TY - THES A1 - Georgakopoulos, Dimos T1 - Einfluss der N-Glykosylierung von HIV-Env auf die Krankheitsprogression der HIV-Infektion T1 - Influence on disease progress by HIV-env's glycosylation density in HIV infected persons N2 - N-Glykosylierungen spielen beim Env-Gen eine wichtige Rolle. Sie dienen nicht nur als „Escape-Phänomen“ zur Verhinderung einer Elimination des Virus durch neutralisierende Antikörper. Es hat sich gezeigt, dass bestimmte Menschen sich mit HIV infizieren können, aber es zu keinem Zeitpunkt zu AIDS-typischen Symptomen kommt, ohne die Einnahme antiretroviraler Therapie (ART). Solche Menschen werden als Elite Controller bezeichnet. Ihr Organismus kann selbst die Viruslast in sehr geringen Grenzen halten (< 50 Kopien/ml). Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss von N-Glykosylierungen in der Entstehung von Elite Controller zu untersuchen und prozentuell eine Tendenz zu schaffen, inwieweit die Glykosylierungsdichte des Env-Proteins entscheidend ist. Es konnte gezeigt werden, dass eine immunologische Kontrolle auch auf der B-Zellebene stattfinden kann. Als Hinweis dient die geringe Glykosylierungsdichte im Bereich CD4bs und MPER, die indirekt über MHC Klasse II zu einer erhöhten Produktion von Antikörpern führen kann. Bisher wurde bei Elite Controller die T-Zellebene als mögliche immunologische Kontrolle beschrieben, jedoch gibt diese Arbeit hinweise, dass auch eine immunologische Kontrolle mittels Antikörper möglich ist. Die glykosylierten Zielepitope können eine große Hilfe sein für das Aussehen eines späteren Impfstoffs. N2 - Predicted N-linked glycosylations loom large in env-gene of hiv and do not only function as an escape mechanism to avoid elimination of hiv by neutralising antibodies. Some people can become infected with hiv and never require antiretroviral medication and also never develop an AIDS-related disease. These people are the so called elite controler. Their immune system can dam the viral load of the virus in low-level (< 50 copies/ml). The aim of this thesis ist o show how predicted n-linked glycosylation influence the genesis of an elite controler and how glycosylation density is crucial for their development. One can show that there is also an immunological controll on the human B cell line. The low glycosylation density in CD4 binding site and MPER affects indirectly the higher concentration of neutralising antibodies by major histocompatibility complex type II. Previously the immunological control in elite controler was described by the T cell line but this thesis gives directions that an immunological control can be done also by antibodies. The env´s parts whith lower glycyosylation can be an instrument fort he later development of a vaccine. KW - HIV-Infektion KW - Elite Controller Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217023 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-30362 ER - TY - THES A1 - von Wardenburg, Niels Oliver T1 - Investigations into the Pathogenic Antibody-Antigen-Interference of Glycine Receptor Autoantibodies T1 - Untersuchungen zur pathogenen Antikörper-Antigen-Interferenz von Autoantikörpern gegen den Glycinrezeptor N2 - Anti-glycine receptor (GlyR) autoantibodies belong to the novel group of autoantibodies that target neuronal cell-surface antigens (NCS), which are accompanied with various neurologic and neuropsychiatric conditions. The inhibitory ionotropic GlyR is one of the major inhibitory neurotransmitter receptors and therefore involved in maintaining homeostasis of neuronal excitation levels at brain stem and spinal cord. Anti-GlyR autoantibodies are associated with progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus or stiff person syndrome. These neuromotor disorders are characterized by exaggerated startle, muscle stiffness, and painful spasms, leading to immobility and fatal outcome in some cases. It was hypothesized that imbalance of motoneuronal inhibition by functional impairment of GlyR and receptor internalization are direct consequences of antibody-antigen interference. Here, serum samples of four patients were tested for anti-GlyR autoantibodies and were used for the analysis of the functional impact on the electrophysiological properties of recombinant GlyRs, transiently expressed in HEK293 cells. Furthermore, the recognition pattern of anti- GlyR autoantibodies to human, zebrafish and chimeric GlyRα1 located the epitope to the far N-terminal region. The pathogenicity of anti-GlyR autoantibodies and thereby the autoimmunologic etiology of the disease was confirmed by passive transfer of patient serum to zebrafish (Danio rerio) larvae, that yielded an abnormal escape response – a brain stem reflex that corresponds to the exaggerated startle of afflicted patients. The phenotype was accompanied by profound reduction of GlyR clusters in spinal cord cryosections of treated zebrafish larvae. Together, these novel insights into the pathogenicity of GlyR autoantibodies confirm the concept of a novel neurologic autoimmune disease and might contribute to the development of innovative therapeutic strategies. N2 - GlyR Autoantikörper sind mit dem Stiff-Person-Syndrom assoziiert, insbesondere mit der schwerverlaufenden Variante der Progressiven Enzephalopathie mit Rigidität und Myoklonus. Diese Studie hat sich als Ziel gesetzt, die Pathogenität der Autoantikörper sowie deren pathogenen Eigenschaften mit Hilfe der Patch-Clamp-Methode sowie eines passiven Transfers der Erkrankung auf Zebrafischlarven zu erklären. ... KW - stiff person syndrome KW - glycine receptor autoantibodies Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247217 ER - TY - THES A1 - Sarma, Bhavishya T1 - Merkel Cell Carcinoma: Investigations on its carcinogenesis and new therapeutic approaches T1 - Merkelzellkarzinom: Untersuchungen zur Karzinogenese und neue Therapieansätze N2 - Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and aggressive skin cancer with an increasing incidence. The majority of MCC cases (approximately 80%) are associated with the Merkel cell polyomavirus (MCPyV). This virus encodes for the MCPyV T antigens (small T (sT) and large T (LT)), which are oncoproteins that drive MCC carcinogenesis. However, the precise cells of the skin that are transformed by the T antigens are not known i.e., the cells of origin of MCC are yet to be discovered. Therefore, the first part of this study involved the generation and evaluation of a vector system that could be used to study MCC oncogenesis. To this end, a set of lentiviral vectors was cloned that allows independent, inducible expression of potential key factors in MCC oncogenesis. In addition, a CRISPR/Cas9 knock in was established that allows the coding sequence for a fluorescent protein to be placed under the control of the promoter of KRT20, one of the most crucial markers of MCC. The functionality of this KRT20 reporter was proven in the MCPyV-positive MCC cell line, WaGa. The different inducible vector systems (doxycycline-inducible MCPyV T antigens or MCPyV sT, RheoSwitch-inducible ATOH1 and IPTG-inducible dnMAML1 and GLI1) were found to have different efficacies in various cellular systems and in particular, a considerable reduction in efficiency was observed at times upon the interaction of several vectors in one cell. In the second and more important part of this study, the role of the well-established anti-malarial drug, artesunate, which possesses additional anti-tumor and anti-viral activity, in the treatment of MCPyV-positive MCC was analyzed. In our study, artesunate was found to be cytotoxic towards MCPyV-positive MCC cell lines in vitro and repressed tumor growth in vivo in a mouse model. Artesunate was also found to downregulate T antigen expression, which is critical for the proliferation of MCPyV-positive MCC cells. The repression of T antigen expression, however, was not the sole mechanism of artesunate’s cytotoxic action; instead, the MCPyV-positive MCC cell line, WaGa, was found to be even less sensitive to artesunate after shRNA knockdown of the T antigens. Since loss of membrane integrity occurred more rapidly than degradation/loss of genomic DNA under the influence of artesunate in four of five MCPyV-positive MCC cell lines examined, apoptosis, although widely described as a modus operandi for artesunate, did not appear to be a determinant of the cytotoxicity of artesunate against MCPyV-positive MCC cells. Instead, we were able to demonstrate that artesunate induced the recently described iron-dependent and lipid