TY - THES A1 - Schmitt, Franziska T1 - Neuronal basis of temporal polyethism and sky-compass based navigation in \(Cataglyphis\) desert ants T1 - Die neuronale Grundlage von Alterspolyethismus und Himmelskompassnavigation in der Wüstenameise \(Cataglyphis\) N2 - Desert ants of the genus Cataglyphis (Formicinae) are widely distributed in arid areas of the palearctic ecozone. Their habitats range from relatively cluttered environments in the Mediterranean area to almost landmark free deserts. Due to their sophisticated navigational toolkit, mainly based on the sky-compass, they were studied extensively for the last 4 decades and are an exceptional model organism for navigation. Cataglyphis ants exhibit a temporal polyethism: interior workers stay inside the dark nest and serve as repletes for the first ∼2 weeks of their adult life (interior I). They then switch to nursing and nest maintenance (interior II) until they transition to become day-active outdoor foragers after ∼4 weeks. The latter switch in tasks involves a transition phase of ∼2-3 days during which the ants perform learning and orientation walks. Only after this last phase do the ants start to scavenge for food as foragers. In this present thesis I address two main questions using Cataglyphis desert ants as a model organism: 1. What are the underlying mechanisms of temporal polyethism? 2. What is the neuronal basis of sky-compass based navigation in Cataglyphis ants? Neuropeptides are important regulators of insect physiology and behavior and as such are promising candidates regarding the regulation of temporal polyethism in Cataglyphis ants. Neuropeptides are processed from large precursor proteins and undergo substantial post-translational modifications. Therefore, it is crucial to biochemically identify annotated peptides. As hardly any peptide data are available for ants and no relevant genomic data has been recorded for Cataglyphis, I started out to identify the neuropeptidome of adult Camponotus floridanus (Formicinae) workers (manuscript 1). This resulted in the first neuropeptidome described in an ant species – 39 neuropeptides out of 18 peptide families. Employing a targeted approach, I identified allatostatin A (AstA), allatotropin (AT), short neuropeptide F (sNPF) and tachykinin (TK) using mass spectrometry and immunohistology to investigate the distribution of AstA, AT and TK in the brain (manuscript 2). All three peptides are localized in the central complex, a brain center for sensory integration and high-order control of locomotion behavior. In addition, AstA and TK were also found in visual and olfactory input regions and in the mushroom bodies, the centers for learning and memory formation. Comparing the TK immunostaining in the brain of 1, 7 and 14 days old dark kept animals revealed that the distribution in the central complex changes, most prominently in the 14 day old group. In the Drosophila central complex TK modulates locomotor activity levels. I therefore hypothesize that TK is involved in the internal regulation of the interior I–interior II transition which occurs after ∼2 weeks of age. I designed a behavioral setup to test the effect of neuropeptides on the two traits: ’locomotor activity level’ and ’phototaxis’ (manuscript 3). The test showed that interior I ants are less active than interior II ants, which again are less active than foragers. Furthermore, interior ants are negatively phototactic compared to a higher frequency of positive phototaxis in foragers. Testing the influence of AstA and AT on the ants’ behavior revealed a stage-specific effect: while interior I behavior is not obviously influenced, foragers become positively phototactic and more active after AT injection and less active after AstA injection. I further tested the effect of light exposure on the two behavioral traits of interior workers and show that it rises locomotor activity and results in decreased negative phototaxis in interior ants. However, both interior stages are still more negatively phototactic than foragers and only the activity level of interior II ants is raised to the forager level. These results support the hypothesis that neuropeptides and light influence behavior in a stage-specific manner. The second objective of this thesis was to investigate the neuronal basis of skycompass navigation in Cataglyphis (manuscript 4). Anatomical localization of the sky-compass pathway revealed that its general organization is highly similar to other insect species. I further focused on giant synapses in the lateral complex, the last relay station before sky-compass information enters the central complex. A comparison of their numbers between newly eclosed ants and foragers discloses a rise in synapse numbers from indoor worker to forager, suggesting task-related synaptic plasticity in the sky-compass pathway. Subsequently I compared synapse numbers in light preexposed ants and in dark-kept, aged ants. This experiment showed that light as opposed to age is necessary and sufficient to trigger this rise in synapse number. The number of newly formed synapses further depends on the spectral properties of the light to which the ants were exposed to. Taken together, I described neuropeptides in C. floridanus and C. fortis, and provided first evidence that they influence temporal polyethism in Cataglyphis ants. I further showed that the extent to which neuropeptides and light can influence behavior depends on the animals’ state, suggesting that the system is only responsive under certain circumstances. These results provided first insight into the neuronal regulation of temporal polyethism in Cataglyphis. Furthermore, I characterized the neuronal substrate for sky-compass navigation for the first time in Cataglyphis. The high level of structural synaptic plasticity in this pathway linked to the interior–forager transition might be particularly relevant for the initial calibration of the ants’ compass system. N2 - Wüstenameisen der Gattung Cataglyphis sind weit verbreitet in ariden Gebieten der paläarktischen Ökozone. Die von ihnen bewohnten Habitate reichen von landmarkenreichen Arealen im Mittelmeerraum, zu beinahe landmarkenfreien Wüstengebieten. Aufgrund ihres hochentwickelten Navigationssystems, welches größtenteils auf dem Himmelskompass basiert, wurden sie in den letzten 4 Jahrzehnten extensiv studiert und sind ein einzigartiges Modellsystem für Navigation. Cataglyphis weisen einen alterskorrelierten Polyethismus auf: Innendienstler dienen als Speichertiere für die ersten ∼2 Wochen ihres adulten Lebens (Interior I). Sie gehen daraufhin zu Brutpflege und Nestbau (Interior II) über bis sie nach ∼4 Wochen zu tagaktiver Furagiertätitkeit außerhalb ihres Nestes wechseln. Dieser letzte Übergang dauert ∼2-3 Tage und wird von den Ameisen genutzt, um Lernund Orientierungsläufe durchzuführen. In der vorliegenden Arbeit befasse ich mich vor allem mit zwei Fragen, die ich mit Hilfe von Cataglyphis als Modellorganismus beantworten möchte: 1. Welches sind die zugrunde liegenden Mechanismen des Alterspolyethismus? 