TY - THES A1 - Reis, Helena T1 - Characterization of telomere protein complexes in Trypanosoma brucei T1 - Charakterisierung von telomerischen Proteinkomplexen in Trypanosoma brucei N2 - African trypanosomiasis is a disease endemic to sub-Saharan Africa. It affects humans as well as wild and domestic animals. The human form of the disease is known as sleeping sickness and the animal form as nagana, which are usually fatal if left untreated. The cause of African trypanosomiasis is the unicellular parasite Trypanosoma brucei. During its life cycle, Trypanosoma brucei shuttles between a mammalian host and the tsetse fly vector. In the mammalian host the parasite multiplies as bloodstream form (BSF) extracellularly in the bloodstream or the lymphatic system. Survival of BSF parasites relies on immune evasion by antigenic variation of surface proteins because its extracellular lifestyle leads to direct exposure to immune responses. At any given time each BSF cell expresses a single type of variant surface glycoprotein (VSG) on its surface from a large repertoire. The active VSG is transcribed from one of 15 specialized subtelomeric domains, termed bloodstream expression sites (BESs). The remaining 14 BESs are silenced. This monoallelic expression and periodic switching of the expressed VSG enables to escape the immune response and to establish a persistent infection in the mammalian host. During developmental differentiation from BSF to the insect vector-resident procyclic form (PCF), the active BES is transcriptionally silenced to stop VSG transcription. Thus, all 15 BESs are inactive in the PCF cells as surface protein expression is developmentally regulated. Previous reports have shown that the telomere complex components TbTRF, TbRAP1 and TbTIF2 are involved in VSG transcriptional regulation. However, the precise nature of their contribution remains unclear. In addition, no information is available about the role of telomeres in the initiation and regulation of developmental BES silencing. To gain insights into the regulatory mechanisms of telomeres on VSG transcription and developmental repression it is therefore essential to identify the complete composition of the trypanosome telomere complex. To this end, we used two complementary biochemical approaches and quantitative label-free interactomics to determine the composition of telomere protein complexes in T. brucei. Firstly, using a telomeric pull-down assay we found 17 potential telomere-binding proteins including the known telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2. Secondly, by performing a co-immunoprecipitation experiment to elucidate TbTRF interactions we co-purified five proteins. All of these five proteins were also enriched with telomeric DNA in the pull-down assay. To validate these data, I characterized one of the proteins found in both experiments (TelBP1). In BSF cells, TelBP1 co-localizes with TbTRF and interacts with already described telomere-binding proteins such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 indicating that TelBP1 is a novel component of the telomere complex in trypanosomes. Interestingly, protein interaction studies in PCF cells suggested a different telomere complex composition compared to BSF cells. In contrast to known members of the telomere complex, TelBP1 is dispensable for cell viability indicating that its function might be uncoupled from the known telomere-binding proteins. Overexpression of TelBP1 had also no effect on cell viability, but led to the discovery of two additional shorter isoforms of TelBP1. However, their source and function remained elusive. Although TelBP1 is not essential for cell viability, western blot analysis revealed a 4-fold upregulation of TelBP1 in the BSF stage compared to the PCF stage supporting the concept of a dynamic telomere complex composition. We observed that TelBP1 influences the kinetics of transcriptional BES silencing during developmental transition from BSF to PCF. Deletion of TelBP1 caused faster BES silencing compared to wild-type parasites. Taken together, TelBP1 function illustrates that developmental BES silencing is a fine-tuned process, which involves stage-specific changes in telomere complex formation. N2 - Afrikanische Trypanosomiasis ist eine Krankheit, die in Afrika südlich der Sahara endemisch vorkommt und sowohl Menschen als auch Wild- und Haustiere betrifft. Die menschliche Form der Krankheit ist als Schlafkrankheit und die Tierform als Nagana bekannt. Ohne Behandlung verläuft die Krankheit in der Regel tödlich. Der einzellige Parasit Trypanosoma brucei ist die Ursache dieser Krankheit. Während seines Lebenszyklus bewegt sich der Parasit zwischen einem Säugetierwirt und einem Insektenvektor, der Tsetsefliege. Im Säugetierwirt vermehrt sich der Parasit als Blutstromform (BSF) extrazellulär im Blutkreislauf und im Lymphsystem. Das Fortbestehen der BSF-Parasiten im Wirt beruht auf einer Immunausweichstrategie durch antigene Variation der Oberflächenproteine. Diese Abwehrstrategie ist erforderlich, da der Parasit durch seinen extrazellulären Lebensstil direkt der Immunantwort ausgesetzt ist. Zu jedem Zeitpunkt wird nur ein variables Oberflächenprotein (VSG) auf der Zelloberfläche aus einem großen Repertoire exprimiert. Dabei wird das aktive VSG von einer von 15 spezialisierten telomerproximalen Transkriptionseinheiten transkribiert, den sogenannten Blutstromform Expression Sites (BESs). Die restlichen 14 BESs sind inaktiv. Diese monoallelische Expression und das periodische Wechseln des exprimierten VSG ermöglichen dem Parasiten der Immunantwort zu entgehen und eine persistente Infektion im Säugetierwirt zu etablieren. Während der Differenzierung von BSF zur Insektenvektor-residenten prozyklischen Form (PCF) wird die aktive BES transkriptionell herunter reguliert um die VSG-Transkription zu stoppen. Somit sind alle 15 BESs in PCF-Zellen inaktiv, da die Expression von Oberflächenproteinen stadienspezifisch reguliert ist. Frühere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass die Proteine TbTRF, TbRAP1 und TbTIF2 des Telomerkomplexes an der Transkriptionsregulation von VSG-Genen beteiligt sind. Es ist jedoch unklar, wie genau sie zur Regulation beitragen. Darüber hinaus gibt es keine Informationen über die Rolle von Telomeren bei der Initiation und Regulation der BES-Inaktivierung während der Differenzierung. Um Einblicke in die regulatorischen Mechanismen von Telomeren auf die VSG-Transkription und differenzierungsbedingte Repression der aktiven BES zu gewinnen, ist es daher notwendig, die vollständige Zusammensetzung der Telomerkomplexe in Trypanosomen zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden zwei komplementäre biochemische Ansätze und quantitative Massenspektrometrie genutzt um die Zusammensetzung von Telomerproteinkomplexen in T. brucei zu bestimmen. Zunächst wurden mittels einer Affinitätschromatographie mit TTAGGG-Oligonukleotiden 17 potentielle telomerbindende Proteine gefunden. Darunter waren auch die bereits bekannten telomerbindenden Proteine TbTRF und TbTIF2. Zweitens wurde mit Hilfe eines Co-Immunpräzipitationsexperiments um die Interaktionen von TbTRF aufzuklären, fünf Proteine aufgereinigt. Alle diese fünf Proteine wurden auch mit telomerischer DNA in der Affinitätschromatographie angereichert. Um diese Daten zu validieren, wurde eines der in beiden Experimenten gefundenen Proteine (TelBP1) charakterisiert. In BSF-Zellen co-lokalisiert TelBP1 mit TbTRF und interagiert mit bereits beschriebenen telomerbindenden Proteinen wie TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1. Dies deutet darauf, dass TelBP1 eine weitere Komponente des Telomerkomplexes in Trypanosomen ist. Interessanterweise deuteten Proteininteraktionsstudien in PCF-Zellen auf eine andere Zusammensetzung des Telomerkomplexes im Vergleich zu BSF-Zellen. Im Gegensatz zu den bekannten Mitgliedern des Telomerkomplexes ist TelBP1 für das Zellwachstum nicht essentiell. Damit könnte die Funktion von TelBP1 von den bekannten telomerbindenden Proteinen entkoppelt sein. Die Überexpression von TelBP1 zeigte auch keinen Einfluss auf das Zellwachstum, führte aber zur Entdeckung von zwei weiteren kürzeren Isoformen von TelBP1. Ihr Ursprung und Funktion blieben jedoch ungeklärt. Obwohl TelBP1 für das Zellwachstum entbehrlich ist, zeigten Westernblot-Analysen eine 4-fache Hochregulierung von TelBP1 in BSF-Zellen im Vergleich zu PCF-Zellen. Die stadienspezifische Regulation von TelBP1 unterstützt damit das Konzept von einer dynamischen Zusammensetzung der Telomerkomplexe. Zudem wurde beobachtet, dass TelBP1 die Kinetik der Inaktivierung der aktiven BES während der Differenzierung von der BSF zur PCF beeinflusst. Die Deletion von TelBP1 führte zu einem schnelleren Abschalten der BES im Vergleich zu Wildtyp-Parasiten. Zusammengefasst zeigt die Funktion von TelBP1, dass das Abschalten der aktiven BES während der Differenzierung ein fein abgestimmter Prozess ist, der stadienspezifische Veränderungen der Telomerkomplexe beinhaltet. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Telomer KW - telomere-binding protein KW - chromatin remodeling KW - developmental differentiation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151323 ER - TY - THES A1 - Müller-Hübner, Laura T1 - The role of nuclear architecture in the context of antigenic variation in Trypanosoma brucei T1 - Über die Rolle der Zellkernarchitektur im Kontext von Antigenvariation in Trypanosoma brucei N2 - Antigenic variation of surface proteins is a commonly used strategy among pathogens to evade the host immune response [63]. The mechanism underlying antigenic variation relies on monoallelic exclusion of a single gene from a hypervariable multigene family combined with repeated, systematic changes in antigen expression. In many systems, these gene families are arranged in subtelomeric contingency loci that are subject to both transcriptional repression and enhanced mutagenesis and recombination [16]. Eviction of a selected gene from a repressed antigen repertoire can be achieved e.g. by recombination into a dedicated, transcriptionally permissive site or by local epigenetic alterations in chromatin composition of the selected gene. Both processes are ultimately affected by genome architecture. Architectural proteins controlling antigenic variation have, however, remained elusive in any pathogen. The unicellular protozoan parasite Trypanosoma brucei evades the host immune response by periodically changing expression of a single variant surface glycoprotein (VSG) from a repertoire of ~3000 VSG genes – the largest mutually exclusively expressed gene family described today. To activate a selected VSG gene, it needs to be located in a dedicated expression site that becomes subject to relocation into a distinct, transcriptionally active subnuclear compartment, the expression site body (ESB). Whereas this emphasizes the importance of nuclear architecture in regulating antigen expression in T. brucei, the mechanisms underlying spatial positioning of DNA in T. brucei are not well understood. In this study I applied genome-wide chromosome conformation capture (Hi-C) to obtain a comprehensive picture of the T. brucei genome in three dimensions, both in procyclic and bloodstream form parasites. Hi-C revealed a highly structured nucleus with megabase chromosomes occupying distinct chromosome territories. Further, specific trans interactions between chromosomes, among which are clusters of centromeres, rRNA genes and procyclins became apparent. With respect to antigenic variation, Hi-C revealed a striking compaction of the subtelomeric VSG gene repertoire and a strong clustering of transcriptionally repressed VSG-containing expression sites. Further, Hi-C analyses confirmed the spatial separation of the actively transcribed from the silenced expression sites in three dimensions. I further sought to characterize architectural proteins mediating nuclear architecture in T. brucei. Whereas CTCF is absent in non-metazoans, we found cohesin to be expressed throughout the cell cycle, emphasizing a function beyond sister chromatid cohesion in S-phase. By Chromatin-Immunoprecipitation with sequencing (ChIPseq), I found cohesin enrichment to coincide with the presence of histone H3 vari- ant (H3.V) and H4 variant (H4.V). Most importantly, cohesin and the histone variants were enriched towards the VSG gene at silent and active expression sites. While the deletion of H3.V led to increased clustering of expression sites in three dimensions and increased chromatin accessibility at expression site promoters, the additional deletion of H4.V increased chromatin accessibility at expression sits even further. RNAseq showed that mutually exclusive VSG expression was lost in H3.V and H4.V single and double deletion mutants. Immunofluorescence imaging of surface VSGs, flow cytometry and single-cell RNAseq revealed a progressive loss of VSG-2 expression, indicative of an increase in VSG switching rate in the H3.V/H4.V double deletion mutants. Using long-read sequencing technology, we found that VSG switching occurred via recombination and concluded, that the concomitant increase in spatial proximity and accessibility among expression sites facilitated the recombination event. I therefore identified the histone variants H3.V and H4.V to act at the interface of global nuclear architecture and chromatin accessibility and to represent a link between genome architecture and antigenic variation. N2 - Antigenvariation ist ein weit verbreiteter Mechanismus der Immunevasion von Pathogenen [63]. Sie beruht auf der transkriptionellen Selektion eines einzelnen Gens aus einer hypervariablen Multi-Gen Familie und dem wiederholten, systematischen Wechsel zwischen der Expression verschiedener Gene dieser Familie. In vielen Organismen sind diese Gene als Kontingenzgene in den Subtelomeren angeordnet, wo sind einerseits transkriptionell reprimiert werden, andererseits erhöhter Mutagenese und Rekombination unterliegen [16]. Monoallelische Exklusion eines Gens und die damit einhergehende Eviktion aus seinem reprimierten genomischen Umfeld beruht auf unterschiedlichen molekularen Mechanismen. Sie ist, zum Beispiel, das Resultat einer Rekombination des betreffenden Gens in einen dedizierten, transkriptionell permissiven Lokus oder wird durch epigenetische, bzw. räumliche Umstrukturierung des entsprechenden Gens oder zugrunde liegenden Chromatins erreicht. Beide Prozesse sind letztendlich durch die Architektur des Genoms beeinflusst. Architekturelle Proteine, die ebenfalls Antigenvariation kontrollieren, sind in vielen Pathogenen unbekannt. Der parasitäre Protozoe Trypanosoma brucei entkommt einer Elimination durch die Immunabwehr seines Wirtes durch den periodischen Wechsel in der Expression eines von fast 3000 variablen Oberflächenglykoproteinen (VSGs). VSG-Gene umfassen die größte, monoallelisch exprimierte Genfamilie, die bislang beschrieben wurde. Um exprimiert zu werden, muss das selektierte VSG Gen in eine Expressionsseite transloziert sein. Diese wiederum wird in einem dedizierten Kompartment des Zellkerns, dem Expressionsseiten-Zellkernkörper (ESB), transkribiert. Obgleich diese Gegebenheiten die zentrale Rolle der Zellkernarchitektur in der Antigenvariation in T. brucei verdeutlichen, so ist wenig über die ihr zugrundeliegenden Mechanismen bekannt. Um ein umfassendes Bild der Zellkernarchitektur in Trypanosomen zu bekommen, habe ich in der hier vorliegenden Doktorarbeit Hi-C, eine Methode zur Feststellung chromosomaler Konformationen, in T. brucei Blutstromform und Prozyklen etabliert und angewendet. Die Applikation dieser Technik offenbarte einen hoch strukturierten Zellkern: Chromosome sind territorial angeordnet und gehen spezifische Interaktionen in trans untereinander ein. Dies sind beispielsweise Interaktionen zwischen Zentromeren, Genen für ribosomale RNA und Prozyklinen unterschiedlicher Chromosomen. Auch Interaktionen, die in funktionellem Zusammenhang mit Antigenvariation stehen, wurden gefunden. Dabei handelte es sich zum Einen um strukturelle Verdichtungen des subtelomerischen Chromatins transkriptionell reprimierter VSG Gene und zum Anderen um erhöhte Interaktionen zwischen reprimierten VSG-Expressionsseiten. Hi-C bestätigte außerdem die räumliche Separation der aktiv transkribierten Expressionsseite von den übrigen, stillen VSG-Expressionsseiten. Des Weiteren suchte ich nach Proteinen, die in der Aufrechterhaltung der Zellkernarchitektur in T. brucei wirken. Anders als CTCF ist Cohesin nicht auf Metazoen beschränkt. Ich fand Cohesin über den gesamten Zellzyklus exprimiert, was eine architekturelle Rolle des Proteinkomplexes zuzüglich der Schwesterchromatidkohäsion suggerierte. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation konnte ich feststellen, dass Cohesin mit den Histonvarianten H3.V und H4.V an vielen Stellen des Ge- noms kolokalisierte, insbesondere über dem VSG Gen der aktiven und reprimierten Expressionsseiten. Während eine Deletion von H3.V zu erhöhten Interaktionsfrequenzen zwischen Expressionsseiten führte, resultierte eine gleichzeitige Deletion von H3.V und H4.V zu einer additiven Öffnung des Chromatins an Expressionsseiten. RNA Sequenzierungen ergaben, dass in der H3.V/H4.V Doppeldeletionsmutante die Transcription von VSG Genen erhöht war, was auf einen funktionellen Verlust der monoallelischen Expression hindeutete. Immunfluoreszenzaufnahmen der VSGs auf der Zelloberfläche, Durchflusszytometrie und RNA Sequenzierung einzelner Zellen zeigten einen fortschreitenden Verlust der Expression von VSG-2, was auf einen erhöhten Wechsel der VSG-Expression auf dem Einzelzelllevel hindeutete. Durch die Sequenzierung der genomischen DNA der H3.V/H4.V Doppeldeletionsmutante konnten wir feststellen, dass der primäre Mechanismus des Wechsels in der VSG Expression auf eine Rekombination zwischen Expressionsseiten zurückzuführen war. Diese Rekombination wurde vermutlich durch die gesteigerte räumliche Nähe und Öffnung des Chromatins der Expressionsseiten begünstigt. Zusammenfassend konnte ich feststellen, dass die Histonvarianten H3.V und H4.V auf der Schnittstelle zwischen globaler Zellkernarchitektur und lokaler Chromatinzugänglichkeit agieren und funktionell ein molekulares Verbindungsstück zwischen Genomarchitektur und Antigenvariation darstellen. KW - Trypanosoma brucei brucei KW - Zellkern KW - Histone KW - DNS KW - Zellkernarchitektur KW - Hi-C KW - nuclear architecture KW - parasitology KW - histone variants KW - antigenic variation KW - mutually exclusive expression KW - chromosome conformation capture KW - variant surface glycoprotein KW - VSG Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187074 ER - TY - THES A1 - Vasquez Ospina, Juan Jose T1 - Development of tools for the study of gene regulation in Trypanosoma brucei T1 - Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der