peroxide-associated form of cell death known as "ferroptosis". This was achieved primarily through the use of inhibitors that can suppress specific individual steps of the ferroptotic process. Thus, artesunate-induced cell death of MCPyV-positive MCC cells could be suppressed by iron chelators and by the inhibition of lipid peroxidation and lysosomal transport. Surprising results were obtained from the analysis of two proteins associated with the ferroptotic process, namely, ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) and tumor suppressor protein p53. Here, we showed that ectopically- 2 expressed FSP1 cannot suppress artesunate-induced ferroptosis in MCPyV-positive MCC cells and that p53 does not play a pro-ferroptotic role in artesunate-induced cell death of MCPyV-positive MCCs. Since artesunate did not suppress the interferon-γ-induced expression of immune-related molecules such as HLA and PD-L1 on the surface of MCPyV-positive MCCs, our study also provided the first positive evidence for its use in combinatorial immunotherapy. Overall, this study showed that artesunate appears to be an effective drug for the treatment of MCPyV-positive MCC and might also be considered for its use in combinatorial MCC immunotherapy in the future. N2 - Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und aggressiver Hautkrebs mit einer steigenden Inzidenz. Die Mehrzahl der MCC-Fälle (ca. 80%) sind mit dem Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV) assoziiert. Dieses Virus kodiert für die MCPyV T Antigene (small T (sT) und Large T (LT)), die als Onkoproteine die MCC Karzinogenese vorantreiben. Unbekannt ist jedoch welche Zellen der Haut durch die T Antigene transformiert werden, was also die Ursprungszellen des MCC sind. Der erste Teil dieser Arbeit befasste sich daher mit der Generierung und Evaluierung eines Vektorsystems, das zur Untersuchung der MCC-Onkogenese genutzt werden könnte. Dazu wurde ein Set von lentiviralen Vektoren kloniert, das die voneinander unabhängige, induzierbare Expression von potentiellen Schlüsselfaktoren der MCC-Onkogenese erlaubt. Außerdem wurde ein CRISPR/Cas9 knock in etabliert, der es erlaubt die kodierende Sequenz für ein fluoreszierendes Protein unter die Kontrolle des Promoters von KRT20, dessen Expression eines der wichtigsten MCC Marker ist, zu bringen. Die Funktionalität dieses KRT20 Reporters konnte in einer MCPyV-positive MCC Linie, WaGa, nachgewiesen werden. Die verschiedenen induzierbaren Vektorsysteme (Doxycyclin-induzierbare MCPyV T Antigene bzw. MCPyV sT, RheoSwitch-induzierbare ATOH1, IPTG-induzierbares dnMAML1 und GLI1) zeigten sich unterschiedlich effektiv in unterschiedlichen Zellsystemen und insbesondere im Zusammenspiel mehrerer Vektoren in einer Zelle war die Induzierbarkeit teilweise erheblich reduziert. Im zweiten, und wichtigeren Teil dieser Arbeit, habe ich mich mit der Frage auseinandergesetzt, ob ein etabliertes Anti-Malaria-Medikament, dem zusätzlich anti-tumorale und anti-virale Aktivität zugeschrieben werden, sich für die Behandlung des MCPyV-positiven MCC anbieten könnte. In unserer Studie wurde festgestellt, dass Artesunat in vitro zytotoxisch auf MCPyV-positive MCC Zelllinien wirkt und in vivo im Mausmodell das Tumorwachstum verlangsamen kann. Es wurde zudem beobachtet, dass Artesunat die T Antigen Expression unterdrückt, das für die Proliferation von MCPyV-positiven MCC-Zellen entscheidend ist. Allerdings spielt die Repression der T Antigen Expression keine Rolle für den zytotoxischen Effekt von Artesunat, sondern es zeigte sich, dass die MCC-Zelllinie WaGa nach shRNA knockdown der T Antigene sogar weniger sensitiv gegenüber Artesunat war. Da unter dem Einfluss von Artesunat in vier von fünf untersuchten MCC Zelllinien der Verlust der Membranintegrität schneller eintrat als eine Degradation/Verlust der genomischen DNA scheint Apoptose, obwohl vielfach als Modus Operandi für Artesunat beschrieben, nicht bestimmend für die Zytotoxität von Artesunat gegenüber MCPyV-positiven MCC Zellen zu sein. Stattdessen konnten wir die kürzlich beschriebene eisenabhängige und Lipidperoxid-assoziierte Form des Zelltods, die sogenannte "Ferroptose", nachweisen. Dies gelang vor allem durch den Einsatz von Inhibitoren, die spezifische Einzelschritte des ferroptotischen Prozesses unterdrücken können. So ließ sich der durch Artesunat induzierte Zelltod von MCPyV-positiven Zellen durch Eisenchelatbildner und Inhibition der Lipidperoxidation und des lysosomalen Transports unterdrücken. Überraschende Ergebnisse lieferte die Analyze von zwei Proteinen, die mit dem ferroptotischen Prozess in Verbindung gebracht werden, nämlich dem Ferroptose-Suppressor-Protein 1 (FSP1) und dem Tumorsuppressor-Protein p53. Hier zeigte sich, dass ektopisch-exprimiertes FSP1 die Artesunat-induzierte Ferroptose in MCC Zellen nicht unterdrücken kann und dass p53 keine pro-ferroptotische Rolle beim Artesunat-induzierten Zelltod von MCPyV-positiven MCCs spielt. Da Artesunat die Interferon-γ induzierte Expression von immunrelevanten Molekülen wie HLA und PD-L1 auf der Oberfläche von MCPyV-positiven MCCs nicht unterdrückte, ergaben sich auch erste positive Hinweise auf seinen Einsatz in der kombinatorischen Immuntherapie. Insgesamt zeigte diese Studie, dass Artesunat ein wirksames Medikament für die Behandlung von MCPyV-positivem MCC zu sein scheint und in Zukunft auch für den Einsatz in der kombinatorischen MCC-Immuntherapie in Frage kommen könnte. KW - Merkel cell carcinoma KW - Merkel cell polyomavirus KW - Ferroptosis KW - Artesunate Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247402 ER - TY - THES A1 - Georgakopoulos, Dimos T1 - Einfluss der N-Glykosylierung von HIV-Env auf die Krankheitsprogression der HIV-Infektion T1 - Influence on disease progress by HIV-env's glycosylation density in HIV infected persons N2 - N-Glykosylierungen spielen beim Env-Gen eine wichtige Rolle. Sie dienen nicht nur als „Escape-Phänomen“ zur Verhinderung einer Elimination des Virus durch neutralisierende Antikörper. Es hat sich gezeigt, dass bestimmte Menschen sich mit HIV infizieren können, aber es zu keinem Zeitpunkt zu AIDS-typischen Symptomen kommt, ohne die Einnahme antiretroviraler Therapie (ART). Solche Menschen werden als Elite Controller bezeichnet. Ihr Organismus kann selbst die Viruslast in sehr geringen Grenzen halten (< 50 Kopien/ml). Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss von N-Glykosylierungen in der Entstehung von Elite Controller zu untersuchen und prozentuell eine Tendenz zu schaffen, inwieweit die Glykosylierungsdichte des Env-Proteins entscheidend ist. Es konnte gezeigt werden, dass eine immunologische Kontrolle auch auf der B-Zellebene stattfinden kann. Als Hinweis dient die geringe Glykosylierungsdichte im Bereich CD4bs und MPER, die indirekt über MHC Klasse II zu einer erhöhten Produktion von Antikörpern führen kann. Bisher wurde bei Elite Controller die T-Zellebene als mögliche immunologische Kontrolle beschrieben, jedoch gibt diese Arbeit hinweise, dass auch eine immunologische Kontrolle mittels Antikörper möglich ist. Die glykosylierten Zielepitope können eine große Hilfe sein für das Aussehen eines späteren Impfstoffs. N2 - Predicted N-linked glycosylations loom large in env-gene of hiv and do not only function as an escape mechanism to avoid elimination of hiv by neutralising antibodies. Some people can become infected with hiv and never require antiretroviral medication and also never develop an AIDS-related disease. These people are the so called elite controler. Their immune system can dam the viral load of the virus in low-level (< 50 copies/ml). The aim of this thesis ist o show how predicted n-linked glycosylation influence the genesis of an elite controler and how glycosylation density is crucial for their development. One can show that there is also an immunological controll on the human B cell line. The low glycosylation density in CD4 binding site and MPER affects indirectly the higher concentration of neutralising antibodies by major histocompatibility complex type II. Previously the immunological control in elite controler was described by the T cell line but this thesis gives directions that an immunological control can be done also by antibodies. The env´s parts whith lower glycyosylation can be an instrument fort he later development of a vaccine. KW - HIV-Infektion KW - Elite Controller Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303626 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 09.12.2020 ER - TY - THES A1 - Jürges, Christopher Sebastian T1 - Algorithmic methods for elucidating the transcriptomic landscape of herpesviruses T1 - Algorithmische Methoden zur Aufklärung der transkriptomischen Landschaft von Herpesviren N2 - Transcription describes the process of converting the information contained in DNA into RNA. Although, tremendous progress has been made in recent decades to uncover this complex mechanism, it is still not fully understood. Given the advances and reduction in cost of high-throughput sequencing experiments, more and more data have been generated to help elucidating this complex process. Importantly, these sequencing experiments produce massive amounts of data that are incomprehensible in their raw form for humans. Further, sequencing techniques are not always 100% accurate and are subject to a certain degree of variability and, in special cases, they might introduce technical artifacts. Thus, computational and statistical methods are indispensable to uncover the information buried in these datasets. In this thesis, I worked with multiple high throughput datasets from herpes simplex virus 1 (HSV-1) and human cytomegalovirus (HCMV) infections. During the last decade, it has became clear that a gene might not have a single, but multiple sites at which transcription initiates. These multiple transcription start sites (TiSS) demonstrated to have regulatory effects on the gene itself depending on which TiSS is used. Specialized experimental approaches were developed to help identify TiSS (TiSS-profiling). In order to facilitate the identification of all potential TiSS that are used for cell type- and condition-specific transcription, I developed the tool iTiSS. By using a new general enrichment-based approach to predict TiSS, iTiSS proved to be applicable in integrated studies and made it less prone to false positives compared to other TiSS-calling tools. Another improvement in recent years was made in metabolic labeling experiments such as SLAM-seq. Here, they removed the time consuming and laborious step of physically separating new from old RNA in the samples. This was achieved by inducing specific nucleotide conversions in newly synthesized RNA that are later visible in the data. Consequently, the separation of new and old RNA is now done computationally and, hence, tools are needed that accurately quantify these fold-changes. My second tool that I developed, called GRAND-SLAM proved to be capable to accomplish this task and outperform competing programs. As both of my tools, iTiSS and GRAND-SLAM are not specifically tailored to my own goals, but could also facilitate the research of other groups in this field, I made them publicly available on GitHub. I applied my tools to datasets generated in our lab as well as to publicly available data sets from HSV-1 and HCMV, respectively. For HSV-1, I was able to predict and validate TiSS with nucleotide precision using iTiSS. This has lead to the most comprehensive annotation for HSV-1 to date, which now serves as the fundamental basis of any future transcriptomic research on HSV-1. By combining both my tools, I was further able to uncover parts of the highly complex gene kinetics in HCMV and to resolve the limitations caused by the densely packed genome of HCMV. With the ever-increasing advances in sequencing techniques and their decrease in cost, the amounts of data produced will continue to rise massively in the future. Additionally, more and more specialized omics approaches are appearing, calling for new tools to leverage their full information potential. Consequently, it has become apparent that specialized computational tools such as iTiSS and GRAND-SLAM are needed and will become an essential and indispensable part of the analysis. N2 - Transkription beschreibt den Prozess des Umwandelns von DNA-Information in RNA- Information. Obwohl in den letzten Jahrzehnten enorme Fortschritte bei der Aufdeckung dieses komplexen Mechanismus erzielt wurden, ist dieser Prozess bis heute noch nicht vollends verstanden. Mit den Fortschritten und der Kostensenkung bei den Hochdurchsatzexperimenten wurden immer mehr Daten gewonnen, die zur Aufklärung dieses komplexen Prozesses beitragen. Diese Sequenzierungsexperimente erzeugen allerdings riesige Datenmengen, welche in ihrer Rohform für den Menschen unverständlich sind. Darüber hinaus sind Sequenzierungstechniken nicht immer zu 100% genau und unterliegen einer gewissen Variabilität. In besonderen Fällen können sie sogar technische Artefakte enthalten. Daher sind computergestützte und statistische Methoden unerlässlich, um die in diesen Datensätzen verborgenen Informationen aufzudecken. In dieser Arbeit habe ich mit mehreren Hochdurchsatzdatensätzen von Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) und Humanem Cytomegalovirus (HCMV) gearbeitet. In den letzten Jahrzehnten wurde deutlich, dass ein Gen möglicherweise nicht nur eine einzige, sondern mehrere Transkriptionsstartpunkte (TiSS) besitzt. Diese multiplen TiSS haben nachweislich regulatorische Auswirkungen auf das Gen selbst, je nachdem, welche TiSS verwendet wird. Nachfolgend wurden demnach spezielle experimentelle Ans ̈atze entwickelt, um TiSS zu identifizieren (TiSS-Profiling). Um die Identifizierung aller potenziellen TiSS zu erleichtern, die für die zelltyp- und zustandsspezifische Transkription verwendet werden, habe ich das Programm iTiSS entwickelt. Durch die Verwendung eines neuen, auf allgemeiner Anreicherung basierenden Ansatzes zur Vorhersage von TiSS erwies sich iTiSS in integrier- ten Studien als anwendbar und war im Vergleich zu anderen TiSS-Erkennungsprogrammen weniger anfällig für falsch positive Ergebnisse. Eine weitere Verbesserung in jüngster Zeit wurde bei metabolischen Markierungsexperimenten wie SLAM-seq erzielt. Hier wurde der zeitaufwändige und mühsame Schritt der physischen Trennung von neuer und alter RNA in den Proben entfernt. Dies wurde erreicht, indem spezifische Nukleotidumwandlungen in neu synthetisierter RNA induziert wurden, die später in den Daten sichtbar sind. Da- her wird die Trennung von neuer und alter RNA jetzt per Computer vorgenommen. Dies benötigt daraufhin nun aber neue Programme, welche in der Lage sind diese Werte genau zu quantifizieren. Mein zweites von mir entwickeltes Tool namens GRAND-SLAM hat sich als fähig erwiesen, diese Aufgabe zu erfüllen und übertraf konkurrierende Programme. Da meine beiden Tools, iTiSS und GRAND-SLAM, nicht speziell auf meine eigenen Ziele zugeschnitten sind, sondern auch die Forschung anderer Gruppen in diesem Bereich erleichtern könnten, habe ich sie auf GitHub öffentlich zugänglich gemacht. Ich habe meine Tools auf Datensätze angewandt, die in unserem Labor erzeugt wurden, sowie auf öffentlich verfügbare Datensätze von HSV-1 bzw. HCMV. Fu ̈r HSV-1 konnte ich mit iTiSS TiSS mit Nukleotidpräzision vorhersagen und validieren. Dies hat zu der bisher umfassendsten Annotation für HSV-1 geführt, die nun als grundlegende Basis für jede zukünftige transkriptomische Forschung zu HSV-1 dient. Durch die Kombination meiner beiden Programme konnte ich außerdem Teile der hochkomplexen Genkinetik von HCMV aufdecken und die durch das dicht gepackte Genom von HCMV verursachten Einschränkungen überwinden. Mit den zunehmenden Fortschritten bei den Sequenzierungstechniken und den sinkenden Kosten wird die Menge der produzierten Daten in Zukunft weiter massiv ansteigen. Darüber hinaus gibt es immer mehr spezialisierte ”Omics”-Ansätze, die neue Programme erfordern, um ihr Informationspotenzial vollständig auszuschöpfen. Folglich ist es offensichtlich geworden, dass spezialisierte Computerprogramme wie iTiSS und GRAND-SLAM benötigt werden und zu einem wesentlichen und unverzichtbaren Teil der Analyse werden. KW - Herpesviren KW - Herpesviruses Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272825 ER - TY - THES A1 - Ruf, Theresa T1 - Immunhistologische Analyse der Effekte einer Kombinationstherapie im Brustkrebsmodell: Inhibition der Kollagensynthese durch PLOD-2-Blockade und Inhibierung des PD-1/PD-L1 Checkpoints T1 - Immunohistochemical analysis of the effects of combination therapy in the breast cancer model: Inhibition of Collagen Synthesis by PLOD-2 blockade and inhibition of the PD-1/PD-L1 checkpoint N2 - In dieser Arbeit wurden die histologischen und immunhistologischen Auswirkungen der Kombination aus Inhibition des PD-1/PD-1L-Checkpoints und PLOD-2-Blockade untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Immuntherapie anschlägt und dabei als Monotherapie die stärksten Tumornekrosen induzierte. Das Ansprechen auf die Immuntherapie mit BMS-1166 war jedoch sehr unterschiedlich. In der Kombination mit dem PLOD-2-Inhibitor Minoxidil wurden hingegen einheitlichere, aber auch geringere Nekroseanteile festgestellt. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass die Kombinationsbehandlung die stärkste Auswirkung auf das Tumorwachstum hatte. So waren diese Tumore die kleinsten und leichtesten, was in Zusammenhang mit dem ausgeprägten kollagenen Netzwerk dieser Gruppe stehen könnte. Die Kombination zeigte keine Auswirkung auf die Tumorvaskularisierung und die Zellteilungsaktivität, sowie auch keine Auffälligkeiten bezüglich der Infiltration mit Immunzellen. Lungenmetastasen kamen in allen Behandlungsgruppen vor. Bei der Kombinationsbehandlung waren jedoch die durchschnittlich größten Lungenmetastasen festzustellen. In dieser Arbeit konnte keine klare signifikante Verbesserung der Brustkrebstherapie durch die Kombination von Inhibition der Kollagensynthese durch PLOD-2-Blockade und Inhibierung des PD-1/PD-1L-Checkpoints aufgezeigt werden. Das kollagene Netzwerk war auffällig und sollte genauer untersucht werden. Es lohnt sich weiter an Kombinationen aus Immuntherapeutikum und EZM-Destabilisierung zu arbeiten. Die TME muss dabei weiterhin Ansatzpunkt der Forschung bleiben, um eine erleichterte Penetration der Medikamente in den Tumor zu erzielen. Hier ist der Austausch des Medikaments zur EZM-Destabilisierung empfehlenswert. Die LOX-Inhibierung hat sich bereits in Kombination mit Chemotherapie als vorteilhaft erwiesen (Rossow et al., 2018) und sollte nachfolgend in einem ähnlichen Versuchsaufbau mit dem Immuntherapeutikum BMS-1166 ausprobiert werden. N2 - In this thesis, the histological and immunohistological effects of the combination of PD-1/PD-1L checkpoint inhibition and PLOD-2 blockade were investigated. It was found, that the immunotherapy was effective and induced the strongest tumor necrosis as monotherapy. The response to immunotherapy with BMS-1166 was highly variable. In combination with the PLOD-2 inhibitor minoxidil, more uniform but also lower levels of necrosis proportions were observed. It must be noted, that the combination treatment had the strongest effect on tumor growth. Thus tumors were the smallest and lightest, which may be related to the pronounced collagenous network of this group. The combination showed no effect on tumor vascularization and cell division activity, as well as no abnormalities regarding infiltration with immune cells. Lung metastases occurred in all treatment groups. However, in the combination treatment group were observed the largest lung metastases. In this thesis, no clear significant improvement of breast cancer therapy could be shown with the combination of inhibition of collagen synthesis by PLOD-2 blockade and inhibition of the PD-1/PD-1L checkpoint. The collagen network was conspicuous and should be investigated further. It is worthwhile to further investigate combinations of immunotherapeutic agents and ECM destabilization. The TME must remain the starting point of research to facilitate drug penetration into the tumor. Here, the replacement of the Drug for ECM destabilization is recommended. LOX inhibition has already been shown to be beneficial in combination with chemotherapy (Rossow et al., 2018) and should be subsequently tested in a similar experimental setting with the immunotherapeutic BMS-1166. KW - Immunhistochemie KW - Kombinationstherapie KW - Minoxidil KW - PD-1/PD-L1 KW - Immuncytochemie KW - Immun-Checkpoint Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320380 ER - TY - THES A1 - Herb, Stefanie Maria T1 - Regulation of MCMV immediate early gene expression by virally encoded miRNAs T1 - Regulation der MCMV immediate early Genexpression durch viral kodierte miRNAs N2 - Gene expression in eukaryotic cells is regulated by the combinatorial action of numerous gene-regulatory factors, among which microRNAs (miRNAs) play a fundamental role at the post-transcriptional level. miRNAs are single-stranded, small non-coding RNA molecules that emerge in a cascade-like fashion via the generation of primary and precursor miRNAs. Mature miRNAs become functional when incorporated into the RNA induced silencing complex (RISC). miRNAs guide RISCs to target mRNAs in a sequence-specific fashion. To this end, base-pairs are usually formed between the miRNA seed region, spanning nucleotide positions 2 to 8 (from the 5' end) and the 3'UTR of the target mRNA. Once miRNA-mRNA interaction is established, RISC represses translation and occasionally induces direct or indirect target mRNA degradation. Interestingly, miRNAs are expressed not only in every multicellular organism but are also encoded by several viruses, predominately by herpesviruses. By controlling both, cellular as well as viral mRNA transcripts, virus-encoded miRNAs confer many beneficial effects on viral growth and persistence. Murine cytomegalovirus (MCMV) is a ß-herpesvirus and so far, 29 mature MCMV-encoded miRNAs have been identified during lytic infection. Computational analysis of previously conducted photoactivated ribonucleotide-enhanced individual nucleotide resolution crosslinking immunoprecipitation (PAR-iCLIP) experiments identified a read cluster within the 3' untranslated region (3'UTR) of the immediate early 3 (IE3) transcript in MCMV. Based on miRNA target predictions, two highly abundant MCMV miRNAs, namely miR-m01-2-3p and miR-M23-2-3p were found to potentially bind to two closely positioned target sites within the IE3 PAR-iCLIP peak. To confirm this hypothesis, we performed luciferase assays and showed that activity values of a luciferase fused with the 3'UTR of IE3 were downregulated in the presence of miR-m01- 2 and miR-M23-2. In a second step, we investigated the effect of pre-expression of miR-m01-2 and miR-M23-2 on the induction of virus replication. After optimizing the transfection procedure by comparing different reagents and conditions, plaque formation was monitored. We could demonstrate that the replication cycle of the wild-type but not of our MCMV mutant that harbored point mutations in both miRNA binding sites within the IE3-3'UTR, was significantly delayed in the presence of miR-m01-2 and miR-M23-2. This confirmed that miR-m01-2 and miR-M23-2 functionally target the major transcription factor IE3 which acts as an indispensable regulator of viral gene expression during MCMV lytic infection. Repression of the major immediate early genes by viral miRNAs is a conserved feature of cytomegaloviruses. The functional role of this type of regulation can now be studied in the MCMV mouse model. N2 - In eukaryotischen Zellen wird die Expression von Genen durch das Zusammenspiel vieler verschiedener biologischer Regulatoren, wie microRNAs (miRNAs), kontrolliert. MiRNAs sind einzelsträngige, kurze, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die aus sogenannten primären miRNAs und Vorläufer-miRNAs entstehen und die Genexpression auf Ebene der Posttranskription beeinflussen. Um ihre Funktion ausüben zu können, werden reife miRNAs in RNA-induzierte Silencing-Komplexe (RISCs) eingebaut und zu ihren Ziel-mRNAs geführt. Durch Wechselwirkungen zwischen der miRNA "seed-Region , die die Nukleotide 2 bis 8 vom 5'-Ende überspannt und der 3'UTR (3' untranslatierte Region) der Ziel-mRNA, unterdrückt RISC die Translation der Ziel-mRNA und kann deren Abbau durch direkte sowie indirekte Mechanismen induzieren. Die Expression von miRNAs wurde nicht nur in multizellulären Organismen, sondern in bereits zahlreichen Viren, insbesondere in der Virusfamilie der Herpesviridae, nachgew- iesen. Viruskodierte miRNAs kontrollieren dabei zelluläre wie auch virale mRNA-Transkripte und verleihen dem Virus einen Selektionsvorteil bzgl. Wachstum und Persistenz. Das mur- ine Cytomegalievirus (MCMV) ist ein β-Herpesvirus, das nach aktuellem Wissensstand 29 reife miRNAs kodiert, die allesamt während der lytischen Infektion identifziert wurden. Bioinformatische Analysen eines vor dieser Arbeit durchgeführten PAR-iCLIP-Experiments (photoactivated ribonucleotide-enhanced individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation), zeigten einen PAR-iCLIP Peak in der 3'UTR (3' untranslatierte Region) des immediate early 3-Transkripts (IE3) von MCMV. Unter Verwendung von RNAhbybrid, einem miRNA target prediction tool, fanden sich zwei virale miRNAs, näm- lich miR-m01-2-3p und miR-M23-2-3p mit potentiellen Bindestellen innerhalb