2. Was ist die neuronale Grundlage von Navigation, die auf dem Himmelskompass basiert? Neuropeptide sind bedeutende Regulatoren der Physiologie und des Verhaltens von Insekten und als solche vielversprechende Kandidaten im Hinblick auf die Regulation des Alterspolyethismus in Cataglyphis Ameisen. Neuropeptide werden aus größeren Vorläuferproteinen herausgeschnitten und posttranslational stark modifiziert. Daher ist es wichtig, annotierte Peptide auch biochemisch zu identifizieren. Da für Ameisen kaum Peptiddaten zur Verfügung stehen und es zudem keine relevanten genomischen Daten für Cataglyphis gibt, identifizierte ich zunächst das Neuropeptidom adulter Camponotus floridanus (Formicinae) Arbeiterinnen (Manuskript 1). Daraus resultierte das erste Neuropeptidom, das für eine Ameisenart beschrieben wird—39 Neuropeptide aus 18 Peptidfamilien. In einer weiteren Studie identifizierte ich gezielt die Neuropeptidfamilien Allatostatin A (AstA), Allatotropin (AT), das kurze Neuropeptid F (sNPF) und Tachykinin (TK) mittels Massenspektroskopie und untersuchte die Verteilung von AstA, AT und TK im Gehirn mit Hilfe der Immunhistologie (Manuskript 2). Alle drei Peptide sind im Zentralkomplex lokalisiert, dem Gehirnzentrum welches sensorische Eingänge integriert und in einer übergeordneten Rolle Lokomotorverhalten steuert. AstA und TK sind zudem in den visuellen und olfaktorischen Eingangsregionen, sowie den Pilzkörpern, den Zentren für Lernen und Gedächtnisbildung, zu finden. Ein Vergleich der TK-Immunfärbung im Gehirn von 1, 7 und 14 Tage alten im Dunkeln gehaltenen Tieren zeigt, dass sich die Verteilung im Zentralkomplex verändert— dies ist besonders prominent in der 14 Tage alten Gruppe. In Drosophila moduliert TK im Zentralkomplex Lokomotoraktivität. Basierend darauf stelle ich die Hypothese auf, dass TK in der internen Regulierung des Übergangs von Interior I zu Interior II involviert ist, welchen die Tiere im Alter von ∼2 Wochen durchlaufen. Für eine dritte Studie konstruierte ich ein Verhaltenssetup um den Einfluss von Neuropeptiden und Licht auf die beiden Verhaltensmerkmale ’Lokomotoraktivität’ und ’Phototaxis’ zu testen (Manuskript 3). Der Test zeigte, dass Interior I Ameisen weniger aktiv sind als Interior II Ameisen, welche wiederum weniger aktiv sind als Furageure. Zudem sind Interior Ameisen negativ phototaktisch, verglichen mit einer häufiger zu beobachtenden positiven Phototaxis bei Furageuren. Im Test zeigte sich auch, dass der Einfluss von AstA und AT stadiumsspezifisch ist: während das Verhalten von Interior I Tieren nicht offensichtlich beeinflusst wird, werden Furageure durch die Injektion von AT positiv phototaktisch, sowie aktiver und AstA-Injektion führt zu geminderter Lokomotoraktivität. Darüber hinaus testete ich den Lichteinfluss auf beide Verhaltensmerkmale in den Innendienststadien und zeige, dass er Lokomotoraktivität steigert und in einer geminderten negativen Phototaxis resultiert. Beide Innendienststadien sind jedoch weiterhin negativer phototaktisch als Furageure und nur die Lokomotoraktivtät von Interior II Ameisen wird auf das Niveau von Furageuren angehoben. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Neuropeptide und Licht stadiumsspezifisch Verhalten beeinflussen. Der zweite Aspekt dieser Thesis war es, die neuronale Grundlage der Himmelskompassnavigation in Cataglyphis aufzuklären (Manuskript 4). Die neuroanatomische Lokalisation der Himmelskompasssehbahn zeigt, dass die allgemeine Organisation dieser neuronalen Bahn der bei bisher untersuchten anderen Insekten stark ähnelt. Ich habe mich daraufhin auf Riesensynapsen im lateralen Komplex konzentriert, der letzten Verschaltungsstation ehe die Himmelskompassinformation in den Zentralkomplex übertragen wird. Ein Vergleich zwischen der Synapsenzahl in frisch geschlüpfte Ameisen und erfahrenen Furageueren zeigte einen Anstieg der Synapsenzahl von Innendienst zu Furaguer, was aufgabenabhängige synaptische Plastizität in der Himmelskompasssehbahn suggeriert. In einem weiteren Versuch verglich ich die Riesensynapsenzahlen lichtexponierter Tiere und dunkel gehaltener, gealteter Tiere. Dieses Experiment zeigte, dass der Zuwachs an Riesensynapsen durch den Lichteinfluss ausgelöst wird und keinen altersabhängigen Prozess darstellt. Zudem verändert sich die Anzahl der neu gebildeten Riesensynapsen in Abhängigkeit von den spektralen Eigenschaften des Lichts, dem die Ameisen ausgesetzt sind. Zusammengefasst beschrieb ich in dieser Thesis Neuropeptide in C. floridanus und Cataglyphis und lieferte erste Evidenz, dass diese den Alterspolyethismus in Cataglyphis beeinflussen. Zudem zeigte ich, dass das Ausmaß in dem Neuropeptide und Lichtexposition Verhalten beeinflussen können, stadiumsspezifisch ist. Dies suggeriert, dass das System nur unter bestimmten Bedingungen auf externe Einflüsse reagiert. Diese Ergebnisse lieferten erste wichtige Einblicke in die neuronale Grundlage von Alterspolyethismus in Cataglyphis. Zudem charakterisierte ich erstmals das neuronale Substrat der Himmelskompassnavigation in Cataglyphis. Das hohe Maß an synaptischer Plastizität in dieser Sehbahn beim Übergang von Innenzu Außendienst, könnte besondere Relevanz für die initiale Kalibrierung des Kompasssystems haben. KW - Cataglyphis KW - Neuroethologie KW - Neuropeptide KW - Neuronale Plastizität KW - Soziale Insekten KW - Verhaltensplastizität KW - Himmelskompass KW - Riesensynapsen KW - Neuropeptidom KW - Neuromodulation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142049 ER - TY - THES A1 - Münz, Thomas Sebastian T1 - Aspects of neuronal plasticity in the mushroom body calyx during adult maturation in the honeybee Apis mellifera T1 - Aspekte neuronaler Plastizität im Pilzkörper kalyx während der Adultreifung der Honigbiene Apis mellifera N2 - Division of labor represents a major advantage of social insect communities that accounts for their enormous ecological success. In colonies of the honeybee, Apis mellifera, division of labor comprises different tasks of fertile queens and drones (males) and, in general, sterile female workers. Division of labor also occurs among workers in form of an age-related polyethism. This helps them to deal with the great variety of tasks within the colony. After adult eclosion, workers spend around three weeks with various duties inside the hive such as tending the brood or cleaning and building cells. After this period workers switch to outdoor tasks and become foragers collecting nectar, pollen and water. With this behavioral transition, workers face tremendous changes in their sensory environment. In particular, visual sensory stimuli become important, but also the olfactory world changes. Foragers have to perform a completely new behavioral repertoire ranging from long distance navigation based on landmark orientation and polarized-skylight information to learning and memory tasks associated with finding profitable food sources. However, behavioral maturation is not a purely age-related internal program associated with a change, for example, in juvenile hormone titers. External factors such as primer pheromones like the brood pheromone or queen mandibular pheromone can modulate the timing of this transition. In this way colonies are able to flexibly adjust their work force distribution between indoor and outdoor tasks depending on the actual needs of the colony. Besides certain physiological changes, mainly affecting glandular tissue, the transition from indoor to outdoor tasks requires significant adaptations in sensory and higher-order integration centers of the brain. The mushroom bodies integrate olfactory, visual, gustatory and mechanosensory information. Furthermore, they play important roles in learning and memory processes. It is therefore not surprising that the mushroom bodies, in particular their main input region, the calyx, undergo volumetric neuronal plasticity. Similar to behavioral maturation, plastic changes of the mushroom bodies are associated with age, but are also to be affected by modulating factors such as task and experience. In my thesis, I analyzed in detail the neuronal processes underlying volumetric plasticity in the mushroom body. Immunohistochemical labeling of synaptic proteins combined with quantitative 3D confocal imaging revealed that the volume increase of the mushroom body calyx is largely caused by the growth of the Kenyon cell dendritic network. This outgrowth is accompanied by changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx, which is organized in a distinct pattern of synaptic complexes, so called microglomeruli. During the first week of natural adult maturation microglomeruli remain constant in total number. With subsequent behavioral transition from indoor duties to foraging, microglomeruli are pruned while the Kenyon cell dendritic network is still growing. As a result of these processes, the mushroom body calyx neuropil volume enlarges while the total number of microgloumeruli becomes reduced in foragers compared to indoor workers. In the visual subcompartments (calyx collar) this process is induced by visual sensory stimuli as the beginning of pruning correlates with the time window when workers start their first orientation flights. The high level of analysis of cellular and subcellular process underlying structural plasticity of the mushroom body calyx during natural maturation will serve as a framework for future investigations of behavioral plasticity in the honeybee. The transition to foraging is not purely age-dependent, but gets modulated, for example, by the presence of foragers. Ethyl oleate, a primer pheromone that is present only in foragers, was shown to delay the onset of foraging in nurse bees. Using artificial application of additional ethyl oleate in triple cohort colonies, I tested whether it directly affects adult neuronal plasticity in the visual input region of the mushroom body calyx. As the pheromonal treatment failed to induce a clear behavioral phenotype (delayed onset of foraging) it was not possible to show a direct link between the exposure to additional ethyl oleate and neuronal plasticity in mushroom body calyx. However, the general results on synaptic maturation confirmed my data of natural maturation processes in the mushroom body calyx. Given the result that dendritic plasticity is a major contributor to neuronal plasticity in the mushroom body calyx associated with division of labor, the question arose which proteins could be involved in mediating these effects. