetically modified mice, as well as the cell lines K562 and Meg01 by pharmacological modulation of signaling pathways. The first part of this thesis describes establishment of the basic assays for investigation of MK polarization. Initial data on polarization of the MK-like erythroleukemia cell line K562 revealed first insights into actin and tubulin dynamics of wild type (WT) and RhoA knock-out (RhoA-/-) K562 cells. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induction of K562 cells led to the expected MK-receptor upregulation but also RhoA depletion and altered polarization patterns. The second part of this thesis focuses on podosome formation of MKs. RhoA is shown to be dispensable for podosome formation. Cdc42 is revealed as an important, but not essential regulator of MK spreading and podosome formation. Studies of signaling pathways of podosome formation reveal the importance of the tyrosine kinases Src, Syk, as well as glycoprotein (GP)VI in MK spreading and podosome formation. This thesis provides novel insights into the mechanisms underlying polarization and podosome formation of MKs and reveals new, important information about cytoskeletal dynamics of MKs and potentially also platelets. N2 - Bei Säugetieren entstehen Blutplättchen aus großen Knochenmark-vorläuferzellen, Megakaryozyten, die lange, polarisierte Zellprotrusionen (Proplättchen) in Knochenmarkssinusoide ausstülpen. Die Bildung von Proplättchen erfordert eine umfangreiche Reorganisation des Zytoskeletts, die die Bildung von Podosomen, F-Aktin- und Integrinreichen Strukturen beinhaltet. Die genauen molekularen Mechanismen, die megakaryozytäre Podosomenbildung, Polarisation und Migration im Knochenmark regulieren, sind jedoch bisher unzureichend erforscht. Rho GTPasen wie beispielsweise RhoA und Cdc42 sind nachgewiesenermaßen beteiligt an der klassischen Zytoskelettregulierung. In dieser Dissertation wurden die obengenannten Reifungsprozesse mithilfe von Megakaryozyten von genetisch modifizierten Mäusen sowie den Zelllinien K562 und Meg01 durch pharmakologische Beeinflussung zellulärer Signaltransmitter erforscht. Im ersten Teil der Dissertation wurden Experimente zur Untersuchung megakaryozytärer Polarisation etabliert. Initiale Daten über die Polarisation der megakaryozytären, erythroleukämischen Zelllinie K562 erlaubten Einblicke in Aktin- und Tubulindynamik von Wildtyp- und RhoA-defizienten K562 Zellen. Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)-induzierte K562-Differenzierung verursachte die erwartete Hochregulierung megakaryozytärer Rezeptoren, aber auch eine unerwartete RhoA-Depletion und bisher unbeobachtete Polarisationsmuster. Der zweite Teil dieser Dissertation galt der Untersuchung der Podosomenbildung von Megakaryozyten. RhoA zeigte sich als entbehrlich für die Podosomenbildung, während Cdc42 sich als wichtiger, dennoch nicht essentieller Regulator der podosomenbildenden Zytoskelettdynamik erwies. Untersuchungen von Signalwegen in der Podosomenbildung von Megakaryozyten offenbarten die Bedeutung von Tyrosinkinasen Src, Syk sowie Glykoprotein VI bei der MK-Adhäsion und der Bildung von Podosomen. Somit liefert diese Dissertation neue Einblicke in die Signalwege der dynamischen Regulation des Zytoskeletts in Megakaryozyten. KW - Megakaryozyt KW - megakaryocyte KW - polarization KW - RhoA KW - CDC42 KW - podosome formation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160508 ER - TY - THES A1 - Schmithausen, Patrick Alexander Gerhard T1 - Three-dimensional fluorescence image analysis of megakaryocytes and vascular structures in intact bone T1 - Dreidimensionale Fluoreszenzbildanalyse von Megakaryozyten und Gefäßstrukturen in intaktem Knochen N2 - The thesis provides insights in reconstruction and analysis pipelines for processing of three-dimensional cell and vessel images of megakaryopoiesis in intact murine bone. The images were captured in a Light Sheet Fluorescence Microscope. The work presented here is part of Collaborative Research Centre (CRC) 688 (project B07) of the University of Würzburg, performed at the Rudolf-Virchow Center. Despite ongoing research within the field of megakaryopoiesis, its spatio-temporal pattern of megakaryopoiesis is largely unknown. Deeper insight to this field is highly desirable to promote development of new therapeutic strategies for conditions related to thrombocytopathy as well as thrombocytopenia. The current concept of megakaryopoiesis is largely based on data from cryosectioning or in vitro studies indicating the existence of spatial niches within the bone marrow where specific stages of megakaryopoiesis take place. Since classic imaging of bone sections is typically limited to selective two-dimensional views and prone to cutting artefacts, imaging of intact murine bone is highly desired. However, this has its own challenges to meet, particularly in image reconstruction. Here, I worked on processing pipelines to account for irregular specimen staining or attenuation as well as the extreme heterogeneity of megakaryocyte morphology. Specific challenges for imaging and image reconstruction are tackled and solution strategies as well as remaining limitations are presented and discussed. Fortunately, modern image processing and segmentation strongly benefits from continuous advances in hardware as well as software-development. This thesis exemplifies how a combined effort in biomedicine, computer vision, data processing and image technology leads to deeper understanding of megakaryopoiesis. Tailored imaging pipelines significantly helped elucidating that the large megakaryocytes are broadly distributed throughout the bone marrow facing a surprisingly dense vessel network. No evidence was found for spatial niches in the bone marrow, eventually resulting in a revised model of megakaryopoiesis. N2 - Im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens wurden Segmentierungs- und Auswertepipelines dreidimensionaler Bilder von Zellen und Gefäßen im intakten Mausknochen erarbeitet. Die Bilder entstanden durch Fluoreszenzaufnahmen eines Lichtblattmikroskops. Das Dissertationsvorhaben war Teil des Sonderforschungsbereichs 688 (Teilprojekts B07) der Universität Würzburg und es wurde am Rudolf-Virchow-Zentrum durchgeführt. Trotz einer Vielzahl aktueller Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Megakaryopoese sind Erkenntnisse über deren räumlich-zeitliche Zusammenhänge größtenteils unbekannt. Neuere wissenschaftliche Erkenntnisse auf diesem Gebiet wären insbesondere hilfreich für die Weiterentwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten, die an Thrombozytopenien oder Thrombozytopathien leiden. Das aktuell vorherrschende Modell zur Erklärung der Megakaryopoese geht von der Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark aus, in denen sich die einzelnen Schritte der Megakaryopoese vollziehen. Dieses Modell basiert hauptsächlich auf Auswertungen von Gefrierschnitten sowie in-vitro Experimenten. Da die klassische Bildgebung von Knochenschnitten nur auf eine bestimmte Anzahl zweidimensionaler Schnitte begrenzt ist und deren Qualität unter Schnittartefakten leidet, ist die Bildgebung des intakten Knochens von besonderem Interesse. Dennoch führt dies zu neuen Herausforderungen im Bereich der Bilddatenauswertung. Im vorliegenden Dissertationsvorhaben beschäftige ich mich in diesem Bereich mit der Erarbeitung von Auswerteprotokollen, welche beispielsweise den Einfluss unregelmäßiger Färbungen oder Signalabschwächungen sowie die extreme Heterogenität der Megakaryozytenmorphologie berücksichtigen. Spezifische Herausforderungen für die Bildgebung und Bildrekonstruktion werden in Angriff genommen und Lösungsstrategien sowie verbleibende Einschränkungen werden vorgestellt und diskutiert. Erfreulicherweise profitieren insbesondere die moderne Bildbearbeitung sowie die Objekterkennung in großem Ausmaß von fortlaufenden Entwicklungen aus dem Hard- sowie Softwarebereich. Dieses Dissertationsvorhaben zeigt auf exemplarische Art und Weise auf, wie gemeinsame Forschungsanstrengungen im Bereich der Biomedizin, des Maschinellen Sehens, der Datenverarbeitung sowie der Bildtechnologie zu einem tieferen Verständnis der Megakaryopoese führen. Die maßgeschneiderten Pipelines zur Bilddatenauswertung stützten letztlich die These, dass größere Megakaryozyten im Knochenmark breit verteilt sind und von einem überraschend dichten Gefäßnetz umgeben sind. Beweise für die Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark konnten nicht gefunden warden. Dieses führte schließlich zur Vorstellung eines überarbeiteten Modells der Megakaryopoese. KW - Megakaryozytopoese KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Megakaryozyt KW - Lichtscheibenmikroskopie KW - Bildverarbeitung KW - lightsheet microscopy KW - megakaryopoiesis KW - fluorescence microscopy KW - intact bone imaging KW - object segmentation KW - Lichtblattmikroskopie KW - Bildbearbeitung KW - Megakaryopoese KW - Bildgebung intakten Knochens Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178541 ER - TY - THES A1 - Nahm, Daniel T1 - Poly(2-oxazine) Based Biomaterial Inks for the Additive Manufacturing of Microperiodic Hydrogel Scaffolds T1 - Poly(2-oxazine) Basierte Biomaterialtinten für die Additive Fertigung von Mikroperiodischen Hydrogelstrukturen N2 - The aim of this thesis was the preparation of a biomaterial ink for the fabrication of chemically crosslinked hydrogel scaffolds with low micron sized features using melt electrowriting (MEW). By developing a functional polymeric material based on 2-alkyl-2-oxazine (Ozi) and 2-alkyl-2-oxazoline (Ox) homo- and copolymers in combination with Diels-Alder (DA)-based dynamic covalent chemistry, it was possible to achieve this goal. This marks an important step for the additive manufacturing technique melt electrowriting (MEW), as soft and hydrophilic structures become available for the first time. The use of dynamic covalent chemistry is a very elegant and efficient method for consolidating covalent crosslinking with melt processing. It was shown that the high chemical versatility of the Ox and Ozi chemistry offers great potential to control the processing parameters. The established platform offers straight forward potential for modification with biological cues and fluorescent markers. This is essential for advanced biological applications. The physical properties of the material are readily controlled and the potential for 4D-printing was highlighted as well. The developed hydrogel architectures are excellent candidates for 3D cell culture applications. In particular, the low internal strength of some of the scaffolds in combination with the tendency of such constructs to collapse into thin strings could be interesting for the cultivation of muscle or nerve cells. In this context it was also possible to show that MEW printed hydrogel scaffolds can withstand the aspiration and ejection through a cannula. This allows the application as scaffolds for the minimally invasive delivery of implants or functional tissue equivalent structures to various locations in the human body. N2 - Das Ziel dieses Projekts war die Herstellung einer Biomaterialtinte, welche die Herstellung chemisch vernetzter, mikrostrukturierter Hydrogelgerüste mittels Melt Electrowriting (MEW) ermöglicht. Die Verwendung von speziell auf den schmelzbasierten 3D Druck angepassten polyoxazinbasierten Polymeren und die Anwendung von dynamisch kovalenter Chemie ermöglichte es, dieses Ziel zu erreichen. Dies ist ein wichtiger Schritt für die aufstrebende, additive Fertigungstechnologie MEW, da nun erstmals weiche und hydrophile Strukturen erzeugt werden können. Speziell die Verwendung der dynamischen Diels-Alder (DA) Chemie ist ein effizienter Weg, die Fertigung von kovalent vernetzten Strukturen mit der Schmelzprozessierung zu vereinen. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die hier etablierte Materialplattform die Möglichkeit zur Modifikation mit biologischen und chemischen Signalen bietet. Dies ist besonders für biologische Anwendungen unerlässlich. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Materials lassen sich leicht auf potentielle Anwendungen anpassen und das Potential für den 4D Druck wurde ebenfalls hervorgehoben. Alles in Allem legt diese Arbeit den Grundstein für eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen sowohl in der Biomedizin als auch in anderen Bereichen. KW - Polymere KW - Ringöffnungspolymerisation KW - Biomaterial KW - 3D-Druck KW - biofabrication KW - poly(2-oxazoline)s KW - poly(2-oxazine)s KW - ring-opening polymerization Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245987 ER - TY - THES A1 - Reimann, Hauke T1 - Schicksal von Mikrokernen bzw. mikrokernhaltigen Zellen und Bedeutung von Mikrokernen als Biomarker T1 - Fate of micronuclei and micronucleated cells along with relevance of micronuclei as biomarker N2 - Mikrokerne sind als wichtiger Biomarker in der Gentoxizitätsforschung seit langer Zeit etabliert und ihre Bildung ist mechanistisch gut verstanden, wohingegen das Mikrokernschicksal und die genaue Funktion von Mikrokernen in der Kanzerogenese unzureichend erforscht sind. Um das Schicksal von Mikrokernen und mikrokernhaltigen Zellen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen, die mit einem GFP-markierten Histon H2B transfiziert worden sind, mittels Lebendzellmikroskopie nach Behandlung mit verschiedenen gentoxischen Agenzien für 96 h untersucht. Parameter wie die Mitose- oder Zelltodrate wurden dabei ebenso wie das Schicksal der Mikrokerne dokumentiert. Während Persistenz und Reinkorporation von Mikrokernen häufig beobachtet wurden, waren Degradation und Auswurf von Mikrokernen selten bis gar nicht zu sehen. Auch konnte ein Teil der mikrokernhaltigen Zellen über mehrere Zellteilungen persistieren und proliferieren, wodurch die in Mikrokernen manifestierte chromosomale Instabilität unverändert bleiben kann. Ein eindeutiger Substanzeinfluss auf das Mikrokernschicksal konnte nicht ausgemacht werden. Extrusion sollte weiterhin durch Behandlung mit Hydroxyurea oder Cytochalasin B in Kombination mit gentoxischer Behandlung induziert werden, es wurde jedoch kein Effekt auf die Extrusionsrate beobachtet. Degradation wurde mittels γH2AX-Antikörperfärbung und transduziertem dsRed-markierten Autophagiemarker LC3B in HeLa-H2B-GFP-Zellen untersucht. Trotz erhöhter DNA-Degradation in Mikrokernen wurde nur selten eine Ko-Lokalisierung mit LC3B beobachtet. Dafür gab es in HeLa-H2B-GFP-Zellen, die zusätzlich mit dsRed markierten Kernmembranmarker Lamin B1 transduziert worden sind, Anzeichen für eine eingeschränkte Mikrokernmembranintegrität. Weiterhin wurden Zytokinese-Block Mikrokerntests nach Behandlung mit Thebain mit und ohne metabolische Aktivierung sowie Celecoxib und Celecoxibderivaten durchgeführt. Hierbei wurde nach Thebainbehandlung nur ohne metabolische Aktivierung und bei Anwesenheit von Zytotoxizität mehr Mikrokerne gefunden, während nach Behandlung mit Celecoxib und Celecoxibderivaten kein Anstieg beobachtet wurde. Zusätzlich wurde der Einfluss durch neurodegenerative Veränderungen auf Mundschleimhautzellen in zwei großen Kohorten untersucht, wobei keine Effekte auf die Häufigkeit von Mikrokernen oder mikrokernhaltigen Zellen zugeordnet werden konnten, während es teilweise bei Parametern, die auf Zytotoxizität hindeuten, zu Veränderungen kam. Es konnte insgesamt gezeigt werden, dass Mikrokerne und mikrokernhaltige Zellen zusätzlich zu ihrer Funktion als Biomarker über wenigstens mehrere Zellteilungen bestehen bleiben können. Auf diese Weise können sie z. B. über Chromothripsis zu einer beschleunigten Kanzerogenese führen, was zu einer schlechten Prognose für Krebspatienten führen kann. N2 - Micronuclei have been established as biomarkers long ago in genotoxicity research and although formation is mechanistically well understood, the fate of micronuclei as well as micronuclei function in carcinogenesis are poorly investigated. To explore the long-term fate of micronuclei and micronucleated cells, HeLa cells transfected with GFP-tagged histone H2B were examined via live cell imaging after treatment with various genotoxic agents for 96 h. Parameters like mitosis or cell death rate as well as the development of micronuclei were analysed. While persistence and reincorporation of micronuclei were frequently observed, degradation and extrusion of micronuclei were found only rarely or never. A subset of micronucleated cells could persist and proliferate over multiple cell divisions, so that micronuclei as manifestation of chromosomal instability also persisted. No clear substance-related effect on micronucleus fate could be determined. Extrusion of micronuclei was furthermore investigated after treatment with hydroxyurea or after combination treatment with cytochalasin B and a genotoxic agent, but no effect on the extrusion rate was observed. Degradation of micronuclei was investigated in detail by γH2AX antibody staining and transduction of dsRed-tagged autophagy marker LC3B in HeLa-H2B- GFP-cells. Although enrichment of DNA degradation in micronuclei were identified, co-localisation with LC3B was observed only rarely. In HeLa-H2B-GFP-cells transduced with dsRed-tagged nuclear membrane marker lamin B1, evidence for impaired nuclear membrane integrity was found. In addition, cytokinesis-block micronucleus tests after treatment with thebaine with and without metabolic activation as well as celecoxib and celecoxib derivatives were conducted. After thebaine treatment, increased micronucleus frequency was only observed without metabolic activation and together with cytotoxicity, while treatment with celecoxib and celecoxib derivatives caused no effect on micronucleus frequency. Effects of neurodegenerative disease on DMA damage in buccal cells of two large cohorts were furthermore investigated, but no effect on the frequency of micronuclei and micronucleated cells was observed, while parameters indicating cytotoxicity showed alterations. All in all, it could be demonstrated, that micronuclei and micronucleated cells, apart from their role as biomarker, can persist for multiple cell divisions. This way, cancerogenesis can be accelerated e.g. via chromothripsis, potentially leading to poor prognosis for cancer patients. KW - Kleinkern KW - Mutagenität KW - Thebain KW - Celecoxib KW - Kognitive Beeinträchtigung KW - Mundschleimhautzellen KW - Lebendzellmikroskopie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240109 ER - TY - THES A1 - Schlegel, Jan T1 - Super-Resolution Microscopy of Sphingolipids and Protein Nanodomains T1 - Hochaufgelöste Mikroskopie von Sphingolipiden und Protein Nanodomänen N2 - The development of cellular life on earth is coupled to the formation of lipid-based biological membranes. Although many tools to analyze their biophysical properties already exist, their variety and number is still relatively small compared to the field of protein studies. One reason for this, is their small size and complex assembly into an asymmetric tightly packed lipid bilayer showing characteristics of a two-dimensional heterogenous fluid. Since membranes are capable to form dynamic, nanoscopic domains, enriched in sphingolipids and cholesterol, their detailed investigation is limited to techniques which access information below the diffraction limit of light. In this work, I aimed to extend, optimize and compare three different labeling approaches for sphingolipids and their subsequent analysis by the single-molecule localization microscopy (SMLM) technique direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). First, I applied classical immunofluorescence by immunoglobulin G (IgG) antibody labeling to detect and quantify sphingolipid nanodomains in the plasma membrane of eukaryotic cells. I was able to identify and characterize ceramide-rich platforms (CRPs) with a size of ~ 75nm on the basal and apical membrane of different cell lines. Next, I used click-chemistry to characterize sphingolipid analogs in living and fixed cells. By using a combination of fluorescence microscopy and anisotropy experiments, I analyzed their accessibility and configuration in the plasma membrane, respectively. Azide-modified, short fatty acid side chains, were accessible to membrane impermeable dyes and localized outside the hydrophobic membrane core. In contrast, azide moieties at the end of longer fatty acid side chains were less accessible and conjugated dyes localized deeper within the plasma membrane. By introducing photo-crosslinkable diazirine groups or chemically addressable amine groups, I developed methods to improve their immobilization required for dSTORM. Finally, I harnessed the specific binding characteristics of non-toxic shiga toxin B subunits (STxBs) and cholera toxin B subunits (CTxBs) to label and quantify glycosphingolipid nanodomains in the context of Neisseria meningitidis infection. Under pyhsiological conditions, these glycosphingolipids were distributed homogenously in the plasma membrane but upon bacterial infection CTxB detectable gangliosides accumulated around invasive Neisseria meningitidis. I was able to highlight the importance of cell cycle dependent glycosphingolipid expression for the invasion process. Blocking membrane accessible sugar headgroups by pretreatment with CTxB significantly reduced the number of invasive bacteria which confirmed the importance of gangliosides for bacterial uptake into cells. Based on my results, it can be concluded that labeling of sphingolipids should be carefully optimized depending on the research question and applied microscopy technique. In particular, I was able to develop new tools and protocols which enable the characterization of sphingolipid nanodomains by dSTORM for all three labeling approaches. N2 - Die Entwicklung von zellulären Lebensformen auf der Erde basiert auf der Entstehung biologischer Lipid-Membranen. Obwohl viele Techniken zur Verfügung stehen, welche es erlauben deren biophysikalische Eigenschaften zu untersuchen, sind die Möglichkeiten, verglichen mit der Analyse von Proteinen, eher eingeschränkt. Ein Grund hierfür, ist die geringe Größe von Lipiden und deren komplexe Zusammenlagerung in eine asymmetrische dicht gepackte Lipiddoppelschicht, welche sich wie eine heterogene zweidimensionale Flüssigkeit verhält. Durch die lokale Anreicherung von Sphingolipiden und Cholesterol sind Membranen in der Lage dynamische, nanoskopische Domänen auszubilden, welche lediglich mit Techniken, welche die optische Auflösungsgrenze umgehen, detailliert untersucht werden können. Ein wesentliches Ziel meiner Arbeit war es, drei Färbeverfahren für Sphingolipide zu vergleichen, erweitern und optimieren, um eine anschliessende Untersuchung mit Hilfe der einzelmolekülsensitiven Technik dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) zu ermöglichen. Zunächst verwendete ich das klassische Färbeverfahren der Immunfluoreszenz, um Sphingolipid-Nanodomänen auf eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Farbstoff-gekoppelten Antikörpern zu detektieren und quantifizieren. Dieses Vorgehen ermöglichte es mir, Ceramid-angereicherte Plattformen mit einer Größe von ~ 75nm auf der basalen und apikalen Membran verschiedener Zell-Linien zu identifizieren und charakterisieren. Als nächstes Verfahren verwendete ich die Klick-Chemie, um Sphingolipid-Analoge in lebenden und fixierten Zellen zu untersuchen. Eine Kombination aus Fluoreszenz-Mikroskopie und Anisotropie-Messungen erlaubte es mir Rückschlüsse über deren Zugänglichkeit und Konfiguration innerhalb der Plasmamembran zu ziehen. Hierbei lokalisierten Azid-Gruppen am Ende kurzkettiger Fettsäurereste außerhalb des hydrophoben Membrankerns, wodurch sie mittels membran-undurchlässige Farbstoffe angeklickt werden konnten. Im Gegensatz dazu, waren Azide an längeren Fettsäureresten weniger zugänglich und konjugierte Farbstoffe tauchten tiefer in die Plasmamembran ein. Durch die Einführung photoreaktiver Diazirin-Gruppen oder chemisch modifzierbarer Amin-Gruppen wurden Wege geschaffen, welche eine Immobilisierung und anschließende Analyse mit Hilfe von dSTORM ermöglichen. Schließlich nutzte ich das spezifische Bindeverhalten der nicht toxischen B Untereinheiten von Shiga- (STxB) und Cholera-Toxin (CTxB) aus, um Glycosphingolipid Nanodomänen im Kontext einer Neisseria meningitidis Infektion zu untersuchen. Unter physiologischen Bedingungen waren diese homogen in der Plasmamembran verteilt, jedoch reicherten sich CTxB-detektierbare Ganglioside um eindringende Bakterien an. Darüber hinaus konnte ich einen Zusammenhang zwischen der zellzyklusabhängigen Expression von Glycosphingolipiden und dem Eindringen der Bakterien herstellen. Eine Absättigung der Zucker an der äußeren Membran durch CTxB-Vorbehandlung reduzierte die Anzahl von invasiven Bakterien signifikant und bestätigte die Schlüsselrolle von Gangliosiden bei der Aufnahme von Bakterien. Meine Ergebnisse legen Nahe, dass das Färbeverfahren für Sphingolipide an die jeweilige Fragestellung und Mikroskopietechnik angepasst werden sollte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Werkzeuge und Protokolle geschaffen werden, die die Charakterisierung von Sphingolipid-Nanodomänen mittels dSTORM für alle drei Färbeverfahren ermöglichen. KW - Sphingolipide KW - Lipide KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Click-Chemie KW - Lipid Raft KW - super-resolution microscopy KW - sphingolipids KW - labeling techniques KW - dSTORM KW - lipid rafts Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229596 ER - TY - THES A1 - Gross, Carina T1 - The role of platelets in hepatic ischemia reperfusion injury in mice T1 - Die Rolle von Thrombozyten im hepatischen ischämischen Reperfusionsschaden in Mäusen N2 - Platelets are the second most abundant blood cells and their main function is maintenance of vascular integrity. In addition, platelets are increasingly recognized as cells with immune functions, as they participate in the recruitment of immune cells and modulate the progression and severity of an immune response. So-called lipid mediators, which are – besides other cells – released by activated platelets, influence the immune response. LTB4 is one of these potent lipid mediators and is able to activate neutrophils and induce their infiltration into injured tissue. In order to investigate the involvement of platelets in inflammatory processes, a murine model of hepatic ischemia reperfusion injury as well as confocal intravital microscopy of the liver were established. Both methods were used to analyze the influence of platelets on the inflammation that follows sterile liver inflammation. We found platelet function to be unaltered after three hours of reperfusion and platelet aggregation to be irrelevant for the outcome of hepatic ischemia reperfusion injury. However, a strong impact of the GPIb-vWF axis could be observed, as antibody mediated blockade of GPIb as well as vWF-deficiency