der 3'UTR des MCMV IE3 Transkripts. Unsere konsekutiv durchgeführten Luciferase-Assays be- stätigten, dass sowohl miR-m01-2 als auch miR-M23-2 an die 3'UTR von IE3 binden. Beide viralen miRNAs führten zu einer verminderten Luciferaseaktivität unter Verwendung von Reportern, in denen die 3'UTR des IE3-Gens mit dem Luciferase-Transkript fusioniert war. xxiv Summary Das IE3 Protein gilt während des lytischen Zykluses als einer der wichtigsten Transkrip- tionsfaktoren von MCMV. Ebenfalls wurde der Einfluss der beiden viralen miRNAs auf die virale Reproduktion von uns untersucht. Hierfür wurden murine Zelllinien vor Infektion mit miR-m01-2 und miR- M23-2 transziert. Das Transfektionsverfahren optimierten wir zunächst durch Testung verschiedener Reagenzien und experimenteller Bedingungen. Schließlich zeigten wir mittels Plaqueassays, dass eine vor Infektion durchgeführte Transfektion mit miR-m01-2 und miR- M23-2 die Replikation von MCMV signifikant verzögerte. Unter Verwendung einer MCMV- Mutante, die durch Punktmutationen in beiden miRNA-Bindungsstellen innerhalb der IE3- 3'UTR charakterisiert war, ließ sich dieser Effekt aufheben. Unsere Experimente weisen somit stark darauf hin, dass miR-m01-2 und miR-M23-2 die Expression des IE3 Proteins regulieren und damit indirekt Einfluss auf die Genexpression während der lytischen Phase des Replikationszykluses von MCMV nehmen. Die miRNA-mediierte Repression der immediate early Genexpression stellt ein evolutionär konserviertes Merkmal von Zytomegalieviren dar. Für eine weitere Einordnung der Rolle dieser Genexpressionskontrolle bedarf es zukünftige Untersuchungen im MCMV-Tiermodell KW - miRNS KW - Cytomegalie-Virus KW - Herpes KW - Frühe Gene KW - PAR-CLIP KW - MCMV KW - miRNA KW - immediate early genes KW - lytic infection KW - IE3 KW - miRNA target KW - luciferase assay KW - CMV KW - HCMV KW - viral miRNAs Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323314 ER - TY - THES A1 - Weissenberger [geb. Kunz], Manuela-Hermina T1 - Adenoviraler Gentransfer von SOX9 zur chondrogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen T1 - Adenoviral gene transfer of SOX9 for chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells N2 - Der adenovirale SOX9-Gentransfer induziert nach 3-wöchiger in vitro Pelletkultur die chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Pelletkultur wirksamer als der TGFB1 Gentransfer mit geringerer Chondrozytenhypertrophie. Eine solche Technologie könnte zukünftig in vivo die Bildung von stabilerem hyalinem Knorpelregeneratgewebe ermöglichen. N2 - Adenoviral SOX9 genetransfer in human mesenchymal stem cells can be used for chondrogenic differentiation and to generate stable hyaline cartilage regeneration in vitro in pellet culture system. KW - Hyaliner Knorpel KW - Adenoviraler Gentransfer KW - Knorpelregeneration KW - Stammzellen KW - chondrogene Differenzierung KW - SOX9 KW - Stammzelle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321221 ER - TY - THES A1 - Daub, Jonas T1 - Der Einfluss von Alter und Ängstlichkeit auf die Furchtgeneralisierung und die Aufmerksamkeitslenkung bei gesunden Kindern und Jugendlichen T1 - The influence of age and anxiety on fear generalization and attentional processes in healthy children and adolescents N2 - Mittels einer klinischen Studie wurden die Furchtgeneralisierung und Aufmerksamkeitslenkung von 44 gesunden Kindern und Jugendlichen im Alter von 9-17 Jahren untersucht. Eine Übergeneralisierung konditionierter Furcht sowie veränderte Aufmerksamkeitsprozesse werden in zahlreichen Arbeiten mit der Entstehung und Aufrechterhaltung von Angsterkrankungen in Verbindung gebracht. Der Hauptteil der Forschung beschränkte sich bislang auf die Untersuchung von erwachsenen Probanden. Da Angsterkrankungen jedoch häufig bereits im Kindes- und Jugendalter entstehen und sich in der Erforschung psychiatrischer Erkrankungen zunehmend eine dimensionale Betrachtungsweise durchsetzt, bestand das Ziel der Studie darin, etwaige Alterseffekte und den Einfluss der Ängstlichkeit auf die genannten Phänomene bei gesunden Probanden zu untersuchen. Darüber hinaus wurde ein potentiell präventiver Ansatz erforscht. Im Ergebnis zeigten sich in den Gruppenvergleichen keine relevanten Differenzen. Interessanterweise deutete sich in der Gruppe der älteren Probanden entgegen der Erwartung eine verstärkte Furchtgeneralisierung an, die womöglich mit einer veränderten Beziehung zu Furcht und Risiko in der Adoleszenz zusammenhängt. Aus den Befunden ergibt sich die Notwendigkeit weiterer, prospektiver Arbeiten, um unser Verständnis der Ätiologie von Angsterkrankungen zu verbessern. Weiterhin ist noch offen, inwiefern es sich bei der Übergeneralisierung und einer veränderten Aufmerksamkeitslenkung um Risikofaktoren für die Entwicklung von Angsterkrankungen oder vielmehr um Epiphänomene handelt, die erst mit Ausbruch der Erkrankung auftreten. Der Einsatz von Methoden der virtuellen Realität erscheint besonders geeignet, diese Prozesse zukünftig noch besser zu erforschen. N2 - In this clinical study fear generalization and attentional processes have been investigated in 44 healthy children and adolescents aged 9-17 years. Overgeneralization of conditioned fear and altered attentional processes have been linked to the development and maintenance of anxiety disorders in numerous studies. The majority of research to date has been limited to the study of adult subjects. However, since anxiety disorders often develop in childhood and adolescence and a dimensional approach has become increasingly important in the study of psychiatric disorders, the aim of the study was to investigate age effects and the influence of anxiety on the aforementioned phenomena in healthy subjects. In addition, a potential preventive approach has been studied. The results showed no relevant differences in the group comparisons. Interestingly and contrary to expectations, there was a trend for increased fear generalization in the group of older subjects, which can possibly be related to a changed relationship to fear and risk in adolescence. The findings suggest the need for further, prospective work to improve our understanding of the aetiology of anxiety disorders. Furthermore, it is still open to what extent overgeneralization and altered attentional processes are risk factors for the development of anxiety disorders or rather epiphenomena that only appear with the onset of the disorder. The use of virtual reality methods seems particularly suitable for researching these processes even better in the future. KW - Angst KW - Furcht KW - Anxiety KW - Fear KW - Klinisches Experiment KW - Furchtgeneralisierung KW - Aufmerksamkeitsprozesse KW - Angsterkrankungen KW - Kinder- und Jugendpsychiatrie KW - klinische Studie KW - fear generalization KW - attentional processes KW - anxiety disorders KW - child and adolescent psychiatry KW - clinical study Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300100 ER - TY - THES A1 - Rombach [geb. Grosso], Franziska T1 - Der Interaktionsrezeptor des Masernvirus auf hämatopoetischen Zellen T1 - The Measles Virus´ Interaction Receptor on Hematopoietic Cells N2 - Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen begünstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der hämatopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfläche induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellulären Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2). In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberflächenmolekül CD43 ist auf hämatopoetischen Zellen ubiquitär exprimiert und reguliert in T-Zellen deren Überleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adhäsion. P2X3 wird in hämatopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erwähnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zusätzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an primären und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren. Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. Während die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation primärer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und primären T-Zellen signifikant erhöht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen. In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im hämatopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, könnte ein vielversprechender Kandidat für eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verfügbar ist. N2 - Measles virus (MV) infection induces a severe and long-lasting immunosuppression in patients resulting in infections through opportunistic pathogens. T cell paralysis is a major contributor to MV induced immunosuppression. This can be achieved through contact of a viral glycoprotein complex with an uncharacterized receptor X on the surface of hematopoietic cells. Contact-mediated downregulation of Akt-kinase phosphorylation, inhibition of proliferation and activation the neutral spingomyelinase 2 (NSM2) are key characteristics of T cell inhibition in vitro. Using a kinetic phosphoproteomic approach, two potential interaction receptor candidates were identified: CD43 and P2X3 receptor. The highly glycosylated surface protein CD43 is ubiquitously expressed on hematopoietic cells and is known to regulate T cell survival, proliferation, activation, migration and adhesion. The expression of P2X3 in this compartment is low and its functional importance unknown. It is widely expressed in neuronal cells where it is a major effector in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Using the CRISPR/Cas9 method both candidates were knocked down singly or combined in Jurkat T cells. Cells were then tested for the MV modulated parameters mentioned above upon MV challenge. In addition to that, iso- and allosteric functional inhibitors for P2X3 were employed on primary and Jurkat T cells to determine its role in calcium influx and proliferation after T cell receptor stimulation. The knockdown of both CD43 and P2X3 significantly decreased MV effects on all analyzed parameters (Akt-kinase phosphorylation, proliferation, NSM2 activation) indicating that both proteins play a major role in MV-induced T cell suppression. While isosteric inhibition of receptor P2X3 had no effect, its allosteric inhibition prior to stimulation increased proliferation of primary T cells almost twofold and significantly increased Ca2+ influx in Jurkat cells and primary T cells. In contrast, genetic depletion of P2X3 significantly reduced calcium influx after stimulation as compared to wildtype cells. In this study two important mediators of MV induced T cell suppression were identified. Amongst those, P2X3 whose expression, regulation and functional importance in the hematopoietic compartment has not been investigated yet, may represent a promising candidate for anti-viral therapy due to the existence of a clinically tested inhibitor. KW - Masernvirus KW - Immunsuppression KW - JURKAT-Zelle KW - T-Zellen KW - Interaktionsrezeptor KW - T-Lymphozyt Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-353394 ER - TY - THES A1 - Haas, Tobias Eberhard T1 - Analyse der RNA-Landschaft und Chromatinorganisation in lytischer HSV-1 Infektion und Stress T1 - Analysis of RNA landscape and chromatin organization in lytic HSV-1 infection and stress N2 - Zellstress in Form von lytischer Herpes-simplex-Virustyp-1-Infektion, Hitze und Salzstress führt dazu, dass die RNA-Polymerase II über das 3'-Ende von manchen Genen hinaus transkribiert. Dies geht bei Herpes-simplex-Virustyp-1-Infektion teilweise mit offenem Chromatin nach dem 3'-Ende einher. In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden getestet, um diese Effekte genomweit zu eruieren. Dabei wurden die Peak-Caller ATAC-seq-Pipeline, F-Seq, Hotspots und MACS2 getestet sowie mit der Hilfsgröße „downstream Open Chromatin Regions“ gearbeitet. Weiterhin wurde das R-Skript „Pipeline for ATAC-seq and 4sU-seq plotting“ entwickelt, mit dem sich die Dynamik der oben beschriebenen Effekte zeigen lässt: Die Offenheit des Chromatins ist bei Herpesinfektion zusätzlich zur Erhöhung nach dem 3'-Ende generell erhöht. Die Transkription der RNA-Polymerase II über das 3'-Ende hingegen nimmt nach 75k Basenpaaren rapide ab. Die Ergebnisse des R-Skripts im Bezug auf Salz und Hitzestress decken sich mit vorbeschriebener Literatur, in der gezeigt wurde, dass eine Erhöhung der Offenheit des Chromatins nach dem 3'-Ende nicht stattfindet. N2 - Cell stress in the form of lytic herpes simplex virus type 1 infection, heat, and salt stress causes RNA polymerase II to transcribe beyond the 3' end of some genes. This is sometimes associated with open chromatin beyond the 3' end in herpes simplex virus type 1 infection. In this work, several methods were tested to elicit these effects genome-wide. The peak caller ATAC-seq-Pipeline, F-Seq, hotspots, and MACS2 were tested, and the auxiliary variable "downstream open chromatin regions" was used. Furthermore, the R script "Pipeline for ATAC-seq and 4sU-seq plotting" was developed to show the dynamics of the effects described above: Chromatin openness is generally increased in herpes infection in addition to being increased after the 3' end. In contrast, RNA polymerase II transcription across the 3' end decreases rapidly after 75k base pairs. The results of the R-script in relation to salt and heat stress are consistent with pre-described literature showing that an increase in chromatin openness after the 3' end does not occur. KW - Herpes-simplex-Virus KW - Salzstress KW - Hitzestress KW - Chromatin KW - Peak Caller Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-283028 ER - TY - THES A1 - Deng, Chunchu T1 - Dynamic remodeling of endoplasmic reticulum and ribosomes in axon terminals of wildtype and Spinal Muscular Atrophy motoneurons T1 - Dynamische Reorganization des endoplasmatischen Retikulums und der Ribosomen in Axonterminalen von Wildtyp- und Spinaler Muskelatrophie Motoneuronen N2 - In highly polarized neurons, endoplasmic reticulum (ER) forms a dynamic and continuous network in axons that plays important roles in lipid synthesis, Ca2+ homeostasis and the maintenance of synapses. However, the mechanisms underlying the regulation of axonal ER dynamics and its function in regulation of local translation still remain elusive. In the course of my thesis, I investigated the fast dynamic movements of ER and ribosomes in the growth cone of wildtype motoneurons as well as motoneurons from a mouse model of Spinal Muscular Atrophy (SMA), in response to Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) stimulation. Live cell imaging data show that ER extends into axonal growth cone filopodia along actin filaments and disruption of actin cytoskeleton by cytochalasin D treatment impairs the dynamic movement of ER in the axonal filopodia. In contrast to filopodia, ER movements in the growth cone core seem to depend on coordinated actions of the actin and microtubule cytoskeleton. Myosin VI is especially required for ER movements into filopodia and drebrin A mediates actin/microtubule coordinated ER dynamics. Furthermore, we found that BDNF/TrkB signaling induces assembly of 80S ribosomes in growth cones on a time scale of seconds. Activated ribosomes relocate to the presynaptic ER and undergo local translation. These findings describe the dynamic interaction between ER and ribosomes during local translation and identify a novel potential function for the presynaptic ER in intra-axonal synthesis of transmembrane proteins such as the α-1β subunit of N-type Ca2+ channels in motoneurons. In addition, we demonstrate that in Smn-deficient motoneurons, ER dynamic movements are impaired in axonal growth cones that seems to be due to impaired actin cytoskeleton. Interestingly, ribosomes fail to undergo rapid structural changes in Smn-deficient growth cones and do not associate to ER in response to BDNF. Thus, aberrant ER dynamics and ribosome response to extracellular stimuli could affect axonal growth and presynaptic function and maintenance, thereby contributing to the pathology of SMA. N2 - Das Endoplasmatische Retikulum (ER) bildet ein dynamisches und kontinuierliches Netzwerk in Axonen von stark polarisierten Neuronen und spielt dabei eine wichtige Rolle in der Lipidsynthese, dem Ca2+ Homöostase und der Aufrechterhaltung von Synapsen. Allerding sind die Mechanismen, die der Regulierung der axonalen ER-Dynamik und seiner Funktion bei der dynamischen Regulierung der lokalen Translation zugrunde liegen, nicht vollständig aufgeklärt. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die schnellen dynamischen Bewegungen des ERs und Ribosomen in Wachstumskegeln von Wildtyp- und Smn-defizienten Motoneuronen als Reaktion auf einen kurzen Puls von Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) untersucht. Daten der Bildgebung lebender Zellen zeigen, dass sich das ER in axonalen Filopodien des Wachstumskegels entlang von Aktin-Filamenten ausbreitet. Die Beeinträchtigung des Aktin-Zytoskeletts mittels Cytochalasin D Behandlung führt zu einer Einschränkung der dynamischen Bewegung des ERs in den axonalen Filopodien. Im Gegensatz zu den Filopodien scheinen die Bewegungen des ERs in Wachstumskegeln von einem koordinierten Zusammenspiel des Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts zu beruhen. Myosin VI ist insbesondere für die ER-Bewegungen in Filopodien erforderlich, während Drebrin A die Aktin/Mikrotubuli koordinierte ER-Dynamik vermittelt. Darüber hinaus zeigte sich, dass das BDNF/TrkB Signal die Bildung von 80S-Ribosomen in Wachstumskegeln in Sekundenschnelle auslöst. Aktivierte Ribosomen verlagern sich in das präsynaptische ER und vollziehen eine lokale Translation. Diese Ergebnisse beschreiben die dynamische Interaktion zwischen ER und Ribosomen während der lokalen Translation und zeigen eine neuartige potentielle Funktion des präsynaptischen ER bei der intra-axonalen Synthese von Transmembranproteinen wie die α-1β Untereinheit der N-Typ Ca2+ Kanäle in Motoneuronen auf. Darüber hinaus zeigen wir, dass in Smn-defizienten Motoneuronen die dynamischen ER-Bewegungen in axonalen Wachstumskegeln beeinträchtigt sind, was mit einer gestörten Polymerisation von Aktinfilamenten zusammenzuhängen scheint. Interessanterweise erfahren Ribosomen in Smn-defizienten Wachstumskegeln keine schnellen strukturellen Veränderungen und assoziieren nicht mit dem ER als Reaktion auf BDNF. Somit könnten eine abweichende ER-Dynamik und die Reaktion der Ribosomen auf extrazelluläre Reize das axonale Wachstum und die präsynaptische Funktion und Aufrechterhaltung beeinträchtigen und damit zur Pathologie von SMA beitragen. KW - Motoneuron KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Ribosom KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Spinale Muskelatrophie KW - ER dynamics in axon terminals KW - Dynamics of ribosome assembly KW - BDNF stimulation KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-264954 ER - TY - THES A1 - Djaković, Lara T1 - The HSV-1 ICP22 protein selectively impairs histone repositioning upon Pol II transcription downstream of genes T1 - Das HSV-1 ICP22 Protein stört selektiv die Repositionierung von Histonen bei der Transkription durch Pol-II unterhalb von Genen N2 - Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) is an ubiquitous neurotropic human pathogen that infects a large majority of the world’s population. It is the causative agent of the common cold sore but also responsible for life-threatening infections (e.g., encephalitis), particularly in immunocompromised individuals and neonates. Like other herpesviruses, HSV-1 takes over the cellular RNA machinery to facilitate productive infection while efficiently shutting down host gene expression by targeting multiple steps of RNA metabolism. The two viral proteins, vhs and ICP27, play a crucial role in this process. Delivered by the tegument of the incoming virus, the virion host shut-off (vhs) endonuclease rapidly starts cleaving both cellular and viral mRNAs. With the onset of viral gene expression, the HSV-1 immediate-early protein ICP27 promotes the expression of viral early and late genes through various mechanisms, including mRNA processing, export, and translation. Prior research by the Dölken lab demonstrated that lytic HSV-1 infection results in the disruption of transcription termination (DoTT) of most cellular genes by the viral ICP27 protein. This significantly contributes to HSV-1 induced host shut-off. DoTT results in transcription for tens of thousands of nucleotides beyond poly(A) sites and into downstream genes. Interestingly, this was found to be accompanied by a dramatic increase in chromatin accessibility downstream of the affected poly(A) sites. This is consistent with the formation of extensive downstream open chromatin regions (dOCR) and indicative of impaired histone repositioning in the wake of RNA polymerase II (Pol II) downstream of the affected poly(A) sites. In my PhD thesis, I demonstrate that dOCR formation is dependent on the viral ICP22 protein when poly(A) read-through transcription is triggered by the ectopic expression of ICP27 or salt stress. I show that dOCR formation occurs when a high level of transcriptional activity arises downstream of genes due to the HSV-1-induced DoTT. To investigate whether histone composition is affected downstream of genes, I established the ChIPmentation approach to study associated changes and the influence of DoTT and dOCR formation on major histone modification marks. In HSV-1 WT infection, dOCR formation was reflected in alterations of canonical H1 histone downstream of affected genes, which was absent in ICP22 infection. To elucidate the underlying molecular mechanism, two major histone chaperones SPT6 and FACT (SPT16 and SSRP1), which govern histone repositioning and may thus play a role in H1 homeostasis, were extensively studied. Both histone chaperones have been recently shown to be recruited to the viral genome by interactions with ICP22 protein. To investigate whether the depletion of SSRP1 or SPT6 would complement the loss of ICP22 to induce dOCR, T-HF cells with doxycycline-inducible knock-down of either of the two factors were generated. ATAC-seq analysis revealed that the interaction between the two histone chaperones and ICP22 is not involved in HSV-1-induced dOCR formation, suggesting the involvement of other proteins. In summary, this work sheds new light on a fundamental molecular mechanism of the cellular transcriptional machinery that is manipulated by the concerted actions of the two HSV-1 immediate-early proteins ICP22 and ICP27. N2 - HSV-1 ist ein weit verbreitetes, neurotropisches Virus, mit welchem ein Großteil der Weltbevölkerung infiziert ist. Es verursacht milde Infektionen wie Herpes labialis, aber kann auch lebensbedrohliche Infektionen des Nervensystems (z. B. Enzephalitis) in immunsupprimierten Menschen und Neugeborenen auslösen. Um sich lytisch zu vermehren, programmiert HSV-1 die Transkriptions- und Translationsmaschinerie der Zelle effizient um und hemmt gleichzeitig an mehreren Punkten zelluläre Genexpression. Zwei virale Proteine, vhs und ICP27, spielen dabei eine entscheidende Rolle. Vhs wird im Tegument des Virions mit dem Inokulum in die Zelle geliefert und baut so zelluläre Transkripte ab noch bevor virale Genexpression startet. ICP27 wird also sogenanntes „immediate-early“ Gen als eines der ersten viralen Proteine exprimiert und kann unterstützt auf mehreren Ebenen (RNA Prozessierung, Export und Translation) die Expression der viralen „early“ und „late“ Gene. Unsere Gruppe hat diesbezüglich gezeigt, dass die Terminierung der Transkription (sogenanntes „DoTT“) durch das virale Protein ICP27 in der lytischen Infektion gestört wird. Dies trägt maßgeblich zur Abschaltung der zellulären Genexpression bei. Die Störung der Terminierung führt dazu, dass RNA Polymerase II bis zu >100 Kilobasen nach dem Polyadenylierungssignal weiter transkribiert. Durch die Aktivität der RNA Polymerase II wird in den 3‘ Regionen der betroffenen Gene das Chromatin gelockert (sogenanntes „dOCR“). Dies steht im Einklang mit einer Öffnung des Chromatins durch gehemmte Histon-Neupositionierung, verursacht durch die Transkription der betroffenen Genomregionen. Im Rahmen meiner Doktorarbeit konnte ich mittels Hochdurchsatzsequenzieranalyse von Transposon-zugänglichem Chromatin (ATAC-seq) zeigen, dass offenes Chromatin durch das virale Protein ICP22 verursacht wird. Dieser Effekt konnte unterdessen nur beobachtet werden, wenn die Terminierung der Transkription, entweder durch die gleichzeitige Expression von ICP27 oder stressinduziert z.B. durch hypertonen Lösungen, gestört wurde. Das Ausmaß an offenem Chromatin korrelierte dabei mit der Transkriptionsaktivität der entsprechenden Genomregionen. Durch bioinformatische Analysen von Hochdurchsatzsequenzierungen von Wildtyp Virus und ICP22-defizitären Mutanten infizierten Zellen konnte ich einen Cluster von stark exprimierten Genen mit ausgeprägter DoTT identifizieren, der besonders stark von der Chromatinöffnung betroffen war. Um zu testen, ob die Histone in den betroffenen Regionen durch die Induktion von dOCR verändert wurden, habe ich ein neues Chromatin-Immunpräzipitations Verfahren namens ChIPmentation etabliert und hiermit die mit der Induktion von dOCR assoziierten Histonvarianten untersucht. Dabei fiel auf, dass das H1 Histon gezielt in von dOCR betroffenen Regionen verloren ging. Um den zu Grunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, habe ich die Rolle der beiden