Genregulation in Trypanosoma brucei N2 - The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the causal agent of sleeping sickness and besides its epidemiological importance it has been used as model organism for the study of many aspects of cellular and molecular biology especially the post-transcriptional control of gene expression. Several studies in the last 30 years have shown the importance of mRNA processing and stability for gene regulation. In T. brucei genes are unusually arranged in polycistronic transcription units (PTUs) and a coupled process of trans-splicing and polyadenylation produces the mature mRNAs. Both processes, mRNA processing and stability, cannot completely explain the control of gene expression in the different life cycle stages analyzed in T. brucei so far. In recent years, the relevance of expression regulation at the level of translation has become evident in other eukaryotes. Therefore, in the first part of my thesis I studied the impact of translational regulation by means of a genome-wide ribosome profiling approach. My data suggest that translational efficiencies vary between life cycle stages of the parasite as well as between genes within one life cycle stage. Furthermore, using ribosome profiling I was able to identify many new putative un-annotated coding sequences and to evaluate the coding potential of upstream open reading frames (uORF). Comparing my results with previously published proteomic and RNA interference (RNAi) target sequencing (RIT-seq) datasets allowed me to validate some of the new coding sequences and to evaluate their relevance for the fitness of the parasite. In the second part of my thesis I used the transcriptomic and translatomic profiles obtained from the ribosome profiling analysis for the identification of putative non-coding RNAs (ncRNAs). These results led to the analysis of the coding potential in the regions upstream and downstream of the expressed variant surface glycoprotein (VSG), which is outlined in the third part of the results section. The region upstream of the VSG, the co-transposed region (CTR), has been implicated in an increase of the in situ switching rate upon its deletion. The ribosome profiling results indicated moderate transcription but not translation in this region. These results raised the possibility that the CTR may be transcribed into ncRNA. Therefore, in the third part of my thesis, I performed a primary characterization of the CTR-derived transcripts based on northern blotting and RACE. The results suggested the presence of a unique transcript species of about 1,200 nucleotides (nt) and polyadenylated at the 3’-end of the sequence. The deletion of the CTR sequence promoting and increase of the in situ switching rates was performed around 20 years ago by means of inserting reporter genes. With the recent development of endonuclease-based tools for genome editing, it is now possible to delete sequences in a marker-free way. In the fourth part of my thesis, I show the results on the implementation of the highly efficient genome-editing CRISPR-Cas9 system in T. brucei using episomes. As a proof of principle, I inserted the sequence coding for the enhanced green fluorescent protein (eGFP) at the end of the SCD6 coding sequence (CDS). Fluorescent cells were observed as early as two days after transfection. Therefore, after the successful set up of the CRISPR-Cas9 system it will be possible to modify genomic regions with more relevance for the biology of the parasite, such as the substitution of codons present in gene tandem arrays. The implementation of ribosome profiling in T. brucei opens the opportunity for the study of translational regulation in a genome-wide scale, the re-annotation of the currently available genome, the search for new putative coding sequences, the detection of putative ncRNAs, the evaluation of the coding potential in uORFs and the role of unstranslated regions (UTRs) in the regulation of translation. In turn, the implementation of the CRISPR-Cas9 system offers the possibility to manipulate the genome of the parasite at a nucleotide resolution and without the need of including resistant makers. The CRISPR-Cas9 system is a powerful tool for editing ncRNAs, UTRs, multicopy gene families and CDSs keeping their endogenous UTRs. Moreover, the system can be used for the modification of both alleles after just one round of transfection and of codons coding for amino acids carrying post-translational modifications (PTMs) among other possibilities.     N2 - Trypanosoma brucei ist nicht nur als Erreger der Schlafkrankheit von großer epidemiologischer Bedeutung, sondern dient auch der Zell-­‐ und Molekularbiologie – insbesondere zur Erforschung der Genregulation auf posttranskriptionaler Ebene – als wichtiger Modellorganismus. In den vergangenen 30 Jahren konnten mehrere Forschungsarbeiten zeigen, dass mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung maßgeblich zur Regulation der Genexpression beitragen. Anders als in den meisten Eukaryoten sind die Gene in T. brucei in polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTUs) angeordnet. Die reife mRNA entsteht aus dem polycistronischen Transkript in einem gekoppelten Prozess aus Trans-­‐splicing und paralleler Polyadenylierung. Beide Vorgänge allein, mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung, reichen nicht aus, um die Regulation der Genexpression in T. brucei vollständing zu erklären und zusätzliche Mechanismen müssen wirksam sein. Daher habe ich im ersten Teil meiner hier vorliegenden Doktorarbeit die Genregulation auf Ebene der Translation mittels genomweitem Ribosome Profiling untersucht. Die dabei gewonnen Daten deuten darauf hin, dass die Translationseffizienzen nicht nur zwischen prozyklischen-­‐ und Blutstromformen des Parasiten differieren, sondern auch die Gene innerhalb eines Stadiums verschieden effizient translatiert werden. Zudem war es mir mit diesem Ansatz möglich, neue, noch nicht annotierte kodierende Sequenzen zu identifizieren und das Kodierungspotenzial der jeweils vorgelagerten offenen Leseraster (ORFs) zu evaluieren. Mithilfe bereits veröffentlichter Proteom-­‐ und RNA Interferenz-­‐ Studien (RIT-­‐seq) konnte ich einige der neu identifizierten kodierenden Sequenzen validieren und deren Bedeutung für die Fitness des Parasiten bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die ermittelten Translations-­‐ und Transkriptionsprofile miteinander verglichen, um auf diese Weise mögliche nicht-­‐kodierende RNAs (ncRNAs) zu identifizieren. Dies führte zu einer eingehenderen Betrachtung der Kodierungspotenziale der dem exprimierten variablen Oberflächenproteins (VSG) vor-­‐ und nachgeschalteten Regionen. In früheren Arbeiten wurde bereits beschrieben, dass eine Deletion der dem VSG vorgelagerten, sogenannten co-­‐transposed region (CTR), vermehrt zu einer Aktivierung einer alternativen VSG Expressionsseite (in situ switches) führt. Ribosome Profiling zeigte, dass eben jede Regionen zwar moderat transkribiert, jedoch nicht translatiert werden. Da diese Ergebnisse vermuten ließen, dass die CTR für eine ncRNA kodiert, hab ich im dritten Teil meiner Arbeit die CTR Transkripte mittels Northern Blot und RACE weiter charakterisiert. Auf diese Weise konnte ich spezifische, 1200 Nukleotide (nt) lange und am 3`-­‐Ende polyadenylierte Transkripte nachweisen. Die bereits erwähnte Deletion der CTR verbunden mit einer erhöhten Rate an in situ switches wurde vor etwa 20 Jahren durch Insertion von Reportergenen durchgeführt. Heute ist es möglich mithilfe von Endonukleasen Genome ohne solche Marker zu editieren. So beschreibt der vierte Teil der Arbeit die Konstruktion von Episomen zur Etablierung und Anwendung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei. Als Machbarkeitsnachweis wurde die kodierende Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) am Ende des SCD6 Gens als Fusionsprotein inseriert. Grün fluoreszierende Zellen konnten bereits zwei Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden. Nachdem CRISPR-­‐Cas9 erfolgreich in T. brucei etabliert werden konnte, werde ich im Folgenden weitere relevante Regionen im Genom modifizieren und beispielsweise die Deletion zweier Histonvarianten durchführen. Die Ribosome Profiling Studie in T. brucei erlaubt es uns, genomweit Genregulation auf Ebene der Translation zu analysieren, das uns zurzeit vorliegende Genom zu re-­‐annotieren, neue kodierende Sequenzen wie auch ncRNAs zu identifizieren und den Einfluss nicht-­‐kodierender Sequenzen auf die Translation zu untersuchen. Gleichzeitig ermöglicht die Etablierung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei eine hochpräzise Manipulation des Genoms ohne den Einsatz von Resistenzmarkern. Auf diese Weise ist es möglich, Gene zu modifizieren und dabei die zugehörigen untranslatierten Bereiche (UTRs) zu erhalten, aber auch ncRNAs, UTRs und mehrfache Kopien eines Gens (gleichzeitig) zu editieren. Ebenso können einzelne Kodons in der Sequenz und somit posttranslational modifizierte Aminosäuren im Genprodukt verändert werden, was uns weitere Möglichkeiten zur Erforschung der Genregulation eröffnet. KW - Trypanosoma brucei KW - Ribosom KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Trypanosoma brucei KW - Gene expression regulation KW - Ribosome profiling KW - CRISPR Cas9 KW - CRISPR Cas9 system Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133996 