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) especially in mammals, but also in insects (Drosophila, Cockroach), was shown to be involved in facilitating learning and memory processes like long-term synaptic potentiation. In addition to presynaptic effects, the protein was also revealed to directly interact with cytoskeleton elements in the postsynapse. It therefore is a likely candidate to mediate structural synaptic plasticity. As part of my thesis, the presence and distribution of CaMKII was analyzed, and the results showed that the protein is highly concentrated in a distinct subpopulation of the mushroom body intrinsic neurons, the noncompact Kenyon cells. The dendritic network of this population arborizes in two calyx subregions: one receiving mainly olfactory input – the lip – and the collar receiving visual input. This distribution pattern did not change with age or task. The high concentration of CaMKII in dendritic spines and its overlap with f-actin indicates that CaMKII could be a key player inducing structural neuronal plasticity associated with learning and memory formation and/or behavioral transitions related to division of labor. Interestingly CaMKII immunoreactivity was absent in the basal ring, another subregion of the mushroom body calyx formed almost exclusively by the inner compact Kenyon cells and known to receive combined visual and olfactory input. This indicates differences of this mushroom body subregion regarding the molecular mechanisms controlling plastic changes in corresponding Kenyon cells. How is timing of behavioral and neuronal plasticity regulated? The primer pheromone ethyl oleate was found in high concentrations on foragers and was shown to influence behavioral maturation by delaying the onset of foraging when artificially applied in elevated concentrations. But how is ethyl oleate transferred and how does it shift the work force distribution between indoor and outdoor tasks? Previous work showed that ethyl oleate concentrations are highest in the honeycrop of foragers and suggested that it is transferred and communicated inside the colony via trophallaxis. The results of this thesis however clearly show, that ethyl oleate was not present inside the honey crop or the regurgitate, but rather in the surrounding tissue of the honey crop. As additionally the second highest concentration of ethyl oleate was measured on the surface of the cuticle of forgers, trophallaxis was ruled out as a mode of transmission. Neurophysiological measurements at the level of the antennae (electroantennogram recordings) and the first olfactory neuropil (calcium imaging of activity in the antennal lobe) revealed that the primer pheromone ethyl oleate is received and processed as an olfactory stimulus. Appetitive olfactory conditioning using the proboscis extension response as a behavioral paradigm showed that ethyl oleate can be associated with a sugar reward. This indicates that workers are able to perceive, learn and memorize the presence of this pheromone. As ethyl oleate had to be presented by a heated stimulation device at close range, it can be concluded that this primer pheromone acts via close range/contact chemoreception through the olfactory system. This is also supported by previous behavioral observations. Taken together, the findings presented in this thesis revealed structural changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx associated with division of labor. For the primer pheromone ethyl oleate, which modulates the transition from nursing to foraging, the results clearly showed that it is received via the olfactory system and presumably acts via this pathway. However, manipulation experiments did not indicate a direct effect of ethyl oleate on synaptic plasticity. At the molecular level, CaMKII is a prime candidate to mediate structural synaptic plasticity in the mushroom body calyx. Future combined structural and functional experiments are needed to finally link the activity of primer pheromones like ethyl oleate to the molecular pathways mediating behavioral and synaptic plasticity associated with division of labor in Apis mellifera. The here identified underlying processes will serve as excellent models for a general understanding of fundamental mechanisms promoting behavioral plasticity. N2 - Arbeitsteilung stellt einen der wesentlichen Faktoren dar, der für den ökologischen Erfolg von sozialen Insektengemeinschaften verantwortlich ist. In Staaten der Honigbiene, Apis mellifera, umfasst die Arbeitsteilung verschiedene Aufgaben für die fertilen Königinnen und Drohnen (Männchen) beziehungsweise die gewöhnlicherweise sterilen Arbeiterinnen. Arbeitsteilung findet aber auch in Form eines altersabhängigen Polyethismus zwischen den Arbeiterinnen selber statt. Dies hilft ihnen die Vielzahl verschiedener Aufgaben im Stock zu bewältigen. Nach dem Schlupf verbringen die Arbeiterinnen etwa drei Wochen mit verschiedenen Aufgaben im Stock, wie beispielsweise Brutpflege oder Reinigen und Bauen neuer Wabenzellen. Nach dieser Zeit wechseln die Arbeiterinnen zu Aufgaben außerhalb des Stocks und werden Nektar-, Pollen- oder Wassersammlerinnen. Durch diesen Verhaltensübergang sind die Arbeiterinnen mit einem massiven Wandel ihrer sensorischen Umwelt konfrontiert. Im speziellen werden nun visuelle Reize wichtig, aber auch die olfaktorische Welt der Arbeiterinnen ändert sich. Sammlerinnen zeigen ein komplett neues Verhaltensrepertoire das von Langstreckennavigation, basierend Landmarken und dem Polarisationsmuster des Himmels, bishin zu Lern- und Gedächtnisaufgaben im Zusammenhang mit dem Auffinden profitabler Futterquellen reicht. Allerdings ist Verhaltensreifung kein rein altersbedingtes internes Programm beispielsweise basierend auf einer Veränderung des Juvenilhormon-Titers. Externe Faktoren wie beispielsweise die Primer Pheromone Brutpheromone oder Königinnenpheromon können den Zeitpunkt des Übergangs modulieren. Hierdurch sind Staaten in der Lage ihre Arbeiterkräfte flexibel zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben zu verschieben. Neben bestimmten physiologischen Veränderungen, die vor allem Drüsengewebe betreffen, benötigt der Übergang vom Innendienst zum Außendienst deutliche Anpassungen sensorischer und höherer Integrationszentren im Gehirn. Die Pilzkörper integrieren olfaktorische, visuelle und mechanosensorische Informationen. Sie spielen weiterhin eine wichtige Rolle für Lern- und Gedächtnisvorgänge. Es ist daher nicht überraschend, dass die Pilzkörper, im Speziellen deren Haupteingangsregion, der Kalyx, eine neuronale Volumensplastizität durchlaufen. Ähnlich wie die Verhaltensreifung, sind plastische Veränderungen im Pilzkörper mit dem Alter verbunden, werden aber auch durch modulierende Faktoren wie Aufgabe und Erfahrungen beeinflusst. In meiner Dissertation habe ich detailliert die neuronalen Prozesse analysiert, die der Volumensplastizität des Pilzkörpers zugrunde liegen. Immunhistologische Färbungen synaptischer Proteine kombiniert mit quantitativer 3D Konfokalmikroskopie zeigten, dass die Volumenszunahme des Pilzkörpers hauptsächlich durch dendritisches Wachstum des Kenyon-Zellen-Netzwerks bedingt ist. Dieses Auswachsen wurde begleitet durch Veränderungen der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers, welcher