significantly reduced liver damage markers and decreased neutrophil infiltration. GPIb-IL-4R mice were used to exclude the possibility that the protective effects of the anti-GPIbα antibody treatment (p0p/B) results from something else than blocking GPIbα. Furthermore, the slope of neutrophil infiltration was decreased in p0p/B-treated mice, leading to overall decreased neutrophil numbers in the liver after three hours of reperfusion. Blockade of the integrin αIIbβ3, however, showed no reduction in neutrophil infiltration into the post-ischemic liver, in line with unaltered liver damage. To study the role of leukotriene B4, conditional and constitutive knockout mice for the LTA4 hydrolase, which catalyzes the last step in LTB4 synthesis, were generated. Lta4h deficiency did not affect general platelet functionality in hemostasis and thrombosis. Interestingly, Lta4h-/- mice were not protected from cellular damage following hepatic ischemia, despite lower neutrophil numbers in the post-ischemic liver. Intravital microscopy of the pancreas was established and revealed increased CD4+ T cell numbers in GPVI-deficient animals compared to WT controls in line with the pre-diabetic phenotype of Gp6-/- mice that was revealed in Grzegorz Sumara’s group. Furthermore, platelet ‘behavior’ in pancreatic islets was observed following glucose injection. We found a high number of platelets adherent to islet sinusoids under basal conditions and no rolling/decelerating of platelets following glucose injection. This was accompanied by temporary sinusoidal constriction and stop of the blood flow. This phenomenon was not observed in control settings (injection of PBS, insulin or L-glucose). In a side project, which was carried out jointly with Tobias Heib, a side by side comparison of the classical syringe-based flushing and the centrifugation-based spinning method to isolate murine bone marrow was conducted. Flow cytometry revealed no differences in the distribution of hematopoietic stem cells and immune cells and functional analysis with primary and cultured megakaryocytes (MKs) showed comparable results in all conducted assays. Thus, our data demonstrated that the faster and more efficient spinning method can be used for the isolation of bone marrow cells. N2 - Thrombozyten gehören zu den am stärksten im Blut vertretenen Zellen, deren Hauptaufgabe der Erhalt der vaskulären Integrität darstellt. Des Weiteren werden Thrombozyten immer mehr als „Immunzellen“ betrachtet, da sie andere Zellen rekrutieren, sowie zum Verlauf und der Schwere der Immunantwort beitragen. So genannte Lipidmediatoren, die neben anderen Zellen auch von Thrombozyten freigesetzt werden, sind in der Lage die Immunantwort zu beeinflussen. Leukotrien B4 (LTB4) ist ein solcher hochwirksamer Lipidmediator, der dafür bekannt ist, Neutrophile zu aktivieren und deren Infiltration in verletztes/entzündetes Gewebe zu begünstigen. Um einen besseren Einblick in den Beitrag von Thrombozyten in entzündlichen Prozessen zu bekommen, wurden ein Mausmodell des hepatischen Ischämie/Reperfusionsschadens sowie konfokale Intravitalmikroskopie etabliert. Beide Methoden wurden benutzt, um den Einfluss von Thrombozyten auf eine sterile Entzündungsreaktion zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Thrombozytenaktivität nach 3-stündiger Reperfusion unverändert blieb. Des Weiteren scheint Thrombozytenaggregation für den Ausgang im hepatischen Ischämie- und Reperfusionsmodell vernachlässigbar zu sein, während ein deutlicher Einfluss der GPIb-vWF Achse beobachtet wurde. Antikörper vermittelte GPIb-Blockade sowie vWF Defizienz zeigten reduzierte Werte des Leberschadens sowie geringere Neutrophilzahlen im Lebergewebe. Um auszuschließen, dass die schützenden Effekte der anti-GPIbα Applikation (p0p/B) durch etwas anderes als die Blockade von GPIbα verursacht werden, wurden GPIb-IL-4R Tiere verwendet. Hinzu kommt ein flacherer Anstieg der Neutrophilzahlen in p0p/B behandelten Tieren, was letztlich auch zur geringeren Gesamtzahl nach 3-stündiger Reperfusion führt. Die Blockade des Integrins αIIbβ3 zeigte im Vergleich zu Kontrolltieren unveränderte Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in der post-ischämischen Leber, was in Einklang mit dem unveränderten Leberschaden nach Ischämie/Reperfusion steht. Um den Einfluss von Leukotrienen zu untersuchen, wurden konstitutive und konditionelle Knockout Tiere für die LTA4 Hydrolase generiert, die den letzten Schritt der LTB4-Synthese katalysiert. LTA4H-Defizienz hatte keinen Einfluss auf normale Thrombozytenfunktion in Thrombose und Hämostase. Interessanterweise zeigten diese Tiere jedoch keinen Leber-spezifischen Schutz nach Ischämie, obwohl die Zahl der einwandernden neutrophilen Granulozyten signifikant verringert war. Intravitalmikroskopie des Pankreas wurde erfolgreich etabliert und zeigte erhöhte CD4+ T-Zellzahlen in GPVI-defizienten Tieren im Vergleich zu WT Kontrolltieren. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit dem von Grzegorz Sumaras Gruppe gefundenen prä-diabetischen Phänotyp in Gp6-/- Mäusen. Des Weiteren wurde das „Verhalten“ von Thrombozyten in Langerhans-Inseln nach Glukoseinjektion untersucht. Wir fanden bereits unter Grundbedingungen eine hohe Anzahl von adhärenten Thrombozyten im Gefäßsystem, jedoch kein Verlangsamen/Rollen von Thrombozyten nach Glukose Injektion. Dieser Effekt wurde von einer temporären Verengung des Gefäßsystems und einem Stoppen des Blutflusses begleitet und konnte nicht in Kontrollbedingungen (Injektion von PBS, Insulin oder L-Glukose) beobachtet werden. In einem Nebenprojekt, das gemeinsam mit Tobias Heib durchgeführt wurde, wurden die klassische nadel-basierte Flush- sowie die Zentrifugations-basierte Spin-Methode zur Isolation von murinem Knochenmark verglichen. Durchflusszytometrie zeigte, dass die Verteilung von Stamm- und Immunzellpopulationen unverändert war. Des Weiteren zeigten funktionale Analysen von primären und kultivierten Megakaryozyten (MKs) vergleichbare Ergebnisse in allen durchgeführten Tests. Somit haben unsere Daten gezeigt, dass die schnellere und effizientere Spin-Methode zur Isolierung von Knochenmarkszellen verwendet werden kann. KW - ischemia reperfusion injury KW - liver KW - platelets Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216180 ER - TY - THES A1 - Maier, Sophia Edith T1 - Mapping membrane receptor distribution on resting platelets combining Expansion Microscopy and fluorescence confocal microscopy T1 - Kartierung der Membranrezeptorverteilung auf nicht-aktivierten Blutplättchen mithilfe der Kombination aus Expansionsmikroskopie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie N2 - Stroke and myocardial infarction are the most prominent and severe consequences of pathological thrombus formation. For prevention and/or treatment of thrombotic events there is a variety of anti-coagulation and antiplatelet medication that all have one side effect in common: the increased risk of bleeding. To design drugs that only intervene in the unwanted aggregation process but do not disturb general hemostasis, it is crucial to decipher the exact clotting pathway which has not been fully understood yet. Platelet membrane receptors play a vital role in the clotting pathway and, thus, the aim of this work is to establish a method to elucidate the interactions, clustering, and reorganization of involved membrane receptors such as GPIIb/IIIa and GPIX as part of the GPIb-IX-V complex. The special challenges regarding visualizing membrane receptor interactions on blood platelets are the high abundancy of the first and the small size of the latter (1—3µm of diameter). The resolution limit of conventional fluorescence microscopy and even super-resolution approaches prevents the successful differentiation of densely packed receptors from one another. Here, this issue is approached with the combination of a recently developed technique called Expansion Microscopy (ExM). The image resolution of a conventional fluorescence microscope is enhanced by simply enlarging the sample physically and thus pulling the receptors apart from each other. This method requires a complex sample preparation and holds lots of obstacles such as variable or anisotropic expansion and low images contrast. To increase ExM accuracy and sensitivity for interrogating blood platelets, it needs optimized sample preparation as well as image analysis pipelines which are the main part of this thesis. The colocalization results show that either fourfold or tenfold expanded, resting platelets allow a clear distinction between dependent, clustered, and independent receptor organizations compared to unexpanded platelets.Combining dual-color Expansion and confocal fluorescence microscopy enables to image in the nanometer range identifying GPIIb/IIIa clustering in resting platelets – a pattern that may play a key role in the clotting pathway N2 - Schlaganfall und Myokardinfarkt sind die wohl bekanntesten und schwerwiegendsten Folgen von pathologischer Thrombenbildung. Zur Vorbeugung und/oder Behandlung thrombotischer Ereignisse gibt es eine Vielzahl von Antiplättchen-Medikamenten wie Aspirin oder Plavix, denen allerdings eine Nebenwirkung gemein ist: das unerwünschte, erhöhte Blutungsrisiko. Um Medikamente zu entwickeln, die tatsächlich nur den Aggregationsprozess unterbinden, die generelle Blutstillung jedoch nicht unterbinden, ist es entscheidend, eine detaillierte Vorstellung der Signalkaskade der Plättchenadhesion und -aktivierung zu bekommen. Da diese bisher noch nicht vollständig verstanden wurde, soll eine Methode zur Aufklärung schneller Wechselwirkungen, Clusterbildung und Reorganisation von Plättchenrezeptoren wie GPIIb/IIIa und GPIX, als Teil des Rezeptorkomplex GPIb-IX-V, etabliert werden. Die besonderen Herausforderungen bei der Visualisierung von Wechselwirkungen von Membranrezeptoren auf Blutplättchen sind sowohl ihre hohe Dichte als auch die geringe Größe der Blutplättchen (1–3μm Durchmesser). Die Auflösungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie sowie der superhochauflösenden-Mikroskopie ist nicht in der Lage dicht gepackte Rezeptoren voneinander zu unterscheiden. Eine kürzlich entwickelte Technik namens Expansionsmikroskopie (ExM) bietet hierfür einen Lösungsansatz: Die Bildauflösung von einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop wird dadurch verbessert, dass Proben physikalisch vergrößert werden, sodass markierte Rezeptoren auseinanderdriften und besser voneinander unterschieden werden können. Dieses Verfahren erfordert eine komplexe Probenvorbereitung und birgt viele Unsicherheiten wie die Variabilität des Expansionsfaktors, die Isotropie des Expansionsprozesses sowie das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis in den mikroskopischen Bildern. Um die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Ansatzes auf seine Tauglichkeit zur Untersuchung nicht-aktivierter Blutplättchen zu überprüfen, wurde ein Arbeitsablauf für die optimale Probenvorbereitung entwickelt sowie auf wichtige Analysekriterien für die Kolokalisationsanalyse hingewiesen, welches den Hauptteil dieser Arbeit darstellt. Die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse zeigen, dass die vier– beziehungsweise zehnfache Expansion ruhender Blutplättchen eine eindeutige Unterscheidung zwischen abhängigen, geclusterten und unabhängigen Rezeptororganisationen im Vergleich zu nicht expandierten Blutplättchen erlaubt. Die Kombination aus ExM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte die Identifizierung von Clustern der GPIIb/IIIa-Rezeptoren in ruhenden Blutplättchen – ein Vorgang, der möglicherweise eine Schlüsselrolle in der Plättchenaggregation spielt. KW - Expansion Microscopy KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300317 ER - TY - THES A1 - Heil, Hannah Sophie T1 - Sharpening super-resolution by single molecule localization microscopy in front of a tuned mirror T1 - Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie vor einem abgestimmten Spiegel zur Auflösungsverbesserung N2 - The „Resolution Revolution" in fluorescence microscopy over the last decade has given rise to a variety of techniques that allow imaging beyond the diffraction limit with a resolution power down into the nanometer range. With this, the field of so-called super-resolution microscopy was born. It allows to visualize cellular architecture at a molecular level and thereby achieve a resolution level that had been previously only accessible by electron microscopy approaches. One of these promising techniques is single molecule localization microscopy (SMLM) in its most varied forms such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) which are based on the temporal separation of the emission of individual fluorophores. Localization analysis of the subsequently taken images of single emitters eventually allows to reconstruct an image containing super-resolution information down to typically 20 nm in a cellular setting. The key point here is the localization precision, which mainly depends on the image contrast generated the by the individual fluorophore’s emission. Thus, measures to enhance the signal intensity or reduce the signal background allow to increase the image resolution achieved by dSTORM. In my thesis, this is achieved by simply adding a reflective metal-dielectric nano-coating to the microscopy coverslip that serves as a tunable nano-mirror. I have demonstrated that such metal-dielectric coatings provide