ER - TY - THES A1 - Kraus, Amelie Johanna T1 - H2A.Z – a molecular guardian of RNA polymerase II transcription in African trypanosomes T1 - H2A.Z – eine molekulare Wächterin der RNA Polymerase II Transkription in Afrikanischen Trypanosomen N2 - In eukaryotes, the enormously long DNA molecules need to be packaged together with histone proteins into nucleosomes and further into compact chromatin structures to fit it into the nucleus. This nuclear organisation interferes with all phases of transcription that require the polymerase to bind to DNA. During transcription – the process in which the hereditary information stored in DNA is transferred to many transportable RNA molecules - nucleosomes form a physical obstacle for polymerase progression. Thus, transcription is usually accompanied by processes mediating nucleosome destabilisation, including post-translational histone modifications (PTMs) or exchange of canonical histones by their variant forms. To the best of our knowledge, acetylation of histones has the highest capability to induce chromatin opening. The lysine modification can destabilise histone-DNA interactions within a nucleosome and can serve as a binding site for various chromatin remodelers that can modify the nucleosome composition. For example, H4 acetylation can impede chromatin folding and can stimulate the exchange of canonical H2A histone by its variant form H2A.Z at transcription start sites (TSSs) in many eukaryotes, including humans. As histone H4, H2A.Z can be post-translationally acetylated and as acetylated H4, acetylated H2A.Z is enriched at TSSs suggested to be critical for transcription. However, thus far, it has been difficult to study the cause and consequence of H2A.Z acetylation. Even though, genome-wide chromatin profiling studies such as ChIP-seq have already revealed the genomic localisation of many histone PTMs and variant proteins, they can only be used to study individual chromatin marks and not to identify all factors important for establishing a distinct chromatin structure. This would require a comprehensive understanding of all marks associated to a specific genomic locus. However, thus far, such analyses of locus-specific chromatin have only been successful for repetitive regions, such as telomeres. In my doctoral thesis, I used the unicellular parasite Trypanosoma brucei as a model system for chromatin biology and took advantage of its chromatin landscape with TSSs comprising already 7% of the total T. brucei genome (humans: 0.00000156%). Atypical for a eukaryote, the protein-coding genes are arranged in long polycistronic transcription units (PTUs). Each PTU is controlled by its own ~10 kb-wide TSS, that lies upstream of the PTU. As observed in other eukaryotes, TSSs are enriched with nucleosomes containing acetylated histones and the histone variant H2A.Z. This is why I used T. brucei to particularly investigate the TSS-specific chromatin structures and to identify factors involved in H2A.Z deposition and transcription regulation in eukaryotes. To this end, I established an approach for locus-specific chromatin isolation that would allow me to identify the TSSs- and non-TSS-specific chromatin marks. Later, combining the approach with a method for quantifying lysine-specific histone acetylation levels, I found H2A.Z and H4 acetylation enriched in TSSs-nucleosomes and mediated by the histone acetyltransferases HAT1 and HAT2. Depletion of HAT2 reduced the levels of TSS-specific H4 acetylation, affected targeted H2A.Z deposition and shifted the sites of transcription initiation. Whereas HAT1 depletion had only a minor effect on H2A.Z deposition, it had a strong effect on H2A.Z acetylation and transcription levels. My findings demonstrate a clear link between histone acetylation, H2A.Z deposition and transcription initiation in the early diverged unicellular parasite T. brucei, which was thus far not possible to determine in other eukaryotes. Overall, my study highlights the usefulness of T. brucei as a model system for studying chromatin biology. My findings allow the conclusion that H2A.Z regardless of its modification state defines sites of transcription initiation, whereas H2A.Z acetylation is essential co-factor for transcription initiation. Altogether, my data suggest that TSS-specific chromatin establishment is one of the earliest developed mechanisms to control transcription initiation in eukaryotes. N2 - In Eukaryoten muss die genomische DNA zusammen mit Histonproteinen zu Nukleosomen und weiter zu kompakten Chromatinstrukturen verpackt werden, damit sie in den Zellkern passt. Diese Organisation behindert die Transkription bei jedem Schritt, bei dem die Polymerase an der DNA bindet. Während der Transkription – dem Prozess bei dem die in der DNA gespeicherte Erbinformation in viele transportable RNA Molekülen umgewandelt wird – stellen Nukleosomen ein physikalisches Hindernis für das Vorankommen der Polymerase dar. Aus diesem Grund wird die Transkription üblicherweise von Prozessen begleitet, die für die Destabilisierung der Nukleosomen sorgen, wie zum Beispiel post-translationale Modifizierung (PTM) der Histone oder der Austausch von kanonischen Histonproteinen durch eine ihrer Varianten. Soweit bisher bekannt ist Histonacetylierung am besten dafür geeignet, eine offene Chromatinstruktur bereit zu stellen. Die Lysinmodifizierung kann Interaktionen zwischen der DNA und den Histonen innerhalb eines Nukleosomes destabilisieren und als Andockstelle für einige Proteinkomplexe sogenannte Chromatin-Modellierer fungieren, die die Zusammensetzung eines Nukleosomes verändern können. Zum Beispiel, kann Acetylierung am Histon H4 das „Zusammenfalten“ des Chromatins erschweren und den Austausch von kanonischem H2A mit ihrer Variante H2A.Z an den Transkriptiosinitiationsstellen (TSSen) in vielen eukaryotischen Organismen, Menschen eingeschlossen, stimulieren. Wie Histon H4, kann auch H2A.Z post-translationell acetyliert werden und wie acetyliertes H4, findet man auch acetyliertes H2A.Z vor allem an TSSen. Deswegen geht man davon aus, dass es sehr wichtig für die Transkriptioninitiierung ist. Allerdings war es bisher nicht möglich, die Ursache und Wirkung von H2A.Z Acetylierung genauer zu untersuchen. Genom-weite Chromatinprofilstudien wie z.B. ChIP-Seq ermöglichen es die genomische Lokalisierung von vielen Histon-Modifizierungen und -Varianten zu bestimmen. Dennoch reichen sie nicht dafür aus alle Faktoren, die für die Bildung einer bestimmten Chromatinstruktur notwendig sind, gleichzeitig herauszufinden. Das würde voraussetzen, dass man alle Merkmale der genomischen Stelle kennt. Bisher waren Analysen von spezifischen Chromatinstellen nur erfolgreich, wenn das Chromatin von einer repetitiven Region, wie z.B. Telomeren, stammt. In meiner Doktorarbeit verwendete ich den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei als Modelsystem für Chromatinbiologie. Dabei machte ich mir dessen Chromatinorganisation zunutze, die eher untypisch für einen eukaryotische Organismus ist. TSSen machen hier ungefähr 7% des gesamten Genoms aus (Mensch: 0.00000156%). Protein-kodierende Gene sind in langen polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTE) angeordnet. Jede dieser Einheiten besitzt eine eigene TSS, die vor der PTE liegt, und bis zu 10 kb lang sein kann. Jedoch, wie in anderen Eukaryoten, sind an den TSSen Nukleosomen angereichert, die sich durch acetylierte Histone und den Einbau der Histonvariante H2A.Z auszeichnen. Aus diesen Gründen verwendete ich T. brucei, um während meiner Doktorarbeit die Chromatinstrukturen, die TSSen auszeichnen, genauer zu untersuchen und die Faktoren, die bei der H2A.Z Positionierung und dadurch bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten eine Rolle spielen, herauszufinden. Dafür etablierte ich zuerst eine Methode, mit der man Chromatin von einer bestimmten genomischen Stelle isolieren kann und die es mir ermöglichen würde, die Merkmale von TSS-spezifischen und -unspezifischen Chromatin zu identifizieren. Später konnte ich das entwickelte Protokoll mit einer Methode zur Quantifizierung von Lysin-spezifischen Histonacetylierung kombinieren. Dadurch konnte ich herausfinden, dass Nukleosomen an trypanosomischen TSSen stark acetyliertes H2A.Z und H4 enthalten und dass für diese Modifizierungen die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 verantwortlich sind. Eine Reduzierung der HAT2-Levels führte zu einer Reduzierung von H4 Acetylierung, verschlechterte die gezielte H2A.Z Positionierung und führte dazu, dass die Transkriptioninitiierung sich verlagerte. Wohingegen eine Reduzierung von HAT1, die zwar nur einen kleinen Einfluss auf die H2A.Z Positionierung hatte, eine sehr starke Verringerung von acetyliertem H2A.Z und der Transkriptionsrate zur Folge hatte. Durch meine Ergebnisse konnte ich zeigen, dass in T. brucei, einem evolutionär divergenten eukaryotischem Organismus, die Prozesse der Histonacetylierung, H2A.Z Positionierung und Transkriptionsinitiierung sehr stark miteinander verbunden sind. Meine Arbeit ist des weiteren ein Beweis dafür, dass T. brucei ein sehr wichtiger Modellorganismus für die Forschung an Chromatin ist. Insgesamt erlauben meine Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass H2A.Z, egal ob modifiziert oder nicht, ein Herausstellungsmerkmal für TSSen ist, während acetyliertes H2A.Z essentiell für die Transkriptionsinitiierung darstellt. Zusammengefasst, weisen die