Histonchaperonen SPT6 und FACT (SPT16 und SSRP1) ausgiebig charakterisiert. Diese regulieren normalerweise die Repositionierung von Histonen im Zuge der Pol II Transkription. Beide Faktoren werden zudem durch ICP22 in die viralen DNA Replikationzentren im Nukleus rekrutiert, was den Positionierungsdefekt von H1 hervorrufen könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden beide Proteine durch induzierbare shRNA Knockdowns depletiert und mittels ATAC-seq untersucht, ob dies in der Infektion mit ICP22-defizitären Mutanten zur Öffnung des Chromatin führt. Hierbei zeigte sich allerdings, dass die Depletion dieser beider Histonchaperone kein offenes Chromatin bei Infektion mit der ICP22 Knockout Mutante erzeugt. Zudem fiel auf, dass SSRP1 selektiv dazu beitrug, Chromatin in transkribierten Regionen geschlossen zu halten. Offensichtlich spielen daher die beiden Histonchaperonen keine Rolle bei der ICP22-induzierten Öffnung des zellulären Chromatins unterhalb von Genen. KW - HSV-1 KW - Open chromatin KW - ICP22 KW - Read-through transcription Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246709 ER - TY - THES A1 - Stark, Irmgard Katharina T1 - Einfluss von Interferon auf das Infektionsverhalten von Herpes simplex Virus 1 und seiner DUB - Mutante C65A in der Zellkultur T1 - The influence of interferon on infection of Herpes simplex Virus 1 and its DUB – mutant C65A in cell culture N2 - Die Erforschung viraler Proteine ist wichtig, um virale Infektionen besser verstehen und damit therapieren zu können. Die Aufklärung der DUB-Funktion auf dem viralen Herpesprotein pUL36 ermöglicht ein besseres Verständnis des Infektionshergangs und könnte zur Entwicklung eines Enzyminhibitors führen, der nur an diesem Enzym ansetzt, nachdem es sich von den zellulären DUBs unterscheidet (Kattenhorn et al., 2005). In dieser Arbeit konnten die vorherigen Daten, die eine stärkere Hemmung der DUB- Mutante unter Interferoneinfluss zeigten, in unterschiedlichen Assay-Designs bestätigt werden. Auch Versuche mit einem anderen Herpes simplex Virus Strang, bestätigten die vorherigen Daten. Die Ergebnisse zeigen, dass die DUB-Funktion für HSV-1 wichtig ist für die virale Evasion der zellulären Immunantwort. Die genaue Funktion der DUB in der Infektion ist jedoch unklar. Aufgrund der vorbestehenden Datenlage erschien am wahrscheinlichsten, dass die DUB-Funktion vor Eindringen des Herpes Simplex Virus in den Zellkern zum Tragen kommt, womit es nach Abnahme des Interferons nicht zu einer viralen Reaktivierung käme. Deshalb wurden Untersuchungen unternommen, um eine mögliche Reaktivierung nach Abnahme des Interferons näher zu untersuchen. Hierfür wurden zwei verschiedene Experimente entwickelt. Einmal wurde das Interferon direkt nach Infektion und einmal 3 Tage nach Infektion (3dpi) abgenommen. Die Ergebnisse zeigten beide eine stärkere Hemmung der DUB-HSV-1-Mutante unter Interferoneinfluss. Bei Abnahme des Interferons direkt nach Infektion lag bei Wildtyp und Mutante ein leichter Anstieg der Plaquezahlen vor, wobei dieser Effekt von der Dosis des Interferons abhängig war. Eine hohe Interferondosis begünstigte bei beiden eine stärkere Hemmung, allerdings bei beiden auch eine leichte Erhöhung der Plaquezahl nach Abnahme. Bei einer niedrigen Dosis konnte nur eine stärkere Hemmung der DUB-Mutante, jedoch keine Reaktivierung bei Wildtyp und Mutante nach Abnahme des Interferons gezeigt werden. Bei Abnahme drei Tage nach Infektion zeigte sich sowohl bei dem Wildtyp-Virus als auch der DUB- Mutante kein Anstieg in den Plaquezahlen. Es sind, nachdem Deubiquitinierung nicht nur eine Rolle in der Verhinderung des proteosomalen Abbaus von in die Zelle eingedrungenem Virus spielt, sondern auch der Zellregulation, mehrere Szenarien denkbar, die diesen Phänotyp erklären könnten. Die DUB-Funktion könnte zwar den proteosomalen Abbau durch Deubiqutinierung und damit Verhinderung der Markierung des Virus zum zellulären Abbau verhindern. Allerdings könnten sich durch einen langsameren Transport aus der Zelle oder in den Nucleus auch weniger Plaques bei der Mutante als wie beim Wildtyp unter Interferoneinfluss bilden, nachdem das Virus dann leichter Ziel antiviraler Proteine werden könnte. Oder die DUB-Funktion spielt eine Rolle beim Eintritt in den Kern durch Modifikationen anderer Proteine. Virengenome könnten auch durch eine fehlende DUB-Funktion reprimiert werden oder die Zelle durch Apoptose absterben. Interessanterweise konnte keine Hemmung der DUB-Mutante in Interferon behandelten U-2 OS Zellen gezeigt werden, von denen ein Defekt im STING- vermittelten Signalweg bekannt ist. Vielleicht zeigt dies, dass das STING-Protein an dem gezeigten DUB-Phänotyp beteiligt ist. Nachgewiesen ist außerdem bereits eine Funktion des Enzyms bei der zweiten Umhüllung der Kapside bei Pseudorabiesvirus (Möhl, 2011). Weitere Untersuchungen unter Einsatz bspw. von Immunfluoreszenz, Proteasominhibitoren oder weiteren Zelllinien wie Saos-2, sind nötig, um die genaue Funktion zu klären. N2 - The study of viral proteins is important to better understand and thus treat viral infections. Elucidation of DUB function on the viral herpes protein pUL36 provides a better understanding of the infection process and could lead to the development of an enzyme inhibitor that targets only this enzyme after it is different from cellular DUBs (Kattenhorn et al., 2005). In this work, previous data showing greater inhibition of the DUB- mutant under interferon influence were confirmed in different assay designs. Also, experiments with a different herpes simplex virus strand, confirmed the previous data. The results indicate that DUB function for HSV-1 is important for viral evasion of the cellular immune response. However, the exact function of DUB in infection is unclear. Based on the preexisting data, it seemed most likely that DUB function would come into play before herpes simplex virus enters the nucleus, which would mean that viral reactivation would not occur after interferon depletion. Therefore, studies were undertaken to further investigate a possible reactivation after decrease of interferon. Two different experiments were developed for this purpose. Once the interferon was withdrawn immediately after infection and once 3 days after infection (3dpi). The results both showed a stronger inhibition of the DUB-HSV-1 mutant under interferon influence. When interferon was decreased immediately after infection, a slight increase in plaque counts was present in both wild type and mutant, although this effect was dependent on the dose of interferon. A high dose of interferon promoted greater inhibition in both, but also a slight increase in plaque numbers after decrease in both. A low dose showed only greater inhibition of the DUB mutant but no reactivation in wild type and mutant after decrease of interferon. When decreased three days after infection, there was no increase in plaque counts for either the wild-type virus or the DUB- mutant. Given that deubiquitination plays a role not only in preventing proteosomal degradation of virus that has entered the cell but also in cell regulation, several scenarios are conceivable that could explain this phenotype. To be sure, DUB function could prevent proteosomal degradation by deubiqutinating and thereby preventing the virus from being labeled for cellular degradation. However, slower transport out of the cell or into the nucleus could also result in fewer plaques forming in the mutant than in the wild type under interferon influence, after which the virus could more easily become a target of antiviral proteins. Alternatively, DUB function may play a role in entry into the nucleus through modifications of other proteins. Viral genomes could also be repressed by a lack of DUB function or the cell could die by apoptosis. Interestingly, no inhibition of the DUB mutant was shown in interferon-treated U-2 OS cells, which are known to have a defect in the STING-mediated signaling pathway. Perhaps this indicates that the STING protein is involved in the DUB phenotype shown. Furthermore, a function of the enzyme in the second envelope of capsids in pseudorabies virus has already been demonstrated (Möhl, 2011). Further studies using e.g. immunofluorescence, proteasome inhibitors or additional cell lines such as Saos-2, are necessary to clarify the exact function. KW - Herpes simplex Virus DUB C65A KW - DUB Mutante KW - Herpes simplex virus C65A KW - Interferon KW - Zellkultur Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351950 ER -