in Form synaptischer Komplexe, sogenannter Mikroglomeruli organisiert ist. Während der ersten Woche der Adultreifung blieb die Gesamtzahl der Mikroglomeruli konstant. Im folgenden Verhaltensübergang von Innendienstaufgaben zum Sammeln, wurden die Mikroglomeruli zurückgetrimmt, während das dendritische Kenyon-Zell-Netzwerk weiterhin wuchs. Als Ergebnis dieser Prozesse vergrößerte sich das Volumen des Kalyx des Pilzkörpers während die Gesamtzahl der Mikroglomeruli bei Sammlerinnen im Vergleich zu Inndienst Arbeiterinnen reduziert war. In der visuellen Unterregion (Kragen des Kalyx) wurde dieser Prozess induziert durch sensorische Stimuli, da der Beginn des Zurücktrimmens mit dem Zeitfenster zusammenfiel, in dem die Arbeiterinnen ihre ersten Orientierungsflüge starteten. Der hohe Analysegrad der zellulären und subzellulären Prozesse, die der strukturellen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers während der natürlichen Reifung zugrunde liegen, wird zukünftigen Untersuchungen der Verhaltensplastizität bei Honigbienen als Referenz dienen. Der Übergang zur Sammlerin ist nicht rein altersabhängig, sondern wird beispielsweise durch die Gegenwart von anderen Sammlerinnen moduliert. Ethyloleat, ein Primer Pheromone das nur auf Sammlerinnen auftritt, verzögert das Einsetzen des Sammelns von Ammenbienen. Durch das Einbringen zusätzlichen Ethyloleats in Dreifach Kohorten, testete ich, ob es einen direkten Einfluss auf die neuronale Plastizität der visuellen Eingangsregion des Pilzkörper Kalyx hat. Da durch die Pheromon Behandlung kein eindeutiger Verhaltensphänotyp (verzögerter Sammelbeginn) induziert werden konnte, war es nicht möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der verstärkten Ethyloleat-Exposition und der neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers herzustellen. Dennoch bestätigten die Beobachtungen der synaptischen Reifung meine generellen Daten zu den natürlichen Reifungsprozessen im Kalyx des Pilzkörper. Basierend auf dem Ergebnis, dass dendritische Plastizität einen wesentlichen Anteil an der arbeitsteilungsbezogenen neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörper hat, stellte sich die Frage, welche Proteine daran beteiligt sein könnten diese Effekte zu vermitteln. Von der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II (CaMKII) ist bekannt, dass sie speziell bei Säugetieren - aber bei Insekten (Drosophila, Schabe) - daran beteiligt ist, Lern- und Gedächtnisvorgänge, wie die Langzeitpotenzierung, zu ermöglichen. Neben präsynaptischen Effekten, wurde gezeigt, dass dieses Protein direkt mit Elementen des postsynaptischen Cytoskeletts interagieren kann. Als Teil meiner Dissertation habe ich das Vorkommen und die Verteilung der CaMKII analysiert. Ich konnte es hochkonzentriert in einer definierten Subpopulation der intrinsischen Pilzkörper-Neurone, den „nicht kompakten“ Kenyon Zellen, nachweisen. Das dendritische Netzwerk dieser Population verzweigt sich in zwei Kalyx Subregionen: eine olfaktorisch innervierte – die Lippe – und den Kragen, welcher optischen Eingang erfährt. Dieses Verteilungsmuster ändert sich nicht mit dem Alter oder der Aufgabe der Biene. Die hohe Konzentration von CaMKII in den dendritsichen Dornenfortsätzen und die gleichzeitige räumliche Überlappung mit f-Aktin, weisen darauf hin, dass CaMKII eine Schüsselrolle bei der Induzierung struktureller neuronaler Plastizität im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnisbildung und/oder Arbeitsteilung bezogener Verhaltensübergänge, zukommen könnte. Interessanterweise wies der Basalring, eine weitere Subregion des Kalyx des Pilzkörpers die dafür bekannt ist kombinierten visuellen und olfaktorischen Eingang zu erhalten und fast ausschließlich durch die „inneren kompakten“ Kenyon Zellen gebildet wird, keine Immunreaktivität auf. Dies deutet auf Unterschiede in den molekularen Mechanismen die plastische Veränderungen in den entsprechenden Kenyon zellen kontrollieren. Wie wird die zeitliche Abstimmung der Verhaltensplastizität und neuronalen Plastizität reguliert? Für das in hohen Konzentration auf Sammlerinnen vorkommende Primer Pheromon Ethyloelat konnte durch dessen Anwendung in erhöhten Konzentrationen gezeigt werden, dass es die Verhaltensreifung durch Verzögerung des Sammelbeginns beeinflussen kann. Wie aber wird Ethyloleat transferiert und wie verschiebt es die Arbeitskräfteverteilung zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben? Frühere Arbeiten zeigten die höchste Konzentration von Ethyloleat im Sozialmagen der Sammlerinnen und schlugen vor, dass es innerhalb der Kolonie über Trophollaxis transferiert und kommuniziert wird. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigten aber eindeutig, dass Ethyloleat nicht im Inhalt des Sozialmagen und auch nicht im Regurgitat, sondern nur im Gewebe des Sozialmagens vorhanden ist. Da zusätzlich die zweithöchste Konzentration von Ethyloleat auf der Oberfläche der Kutikula von Sammlerinnen gemessen wurde, wurde Trophollaxis als Übertragungsmodus ausgeschlossen. Neurophysiologische Messungen an der Antenne (Elektroantennografie), dem ersten olfaktorischen Neuropil (Calcium Imaging der Aktivität des Antennallobus), zeigten, dass Ethyloleat als olfaktorischer Reiz wahrgenommen und prozessiert wird. Appetitive olfaktorische Konditionierung mit Hilfe des Rüsselstreckreflexes wurde als Verhaltensparadigma verwendet um zu zeigen, dass Ethyloleat mit einer Zuckerbelohnung assoziiert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass Arbeiterinnen in der Lage sind, die Anwesenheit dieses Pheromons zu perzipieren, zu erlernen und sich auch daran zu erinnern. Da Ethyloleat nur durch Erwärmung als Stimulus präsentiert werden konnte, lässt sich schlussfolgern, dass es über Nahbereichs/Kontakt-Chemorezeption durch das olfaktorische System wahrgenommen wird. Dies wird auch durch frühere Verhaltensbeobachtungen unterstützt. Zusammengenommen, zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse strukturelle Veränderungen in der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers in Zusammenhang mit Arbeitsteilung. Für das Primer Pheromone Ethyloleat, welches den Übergang von Ammendiensten zum Sammeln moduliert, zeigten die Ergebnisse eindeutig, dass es über das olfaktorische System wahrgenommen wird und vermutlich auch über diesen Weg seine Wirkung vermittelt. Dennoch konnten Manipulationsexperimente keine direkte Verbindung zwischen Ethyloleat und der synaptischen Reifung herstellen. Auf molekularer Ebene stellt CaMKII einen Topkandidaten dar, der strukturelle synaptische Plastizität im Kalyx des Pilzkörpers vermitteln kann. Eine Kombination struktureller und funktioneller Experimente ist der nächste logische Schritt um schlussendlich die Verbindung zwischen der Aktivität von Primer Pheromonen (wie Ethyloleat) und molekularen Signalwegen, die Verhaltensplastizität und synaptische Plastizität im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung von Apis mellifera vermitteln, herzustellen. Die hierbei identifizierten zugrundeliegenden Prozesse werden als exzellente Modelle für ein generelles Verständnis der fundamentalen Mechanismen welche Verhaltensplastizität vermitteln, dienen. KW - Biene KW - Neuronale Plastizität KW - Pheromon KW - Neuronal plasticity KW - Honeybee KW - Pheromon communication KW - CaMKII KW - Division of labor KW - Neuronale Plastizität KW - Honigbiene KW - Pheromon Kommunikation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111611 ER - TY - THES A1 - Klein, Dennis T1 - The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy T1 - Die pathogenetische Funktion von endogenen Antikörpern in einem Maus-Modell der Charcot-Marie-Tooth 1B Neuropathie N2 - Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B. In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response. These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages. N2 - Als Charcot-Marie-Tooth (CMT) Typ 1 Erkrankungen bezeichnet man eine genetisch heterogene Gruppe von nicht behandelbaren, erblichen Neuropathien, die das periphere Nervensystem betreffen und letztendlich zu starken motorischen und sensorischen Defiziten führen. Anhand verschiedener Studien konnte gezeigt werden, dass sekundäre Entzündungsreaktionen, insbesondere des angeborenen und