Daten meiner Doktorarbeit darauf hin, dass die Etablierung von bestimmten Chromatinstrukturen an TSSen eines der frühesten entwickelten Mechanismen zur Kontrolle der Transkriptionsinitiierung in Eukaryoten ist. KW - Chromatin KW - Histone KW - Histonacetyltransferase KW - Transcription KW - Acetylation KW - H2A.Z KW - Trypanosoma Brucei KW - Histone Acetylation KW - Transcription KW - Chromatin KW - Histone KW - Histone modification KW - Histone variant Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250568 ER - TY - THES A1 - del Olmo Toledo, Valentina T1 - Evolution of DNA binding preferences in a family of eukaryotic transcription regulators T1 - Evolutionäre Entwicklung der Bindeaffinität an bestimmte DNA Sequenzen in einer Familie von eukaryotischen Transkriptionsfaktoren N2 - Regulation of gene expression by the control of transcription is essential for any cell to adapt to the environment and survive. Transcription regulators, i.e. sequence-specific DNA binding proteins that regulate gene expression, are central elements within the gene networks of most organisms. Transcription regulators are grouped into distinct families based on structural features that determine, to a large extent, the DNA sequence(s) that they can recognise and bind. Less is known, however, about how the DNA binding preferences can diversify within transcription regulator families during evolutionary timescales, and how such diversification can affect the biology of the organism. In this dissertation I study the SREBP (sterol regulatory element binding protein) family of transcriptional regulators in yeasts, and in Candida albicans in particular, as an experimental system to address these questions. The SREBPs are conserved from fungi to humans and represent a subgroup of basic helix-loop-helix DNA binding proteins. Early chromatin immunoprecipitation experiments with SREBPs from humans and yeasts showed that these proteins bound in vivo to the canonical DNA sequence, termed E-box, most basic helix-loop-helix proteins bind to. By contrast, most recent analysis carried out with less-studied fungal SREBPs revealed a non-canonical DNA motif to be the most overrepresented sequence in the bound regions. This study aims to establish the intrinsic DNA binding preferences of key branches of this family and to determine how the divergence in DNA binding affinities originated. To this end, I combined phylogenetic and ancestral reconstruction with extensive biochemical characterisation of key SREBP proteins. The results indicated that while the most-studied SREBPs (in mammals) indeed show preference for the E-box, a second branch of the family preferentially binds the non-E-box, and a third one is able to bind both sequences with similar affinity. The preference for one or the other DNA sequence is an intrinsic property of each protein because their purified DNA binding domain was sufficient to recapitulate their in vivo binding preference. The ancestor that gave rise to these two different types of SREBPs (the branch that binds E-box and the one that binds non-E-box DNA) appears to be a protein with a broader DNA binding capability that had a slight preference for the non-canonical motif. Thus, the results imply these two branches originated by either enhancing the original ancestral preference for non-E-box or tilting it towards the E-box DNA and flipping the preference for this sequence. The main function associated with members of the SREBP family in most eukaryotes is the control of lipid biosynthesis. I have further studied the function of these proteins in the lineage that encompasses the human associated yeast C. albicans. Strikingly, the three SREBPs present in the fungus’ genome contribute to the colonisation of the mammalian gut by regulating cellular processes unrelated to lipid metabolism. Here I describe that two of the three C. albicans SREBPs form a regulatory cascade that regulates morphology and cell wall modifications under anaerobic conditions, whereas the third SREBP has been shown to be involved in the regulation of glycolysis genes. Therefore, I posit that the described diversification in DNA binding specificity in these proteins and the concomitant expansion of targets of regulation were key in enabling this fungal lineage to associate with animals. N2 - Für jede Zelle ist es essenziell die Transkription über die Genexpression zu regulieren, um sich an unterschiedliche Lebensbedingungen anzupassen. Regulatoren der Transkription, zum Beispiel sequenzspezifische DNA-binde Proteine, sind ein zentrales Element des Genregulationsnetzwerks in den meisten Organismen. Auf Grund ihres Aufbaus sowie der daraus resultierenden spezifischen Eigenschaften DNA zu binden, werden diese Regulatoren in unterschiedliche Familien unterteilt. Bisher ist wenig darüber bekannt, wie unterschiedlich die DNA Sequenzen sein können, welche von einer Familie von Transkriptionsregulatoren gebunden werden, wie sich diese Diversität der Bindung in der Evolution über die Zeit verändert hat und ob diese unterschiedlichen Bindeaffinitäten die Biologie eines Organismus beeinflussen. In dieser Dissertation befasse ich mich mit der Transkriptionsregulator Familie der SREBPs (sterol regulatory element binding protein) in Hefen, als Modelorganismus diente dabei Candida albicans. Die Familie der SREBPs ist vom Pilz zu den Menschen genetisch weitestgehend konserviert und repräsentiert eine Unterfamilie der Helix-loop-helix DNA-binde Proteine. Erste Chromatin-Immunpräzipitation Experimente der SREBPs in Menschen und Hefen zeigen in vivo eine Bindung an eine kanonische DNA Sequenz genannt E-box, welche von den meisten der Helix-loop-helix Proteine gebunden wird. Im Gegensatz zeigen neuere Analysen, welche mit weniger bekannten SREBPs aus Pilzen durchgeführt wurden, dass hauptsächlich nicht-kanonische DNA Sequenzen gebunden werden. Diese Arbeit versucht die Präferenzen, mit welchen einige der wichtigsten Mitglieder der Familie der SREBPs an bestimmte DNA Sequenzen binden aufzudecken und heraus zu finden wie es innerhalb dieser Gruppe zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten kam. Dafür wurden phylogenetische Rekonstruktionsanalysen und aufwändige biochemische Charakterisierungen einiger der Proteine der SREBP Familie durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten der bisher charakterisierten SREBPs (in Säugetieren) es vorziehen an die E-box Sequenz zu binden, ein anderer Zweig des SREBP Familienstammbaums bevorzugt hingegen die non-E-box Sequenz, ein dritter Zweig des Stammbaums ist in der Lage beide Sequenzen mit gleicher Affinität zu binden. Das Bevorzugen einer der beiden DNA Sequenzen ist eine natürliche Eigenschaft des jeweiligen Proteins, da in Experimenten die isolierte DNA-binde Domäne der Proteine ausreichend war, um die in vivo Bindepräferenzen zu replizieren. Der Ursprung dieser beiden Gruppen (der E-box bindenden Gruppe und der Gruppe die non-E-box Sequenzen bindet) liegt wahrscheinlich in einem Protein, welches beide Sequenzen binden konnte, mit einem Vorzug für die nicht-kanonische Sequenz. Dies impliziert, dass die Gruppen entstanden sind indem sich entweder eine Präferenz des Vorgängerproteins für die nicht-kanonische Sequenz durchgesetzt hat oder, dass sich eine Präferenz für die E-box bindende Sequenz durchgesetzt hat und somit die Affinität dahingehend verschoben wurde. Die Hauptfunktion der meisten Proteine der SREBP Familie in Eukaryoten ist die Kontrolle der Lipid Biosynthese. In meiner Arbeit habe ich mich auf die Erforschung der SREBPs in einer Gruppe von Organismen zugewandt, die auch den mit dem Menschen assoziierten Hefepilz Candida albicans umfasst. Erstaunlicherweise beeinflussen die drei SREBPs die im Candida albicans Genom zu finden sind, die Kolonisierung des Säugetierdarms, jedoch nicht durch die Kontrolle der Lipid Biosynthese. Im Folgenden werde ich beschreiben wie zwei der drei SREBPs aus Candida albicans eine regulatorische Kaskade bilden, welche Einfluss auf die Regulierung der Morphologie und der Zellwandzusammensetzung des Pilzes unter anaeroben Bedingungen hat, wohingegen das dritte Protein der SREBP Familie für die Regulierung der Glykolyse von Bedeutung ist. Ich habe festgestellt, dass die beschriebene Vielfalt mit der diese Proteine an bestimmte DNA Sequenzen binden und die damit einhergehende Expansion der regulierbaren Ziele ein wesentlicher Grund dafür ist, dass Organismen dieses Stammbaums erfolgreich Säugetiere kolonisieren können. KW - Candida albicans KW - SREBP KW - evolution Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187890 ER - TY - THES A1 - Wedel, Carolin T1 - The impact of DNA sequence and chromatin on transcription in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Der Einfluss der DNA-Sequenz und der Chromatinstruktur auf die Transkription in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - For cellular viability, transcription is a fundamental process. Hereby, the DNA plays the most elemental and highly versatile role. It has long been known that promoters contain conserved and often well-defined motifs, which dictate the site of transcription initiation by providing binding sites for regulatory proteins. However, research within the last decade revealed that it is promoters lacking conserved promoter motifs and transcribing constitutively expressed genes that constitute the majority of promoters in eukaryotes. While the process of