higher photon yield at lower background and thus substantially improve SMLM performance by a significantly increased localization precision, and thus ultimately higher image resolution. The strength of this approach is that ─ except for the coated cover glass ─ no specialized setup is required. The biocompatible metal-dielectric nano-coatings are fabricated directly on microscopy coverslips and have a simple three-ply design permitting straightforward implementation into a conventional fluorescence microscope. The introduced improved lateral resolution with such mirror-enhanced STORM (meSTORM) not only allows to exceed Widefield and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM performance, but also offers the possibility to measure in a simplified setup as it does not require a special TIRF objective lens. The resolution improvement achieved with meSTORM is both spectrally and spatially tunable and thus allows for dual-color approaches on the one hand, and selectively highlighting region above the cover glass on the other hand, as demonstrated here. Beyond lateral resolution enhancement, the clear-cut profile of the highlighted region provides additional access to the axial dimension. As shown in my thesis, this allows for example to assess the three-dimensional architecture of the intracellular microtubule network by translating the local localization uncertainty to a relative axial position. Even beyond meSTORM, a wide range of membrane or surface imaging applications may benefit from the selective highlighting and fluorescence enhancing provided by the metal-dielectric nano-coatings. This includes for example, among others, live-cell Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Resonance Energy Transfer studies as recently demonstrated. N2 - Die „Auflösungsrevolution" in der Fluoreszenzmikroskopie hat während des letzten Jahrzehnts eine Vielzahl von Techniken hervorgebracht, die es ermöglichen, das Beugungslimit zu überschreiten und eine Bildauflösung bis in den Nanometerbereich zu erreichen. Die Entwicklung der sogenannten superhochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es die zelluläre Architektur auf molekularer Ebene zu visualisieren und erreicht damit ein Auflösungsvermögen, wie es bisher nur mit elektronenmikroskopischen Ansätzen möglich war. Der Begriff Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie fasst zum Beispiel eine Vielzahl der unterschiedlichsten Ansätze zusammen. Wie zum Beispiel auch die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) basieren diese auf der zeitlichen Trennung der Emission einzelner Fluorophore. Die Lokalisierungsanalyse der so aufgenommenen Bilder von einzelnen Emittern ermöglicht schließlich die Rekonstruktion eines superhochaufgelösten Bildes, das eine Auflösung von typischerweise 20 nm in einer zellularen Umgebung erreicht. Der entscheidende Punkt ist hierbei die Lokalisierungsgenauigkeit, die hauptsächlich vom Bildkontrast abhängt. Eine Erhöhung der Signalintensität oder Reduzierung des Signalhintergrunds ermöglichen es daher, die mit dSTORM erzielte Bildauflösung zu erhöhen. In meiner Dissertation wird dies durch eine einfache reflektierende metalldielektrische Nanobeschichtung auf dem Mikroskop-Deckglas erreicht, das so als abstimmbarer Nanospiegel dient. Ich zeige in dieser Arbeit, dass solche metalldielektrischen Beschichtungen eine höhere Photonenausbeute bei niedrigerem Hintergrund liefern und somit die SMLM-Leistung durch eine signifikant erhöhte Lokalisierungsgenauigkeit und damit letztendlich einer höheren Bildauflösung wesentlich verbessern. Die Stärke dieses Ansatzes besteht darin, dass mit Ausnahme des beschichteten Deckglases keine spezielle Anpassung des experimentellen Aufbaus erforderlich ist. Die biokompatiblen metallisch-dielektrischen Nanobeschichtungen mit einem einfachen dreischichtigen Design werden direkt auf Mikroskop-Deckgläsern hergestellt, was eine direkte Implementierung in ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop ermöglicht. Die mit diesem spiegelverstärkten STORM (meSTORM) eingeführte verbesserte laterale Auflösung ermöglicht es nicht nur, die Bildauflösung von Weitfeld und Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM zu übertreffen, sondern bietet auch die Möglichkeit, in einem vereinfachten Aufbau zu messen, da kein spezielles TIRF-Objektiv erforderlich ist. Die mit meSTORM erzielte Auflösungsverbesserung ist sowohl spektral als auch räumlich abstimmbar und ermöglicht so einerseits zweifarbige Bildgebung und andererseits eine gezielte Hervorhebung eines bestimmten Bereichs über dem Deckglas. Über die Verbesserung der lateralen Auflösung hinaus bietet das klare Profil des Verstärkungseffekts zusätzliche Information über die axiale Position. Wie in meiner Dissertation gezeigt, kann damit beispielsweise die dreidimensionale Architektur des intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks aufgelöst werden, indem die lokale Lokalisierungsunsicherheit in eine relative axiale Position übersetzt wird. Über meSTORM hinaus kann die selektive Hervorhebung und Fluoreszenzverstärkung durch die metalldielektrischen Nanobeschichtungen für eine Vielzahl von Membran- oder Oberflächenabbildungsanwendungen von Vorteil sein. Dies umfasst unter anderem Anwendungen wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie in lebenden Zellen und Fluoreszenzresonanz-energietransfer, wie bereits kürzlich gezeigt wurde. KW - Fluoreszenz KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Nanofabrikation KW - Nanofabrication KW - Super-resolution microsopy KW - Superhochauflösende Mikroskopie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204329 ER - TY - THES A1 - Karus, Christine T1 - Untersuchung der Architektur von Proteinstrukturen des Ranvier-Schnürrings mittels der super-hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM T1 - Investigation of the architecture of protein structures of the Node of Ranvier using the super-high resolution microscopy method dSTORM N2 - Ranvier-Schnürringe spielen eine entscheidende Rolle bei der schnellen Weiterleitung von elektrischen Impulsen in Nervenzellen. Bei bestimmten neurologischen Erkrankungen, den Neuropathien, kann es zu Störungen in der ultrastrukturellen Organisation verschiedener Schnürring-Proteine kommen (Doppler et al., 2018, Doppler et al., 2016). Eine detailliertere Kenntnis der genauen Anordnung dieser Schnürring-Proteine und eventueller Abweichungen von dieser Anordnung im Krankheitsfall, könnte der Schlüssel zu einer vereinfachten Diagnostik von bestimmten Neuropathie- Formen sein. Ziel meiner Arbeit war es daher, die Untersuchung der ultrastrukturellen Architektur der (para-)nodalen Adhäsionsproteine Neurofascin-155 und Caspr1 unter Verwendung der super-hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) an murinen Zupfnervenpräparaten zu etablieren. Nach erster Optimierung der Probenpräparation für die 2-Farben-dSTORM sowie der korrelationsbasierten Bildanalyse, konnte ich mittels modellbasierter Simulation die zugrundeliegende Molekülorganisation identifizieren und mit Hilfe der Ergebnisse aus früheren Untersuchungen validieren. In einem translationalen Ansatz habe ich anschließend humane Zupfnervenpräparate von 14 Probanden mit unterschiedlichen Formen einer Neuropathie mikroskopiert und ausgewertet, um die Anwendbarkeit dieses Ansatzes in der Diagnostik zu testen. Obgleich keine signifikanten Unterschiede zwischen physiologischem und pathologischem neurologischem Gewebe hinsichtlich Neurofascin-155 und Caspr1 festgestellt werden konnten, scheint der Ansatz grundsätzlich dennoch vielversprechend zu sein, bedarf jedoch noch weiteren Anstrengungen hinsichtlich Probenpräparation, Auswertungs- und Versuchsprotokollen und einer größeren Anzahl an humanen Biopsien mit homogenerem Krankheitsbild. N2 - Nodes of Ranvier play a critical role in the rapid transmission of electrical impulses in neurons. In certain neurological diseases, the neuropathies, there may be disturbances in the ultrastructural organization of various nodal and paranodal proteins (Doppler et al., 2018, Doppler et al., 2016). A more detailed knowledge of the exact arrangement of these nodal and paranodal proteins and possible deviations from this arrangement in disease, could be the key to a simplified diagnosis of certain neuropathy forms. Therefore, the aim of my work was to establish the investigation of the ultrastructural architecture of the (para-)nodal adhesion proteins Neurofascin-155 and Caspr1 using the super-high resolution microscopy method dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) on murine teased fibers. After initial optimization of sample preparation for 2-color dSTORM as well as correlation-based image analysis, I was able to identify the underlying molecular organization using model-based simulation and validate it using results from previous studies. In a translational approach, I then microscoped and evaluated human teased fibers from 14 subjects with different forms of neuropathy to test the applicability of this approach in diagnostics. Although no significant differences were found between physiological and pathological neurological tissue with respect to Neurofascin-155 and Caspr1, the approach still seems promising in principle, but requires further efforts with respect to sample preparation, evaluation and experimental protocols, and a larger number of human biopsies with more homogeneous disease patterns. KW - dSTORM KW - Ranvier-Schnürring Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-274568 N1 - die Dissertation ist ein Kooperationsprojekt dieser beiden Fakultäten ER - TY - THES A1 - Bathe-Peters, Marc T1 - Spectroscopic approaches for the localization and dynamics of β\(_1\)- and β\(_2\)-adrenergic receptors in cardiomyocytes T1 - Spektroskopieansätze zur Bestimmung der Lokalisation und Dynamiken von β\(_1\)- und β\(_2\)-Adrenozeptoren in Kardiomyozyten N2 - In the heart the β\(_1\)-adrenergic receptor (AR) and the β\(_2\)-AR, two prototypical G protein-coupled receptors (GPCRs), are both activated by the same hormones, namely adrenaline and noradrenaline. Both receptors couple to stimulatory G\(_s\) proteins, mediate an increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and influence the contractility and frequency of the heart upon stimulation. However, activation of the β\(_1\)-AR, not the β\(_2\)-AR, lead to other additional effects, such as changes in gene transcription resulting in cardiac hypertrophy, leading to speculations on how distinct effects can arise from receptors coupled to the same downstream signaling pathway. In this thesis the question of whether this distinct behavior may originate from a differential localization of these two receptors in adult cardiomyocytes is addressed. Therefore, fluorescence spectroscopy tools are developed and implemented in order to elucidate the presence and dynamics of these endogenous receptors at the outer plasma membrane as well as on the T-tubular network of intact adult cardiomyocytes. This allows the visualization of confined localization and diffusion of the β\(_2\)-AR to the T-tubular network at endogenous expression. In contrast, the β\(_1\)-AR is found diffusing at both the outer plasma membrane and the T-tubules. Upon overexpression of the β\(_2\)-AR in adult transgenic cardiomyocytes, the receptors experience a loss of this compartmentalization and are also found at the cell surface. These data suggest that distinct signaling and functional effects can be controlled by specific cell surface targeting of the receptor subtypes. The tools at the basis of this thesis work are a fluorescent adrenergic antagonist in combination of fluorescence fluctuation spectroscopy to monitor the localization and dynamics of the lowly expressed adrenergic receptors. Along the way to optimizing these approaches, I worked on combining widefield and confocal imaging in one setup, as well as implementing a stable autofocus mechanism using electrically tunable lenses. N2 - Im Herzen werden der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor (AR) und der β\(_2\)-AR, zwei prototypische GPCR, durch die Hormone Adrenalin und Noradrenalin aktiviert. Dabei interagieren beide Rezeptoren mit dem stimulatorischen G\(_s\) Protein, bewirken eine Erhöhung des cyclischen Adenosinmonophosphates (cAMP) und beeinflussen die Kontraktionskraft und Frequenz des Herzens nach einem Stimulus. Jedoch hat die Aktivierung des β\(_1\)-ARs, nicht des β\(_2\)-ARs, auch weitere Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Transkription von Genen. Dies wiederum führt zu Spekulationen, wie solch unterschiedliche Effekte von Rezeptoren hervorgerufen werden können, die gleiche Signalwege bedienen. In dieser Arbeit wird untersucht, ob dieses unterschiedliche Verhalten durch eine ungleiche Verteilung dieser beiden Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten hervorgerufen werden könnte. Dazu wird die Lokalisation und die Dynamik dieser endogenen Rezeptoren in der Plasmamembran sowie im T-tubulären Netzwerk von intakten adulten Kardiomyozyten, unter Entwicklung und Verwendung hochsensitiver Fluoreszenzspektroskopiemethoden, bestimmt. Dies ermöglicht die örtliche und dynamische Eingrenzung des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors unter endogener Expression ausschließlich auf das T-tubuläre Netzwerk. Dementgegen stellt sich heraus, dass sich der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor ubiquitär auf der äußeren Membran und den T-Tubuli befindet und diffundiert. In β\(_2\)-AR überexprimierenden transgenen Kardiomyozyten hingegen werden diese Kompartments nicht beibehalten und es findet eine Umverteilung der Rezeptoren, auch unter Einbezug der Zelloberfläche, statt. Diese Daten können stärker darauf hindeuten, dass einige Rezeptorsubtypen sich gezielt und spezifisch bestimmte Zelloberflächen aussuchen, um somit ihre verschiedenen Signale und funktionären Effekte erzeugen zu können. Zu den Techniken, die in dieser Arbeit die Bestimmung der Lokalisation und der Dynamiken der niedrig exprimierten adrenergen Rezeptoren zulassen, gehört die Anwendung von Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Kombination mit einem fluoreszierenden β-adrenergen Antagonisten. Weitere Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden und in weiterführenden Studien aufschlussreiche Erkenntnisse liefern könnten, umfassen die Entwicklung eines Setups aus einer Kombination aus Weitfeld- und Konfokalmikroskopie und die Implementierung eines stabilen Autofokus mit Hilfe einer elektrisch veränderbaren Linse. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Beta-Adrenozeptor KW - Kardiomyozyt KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Fluorescence KW - Fluorescence Microscopy KW - G Protein-Coupled Receptor KW - Autofocus KW - Microscopy KW - Beta-Adrenergic Receptor KW - Cardiomyocyte KW - Fluorescence Correlation Spectroscopy KW - FCS KW - GPCR Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258126 ER - TY - THES A1 - Grushevskyi, Yevgenii T1 - Activation kinetics of G-protein-coupled receptors T1 - Aktivierungskinetik von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren N2 - G-protein-coupled receptors (GPCRs) are key biological switches that transmit both internal and external stimuli into the cell interior. Among the GPCRs, the “light receptor” rhodopsin has been shown to activate with a re-arrangement of the transmembrane helix bundle within ≈1 ms, while all other receptors are thought to become activated in subsecond range at saturating concentrations. Here we investigate activation kinetics of a dimeric GPCR, the metabotropic glutamate receptor-1 (mGluR1), and several class A GPCRs, as muscarinic receptor 3 (M3R), adrenergic (α2aAR and β1R) and opioid (µOR) receptors. We first used UV-light-triggered uncaging of glutamate in intact cells. Sub-millisecond Förster resonance energy transfer recordings between labels at intracellular receptor sites were used to record conformational changes in the mGluR1. At millimolar ligand concentrations the initial rearrangement between the mGluR1 subunits occurs at a speed of τ1≈1-2 ms. These rapid changes were followed by significantly slower conformational changes in the transmembrane domain (τ2≈20 ms). We further characterized novel photoswitchable negative allosteric modulators for mGluR1, which bind to its transmembrane core and block the conformational change as well as the downstream signaling. Effects of the compounds were quantified in pharmacological cell assays in the dark and using UV and green light illumination. We finally develop a framework for image-based kinetic analysis of GPCRs which allowed us to measure activation kinetics of several prototypical class A GPCRs and to discover membrane heterogeneities of GPCR activation. It appears that GPCR activation signal is not only dependent on the amount of activated receptors, but also has some level of correlation with the local density of activated receptors. N2 - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Familie der membranständigen Proteine, welche sowohl interne als auch externe Stimulationen in den intrazellulären Raum weiterleiten und somit in Eukaryonten ein breites Spektrum an physiologischen Prozessen regulieren. Innerhalb der GPCRs konnte für den „Lichtrezeptor“ Rhodopsin gezeigt werden, dass dessen Aktivierung, welche eine räumliche Umorientierung der Transmembrandomänen beinhaltet, innerhalb von einer Millisekunde erfolgt, wohingegen angenommen wurde, dass die meisten anderen dieser Rezeptoren wesentlich langsamer, im Sekundenbereich, aktiviert werden. Die vorliegende Arbeit ist auf die Aktivierungskinetiken eines typisch- dimerischen Rezeptors, nämlich dem metabotrobischen Glutamat- rezeptor 1(mGluR1), sowie einige Klasse-A GPCRs fokussiert, darunter befinden sich sowohl der muskarinische M3-Rezeptor, die adrenergen α2A- und β1-Rezeptoren als auch der μ-opioid Rezeptor. Wir nutzten zunächst durch UV-Licht aktivierbares Glutamat auf intakten Zellen. Hierbei erfolgte, unter Verwendung von Sättigungskonzentrationen, die Umorganisation der mGluR1- Untereinheiten innerhalb von ein bis zwei Millisekunden. Diesen Änderungen folgte eine signifikant langsamere Konformationsänderung von 20 Millisekunden in den Transmembrandomänen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von neuen, durch Licht schaltbaren, negativen allosterischen Modulatoren des mGluR1-Rezeptors. Für diese konnte gezeigt werden, dass sie unter bestimmten Belichtungsbedingungen im Mittelpunkt der Transmembrandomänen binden und dadurch sowohl die Konformationsänderung des Rezeptors als auch dessen weitere Signaltransduktion verhindern. Zudem entwickelten wir ein Systemumfeld zur bildbasierten Analyse von GPCR-Kinetiken, welches es uns erlaubte die Aktivierungskinetiken einiger exemplarischer Klasse A GPCRs zu messen und heterogene Aktivierungskinetiken von GPCRs auf Zellmembranen zu entdecken. Die Resultate dieser Arbeit legen Nahe, dass Aktivierungs- Signale von GPCRs nicht nur von der Menge der aktivierten Rezeptoren abhängen, sondern zusätzlich auch zu einem gewissen Grad mit der lokalen Dichte von aktivierten Rezeptoren korrelieren. KW - G-Protein gekoppelter Rezeptor KW - G-protein-coupled receptors KW - Molecular Pharmacology KW - Ligand uncaging Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207215 ER - TY - THES A1 - Gorelashvili, Maximilian Georg T1 - Investigation of megakaryopoiesis and the acute phase of ischemic stroke by advanced fluorescence microscopy T1 - Untersuchungen der Megakaryopoese und der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls mit Hilfe von hochentwickelter Fluoreszenzmikroskopie N2 - In mammals, anucleate platelets circulate in the blood flow and are primarily responsible for maintaining functional hemostasis. Platelets are generated in the bone marrow (BM) by megakaryocytes (MKs), which mainly reside directly next to the BM sinusoids to release proplatelets into the blood. MKs originate from hematopoietic stem cells and are thought to migrate from the endosteal to the vascular niche during their maturation, a process, which is, despite being intensively investigated, still not fully understood. Long-term intravital two photon microscopy (2PM) of MKs and vasculature in murine bone marrow was performed and mean squared displacement analysis of cell migration was performed. The MKs exhibited no migration, but wobbling-like movement on time scales of 3 h. Directed cell migration always results in non-random spatial distribution. Thus, a computational modelling algorithm simulating random MK distribution using real 3D light-sheet fluorescence microscopy data sets was developed. Direct comparison of real and simulated random MK distributions showed, that MKs exhibit a strong bias to vessel-contact. However, this bias is not caused by cell migration, as non-vessel-associated MKs were randomly distributed in the intervascular space. Furthermore, simulation studies revealed that MKs strongly impair migration of other cells in the bone marrow by acting as large-sized obstacles. MKs are thought to migrate from the regions close to the endosteum towards the vasculature during their maturation process. MK distribution as a function of their localization relative to the endosteal regions of the bones was investigated by light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The results show no bone-region dependent distribution of MKs. Taken together, the newly established methods and obtained results refute the model of MK migration during their maturation. Ischemia reperfusion (I/R) injury is a frequent complication of cerebral ischemic stroke, where brain tissue damage occurs despite successful recanalization. Platelets, endothelial cells and immune cells have been demonstrated to affect the progression of I/R injury in experimental mouse models 24 h after recanalization. However, the underlying Pathomechanisms, especially in the first hours after recanalization, are poorly understood. Here, LSFM, 2PM and complemental advanced image analysis workflows were established for investigation of platelets, the vasculature and neutrophils in ischemic brains. Quantitative analysis of thrombus formation in the ipsilateral and contralateral hemispheres at different time points revealed that platelet aggregate formation is minimal during the first 8 h after recanalization and occurs in both hemispheres. Considering that maximal tissue damage already is present at this time point, it can be concluded that infarct progression and neurological damage do not result from platelet aggregated formation. Furthermore, LSFM allowed to confirm neutrophil infiltration into the infarcted hemisphere and, here, the levels of endothelial cell marker PECAM1 were strongly reduced. However, further investigations must be carried out to clearly identify the role of neutrophils and the endothelial cells in I/R injury. N2 - In Säugetieren zirkulieren kernlose Thrombozyten im Blutstrom und sind primär für die Aufrechterhaltung der funktionellen Hämostase verantwortlich. Thrombozyten werden im Knochenmark durch Megakaryozyten gebildet, die sich hauptsächlich in direkter Nähe zu Knochenmarkssinusoiden befinden, um Proplättchen in das Blut freizusetzen. Megakaryo-zyten stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab und man glaubt, dass sie während ihres Reifungspro¬zesses von der endostalen in die vaskuläre Nische wandern – ein Prozess, der trotz intensiver Forschung noch nicht vollständig verstanden ist. Langzeit-Zwei-Photonen-Mikroskopie von Megakaryozyten und des Gefäßbaums wurde in murinem Knochenmark von lebenden Tieren in Kombination mit der Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung der Zellmigration durchgeführt. Die Megakaryozyten zeigten keine Migration, sondern eine wackelartige Bewegung auf Zeitskalen von 3 Stunden. Die gerichtete Zellmigration führt stets zu einer nicht zufälligen räumlichen Verteilung der Zellen. Daher wurde ein Computermodellierungsalgorithmus entwickelt, der eine zufällige Megakaryo¬zytenverteilung unter Verwendung von realen 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Datensätzen simuliert. Der direkte Vergleich realer und simuliert zufälliger Megakaryozyten¬verteilungen zeigte, dass MKs stark mit Knochenmarksgefäßen assoziiert sind. Dieses wird jedoch nicht durch Zellmigration verursacht, da nicht-Gefäß-assoziierte MKs zufällig im intervaskulären Raum verteilt waren. Darüber hinaus zeigten Simulationsstudien, dass Megakaryozyten die Migration anderer Zellen im Knochenmark stark beeinträchtigen, da sie als sterische Hindernisse wirken. Es wird angenommen, dass MKs während ihres Reife¬prozesses von den Regionen in der Nähe des Endosteums in Richtung des Gefäßsystems wandern. Die Megakaryozytenverteilung als Funktion ihrer Lokalisierung relativ zu den endo¬stalen Regionen des Knochens wurde durch Lichtblattmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigen keine knochenregionabhängige Verteilung von Megakaryozyten. Zusammenge¬nommen widerlegen die neu etablierten Methoden und erzielten Ergebnisse das Modell der Megakaryozyten¬migration während ihrer Reifung. Ischämie-Reperfusionsschaden (I/R) ist eine häufige Komplikation des zerebralen ischämischen Schlaganfalls, bei dem trotz erfolgreicher Rekanalisierung eine Schädigung des Hirngewebes auftritt. Es wurde gezeigt, dass Thrombozyten, Endothelzellen und Immunzellen das Fortschreiten der I/R-Verletzung in experimentellen Mausmodellen 24 Stunden nach der Rekanalisierung beeinflussen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen, insbesondere in den ersten Stunden nach der Rekanalisierung, sind jedoch kaum verstanden. Hier wurden Lichtblattmikroskopie, Zwei-Photonen-Mikroskopie und ergänzende hochkom-plexe Bildanalyse-Workflows zur Untersuchung von Thrombozyten, der Gefäße und Neutro-philen in ischämischen Gehirnen etabliert. Die quantitative Analyse der Thrombusbildung in der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphäre zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass die Thrombozytenaggregationsbildung während der ersten 8 Stunden nach der Rekanalisierung minimal ist und in beiden Hemisphären auftritt. In Anbetracht dessen, dass zu diesem Zeitpunkt bereits eine maximale Gewebeschädigung vorliegt, kann geschlossen werden, dass die Infarkt¬progression und der neurologische Schaden nicht aus der Bildung von Thrombozytenaggre¬gaten resultieren. Darüber hinaus erlaubte Lichtblattmikroskopie die Neutrophileninfiltration in die infarzierte Hemisphäre zu bestätigen und hier waren die Spiegel des Endothelzellmarkers PECAM1 stark reduziert. Es müssen jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Rolle von Neutrophilen und Endothelzellen bei I/R-Verletzungen klar zu identifizieren. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Schlaganfall KW - Megakaryozyt KW - Computersimulation KW - Light sheet microscopy KW - ischemic stroke KW - megakaryopoiesis KW - multi-photon microscopy Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186002 ER - TY - THES A1 - Balakrishnan, Ashwin T1 - Fast molecular mobility of β\(_2\)-adrenergic receptor revealed by time-resolved fluorescence spectroscopy T1 - Schnelle molekulare Beweglichkeit des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors durch zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie N2 - G-protein- coupled receptors (GPCRs) are the largest family of membrane confined receptors and they transduce ligand binding to downstream effects. Almost 40% of the drugs in the world target GPCRs due to their function, albeit knowing less about their activation. Understanding their dynamic behaviour in basal and activated state could prove key to drug development in the future. GPCRs are known to exhibit complex molecular mobility patterns. A plethora of studies have been and are being conducted to understand the mobility of GPCRs. Due to limitations of imaging and spectroscopic techniques commonly used, the relevant timescales are hard to access. The most commonly used techniques are electron paramagnetic resonance or double electronelectron resonance, nuclear magnetic resonance, time-resolved fluorescence, single particle tracking and fluorescence recovery after photobleaching. Among these techniques only fluorescence has the potential to probe live cells. In this thesis, I use different time-resolved fluorescence spectroscopic techniques to quantify diffusion dynamics / molecular mobility of β2-adrenergic receptor (β2-AR) in live cells. The thesis shows that β2-AR exhibits mobility over an exceptionally broad temporal range (nanosecond to second) that can be linked to its respective physiological scenario. I explain how β2-AR possesses surprisingly fast lateral mobility (~10 μm²/s) associated with vesicular transport in contrast to the prior reports of it originating from fluorophore photophysics and free fluorophores in the cytosol. In addition, β2-AR has rotational mobility (~100 μs) that makes it conform to the Saffman-Delbrück model of membrane diffusion unlike earlier studies. These contrasts are due to the limitations of the methodologies used. The limitations are overcome in this thesis by using different time-resolved fluorescence techniques of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-resolved anisotropy (TRA) and polarisation resolved fullFCS (fullFCS). FCS is limited to microsecond to the second range and TRA is limited to the nanosecond range. fullFCS complements the two techniques by covering the blind spot of FCS and TRA in the microsecond range. Finally, I show how ligand stimulation causes a decrease in lateral mobility which could be a hint at cluster formation due to internalisation and how β2-AR possesses a basal oligomerisation that does not change on activation. Thus, through this thesis, I show how different complementary fluorescence techniques are necessary to overcome limitations of each technique and to thereby elucidate functional dynamics of GPCR activation and how it orchestrates downstream signalling. N2 - G¬Protein¬gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Familie der Membran¬Rezeptoren und durch Bindung von Liganden leiten sie extrazlluläre Signal in das Innere der Zelle weiter. Fast 40% der Medikamente auf der Welt zielen aufgrund ihrer Funktion auf GPCRs ab, obwohl man relative wenig über ihre Aktivierung weiß. Das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens im basalen und aktivierten Zustand könnte sich in Zukunft als Schlüssel zur Medikamentenentwicklung erweisen. GPCRs sind dafür bekannt, dass sie komplexe molekulare Bewegungsmuster aufweisen. Eine Fülle von Studien wurden und werden durchgeführt, um die Beweglichkeit von GPCRs zu verstehen. Aufgrund der Einschränkungen der gängigen bildgebenden und spektroskopischen Techniken sind die relevanten Zeitskalen nur schwer messbar. Die am häufigsten verwendeten Techniken sind die paramagnetische Elektronenresonanz oder die Doppel¬Elektron¬Elektron¬Resonanz, die magnetische Kernresonanz, die zeitaufgelöste Fluoreszenz, die Einzelpartikelverfolgung und die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung. Unter diesen Techniken haben nur die Fluoreszenz¬basierten Techniken das Potential, lebende Zellen zu untersuchen. In dieser Arbeit werden verschiedene zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Techniken zur Quantifizierung der Diffusionsdynamik oder molekularen Mobilität des β2¬adrenergen Rezeptors (β2¬AR) in lebenden Zellen verwendet. Diese Arbeit zeigt, dass β2-AR eine Beweglichkeit über einen außergewöhnlich breiten, zeitlichen Bereich (Nanosekunde bis Sekunde) aufweist, der mit dem jeweiligen physiologischen Szenario verknüpft werden kann. Es wird gezeigt, wie β2¬AR eine überraschend schnelle, laterale Bewegung (~10 μm²/s) besitzt, welche mit vesikulärem Transport in Verbindung gebracht werden kann. Im Gegensatz zu früheren Berichten, wonach die beobachtete Komponente von der Photophysik der Fluorophore und freien Fluorophoren im Zytosol abstammt. Zusätzlich weist β2¬AR eine Rotationsbeweglichkeit (~100 μs) auf, welche es ¬ im Gegensatz zu früheren Studien ¬ dem Saffman¬Delbrück¬Modell der Membrandiffusion zuordnen lässt. Dieser Unterschied ist auf die Beschränkungen der verwendeten Techniken zurückzuführen. Die Einschränkungen werden in dieser Arbeit durch die Verwendung verschiedener zeitaufgelöster Fluoreszenztechniken überwunden, z. B. der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) im Bereich von mehreren hundert Nanosekunden bis Sekunden, der zeitaufgelösten Anisotropie (TRA) im Nanosekundenbereich und der polarisationsaufgelösten FullFCS (FullFCS), die die zeitlich Lücke zwischen FCS und TRA schließt. Zuletzt wird eine Abnahme der lateralen Beweglichkeit durch Ligandenstimulation gezeigt, was ein Hinweis auf Clusterbildung aufgrund von Internalisierung sein könnte, und dass β2¬AR eine basale Oligomerisierung aufweist, die sich bei Aktivierung nicht ändert. Zusammenfassend kann man sagen, dass verschiedene komplementäre Fluoreszenztechniken notwendig sind, um die Einschränkungen der einzelnen Techniken zu überwinden und dadurch die funktionelle Dynamik der GPCR¬Aktivierung und deren Bedeutung für die nachgeschaltete Signalübertragung aufzuklären. KW - Fluorescence correlation spectroscopy KW - GPCR KW - time-resolved anisotropy KW - adrenergic receptor KW - homoFRET Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250856 ER - TY - THES A1 - Schreiber, Benjamin T1 - Selective and enhanced fluorescence by biocompatible nanocoatings to monitor G-protein-coupled receptor dynamics T1 - Selektive und verstärkte Fluoreszenz durch biokompatible Nanobeschichtungen zur Untersuchung von G-protein-gekoppelten Rezeptoren und ihrer Dynamik N2 - Fluorescence microscopy has become one of the most important techniques for the imaging of biological cells and tissue, since the technique allows for selective labeling with fluorescent molecules and is highly suitable for low-light applications down to the single molecule regime. The methodological requirements are well-defined for studying membrane receptors within a highly localized nanometer-thin membrane. For example, G-protein-coupled receptors (GPCRs) are an extensively studied class of membrane receptors that represent one of the most important pharmaceutical targets. Ligand binding and GPCR activation dynamics are suspected to take place at the millisecond scale and may even be far faster. Thus, techniques that are fast, selective, and live-cell compatible are required to monitor GPCR dynamics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) are methods of choice to monitor the dynamics of GPCRs selectively within the cell membrane. Despite the remarkable success of these modalities, there are limitations. Most importantly, inhomogeneous illumination can induce imaging artifacts, rendering spectroscopic evaluation difficult. Background signal due to scattering processes or imperfect labeling can hamper the signal-to-noise, thus limiting image contrast and acquisition speed. Careful consideration of the internal physiology is required for FRET sensor design, so that ligand binding and cell compatibility are well-preserved despite the fluorescence labeling procedures. This limitation of labeling positions leads to very low signal changes in FRET-based GPCR analysis. In addition, microscopy of these systems becomes even more challenging in single molecule or low-light applications where the accuracy and temporal resolution may become dramatically low. Fluorescent labels should therefore be brighter, protected from photobleaching, and as small as possible to avoid interference with the binding kinetics. The development of new fluorescent molecules and labeling methods is an ongoing process. However, a complete characterization of new labels and sensors takes time. So far, the perfect dye system for GPCR studies has not been found, even though there is high demand. Thus, this thesis explores and applies a different approach based on improved illumination schemes for TIRF-M as well as metal-coated coverslips to enhance fluorescence and FRET efficiency. First, it is demonstrated that a 360° illumination scheme reduces typical TIRF artifacts and produces a much more homogenously illuminated field of view. Second, membrane imaging and FRET spectroscopy are improved by metal coatings that are used to modulate the fluorescent properties of common fluorescent dyes. Computer simulation methods are used to understand the underlying photophysics and to design the coatings. Third, this thesis explores the operational regime and limitations of plasmonic approaches with high sectioning capabilities. The findings are summarized by three publications that are presented in the results section of this work. In addition, the theory of fluorescence and FRET is explained, with particular attention to its emission modulations in the vicinity of metal-dielectric layers. Details of the instrumentation, computer simulations, and cell culture are described in the method section. The work concludes with a discussion of the findings within the framework of recent technological developments as well as perspectives and suggestions for future approaches complete the presented work. N2 - Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer der wichtigsten Techniken für die Bildgebung biologischer Zellen und Gewebe geworden, da die Technik eine selektive Markierung mit fluoreszierenden Molekülen ermöglicht und sich hervorragend für Anwendungen bei schwachem Licht bis hin zum Einzelmolekül-Regime eignet. Die methodischen Anforderungen sind gut definiert, um Membranrezeptoren innerhalb einer stark lokalisierten nanometerdünnen Membran zu untersuchen. Zum Beispiel sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine ausführlich untersuchte Klasse von Membranrezeptoren, weil diese wichtige pharmazeutische Ziele darstellen. Es wird vermutet, dass die Ligandenbindungs- und GPCR-Aktivierungsdynamiken im Millisekundenbereich stattfinden und sogar viel schneller sein können. Daher sind Techniken erforderlich, die schnell, selektiv und lebend-Zell kompatibel sind, um die GPCR-Dynamik zu aufzunehmen. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) und internale Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-M) sind Methoden der Wahl, um die Dynamik von GPCRs selektiv innerhalb der Zellmembran zu untersuchen. Trotz des bemerkenswerten Erfolgs dieser Modalitäten gibt es Einschränkungen. Am wichtigsten ist, dass eine inhomogene Beleuchtung Artefakte erzeugen kann, welche die spektroskopische Auswertung erschweren. Hintergrundsignale aufgrund von Streuprozessen oder unvollständiger Markierung können das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigen und somit den Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit begrenzen. Eine sorgfältige Berücksichtigung der internen Physiologie ist für das Design der FRET-Sensoren ist erforderlich, so dass die Ligandenbindung und die Zellkompatibilität trotz der Fluoreszenzmarkierungsverfahren nicht gestört werden. Diese Einschränkung der Markierungspositionen führt zu sehr geringen Signalkontrast in der FRET-basierten GPCR-Analyse. Darüber hinaus wird die Mikroskopie dieser Systeme bei Einzelmolekül- oder Schwachlichtanwendungen, bei denen die Genauigkeit und die zeitliche Auflösung dramatisch niedrig werden können, noch schwieriger. Fluoreszierende Marker sollten daher heller, vor Photobleichung geschützt und so klein wie möglich sein, um Störungen mit der Rezeptorkinetik zu vermeiden. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Moleküle und Markierungsmethoden ist ein fortlaufender Prozess. Eine vollständige Charakterisierung neuer Marker und Sensoren benötigt jedoch Zeit. Bis jetzt wurde das perfekte Farbstoffsystem für GPCR-Studien noch nicht gefunden, auch wenn es eine hohe Nachfrage dafür gibt. Daher wird ein anderer Ansatz auf der Grundlage verbesserter Beleuchtungsschemata für TIRF-M sowie metallbeschichtete Deckgläser zur Verbesserung der Fluoreszenz- und FRET-Effizienz untersucht. Zunächst wird gezeigt, dass ein 360 ° Beleuchtung typische TIRF-Artefakte reduziert und ein wesentlich homogeneres Bildausleuchtung erzeugt. Zweitens wurde durch die Modulation der Fluoreszenzeigenschaften gängiger Fluoreszenzfarbstoffe die Membranbildgebung und FRET-Spektroskopie verbessert. Computersimulationsmethoden werden verwendet, um die zugrundeliegende Photophysik zu verstehen und zielgerichtet Beschichtungen zu entwerfen. Drittens wurden das operationelle Regime und die Grenzen von plasmonischen Ansätzen mit noch höheren Signalselektiverung untersucht. Die Ergebnisse sind in drei Publikationen zusammengefasst, die im Ergebnisteil dieser Arbeit vorgestellt werden. Darüber hinaus wird die Theorie der Fluoreszenz und des FRET unter besonderer Berücksichtigung ihrer Emissionsmodulationen in der Nähe von Metall-Dielektrikum-Schichten erläutert. Details der Instrumentierung, Computersimulationen und Zellkultur werden im Abschnitt Methoden beschrieben. Die Arbeit schließt mit einer Diskussion der Ergebnisse im Rahmen der jüngsten technologischen Entwicklungen sowie mit Perspektiven und Vorschlägen für zukünftige Ansätze, die die vorliegende Arbeit abrunden. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - Plasmonic KW - Fluorescence Resonance Energy Transfer KW - G Protein-Coupled Receptors KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluorescence Microscopy Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173923 ER - TY - THES A1 - Aigner, Max T1 - Establishing successful protocols and imaging pipelines for Expansion Microscopy in murine blood platelets T1 - Etablierung erfolgreicher Protokolle zur Probenpräparation und Bildgebung für die ‚Expansion Microscopy‘ in murinen Thrombozyten N2 - Platelets play an important role in the body, since they are part of the hemostasis system, preventing and stopping blood loss. Nevertheless, when platelet or coagulation system function are impaired, uncontrolled bleedings but also irreversible vessel occlusion followed by ischemic tissue damage can occur. Therefore, understanding platelet function and activation, mechanisms which are controlled by a variety of platelet membrane receptors and other factors is important to advance out knowledge of hemostasis and platelet malfunction. For a complete picture of platelet function and their modulating behavior it is desired to be able to quantify receptor distributions and interactions of these densely packed molecular ensembles in the membrane. This challenges scientists for several reasons. Most importantly, platelets are microscopically small objects, challenging the spatial resolution of conventional light microscopy. Moreover, platelet receptors are highly abundant on the membrane so even super-resolution microscopy struggles with quantitative receptor imaging on platelets. With Expansion microscopy (ExM), a new super-resolution technique was introduced, allowing resolutions to achieve super-resolution without using a super-resolution microscope, but by combining a conventional confocal microscopy with a highly processed sample that has been expanded physically. In this doctoral thesis, I evaluated the potential of this technique for super-resolution platelet imaging by optimizing the sample preparation process and establishing an imaging and image processing pipeline for dual-color 3D images of different membrane receptors. The analysis of receptor colocalization using ExM demonstrated a clear superiority compared to conventional microscopy. Furthermore, I identified a library of fluorescently labeled antibodies against different platelet receptors compatible with ExM and showed the possibility of staining membrane receptors and parts of the cytoskeleton at the same time. N2 - Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle im Körper, denn als Teil des Gerinnungssystems, sind sie daran beteiligt Blutverlust vorzubeugen und zu stoppen. Gleichwohl können sie bei Störungen des Gerinnungssystems zu unkontrollierbaren Blutungen und auch durch Aggregation zu kardiovaskulären Ereignissen, wie Herzinfarkt und Schlaganfällen führen. Für ein besseres Verständnis von Hämostase und Gerinnungsstörungen ist es deshalb nötig die Funktion und Aktivierung von Thrombozyten zu verstehen, welche durch eine Vielzahl von Membranrezeptoren und anderen Faktoren gesteuert wird. Eine Methode, um weitere Einblicke in diese Prozesse zu bekommen ist die mikroskopische Darstellung von Rezeptorverteilungen auf der Zellmembran und deren Interaktionen. Dies zu realisieren ist aus verschiedenen Gründen anspruchsvoll. Der mikroskopisch kleine Durchmesser der Thrombozyten macht es konventioneller Lichtmikroskopie schwer, einzelne Rezeptoren auf der Membran darzustellen. Außerdem befinden sich sehr viele Rezeptoren dicht gepackt auf der Membran, sodass sogar superhochauflösende Mikroskope Schwierigkeiten haben, die Rezeptoren quantitativ zu beurteilen. Mit ‚Expansion microscopy‘ (ExM) wurde eine relativ junge superhochaufösende Technik auf Thrombozyten angewendet. Diese Technik erreicht Auflösungen vergleichbar mit sogenannten ‚super-resolution‘ Mikroskopen, ohne die Benutzung selbiger, sondern durch die Kombination von konfokaler Mikroskopie mit einer physikalisch expandierten Probe. In dieser Arbeit evaluierte ich das Potential dieser Technik für superhochauflösende Bilder von Thrombozytenrezeptoren und optimierte die Probenvorbereitung, sodass zweifarbige 3D Bilder von verschiedenen Membranrezeptoren möglich waren. Die Ergebnisse der Kolokationsanalyse zeigten einen deutlich vergrößerten Dynamikumfang durch ExM. Außerdem katalogisierte ich fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen verschiedene Thrombozyten Rezeptoren bezüglich ihrer Tauglichkeit mit ExM und zeigte, dass es möglich ist Membranrezeptoren und Bestandteile des Zytoskeletts gleichzeitig zu färben. KW - Expansion Microscopy KW - platelets KW - Mikroskopie KW - Microscopy Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-309003 ER - TY - THES A1 - Khayenko, Vladimir T1 - Functional peptide-based probes for the visualization of inhibitory synapses T1 - Funktionelle peptidbasierte Sonden zur Visualisierung von hemmenden Synapsen N2 - Short functional peptidic probes can maximize the potential of high-end microscopy techniques and multiplex imaging assays and provide new insights into normal and aberrant molecular, cellular and tissue function. Particularly, the visualization of inhibitory synapses requires protocol tailoring for different sample types and imaging techniques and relies either on genetic manipulation or on antibodies that underperform in tissue immunofluorescence. Starting from an endogenous activity-related ligand of gephyrin, a universal marker of the inhibitory post-synapse, I developed a short peptidic multivalent binder with exceptional affinity and selectivity to gephyrin. By tailoring fluorophores to the binder, I have obtained Sylite, a probe for the visualization of inhibitory synapses, with an outstanding signal-to-background ratio, that bests the “gold standard” gephyrin antibodies both in selectivity and in tissue immunofluorescence. In tissue Sylite benefits from simplified handling, provides robust synaptic labeling in record-short time and, unlike antibodies, is not affected by staining artefacts. In super-resolution microscopy Sylite precisely localizes the post-synapse and enables accurate pre- to post-synapse measurements. Combined with complimentary tracing techniques Sylite reveals inhibitory connectivity and profiles inhibitory inputs and synapse sizes of excitatory and inhibitory neurons in the periaqueductal gray brain region. Lastly, upon probe optimization for live cell application and with the help of novel thiol-reactive cell penetrating peptide I have visualized inhibitory synapses in living neurons. Taken together, my work provided a versatile probe for conventional and super-resolution microscopy and a workflow for the development and application of similar compact functional synthetic probes. N2 - Kurze funktionelle peptidische Sonden können das Potenzial von High-End-Mikroskopietechniken und Multiplex-Imaging-Assays maximieren und neue Erkenntnisse über normale und abweichende Molekulare-, Zelluläre- und Gewebefunktionen liefern. Insbesondere die Visualisierung inhibitorischer Synapsen erfordert eine Anpassung des Protokolls an verschiedene Probentypen und Bildgebungsverfahren und ist entweder auf genetische Manipulationen oder auf Antikörper angewiesen, die in der Gewebeimmunfluoreszenz unterdurchschnittlich abschneiden. Ausgehend von einem endogenen aktivitätsbezogenen Liganden von Gephyrin, einem universellen Marker der hemmenden Postsynapse, habe ich einen kurzen peptidischen multivalenten Binder mit außergewöhnlicher Affinität und Selektivität zu Gephyrin entwickelt. Durch die Anpassung von Fluorophoren an das Bindemittel habe ich Sylite erhalten, eine Sonde für die Visualisierung inhibitorischer Synapsen mit einem hervorragenden Signal-Hintergrund-Verhältnis, das die "Goldstandard"-Gephyrin-Antikörper sowohl in der Selektivität als auch in der Gewebe-Immunfluoreszenz übertrifft. Im Gewebe profitiert Sylite von einer vereinfachten Handhabung, bietet eine robuste synaptische Markierung in rekordverdächtig kurzer Zeit und wird im Gegensatz zu Antikörpern nicht durch Färbungsartefakte beeinträchtigt. In der Super-Resolution-Mikroskopie lokalisiert Sylite präzise die Post-Synapse und ermöglicht genaue Messungen von Prä- zu Postsynapse. In Kombination mit ergänzenden Tracing-Techniken deckt Sylite die hemmende Konnektivität auf und erstellt Profile der hemmenden Eingänge und Synapsengrößen von erregenden und hemmenden Neuronen in der periaquäduktalen Grau Hirnregion. Schließlich habe ich nach Optimierung der Sonde für die Anwendung in lebenden Zellen und mit Hilfe eines neuartigen thiolreaktiven zelldurchdringenden Peptids hemmende Synapsen in lebenden Neuronen visualisiert. Insgesamt lieferte meine Arbeit eine vielseitige Sonde für konventionelle und superauflösende Mikroskopie und einen Arbeitsablauf für die Entwicklung und Anwendung ähnlicher kompakter funktioneller synthetischer Sonden. KW - Fluoreszenzsonde KW - Peptidsynthese KW - Neurowissenschaften KW - Inhibitorische Synapse KW - Gephyrin KW - Peptide KW - Fluorescent probes KW - Neuroscience KW - Inhibitory synapse KW - Super-Resolution Microscopy KW - Tissue staining Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320438 ER - TY - THES A1 - Büchner, Lotte T1 - Charakterisierung der CD4+- und CD8+-T-Zell-Immunantwort nach Myokardinfarkt im Mausmodell T1 - Characterisation of the CD4+ and CD8+ T-cell immune response after myocardial infarction in the mouse model N2 - Die Rolle des Immunsystems nach MI hat innerhalb der letzten Jahrzehnte immer mehr Aufmerksamkeit erfahren, trotzdem herrschen weiterhin einige Unklarheiten. Daher war es Ziel dieser Arbeit, das Verhalten der T-Zellen nach MI im Mausmodell näher zu betrachten und zu analysieren. Dafür wurde einerseits mittels Durchflusszytometrie die T-Zell-Immunantwort im Herzen und in verschiedenen lymphatischen Organen mit Fokus auf pro- und antiinflammatorische Zytokine und deren Transkriptionsfaktoren genauer analysiert und andererseits ein Protokoll etabliert, um die T-Zellen im Herzen und in den Lymphknoten mittels Lichtblattmikroskopie sichtbar zu machen. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression von LAP, welches nicht-kovalent an das antiinflammatorische Zytokin TGF-ß1 gebunden ist und das wichtig für eine ausgeglichene Immunantwort ist, indem es überschießende Entzündungsreaktionen verhindert, in T-Zellen im Herzen nach MI im Vergleich zu naiven und scheinoperierten Mäusen signifikant hochreguliert war. Dieses Ergebnis konnte nur im Herzen und in keinem anderen der untersuchten Organe erzielt werden, weshalb es sich somit um eine lokale Immunreaktion handeln muss, die nur im Herzen nach MI stattfindet. Eine weitere Besonderheit war, dass die Häufigkeit des Vorkommens an Foxp3+ Treg im Herzen im Vergleich zu den anderen untersuchten Organen durchgehend am höchsten war, sowohl bei den Mäusen nach MI als auch bei naiven und scheinoperierten Mäusen. Dies unterstreicht, dass Foxp3+ Treg im Herzen eine wichtige Rolle spielen. Dank der Verbesserung des Protokolls zur bildlichen Darstellung von T-Zellen im Herzen konnte gezeigt werden, dass sich diese nach MI insbesondere im Infarktgewebe befinden und dort relativ gleichmäßig verteilt sind. Außerdem konnten die mediastinalen Lymphknoten im Ganzen dargestellt und die einzelnen T-Zellen sichtbar gemacht werden. Insgesamt lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit neue Erkenntnisse zur Charakterisierung der T-Zell-Immunantwort nach MI im Mausmodell hinzugewonnen werden konnten. Die LAP+ T-Zellen scheinen nach MI im Herzen eine wichtige Rolle zu spielen, weshalb die Funktion dieser Zellen im Reparaturprozess nach MI in zukünftigen Versuchen genauer betrachtet werden sollte. Außerdem wurde der Grundstein zur Anfärbung und Darstellung von T-Zellen in Herzen und in Lymphknoten mittels Lichtblattmikroskopie gelegt, weshalb daran weitergearbeitet werden sollte, um auch andere Immunzellen neben den T-Zellen zeigen zu können. Dadurch können weitere Hinweise auf das Zusammenspiel der Immunzellen nach MI erhalten werden, um die immunologischen Vorgänge immer besser verstehen zu können. N2 - The role of the immune system after MI has received more and more attention within the last decades, yet there are still some uncertainties. Therefore, the aim of this work was to take a closer look at and analyse the behaviour of T cells after MI in a mouse model. For this purpose, on the one hand, the T cell immune response in the heart and in various lymphatic organs was analysed in more detail