adaptiven Immunsystems, eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von zwei verschiedenen CMT1-Mausmodellen (CMT1B und CMT1X) spielen. Jedoch ist der genaue Mechanismus, in dem das adaptive Immunsystem zur Pathogenese beiträgt, nicht komplett bekannt. In einer veröffentlichten Studie wurden gebundenen endogenen Antiköpern eine wichtige Rolle beim raschen Myelinabbau nach Nervläsion während der Waller´schen Degeneration zugeschrieben. In Mäusen, die heterozygot defizient für P0 (P0het) sind und einige typische Merkmale der CMT1B Neuropathie aufweisen, sollte ein möglicherweise ähnlicher Mechanismus von endogenen Antikörpern untersucht werden, der zur Verstärkung der Krankheitsentwicklung führt. In dieser Studie konnte eine vermehrte Antikörperbindung in den betroffenen peripheren Nerven von P0het Myelinmutanten beobachtet werden. Anhand von Verkreuzungs-Experimenten von P0het Mutanten mit Mäusen, die keine B-Lymphozyten besitzen und daher keine Antikörper bilden können (JHD-/-), konnte zudem in den untersuchten 6 Monate alten Doppelmutanten eine verringerte Anzahl endoneuraler Makrophagen und eine deutliche Verbesserung der Demyelinisierung aufgezeigt werden. Zusätzlich konnte anhand von Rekonstitutions-Experimenten mit mausspezifischen-IgGs der neuropathische Phänotyp in peripheren Nerven wiederhergestellt werden, was die mögliche pathogenetische Rolle endogener Antikörper im frühen Stadium der Erkrankung bekräftigt. Unerwarteterweise führte die JHD-Defizienz jedoch in 12 Monate alten P0het Mausmutanten eher zu einer Verschlechterung der Neuropathie, zusammen mit einer verstärkten Entzündungsreaktion und M2-polarisierten Makrophagen-Aktivierung. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Fehlen von Antikörpern in einem etablierten Mausmodell für CMT1B unterschiedliche Folgen hat, da dies zu einer verringerten Makrophagen-vermittelten Demyelinisierung im frühen Erkrankungsverlauf führt, gleichzeitig aber im späteren Alter in einer verstärkten Entzündungsreaktion und einem vermehrten Nervschaden resultiert. KW - Charcot-Marie-Tooth KW - Demyelinisierung KW - Adaptives Immunsystem KW - Antikörper KW - Makrophagen KW - B-Lymphocyten KW - Fc-Rezeptor KW - Komplement KW - demyelination KW - antibodies KW - macrophages KW - adaptive immune system KW - B-lymphocytes KW - Fc-receptor KW - complement KW - Maus KW - Charcot-Marie-Syndrom KW - Immunsystem KW - Antikörper Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121941 ER - TY - THES A1 - Sun, Ping T1 - Alzheimer`s disease and brain insulin resistance: The diabetes inducing drug streptozotocin diminishes adult neurogenesis in the rat hippocampus – an in vivo and in vitro study T1 - Alzheimer-Krankheit und Insulinresistenz im Gehirn: Streptozotocin, das Änderungen im Insulinstoffwechsel hervorruft, reduziert die Neubildung von Neuronen im Hippocampus von adulten Ratten - In vivo- und In vitro-Untersuchungen N2 - Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disease of the brain, which is characterized by a progressive loss of memory and spatial orientation. Only less than 5-10% of AD sufferers are familial cases due to genetic mutations in the amyloid precursor protein (APP) gene or presenilin (PS) 1 and 2 genes. The cause of sporadic AD (sAD) which covers > 95% of AD patients is still unknown. Current research found interactions between aging, diabetes and cognitive decline including dementia in general and in AD in particular. Disturbances of brain glucose uptake, glucose tolerance and utilization and impairment of the insulin/insulin receptor (IR) signaling cascade are thought to be key targets for the development of sAD. In the brain of AD patients, neural plasticity is impaired indicated by synaptic and neuronal loss. Adult neurogenesis (AN), the generation of functional neurons in the adult brain, may be able to restore neurological function deficits through the integration of newborn neurons into existing neural networks. The dentate gyrus of the hippocampus is one out of few brain regions where life-long AN exists. However, there is a big controversy in literature regarding the involvement of AN in AD pathology. Most animal studies used transgenic mice based on the Amyloid ß (Aß) hypothesis which primarily act as models for the familial form of AD. Findings from human post mortem AN studies were also inconstistent. In this thesis, we focused on the possible involvement of AN in the pathogenesis of the sporadic form of AD. Streptozotocin intracerebroventricularily (STZ icv) treated rats, which develop an insulin-resistant brain state and learning and memory deficits preceding Aß pathology act as an appropriate animal model for sAD. We used STZ treatment for both parts of my work, for the in vivo and in vitro study. In the first part of my thesis, my coworkers and I investigated STZ icv treatment effects on different stages of AN in an in vivo approach. Even if STZ icv treatment does not seem to considerably influence stem cell proliferation over a short-term (1 month after STZ icv treatment) as well as in a long-term (3 months after STZ icv treatment) period, it results in significantly less immature and newborn mature neurons 3 months after STZ icv treatment. This reduction detected after 3 months was specific for the septal hippocampus, discussed to be important for spatial learning. Subsequently we performed co-localization studies with antibodies detecting BrdU (applied appr. 27 days before sacrifice) and cell-type specific markers such as NeuN, and GFAP, we found that STZ treatment does not affect the differentiation fate of newly generated cells. Phenotype analysis of BrdU-positive cells in the hilus and molecular layer revealed that some of the BrdU-positive cells are newborn oligodendrocytes but not newborn microglia. In the second part of my thesis I worked with cultured neural stem cells (NSCs) isolated from the adult rat hippocampus to reveal STZ effects on the proliferation of of NSCs, and on the survival and differentiation of their progeny. Furthermore, this in vitro approach enabled me to study cellular mechanisms underlying the observed impaired neurogenesis in the hippocampus of STZ-treated rats. In contrast to our findings of the STZ icv in vivo study we revealed that STZ supplied with the cell culture medium inhibits the proliferation of NSCs in a dose-dependent and time-dependent manner. Moreover, performing immunofluorescence studies with antibodies detecting cell-type specific markers after triggering NSCs to differentiate, we could show that STZ treatment affects the number of newly generated neurons but not of astrocytes. Analyzing newborn cells starting to differentiate and migrate I was able to demonstrate that STZ has no effect on the migration of newborn cells. Trying to reveal cellular mechanisms underlying the negative influence of STZ on hippocampal AN, we performed qRT-PCR and immunofluorescence staining and thus could show that in NSCs the expression of glucose transporter (GLUT)3 mRNA as well as IR and GLUT3 protein levels are reduced after STZ treatment. Therefore, the inhibition of the proliferation of NSCs may be (at least partially) caused by these two molecules. Interestingly, the effect of STZ on differentiating cells was shown to be different, as IR protein expression was not significantly changed but GLUT3 protein levels were decreased in consequence of STZ treatment. In summary, this project delivered further insights into the interrelation between AN the sporadic form of sAD and thus provides a basis of new therapeutic approaches in sAD treatment through intervening AN. Discrepancies between the results of the two parts of my thesis, the in vivo and in vitro part, were certainly caused to a certain extent by the missing microenvironment in the in vitro approach with cultured NSCs. Future studies e.g. using co-culture systems could at least minimize the effect of a missing natural microenvironment of cultured NSCs, so that the use of an in vitro approach for the investigation of STZ treatment underlying cellular mechanisms can be improved. N2 - Die Alzheimer-Krankheit (AK) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. Nur etwa 5 bis 10% der Betroffenen leiden an der familiären Form, die auf bestimmten Mutationen in einzelnen