transcription initiation is well studied, whether defined DNA sequence motifs are required for the transcription of constitutively expressed genes in eukaryotes remains unknown. In the highly divergent protozoan parasite Trypanosoma brucei, most of the proteincoding genes are organized in large polycistronic transcription units. The genes within one polycistronic transcription unit are generally unrelated and transcribed by a common transcription start site for which no RNA polymerase II promoter motifs have been identified so far. Thus, it is assumed that transcription initiation is not regulated but how transcription is initiated in T. brucei is not known. This study aimed to investigate the requirement of DNA sequence motifs and chromatin structures for transcription initiation in an organism lacking transcriptional regulation. To this end, I performed a systematic analysis to investigate the dependence of transcription initiation on the DNA sequence. I was able to identify GT-rich promoter elements required for directional transcription initiation and targeted deposition of the histone variant H2A.Z, a conserved component during transcription initiation. Furthermore, nucleosome positioning data in this work provide evidence that sites of transcription initiation are rather characterized by broad regions of open and more accessible chromatin than narrow nucleosome depleted regions as it is the case in other eukaryotes. These findings highlight the importance of chromatin during transcription initiation. Polycistronic RNA in T. brucei is separated by adding an independently transcribed miniexon during trans-splicing. The data in this work suggest that nucleosome occupancy plays an important role during RNA maturation by slowing down the progressing polymerase and thereby facilitating the choice of the proper splice site during trans-splicing. Overall, this work investigated the role of the DNA sequence during transcription initiation and nucleosome positioning in a highly divergent eukaryote. Furthermore, the findings shed light on the conservation of the requirement of DNA motifs during transcription initiation and the regulatory potential of chromatin during RNA maturation. The findings improve the understanding of gene expression regulation in T. brucei, a eukaryotic parasite lacking transcriptional Regulation. N2 - Die Transkription ist ein entscheidender Prozess in der Zelle und die DNA-Sequenz nimmt hierbei eine elementare Rolle ein. Promotoren beinhalten spezifische und konservierte DNASequenzen und vermitteln den Start der Transkription durch die Rekrutierung spezifischer Proteine. Jedoch haben Forschungen im vergangenen Jahrzehnt gezeigt, dass die Mehrzahl der Promotoren in eukaryotischen Genomen keine konservierten Promotormotive aufweisen und häufig konstitutiv exprimierte Gene transkribieren. Obgleich der Prozess der Transkriptionsinitiation im Allgemeinen gut erforscht ist, konnte bisher nicht nachgewiesen werden, ob ein definiertes DNA-Motiv während der Transkription von konstitutiv exprimierten Genes erforderlich ist. In dem eukaryotischen und einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei ist die Mehrzahl der proteinkodierenden Gene in lange polycistronische Transkriptionseinheiten arrangiert. Diese werden von einem gemeinsamen Transkriptionsstart durch die RNA Polymerase II transkribiert, allerdings konnten hier bisher keine Promotormotive identifiziert werden. Aus diesem Grund besteht die Annahme, dass Transkription keiner Regulation unterliegt. Allgemein ist der Prozess der Transkriptionsinitiation in T. brucei bisher nur wenig verstanden. Um den Zusammenhang zwischen DNA-Motiven und konstitutiver Genexpression näher zu untersuchen und Schlussfolgerungen über die DNA-Sequenz-Abhängigkeit der Transkriptionsinitiation zu ziehen, habe ich eine systematische Analyse in T. brucei durchgeführt. Ich konnte GT-reiche Promotorelemente innerhalb dieser Regionen identifizieren, die sowohl eine gerichtete Transkriptionsinitiation, als auch den gezielten Einbau der Histonvariante H2A.Z in Nukleosomen nahe der Transkriptionsstartstelle vermittelt haben. Des Weiteren zeigten Nukleosomenpositionierungsdaten, dass in Trypanosomen die Transkripitonsstartstellen nicht die charakteristische, nukleosomendepletierte Region, wie für andere Organismen beschrieben, sondern eine offene Chromatinstruktur enthalten. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass die Chromatinstruktur eine wichtige Rolle während der mRNAProzessierung spielt. In T. brucei wird die polycistronische pre-mRNA durch das Anfügen eines Miniexons während des sogenannten trans-Splicens in individuelle mRNAs aufgetrennt. Die Daten dieser Arbeit belegen, dass die Anreicherung von Nukleosomen eine Verlangsamung der transkribierenden Polymerase bewirken und sie somit die richtige Wahl der Splicestelle gewährleisten. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Rolle der DNA Sequenz während der Transkriptionsinitiation und Nukleosomenpositionierung in einem divergenten Eukaryoten untersucht. Die Erkenntnisse bringen mehr Licht in die Konservierung der Notwendigkeit eines DNA-Motivs während der Transkriptionsinitiation und das regulatorische Potential der Chromatinstruktur während der RNA-Reifung. Zudem verbessern sie das Verständnis der Genexpressionsregulation in T. brucei, einem eukaryotischen Parasiten, der ohne transkriptionelle Regulation überlebt. KW - Transkription KW - Chromatin KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Epigenetik KW - RNA polymerase II KW - splicing KW - nuclesosome positioning Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173438 ER - TY - THES A1 - Wagner, Rabea Marie T1 - The Bacterial Exo- and Endo-Cytoskeleton Spatially Confines Functional Membrane Microdomain Dynamics in \(Bacillus\) \(subtilis\) T1 - Das bakterielle Außen- und Innenskelett begrenzt die Mobilität funktionaler Membranmikrodomänen in \(Bacillus\) \(subtilis\) räumlich N2 - Cellular membranes form a boundary to shield the inside of a cell from the outside. This is of special importance for bacteria, unicellular organisms whose membranes are in direct contact with the environment. The membrane needs to allow the reception of information about beneficial and harmful environmental conditions for the cell to evoke an appropriate response. Information gathering is mediated by proteins that need to be correctly organized in the membrane to be able to transmit information. Several principles of membrane organization are known that show a heterogeneous distribution of membrane lipids and proteins. One of them is functional membrane microdomains (FMM) which are platforms with a distinct lipid and protein composition. FMM move within the membrane and their integrity is important for several cellular processes like signal transduction, membrane trafficking and cellular differentiation. FMM harbor the marker proteins flotillins which are scaffolding proteins that act as chaperones in tethering protein cargo to FMM. This enhances the efficiency of cargo protein oligomerization or complex formation which in turn is important for their functionality. The bacterium Bacillus subtilis contains two flotillin proteins, FloA and FloT. They form different FMM assemblies which are structurally similar, but differ in the protein cargo and thus in the specific function. In this work, the mobility of FloA and FloT assemblies in the membrane was dissected using live-cell fluorescence microscopy techniques coupled to genetic, biochemical and molecular biological methods. A characteristic mobility pattern was observed which revealed that the mobility of both flotillins was spatially restricted. Restrictions were bigger for FloT resulting in a decreased diffusion coefficient compared to FloA. Flotillin mobility depends on the interplay of several factors. Firstly, the intrinsic properties of flotillins determine the binding of different protein interaction partners. These proteins directly affect the mobility of flotillins. Additionally, binding of interaction partners determines the assembly size of FloA and FloT. This indirectly affects the mobility, as the endo-cytoskeleton spatially restricts flotillin mobility in a size-dependent manner. Furthermore, the extracellular cell wall plays a dual role in flotillin mobility: its synthesis stimulates flotillin mobility, while at the same time its presence restricts flotillin mobility. As the intracellular flotillins do not have spatial access to the exo-cytoskeleton, this connection is likely mediated indirectly by their cell wall-associated protein interaction partners. Together the exo- and the endo-cytoskeleton restrict the mobility of FloA and FloT. Similar structural restrictions of flotillin mobility have been reported for plant cells as well, where the actin cytoskeleton and the cell wall restrict flotillin mobility. These similarities between eukaryotic and prokaryotic cells indicate that the restriction of flotillin mobility might be a conserved mechanism. N2 - Zelluläre Membranen bilden eine Barriere um das Zellinnere von dem -äußeren abzuschirmen. Das ist insbesondere bei Bakterien wichtig, einzellige Organismen, deren Membranen in direktem Kontakt zu ihrer Umgebung stehen. Die Membran muss es ermöglichen, Informationen über mögliche vorteilhafte oder schädliche Einflüsse in der Umgebung wahrzunehmen, damit die Zelle dementsprechend eine Reaktion initiieren