by means of flow cytometry with a focus on pro- and anti-inflammatory cytokines and their transcription factors and, on the other hand, a protocol was established to visualise the T cells in the heart and in the lymph nodes by means of light sheet microscopy. It was found that the expression of LAP, which is non-covalently bound to the anti-inflammatory cytokine TGF-ß1 and which is important for a balanced immune response by preventing excessive inflammatory reactions, was significantly upregulated in T cells in the heart after MI compared to naïve and sham-operated mice. This result could only be obtained in the heart and in none of the other organs studied, so it must therefore be a local immune response that only occurs in the heart after MI. Another peculiarity was that the frequency of occurrence of Foxp3+ Treg was consistently highest in the heart compared to the other organs studied, both in the mice after MI and in naïve and sham-operated mice. This underlines that Foxp3+ Treg play an important role in the heart. Thanks to the improvement of the protocol for imaging T cells in the heart, it was possible to show that after MI they are located in particular in the infarct tissue and are relatively evenly distributed there. In addition, the mediastinal lymph nodes could be depicted as a whole and the individual T cells made visible. Overall, it can be said that the present work has added new insights into the characterisation of the T-cell immune response after MI in the mouse model. The LAP+ T cells seem to play an important role after MI in the heart, which is why the function of these cells in the repair process after MI should be examined more closely in future experiments. In addition, the foundation was laid for staining and visualising T cells in hearts and in lymph nodes using light sheet microscopy, which is why further work should be done on this in order to be able to show other immune cells besides T cells. This can provide further clues to the interplay of immune cells after MI in order to understand the immunological processes better and better. KW - Herzinfarkt KW - Immunreaktion KW - Myokardinfarkt KW - Immunantwort KW - Mausmodell KW - myocardial infarction KW - immune response Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320530 ER - TY - THES A1 - Mott, Kristina T1 - Regulation of platelet biogenesis in the native and myeloablated bone marrow niche T1 - Die Regulation der Thrombozytenbiogenese im nativen und myeloablatierten Knochenmark N2 - Megakaryocytes (MKs) are the largest cells of the hematopoietic system and the precursor cells of platelets. During proplatelet formation (PPF) bone marrow (BM) MKs extent large cytoplasmic protrusions into the lumen of sinusoidal blood vessels. Under homeostatic conditions PPF occurs exclusively in the direction of the sinusoid, while platelet generation into the marrow cavity is prevented. So far, the mechanisms regulating this process in vivo are still not completely understood, especially when PPF is deregulated during disease. This thesis investigated the mechanisms of PPF in native BM and after myeloablation by total body irradiation (TBI). First, we have identified a specialized type of BM stromal cells, so called CXCL12-abundant reticular (CAR) cells, as novel possible regulators of PPF. By using complementary high-resolution microscopy techniques, we have studied the morphogenetic events at the MK/vessel wall interface in new detail, demonstrating that PPF formation preferentially occurs at CAR cell-free sites at the endothelium. In the second part of this thesis, we analyzed the processes leading to BM remodeling in response to myeloablation by TBI. We used confocal laser scanning microscopy (CLSM) to study the kinetic of radiation-triggered vasodilation and mapped extracellular matrix (ECM) proteins after TBI. We could demonstrate that collagen type IV and laminin α5 are specifically degraded at BM sinusoids. At the radiation-injured vessel wall we observed ectopic release of platelet-like particles into the marrow cavity concomitantly to aberrant CAR cell morphology, suggesting that the balance of factors regulating PPF is disturbed after TBI. ECM proteolysis is predominantly mediated by the matrix metalloproteinase MMP9, as revealed by gelatin-zymography and by a newly established BM in situ zymography technique. In transgenic mice lacking MMP9 vascular recovery was delayed, hinting towards a role of MMP9 in vessel reconstitution after myeloablation. In a third series of experiments, we studied the irradiated BM in the context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). By using mice as BM donors that ubiquitously express the fluorescent reporter protein dsRed we tracked engraftment of donor cells and especially MKs in the recipient BM. We found a distinct engraftment pattern and cluster formation for MKs, which is different from other blood cell lineages. Finally, we assessed platelet function after TBI and HSCT and were the first to demonstrate that platelets become massively hyporeactive, particularly upon stimulation of the collagen receptor GPVI. In summary, our findings shed light on the processes of PPF during health and disease which will help to develop treatments for aberrant thrombopoiesis. N2 - Megakaryozyten (MKs) sind die größten Zellen des hämatopoetischen Systems und die Vorläuferzellen der Blutplättchen. Während der Ausbildung von Proplättchen schnüren MKs im Knochenmark (KM) große zytoplasmatische Ausläufer in das Lumen der sinusoidalen Blutgefäße ab. Unter homöostatischen Bedingungen erfolgt die Proplättchenbildung ausschließlich in Richtung der Sinusoide, während die Thrombozytenbildung in die Knochenmarkkavität verhindert wird. Bislang sind die Mechanismen, die diesen Prozess in vivo steuern, noch nicht vollständig aufgeklärt insbesondere, wenn die Thrombozytenbiogenese unter Krankheitsbedingungen dereguliert ist. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der Thrombopoese im nativen Knochenmark und nach Myeloablation durch Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) untersucht. Zunächst haben wir einen spezialisierten Typ von KM-Stromazellen, die sog. CXCL12-abundant reticular (CAR) Zellen, als neue mögliche Regulatoren der Proplättchenbildung identifiziert. Durch den Einsatz komplementärer hochauflösender Mikroskopietechniken haben wir die morphogenetischen Vorgänge an der Schnittstelle zwischen MKs und Gefäßwand genauer untersucht und gezeigt, dass die Generierung von Proplättchen bevorzugt an CAR-Zell-freien Stellen am Endothel stattfindet. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die Prozesse, die zum Knochenmarkumbau nach Myeloablation durch TBI führen. Mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die Kinetik der strahleninduzierten Vasodilatation und kartierten die extrazelluläre Matrix (EZM) Proteine nach TBI. So konnten wir zeigen, dass Kollagen Typ IV und Laminin α5 spezifisch an den Knochenmarksinusoiden abgebaut werden. An der strahlengeschädigten Gefäßwand beobachteten wir die ektope Freisetzung plättchenartiger Partikel in die Knochenmarkkavität, die mit einer abnormalen CAR-Zellmorphologie einherging. Dies weist darauf hin, dass das Gleichgewicht der Faktoren, die die gerichtete Proplättchenbildung regulieren, nach TBI gestört ist. Die EZM-Proteolyse wird vor allem durch die Matrix-Metalloproteinase MMP9 vermittelt, was durch Gelatine-Zymographie und durch eine neu etablierte in situ Zymographie-Technik für das Knochenmark nachgewiesen wurde. Bei transgenen Mäusen, die defizient für MMP9 sind, war die Regeneration der Vaskulatur verzögert, was auf eine Rolle von MMP9 bei der Gefäßrekonstitution nach Myeloablation hindeutet. In einer dritten Versuchsreihe untersuchten wir das bestrahlte KM im Rahmen einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mit Hilfe von Mäusen als KM-Spender, die ubiquitär das fluoreszierende Reporterprotein dsRed exprimieren, verfolgten wir das Anwachsen von Spenderzellen und insbesondere von MKs im Empfängerknochenmark. Wir beobachteten ein eindeutiges Muster bzw. Clusterbildung für anwachsende MKs, die sich von anderen Blutzelllinien unterschied. Schließlich untersuchten wir die Funktion von Thrombozyten nach TBI und HSZT und konnten als erste zeigen, dass Thrombozyten eine massive Hyporeaktivität ausbilden, insbesondere nach Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI. Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Aufschluss über die Prozesse der Thrombopoese im nativen und pathologischen Knochenmark, was zur Entwicklung von Therapien zu Behandlung von defekter Thrombozytenbiogenese beitragen wird. KW - Knochenmark KW - Knochenmarktransplantation KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Ganzkörperbestrahlung KW - bone marrow KW - myeloablation KW - thrombopoiesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289630 ER - TY - THES A1 - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica T1 - Pathomechanisms underlying ischemic stroke T1 - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles N2 - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment. N2 - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist. Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sinusthrombose KW - thrombo-inflammation KW - ischemic stroke KW - blood brain barrier KW - CVT KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727 ER - TY - THES A1 - Zimmermann [née Papp], Lena T1 - Platelets as modulators of blood-brain barrier disruption and inflammation in the pathophysiology of ischemic stroke T1 - Thrombozyten als Modulatoren der Blut-Hirn-Schrankenstörung und Inflammation in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls N2 - Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization. Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS. N2 - Eine häufig auftretende Komplikation in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ist der Ischämie/Reperfusion Schaden (I/R Schaden), welcher trotz der erfolgreichen Wiederherstellung der zerebralen Durchblutung durch ein paradoxes Fortschreiten des entstandenen Gewebeschadens charakterisiert ist. Dieses Phänomen wird durch das schädigende Zusammenspiel von Thrombozyten und inflammatorischen Zellen am vaskulären Endothel verursacht. Allerdings sind die räumlich-temporalen und molekularen Mechanismen dieser zellulären Interaktionen und deren Beteiligung am Infarktwachstum noch nicht vollständig verstanden. Daraus folgend, beabsichtigte diese Arbeit eben diese temporalen Mechanismen des fortschreitenden Infarktwachstums nach der zerebralen Gefäßwiedereröffnung aufzuklären. Die hier vorgestellten Daten implizieren, dass das anhaltende Fortschreiten des Gewebeschadens durch die Schädigung der Bluthirnschranke verursacht wird und somit unabhängig vom Auftreten sekundär gebildeter Thromben ist. In vorangegangenen Studien konnte die Freisetzung von thrombozytären Granula als molekularer Mechanismus, mit welchem Thrombozyten zum I/R Schaden beitragen, aufgedeckt werden. Basierend auf diesen Studien wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die Sekretion thrombozytärer Granula im Zusammenhang mit der Beeinträchtigung der endothelialen Barriere gelegt. Durch die Kombination eines in vitro Ansatzes mit einem murinen Model des ischämischen Schlaganfalls konnte gezeigt werden, dass α-Granula endothelialen Schaden verursachen, wohingegen deren Absenz (NBEAL2 Defizienz) zu einer verbesserten mikrovaskulären Integrität führte. Aufgrund dessen könnte das Adressieren der α-Granula als eine neuartige Therapieoption zum Erhalt der vaskulären Integrität und zur Verminderung des Infarktwachstums trotz Rekanalisation genutzt werden. Neuste Erkenntnisse enthüllten, dass die dem I/R Schaden zu Grunde liegenden Pathomechanismen bereits während des Verschlusses eines großen hirnversorgenden Gefäßes zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust von penumbralem Gewebe unter Okklusion und I/R Schädigung während der Reperfusion im engen Zusammenhang stehen. Im Einklang hiermit konnten humane Daten eine Neutrophilen-dominierte Immunantwort und lokale Thrombozyten Aktivierung und deren Sekretion, anhand der Detektion der α-Granula Hauptkomponenten, im verschlossenen Gefäßsystem von ischämischen Schlaganfall Patienten nachweisen. Diese anfänglichen Beobachtungen konnten im Rahmen dieser Arbeit anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen von lokal abgenommenen ischämischen Blutproben erweitert werden. Die Phänotypisierung von Immunzellen enthüllte eine bisher unbekannte Verschiebung der Lymphozyten Population hin zu CD4+ T-Zellen und bekräftigte zusätzlich das Konzept einer unmittelbaren intravaskulären Immunantwort, welche durch Granulozyten dominiert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Thesis das erste Mal das erhöhte Auftreten von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten in dem verschlossenen humanen Gefäßsystem nachgewiesen werden. Demzufolge könnte eine Beeinflussung von Immunzellen und/oder Thrombozyten bereits unter Okklusion als potentiell vielversprechende Strategie genutzt werden, um die Ausweitung des Infarktes einzuschränken und klinische Endpunkte nach einem ischämischen Schlaganfall zu verbessern. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Entzündung KW - Thrombo-inflammation KW - Ischemic stroke KW - Platelets KW - Inflamamtion KW - Immune cells KW - Vascular system Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302850 ER -