Genen, wie z.B. dem Amyloid precursor protein (APP)-Gen, zurückzuführen ist. Die Ursache der sporadischen Form der AK (sAK), die mehr als 95% der Betroffenen ausmacht, ist hingegen noch weitgehend unbekannt. Jüngste Erkenntnisse weisen auf eine Wechselwirkung von hohem Alter, Stoffwechselkrankheiten wie z.B. Diabetes, und kognitiven Defiziten, welche eine Demenz im Allgemeinen und die Alzheimer-Krankheit im Besonderen kennzeichnen, hin. Deshalb werden Störungen in der Glukoseaufnahme, in der Glukosetoleranz, und in der Funktion des Insulin/Insulinrezeptorsignalweges als Schlüsselelemente für die Entstehung einer sAK angesehen. Die neuronale Plastizität der Gehirne von AK-Patienten ist stark eingeschränkt, was sich vor allem durch den Verlust von Synapsen als auch durch den Verlust ganzer Nervenzellen zeigt. Die adulte Neurogenese (AN), die Neubildung von Neuronen im Gehirn von erwachsenen Individuen, könnte durch den Einbau neu gebildeter Neurone in existierende neuronale Netzwerke eine wichtige Rolle bei der Regenerierung neurologischer Defizite spielen. Der Gyrus dentatus im Hippocampus ist eine der wenigen Gehirnregionen, in welcher lebenslang AN stattfindet. Jedoch ist noch unklar, ob eine veränderte AN an der Pathogenese der AK beteiligt ist. Es wurden bereits viele Untersuchungen zur AN in Tiermodellen durchgeführt, wobei die überwiegende Anzahl von bisher verwendeten Tiermodellen auf der Amyloid ß-(Aß) Hypothese basieren, und somit primär Modelle für die familiäre AK darstellen. Studien mit humanem post mortem-Gewebe gaben bisher jedoch auch noch keine klaren Hinweise auf die mögliche Bedeutung einer veränderten AN für die AK. In dieser Thesis sollte die Rolle der AN für die Pathogenese der sAD untersucht werden. Dafür wurden Ratten mit Streptozotocin intracerebroventrikulär (STZ icv) behandelt. Diese so behandelten Ratten gelten als Tiermodell für die sAK, da sie bereits kurze Zeit nach ihrer STZ icv-Behandlung kognitive Defizite zeigen, ihr Gehirn eine Insulin-Resistenz entwickelt, und etwas später dann auch erste Anzeichen einer Aß-Pathologie nachweisbar sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde in einem in vivo-Ansatz der mögliche Einfluss einer STZ icv-Behandlung auf die verschiedenen Stadien der AN untersucht. Wir konnten zeigen, dass 1 Monat nach STZ icv-Behandlung weder die Proliferation neuraler Stammzellen (neural stem cells, NSCs) noch die Bildung junger Neurone verändert war, dass aber nach 3 Monaten signifikant weniger junge unreife und auch reife Neurone entstanden sind. Diese reduzierte Anzahl neu gebildeter Neurone konnte nur im septalen Teil des Hippocampus, dem eine bedeutende Rolle beim räumlichen Lernen zugesprochen wird, nachgewiesen werden. Durch eine quantitativ ausgewertete Ko-Lokalisationsstudie mit Antikörpern gegen Bromodesoxyuridin (BrdU) (mehrmalige i.p.-Gabe 27 Tage vor Gewebeentnahme) und zelltyp-spezifischen Markern wie dem Neuronenmarker NeuN und dem Marker für Astrozypen GFAP konnten wir zeigen, dass die STZ icv-Gabe nur die Anzahl der neu gebildeten Neuronen, aber nicht die Differenzierungsrichtung der neu gebildeten Zellen verändert. Eine qualitative Phänotypanalyse BrdU-positiver Zellen ergab außerdem, dass im Hilus und in der Molekularschicht des Gyrus dentatus lokalisierte BrdU-positive Zellen neu gebildeten Oligodendrozyten, aber nicht neu gebildeten Mikrogliazellen, zugeordnet werden konnten. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich NSCs aus dem adulten Hippocampus isoliert und kultiviert, um auch auf diese Art und Weise mögliche Effekte von STZ auf die Proliferation von NSCs als auch auf das Überleben und die Differenzierung von neu geborenen Zellen zu untersuchen. Ziel dieser in vitro-Studie war eine genauere Analyse der durch STZ-Gabe ausgelösten grundlegenden zellulären Mechanismen. Im Widerspruch zu den Ergebnissen der in vivo-Studie konnte ich einen Dosis- und Zeit-abhängigen negativen Effekt von STZ auf die Proliferation der NSCs zeigen. Darüber hinaus führte die Zugabe von STZ zum Medium letztendlich zu einer verringerten Bildung von Neuronen, die Neubildung von Astrozyten zeigte sich jedoch unverändert. In einem Test zur Untersuchung der Migration neu gebildeter Zellen konnte ich keinen Einfluss von STZ auf die Migration nachweisen. Weitere Analysen ergaben, dass die verringerte Proliferation der NSCs im Zusammenhang mit einer reduzierten mRNA- als auch Protein-Expression des Glukosetransporters(GLUT)3 und mit reduzierten Insulinrezeptorkonzentrationen stehen könnte. In sich differenzierenden Zellen jedoch wurde neben einer ebenfalls reduzierten GLUT3- Proteinexpression keine veränderte Insulinrezeptorenausstattung detektiert. Zusammenfassend gibt die vorliegende Arbeit mithilfe des in vivo- als auch in vitro-Ansatzes Hinweise auf eine Bedeutung der hippocampalen AN für die Entstehung der sAK und bietet dadurch Ansatzpunkte für neue therapeutische Ansätze. Die im in vivo- und in vitro-Ansatz erzielten unterschiedlichen Resultate, die sicherlich zum Teil durch die fehlende Mikroumgebung der NSCs und sich differenzierenden Zellen im in vitro-Ansatz verursacht wurden, können in Zukunft z.B. durch Ko-Kulturen zumindest verringert werden, so dass mithilfe von in vitro-Ansätzen grundlegende zelluläre Mechanismen einer STZ-Effekts in Zukunft besser untersucht werden können. KW - Alzheimerkrankheit KW - Insulinresistenz KW - adult neurogenesis KW - streptozotocin KW - Alzheimer`s disease KW - insulin resistance Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119252 ER - TY - THES A1 - Sommerlandt, Frank M. J. T1 - Mechanisms of visual memory formation in bees: About immediate early genes and synaptic plasticity T1 - Mechanismen der visuellen Gedächtnisbildung bei Bienen: Über unmittelbar früh exprimierte Gene und synaptische Plastizität N2 - Animals form perceptual associations through processes of learning, and retain that information through mechanisms of memory. Honeybees and bumblebees are classic models for insect perception and learning, and despite their small brains with about one million neurons, they are organized in highly social colonies and possess an astonishing rich behavioral repertoire including navigation, communication and cognition. Honeybees are able to harvest hundreds of morphologically divergent flower types in a quick and efficient manner to gain nutrition and, back in the hive, communicate discovered food sources to nest mates. To accomplish such complex tasks, bees must be equipped with diverse sensory organs receptive to stimuli of different modalities and must be able to associatively learn and memorize the acquired information. Particularly color vision plays a prominent role, e.g. in navigation along landmarks and when bees identify inflorescences by their color signals. Once acquired, bees are known to retain visual information for days or even months. Numerous studies on visual perception and color vision have been conducted in the past decades and largely revealed the information processing pathways in the brain. In contrast, there are no data available on how the brain may change in the course of color learning experience and whether pathways differ for coarse and fine color learning. Although long-term memory (LTM) storage is assumed to generally include reorganization of the neuronal network, to date it is unclear where in the bee brain such changes occur in the course of color learning and whether visual memories are stored in one particular site or decentrally distributed over different brain domains. The present dissertation research aimed to dissect the visual memory trace in bees that is beyond mere stimulus processing and therefore two different approaches were elaborated: first, the application of immediate early genes (IEG) as genetic markers for neuronal activation to localize early processes underlying the formation of a stable LTM. Second, the analysis of late consequences of memory formation, including synaptic reorganization in central brain areas and dependencies of color discrimination complexity. Immediate early genes (IEG) are a group of rapidly and transiently expressed genes that are induced by various types of cellular stimulation. A great number of different IEGs are routinely used as markers for the localization of neuronal