kann. Die Informationsaufnahme und die resultierenden Reaktionen werden von Membranproteinen in Gang gesetzt, deren Organisation in der Membran Voraussetzung für ihre Funktionalität ist. Mehrere Prinzipien zur Membranorganisation sind bekannt, die alle eine heterogene Verteilung von Proteinen und Lipiden zu Grunde legen. Ein Beispiel für ein solches Prinzip sind funktionelle Membranmikrodomänen (FMM), Plattformen mit einer besonderen Lipid- und Proteinzusammensetzung. FMM bewegen sich in der Membran und ihre Integrität ist für viele zelluläre Prozesse wichtig, zum Beispiel für Signaltransduktion, Membrantransport oder zur zellulären Differenzierung. Flotilline sind Markerproteine für FMM. Sie bilden eine Art Gerüst und funktionieren als Chaperone, indem sie die sogenannten Frachtproteine in den FMM binden. Dort wird die Effizienz der Oligomerisierung oder Komplexbildung der Frachtproteine gesteigert, was für ihre Funktionalität und die ihrer assoziierten Prozesse von Bedeutung ist. In dem Bakterium Bacillus subtilis gibt es zwei Flotilline, FloA und FloT. Diese formen FMM Plattformen, die zwar strukturell ähnlich sind, sich aber in ihren Frachtproteinen und somit auch in ihren spezifischen Funktionen unterscheiden. In dieser Arbeit wurde die Mobilität der FloA- und FloT-abhängigen Plattformen in der Membran untersucht. Dafür wurden Technologien der Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen, biochemischen und molekularbiologischen Ansätzen kombiniert. Charakteristische Bewegungsmuster wurden beobachtet, die zeigten, dass die Beweglichkeit beider Flotilline räumlich begrenzt war. Dabei war die Einschränkung für FloT größer, und dementsprechend der Diffusionskoeffizient kleiner verglichen mit FloA. Die Mobilität von FloA und FloT hängt von dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren ab. Zum einen bestimmen intrinsische Eigenschaften der Flotillinproteine ihre Fähigkeit verschiedene Interaktionspartner zu binden. Diese wirken sich dann direkt auf die Mobilität von Flotillinen aus. Des Weiteren bestimmt die Bindung verschiedener Interaktionspartner auch die Größe der FloA- und FloT- abhängigen Plattformen. Die resultierenden Größen beeinflussen die Mobilität indirekt, da das zelluläre Innenskelett die Flotillinmobilität räumlich in größenabhängiger Weise begrenzt. Außerdem spielt das Außenskelett der Zelle, die Zellwand, eine zweifache Rolle: die Zellwandsynthese fördert die Mobilität der Flotilline, während die Zellwand an sich gleichzeitig die Mobilität der Flotilline einschränkt. Da Flotilline räumlich keine Verbindung zum Außenskelett haben, wird diese Verbindung wahrscheinlich durch ihre Zellwand-assoziierten Interaktionspartner übermittelt. Zusammenfassend beschränken das Außen- und das Innenskelett die Mobilität von FloA und FloT. In Pflanzen wurden ähnliche strukturelle Beschränkungen der Mobilität von Flotillinen durch das Aktin- Zytoskelett und die Zellwand beschrieben. Diese Ähnlichkeit zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen deutet darauf hin, dass die Beschränkung der Mobilität der Flotillin-Plattformen ein konservierter Mechanismus sein könnte. KW - Heubacillus KW - Bakterienzellwand KW - Plasmamembran KW - Zellskelett KW - Bacillus subtilis KW - functional membrane microdomains KW - membrane dynamics KW - bacterial lipid rafts KW - cytoskeleton KW - cell wall Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217458 ER - TY - THES A1 - Weisert, Nadine T1 - Characterization of telomere-associated proteins in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Charakterisierung Telomer-assoziierter Proteine in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular pathogen Trypanosoma brucei is the causative agent of African trypanosomiasis, an endemic disease prevalent in sub-Saharan Africa. Trypanosoma brucei alternates between a mammalian host and the tsetse fly vector. The extracellular parasite survives in the mammalian bloodstream by periodically exchanging their ˈvariant surface glycoproteinˈ (VSG) coat to evade the host immune response. This antigenic variation is achieved through monoallelic expression of one VSG variant from subtelomeric ˈbloodstream form expression sitesˈ (BES) at a given timepoint. During the differentiation from the bloodstream form (BSF) to the procyclic form (PCF) in the tsetse fly midgut, the stage specific surface protein is transcriptionally silenced and replaced by procyclins. Due to their subtelomeric localization on the chromosomes, VSG transcription and silencing is partly regulated by homologues of the mammalian telomere complex such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 as well as by ˈtelomere-associated proteinsˈ (TelAPs) like TelAP1. To gain more insights into transcription regulation of VSG genes, the identification and characterization of other TelAPs is critical and has not yet been achieved. In a previous study, two biochemical approaches were used to identify other novel TelAPs. By using ˈco-immunoprecipitationˈ (co-IP) to enrich possible interaction partners of TbTRF and by affinity chromatography using telomeric repeat oligonucleotides, a listing of TelAP candidates has been conducted. With this approach TelAP1 was identified as a novel component of the telomere complex, involved in the kinetics of transcriptional BES silencing during BSF to PCF differentiation. To gain further insights into the telomere complex composition, other previously enriched proteins were characterized through a screening process using RNA interference to deplete potential candidates. VSG expression profile changes and overall proteomic changes after depletion were analyzed by mass spectrometry. With this method, one can gain insights into the functions of the proteins and their involvement in VSG expression site regulation. To validate the interaction of proteins enriched by co-IP with TbTRF and TelAP1 and to identify novel interaction proteins, I performed reciprocal affinity purifications of the four most promising candidates (TelAP2, TelAP3, PPL2 and PolIE) and additionally confirmed colocalization of two candidates with TbTRF via immunofluorescence (TelAP2, TelAP3). TelAP3 colocalizes with TbTRF and potentially interacts with TbTRF, TbTIF2, TelAP1 and TelAP2, as well as with two translesion polymerases PPL2 and PolIE in BSF. PPL2 and PolIE seem to be in close contact to each other at the telomeric ends and fulfill different roles as only PolIE is involved in VSG regulation while PPL2 is not. TelAP2 was previously characterized to be associated with telomeres by partially colocalizing with TbTRF and cells show a VSG derepression phenotype when the protein was depleted. Here I show that TelAP2 interacts with the telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2 as well as with the telomere-associated protein TelAP1 in BSF and that TelAP2 depletion results in a loss of TelAP1 colocalization with TbTRF in BSF. In conclusion, this study demonstrates that characterizing potential TelAPs is effective in gaining insights into the telomeric complex's composition and its role in VSG regulation in Trypanosoma brucei. Understanding these interactions could potentially lead to new therapeutic targets for combatting African trypanosomiasis. N2 - Der einzellige Pathogen Trypanosoma brucei ist der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis, eine endemische Krankheit vertreten in der Sub-Sahara Zone Afrikas. Trypanosoma brucei wechselt zwischen einem Säugerwirt und dem Insektenvektor, der Tsetse-Fliege. Der im Blutstrom des Säugers vorkommende, extrazelluläre Parasit ändert seinen Oberflächenmantel bestehend aus dem ˈvariablen Oberflächenproteinˈ (VSG) in periodischen Abständen, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen. Diese antigenetische Variation wird durch die monoallelische Expression einer einzelnen VSG-Variante, lokalisiert auf den ˈBlutstromform Expressionsseitenˈ (BES), zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht. Diese stadienspezifischen Oberflächenproteine werden während der Differenzierung der ˈBlutstromformˈ (BSF) zur ˈprozyklischen Formˈ (PCF) im Mitteldarm der Tsetse-Fliege stillgelegt und durch Prozykline ersetzt. Wegen der subtelomeren Lokalisation wird die VSG Transkription und Stilllegung teilweise durch Homologe des Säuger Telomerkomplexes TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1 als auch durch Telomer-assoziierte Proteine (TelAPs) wie TelAP1 reguliert. Um Einblicke in die Transkriptionsregulation der VSG Gene zu erhalten, ist die Identifikation und Charakterisierung anderer Telomer-assoziierter Proteine von großem Interesse. In einer vorherigen Studie wurden zwei komplementäre biochemische Versuchsansätze verwendet, um weitere neue TelAPs zu identifizieren. Es wurde eine ko-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner von TbTRF zu identifizieren, sowie eine Affinitätschromatographie unter Verwendung telomerischen Wiederholungseinheiten. Hierdurch wurde eine Liste von potenziellen Kandidaten generiert. Mit diesem Ansatz wurde TelAP1 als neue Komponente des Telomerkomplexes identifiziert, welches an der Kinetik der transkriptionellen BES-Stilllegung während der Differenzierung von BSF zu PCF beteiligt ist. Um weitere Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes zu erhalten, wurden zuvor angereicherte Proteine durch einen Screening-Prozess unter Verwendung von RNA-Interferenz charakterisiert. Nach der Depletion von 21 Proteinen wurden massenspektrometrische Analysen der VSG Expressionsprofiländerungen sowie allgemeine Veränderungen des Proteomenprofils analysiert. Mit dieser Methode können Erkenntnisse über die Funktion der jeweiligen Proteine und ihrer Beteiligung an der Regulierung der antigenetischen Variation von T. brucei gewonnen werden. Um die Interaktionen von Proteinen zu validieren, welche bei den Co-Immunpräzipitationen mit TbTRF und TelAP1 angereichert wurden, habe ich eine reziproke Affinitätschromatographie mit vier der vielversprechendsten Kandidaten durchgeführt (TelAP2, TelAP3, PPL2 und PolIE). Zusätzlich bestätigte ich die Co-lokalisation von zwei Kandidaten mit TbTRF via Immunfluoreszenzaufnahmen (TelAP2, TelAP3). TelAP3 ko-lokalisiert mit TbTRF und TelAP1 und interagiert potenziell mit TbTRF, TbTIF2, TelAP1 und TelAP2 als auch mit den zwei Transläsionspolymerasen PPL2 und PolIE in BSF. PPL2 und PolIE stehen in engem Kontakt zueinander und nehmen an den Telomerenden unterschiedliche Funktionen ein, da nur PolIE an der VSG Regulation beteiligt ist. TelAP2 wurde in einer vorherigen Publikation als Telomer-assoziiertes Protein durch partielle Co-Lokalisation mit TbTRF identifiziert und Zellen zeigen nach der Depletion von TelAP2 eine Derepression von zuvor stillgelegten VSGs. In dieser Studie zeige ich, dass TelAP2 mit den Telomer-bindenden Proteinen TbTRF und TbTIF2 sowie mit dem telomerassoziierten Protein TelAP1 in BSF interagiert und dass die Depletion von TelAP2 zu dem Verlust der Co-Lokalisation von TelAP1 mit TbTRF in BSF führt. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Charakterisierung potenzieller TelAPs dazu beiträgt, Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes und dessen Rolle bei der VSG-Regulation in Trypanosoma brucei zu gewinnen. Das Verständnis dieser Interaktionen könnte möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten zur Bekämpfung der afrikanischen Trypanosomiasis führen. KW - Telomer KW - Trypanosoma brucei KW - telomere-associated protein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352732 ER - TY - THES A1 - Pätzel [geb. Ditter], Katharina Sabine T1 - Molekulare Charakterisierung eines Mitgliedes der TNF-Rezeptor-Superfamilie des Fuchsbandwurmes \(Echinococcus\) \(multilocularis\) T1 - Molecular characterization of a TNF-receptor-superfamily member of \(Echinococcus\) \(multilocularis\) N2 - Die alveoläre Echinokokkose (AE), die durch den Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird, ist eine seltene jedoch schwere und oft tödlich verlaufende Erkrankung. Aufgrund der späten Diagnosestellung sind kurative Behandlungsmethoden häufig nicht durchführbar und als einzige Behandlungsmöglichkeit bleibt eine lebenslange und nebenwirkungsreiche Therapie mit Benzimidazolen. Verbesserte Therapieoptionen durch die Entwicklung neuer Medikamente sind dringend notwendig. Hierfür kann es hilfreich sein die Biologie des Fuchsbandwurmes und die Kommunikationswege zwischen Parasit und Wirt zu verstehen. Bereits in vorherigen Arbeiten als auch in dieser Arbeit erwiesen sich evolutionsgeschichtlich konservierte Signalwege als Kommunikationsweg zwischen dem Fuchsbandwurm und seinem Wirt von zentraler Rolle. Die Entschlüsselung des Echinococcus-Genoms gab Hinweise darauf, dass ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie, jedoch kein endogener TNF α ähnlicher Ligand im Genom kodiert wird. Ein Mitglied der TNFR-Superfamilie des Fuchsbandwurmes (EmTNFR) wurde in dieser Arbeit als membranständiger Rezeptor mit einer intrazellulären Todesdomäne (DD) und hoher Ähnlichkeit zum humanen Typ 16 der TNF-Rezeptor-Superfamilie, auch 〖p75〗^NTR genannt, charakterisiert. Sowohl in bioinformatischen als auch in Sequenzanalysen wurden drei alternative Splicing-Formen von emtnfr (emtnfr, emtnfr-v2 und emtnfr-v3) nachgewiesen. emtnfr-v2 entsteht durch Alternatives Splicing und kodiert ein Protein, das keine intrazelluläre Todesdomäne besitzt. emtnfr-v3 verwendet einen alternativen Transkriptionstart und wird von den letzten 3 Exons von emtnfr kodiert. emtnfr-v3, kodiert ein Protein ohne extrazelluläre Region, aber mit intrazellulärer Todesdomäne. Ein löslicher TNF-Rezeptor konnte auf Proteinebene nicht nachgewiesen werden. Aufgrund von phylogenetischen Analysen und der Rezeptor-Struktur ist zu vermuten, dass EmTNFR ein p75NTR Homolog ist und damit der ursprünglichen Form der TNF-Rezeptoren entspricht. Mitglieder eines intrazellulären TNF-Signalweges wurden in bioinformatischen Analysen beim Fuchsbandwurm E. multilocularis identifiziert. Expressionsuntersuchungen zeigten sowohl in Trankriptomdaten als auch auf Proteinebene eine starke Expression von EmTNFR in Primärzellen und im Metazestoden (MZ), dem pathogenen Stadium für den Zwischenwirt. Echinococcus-Stammzellkulturen zeigten nach RNA-Interferenz-basiertem Knockdown des EmTNFR-kodierenden Gens deutliche Entwicklungsdefekte. Des Weiteren zeigten Echinococcus-Stammzellkulturen nach einer Behandlung mit TNF-α, einem potentiellen Liganden des TNF-Rezeptors und einem zentralen Zytokin in der Immunabwehr des Zwischenwirtes, Entwicklungsfortschritte, wie eine verbesserte Bildung von MZ aus Stammzellen. Zusätzlich wurde in whole-mount in situ Hybridisierungs-Versuchen eine ubiquitäre Expression von emtnfr in der Germinalschicht des MZ sowie eine Spezifität von emtnfr für den MZ, welcher ursächlich für die AE ist, nachgewiesen. Somit scheinen sowohl EmTNFR als auch TNF-α eine wichtige Funktion bei der Entwicklung und Etablierung des Fuchsbandwurmes während der frühen Phase der Infektion des Zwischenwirtes zu haben. TNF-α könnte ein weiterer Faktor für den ausgeprägten Organtropismus des Parasiten zur Leber sein, denn dort bestehen durch Kupfferzellen produzierte hohe lokale Konzentration von TNF-α. Zusammenfassend deuten die hier erarbeiteten Daten darauf hin, dass EmTNFR über die Bindung von Wirts-TNF-α bei der frühen Entwicklung des Echincoccus-Metazestoden eine Rolle spielt. N2 - Alveolar echinococcosis (AE), which is caused by the metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a rare but severe, often fatal disease. Due to late diagnosis and advanced spread of the infection curative therapy is often not possible and the only treatment option is benzimidazole chemotherapy, which often must be taken lifelong and has adverse side effects. Improvement of therapeutic options is thus urgently needed. To this end, a closer understanding of parasite biology and communication mechanisms between parasite and host are helpful. In this work, focus was laid on the possibility of host-parasite cross-communication involving an evolutionarily conserved signalling pathway. By mining the Echinococcus genome sequence, a gene encoding a member of the tumor necrosis-factor-receptor family (TNF-R), was identified. In this work, EmTNFR, a member of the TNF-R superfamily, of the fox tapeworm was identified as a membrane bound receptor with intracellular death domain and highest similarity to human TNFRSF 16, also called p75NTR. In in silico analysis and cDNA sequencing, 3 alternative splice forms of emtnfr (emtnfr-v1, -v2 and -v3) were found. emtnfr-v2 is the result of alternative splicing and encodes a protein lacking the intracellular death domain. emtnfr-v3 employs an alternative transcription start and is encoded by the last 3 exons of emtnfr. emtnfr-v3 encodes a protein without extracellular domain, but containing an intracellular death domain. A soluble TNF-receptor could not be found in proteomic analysis. Based on phylogenetic analysis and receptor structure, EmTNFR is thought to be a homolog of p75NTR, corresponding to the ancient form of TNF receptors. Members of an intracellular TNF signaling pathway were identified in bioinformatic analyses in the fox tapeworm E. multilocularis, indicating the presence of a full TNFR signalling pathway. Expression studies showed in transcriptome data and at protein level a strong expression of EmTNFR in primary cells and in the metacestode (MZ), the pathogenic stage for the intermediate host. Echinococcus stem cell cultures showed marked developmental defects after RNAi based knockdown of the EmTNFR-encoding gene. Furthermore, Echinococcus stem cell culture displayed accelerated developmental progress such as enhanced formation of MZ from stem cells after treatment with TNF-α, a potential ligand of the TNF receptor, and a central cytokine in the immune defense of the intermediate host. In addition, whole-mount in situ hybridization experiments demonstrated ubiquitous expression of emtnfr in the germinal layer of MZ and specificity of emtnfr for MZ, the causative agent of AE. Thus, both EmTNFR and TNF-α appear to have an important function in development and establishment of the fox tapeworm during the early phase of infection of the intermediate host. TNF-α could be an additional factor for the pronounced organ tropism of the parasite to the liver, caused by a high local concentration of TNF-α produced by Kupffer cells. In summary, the data generated in this work suggest that EmTNFR plays a role in the early development of Echinococcus metacestode via binding of host TNF-α. KW - Fuchsbandwurm KW - Wirt-Parasit-Beziehung KW - Parasit KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Echinococcus multilocularis KW - TNF-Rezeptor KW - Wirt-Parasiten-Interaktion KW - Molekulare Charakterisierung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369397 ER -