activation in vertebrate brains. The present dissertation research was dedicated to establish this approach for application in bees, with focus on the candidate genes Amjra and Amegr, which are orthologous to the two common vertebrate IEGs c-jun and egr-1. First the general requirement of gene transcription for visual LTM formation was proved. Bumblebees were trained in associative proboscis extension response (PER) conditioning to monochromatic light and subsequently injected with an inhibitor of gene transcription. Memory retention tests at different intervals revealed that gene transcription is not required for the formation of a mid-term memory, but for stable LTM. Next, the appliance of the candidate genes was validated. Honeybees were exposed to stimulation with either alarm pheromone or a light pulse, followed by qPCR analysis of gene expression. Both genes differed in their expression response to sensory exposure: Amjra was upregulated in all analyzed brain parts (antennal lobes, optic lobes and mushroom bodies, MB), independent from stimulus modality, suggesting the gene as a genetic marker for unspecific general arousal. In contrast, Amegr was not significantly affected by mere sensory exposure. Therefore, the relevance of associative learning on Amegr expression was assessed. Honeybees were trained in visual PER conditioning followed by a qPCR-based analysis of the expression of all three Amegr isoforms at different intervals after conditioning. No learning-dependent alteration of gene expression was observed. However, the presence of AmEgr protein in virtually all cerebral cell nuclei was validated by immunofluorescence staining. The most prominent immune-reactivity was detected in MB calyx neurons. Analysis of task-dependent neuronal correlates underlying visual long-term memory was conducted in free-flying honeybees confronted with either absolute conditioning to one of two perceptually similar colors or differential conditioning with both colors. Subsequent presentation of the two colors in non-rewarded discrimination tests revealed that only bees trained with differential conditioning preferred the previously learned color. In contrast, bees of the absolute conditioning group chose randomly among color stimuli. To investigate whether the observed difference in memory acquisition is also reflected at the level of synaptic microcircuits, so called microglomeruli (MG), within the visual domains of the MB calyces, MG distribution was quantified by whole-mount immunostaining three days following conditioning. Although learning-dependent differences in neuroarchitecture were absent, a significant correlation between learning performance and MG density was observed. Taken together, this dissertation research provides fundamental work on the potential use of IEGs as markers for neuronal activation and promotes future research approaches combining behaviorally relevant color learning tests in bees with examination of the neuroarchitecture to pave the way for unraveling the visual memory trace. N2 - Tiere erlangen Informationen über die Umwelt durch Lernprozesse und speichern diese Informationen durch Mechanismen der Gedächtnisbildung. Honigbienen und Hummeln stellen klassische Modellorganismen zur Untersuchung von sensorischer Perzeption und Lernvorgängen dar. Trotz ihres kleinen, lediglich etwa eine Millionen Nervenzellen umfassenden Gehirns sind diese hoch sozialen Bienen zu erstaunlichen Verhaltensleistungen fähig, welche komplexe Navigation, Kommunikation und Kognition einschließen. Auf der Suche nach Futterquellen navigieren Honigbienen über große Distanzen, ohne dabei die Lage ihres Nestes aus dem Gedächtnis zu verlieren. Außerdem sammeln sie hoch effizient Futter an zahlreichen morphologisch divergenten Blütentypen und kommunizieren neu erschlossene Futterstellen anderen Sammelbienen im Nest. Zur Bewältigung solch komplexer Aufgaben stehen Bienen diverse sensorische Organe zur Verfügung, womit sie Reize unterschiedlicher Modalitäten wahrnehmen und verarbeiten können. Außerdem sind sie zu assoziativem Lernen und dem Speichern und Abrufen von Informationen in der Lage. Insbesondere der Sehsinn spielt für Bienen eine große Rolle, wenn sie sich beispielsweise anhand von Landmarken orientieren oder farbige Blütensignale wahrnehmen. Einmal erlernte visuelle Informationen können mitunter über Tage und Monate hinweg gespeichert werden. Während die Aufnahme und Verarbeitung von Farbinformationen im Bienengehirn bereits gut untersucht wurde, ist über räumliche und zeitliche Abläufe der Speicherung solcher Informationen wenig bekannt. Mit der vorliegenden Arbeit wurde versucht, experimentellen Zugang zur visuellen Gedächtnisspur in Bienen zu bekommen. Die Bildung eines Langzeitgedächtnisses (LZG) geht im Allgemeinen mit Umstrukturierungsprozessen im neuronalen Netzwerk einher. Bislang ist es jedoch unklar, wo im Gehirn diese Veränderungen im Laufe des Farbenlernens stattfinden und ob Informationen in einem zentralen Bereich gespeichert oder dezentral über verschiedene Gehirndomänen verteilt werden. Unterschiedliche Verarbeitungsbahnen werden für das Erlernen grober und feiner Farbunterschiede vermutet. Mit der vorliegenden Arbeit wurden zwei Versuchsansätze gewählt, womit die Lage des visuellen Gedächtnisses untersucht werden sollte: Zum einen wurde die Eignung unmittelbar exprimierter Gene (immediate early genes, IEG) als genetische Marker für neuronale Aktivität untersucht, um damit frühe Prozesse der Bildung eines LZG lokalisieren zu können. Zum anderen wurden Spätfolgen der Bildung eines LZG auf die Organisation synaptischer Netzwerke im zentralen Gehirn untersucht und der Einfluss der Komplexität einer Aufgabenstellung auf diese Organisation betrachtet. IEGs sind eine Gruppe von Genen, die in Antwort auf zelluläre Stimulierung schnell und vorübergehend exprimiert werden. Zahlreiche IEGs werden bereits routinemäßig als Marker für neuronale Aktivierung im Gehirn von Vertebraten eingesetzt und mit der vorliegenden Arbeit sollten die Möglichkeiten evaluiert werden, diesen Ansatz auch in Bienen nutzbar zu machen. Hierzu wurde zunächst ermittelt, ob die Transkription von Genen überhaupt für die Ausbildung eines visuellen LZG von Nöten ist. Hummeln wurden mit Hilfe der Proboscis-Streckreaktion (PER) trainiert, monochromatisches Licht mit Zuckerbelohnung zu assoziieren. Nach erfolgtem Training wurde die Gentranskription pharmazeutisch gehemmt und die Gedächtnisleistung der Hummeln zu zwei Zeitpunkten ermittelt, die das Mittelzeitgedächtnis (MZG) bzw. LZG repräsentieren. Es zeigte sich, dass Gentranskription nicht für die Ausbildung des MZG, jedoch für die des LZG unabdingbar ist. Als nächstes wurden mögliche Kandidatengene validiert. Honigbienen wurden entweder mit Alarmpheromon oder einem Lichtimpuls stimuliert. Die Bienengehirne wurden anschließend seziert und mittels qPCR die Expression von Amjra und Amegr untersucht, zweier Gene, deren orthologe Vertreter c-jun bzw. egr-1 gebräuchliche IEGs in Vertebraten darstellen. Während durch beide Reize die Expression von Amjra in allen Gehirnbereichen (Antenalloben, optische Loben und Pilzkörper) induziert wurde, konnten keine Veränderungen in der Expression von Amegr festgestellt werden. Daraufhin wurde überprüft, ob die Induktion von Amegr möglicherweise abhängig von assoziativen Lernvorgängen ist. Honigbienen wurden mittels PER visuell konditioniert, bevor die Pilzkörper zu verschiedenen Zeiten nach dem Training isoliert und mittels qPCR auf die Expression von Amegr Isoformen untersucht wurden. Hierbei konnte kein Lerneffekt auf die Amegr-Expression nachgewiesen werden. Die Analyse Aufgaben-abhängiger neuronaler Korrelate, die der Bildung des visuellen LZG zugrunde liegen, wurde anhand frei-fliegender Honigbienen durchgeführt. Diese wurden entweder absolut konditioniert auf eine von zwei ähnlichen Farben, oder differentiell auf die Diskriminierung beider Farben. Bei der anschließenden unbelohnten Präsentation beider Farben bevorzugte nur die differentiell trainierte Gruppe die zuvor gelernte Farbe, während absolut konditionierte Bienen zufällig wählten. Um zu ermitteln, ob die beobachteten Unterschiede im Verhalten auch auf neuroanatomischer Ebene repräsentiert werden, wurden alle Bienen nach drei Tagen seziert und mittels Immunfärbung synaptische Komplexe, so genannte Microglomeruli, im visuelle Informationen verarbeitenden Bereich der Pilzkörper quantifiziert. Der Vergleich zwischen den Versuchsgruppen legte keine signifikanten Unterschiede in der neuronalen Architektur offen, jedoch wurden mögliche Zusammenhänge zwischen Lernleistung und Microglomeruli-Dichte gefunden. Die vorliegende Arbeit bietet grundlegende Ergebnisse zum Potential von IEGs als Marker neuronaler Aktivität und unterstreicht die Bedeutung integrativer Versuchsansätze, welche Verhaltensuntersuchungen mit der molekularen und histologischen Analyse des Nervensystems verbinden, um letztlich das visuelle Gedächtnis im Bienengehirn lokalisieren zu können. KW - Biene KW - Langzeitgedächtnis KW - Bestäubung KW - Farbensehen KW - insect visual learning KW - long-term memory formation KW - mushroom body calyx microglomeruli KW - neuronal activation KW - IEG KW - Bienen Dressur Lernen KW - Pilzkörper KW - visuelles Langzeitgedächtnis KW - Genexpression KW - Bestäubung Pollination Honigbiene Hummel KW - Soziale Insekten Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136997 ER - TY - THES A1 - Becker, Nils T1 - Mechanisms and consequences of environmentally and behaviorally induced synaptic plasticity in the honey bee brain T1 - Mechanismen und Konsequenzen umwelt- und verhaltensbedingter synaptischer Plastizität im Gehirn der Honigbiene N2 - The brain is the central organ of an animal controlling its behavior. It integrates internal information from the body and external stimuli from the surrounding environment to mediate an appropriate behavioral response. Since the environment is constantly changing, a flexible adjustment of the brain to new conditions is crucial for the animals’ fitness. The ability of the nervous system to adapt to new challenges is defined as plasticity. Over the last few decades great advances have been made in understanding the cellular and molecular mechanisms underlying neuronal plasticity. Plasticity may refer to structural changes physically remodeling the neuronal circuit, or to functional adaptations which are manifested in modified synaptic transmission, and in altered response and firing properties of single neurons. These structural and functional modifications are mediated by a complex interplay of environmental stimuli, intracellular signal transduction cascades, protein modifications, gene translation and transcription, and epigenetic gene regulatory mechanisms. However, especially the molecular mechanisms of environmentally-induced structural neuronal plasticity are still poorly understood. In this thesis the honey bee was used as an innovative model organism to investigate this issue. The honey bee with its rich behavioral repertoire, highly sophisticated and plastic neuronal system, sequenced genome and full epigenetic machinery is well suited for studying the molecular underpinnings of environmentally-induced neuronal plasticity. Adult honey bees progress through a series of tasks within the dark hive until after about three weeks they start with foraging activities in the external world. The transition from in-hive to outside tasks is associated with remarkable structural neuronal plasticity. Subdivisions of the mushroom body, a brain region related to higher cognitive functions, are increased in volume. The volume expansion is mediated by a remarkable outgrowth of the dendritic network of mushroom body intrinsic neurons, so called Kenyon cells. In parallel, prominent synaptic structures, referred to as microglomeruli, are pruned. Most interestingly for this thesis, the pruning of microglomeruli and the dendritic expansion in Kenyon cells can be induced by a simple light exposure paradigm. In the first chapter of the present thesis I used this paradigm to induce synaptic plasticity in the mushroom bodies under controlled lab conditions to search for correlating molecular changes which possibly mediate the observed plasticity. I compared the brain transcriptome of light-exposed and dark-kept control bees by whole transcriptome sequencing. This revealed a list of differentially expressed genes (DEGs). The list contains conserved genes which have reported functions in neuronal plasticity, thereby introducing them as candidate genes for plasticity in the honey bee brain. Furthermore, with this transcriptomic approach I discovered many candidate genes with unknown functions or functions so far unrelated to neuronal plasticity suggesting that these novel genes may have yet unrecognized roles in neuronal plasticity. A number of DEGs are known to be methylated or to exert epigenetic modifications on themselves speaking for a strong impact of epigenetic mechanisms in light-induced structural plasticity in the honey bee brain. This notion is supported by a differential methylation pattern of one examined DEG between light-exposed and dark-kept bees as shown in this thesis. Also a plasticity-related microRNA, which is predicted to target genes associated with cytoskeleton formation, was found to be upregulated in light-exposed bees. This speaks for a translation regulatory mechanism in structural plasticity in the honey bee. Another interesting outcome of this study is the age-dependent expression of DEGs. For some plasticity-related DEGs, the amplitude of light-induced expression differs between one- and seven-day-old bees, and also the basal expression level of many DEGs in naive dark-kept control bees significantly varies between the two age groups. This suggests that the responsiveness of plasticity-related genes to environmental stimuli is also under developmental (age-dependent) control, which may be important for normal maturation and for the regulation of age-related changes in behavior. Indeed, I was able to demonstrate in phototaxis experiments that one- and seven-day-old bees show different behaviors in response to light exposure and thus the correlating age-dependent transcriptional differences may serve as mechanisms promoting age-related changes in behavior. Together the results of the transcriptomic study demonstrate the successfulness of my approach to identify candidate molecular mechanisms for environmentally-induced structural plasticity in the honey bee brain. Furthermore, the thesis provides seminal evidence for the implication of DNA methylation in this process. To better understand the role of DNA methylation for neuronal and behavioral plasticity in the honey bee, the second chapter of the thesis aims at characterizing this molecular process under more natural conditions. Therefore, I examined the expression of the DNA methyltransferase 3 (DNMT3) and of Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase (TET) between in-hive bees and foragers. DNMT3 is responsible for DNA de novo methylation, whereas TET promotes DNA demethylation by converting methylcytosine (5mC) to hydroxymethylcytosine (5hmC). The data suggest that age and experience determine the expression of these two epigenetic key genes. Additionally, in this context, two examined DEGs are shown to be differentially methylated between nurses and foragers. One of these two DEGs, the plasticity related gene bubblegum (bgm), also exhibits an altered DNA methylation pattern in response to light exposure. Hence, these results of my thesis provide additional evidence for the importance of DNA methylation in behavioral and neuronal plasticity. Results from the second chapter of this thesis also suggest additional functions of DNMT3 and TET to their traditional roles in DNA methylation/demethylation. I show that TET is far more expressed in the honey bee brain than DNMT3. This stands in contrast to the relative scarcity of 5hmC compared to 5mC and points at extra functions of this gene like RNA modifications as reported for Drosophila. Antibody staining against the DNMT3 gene product revealed an unexpected rare localization of the enzyme in the nucleus, but a surprisingly high abundance in the cytoplasm. The role of cytoplasmic DNMT3 is unknown. One possibility for the high abundance in the cytoplasm is a regulatory mechanism for DNA methylation by cytoplasmic-nuclear trafficking, or an additional function of DNMT3 in RNA modification, similar to TET. Altogether, this thesis points at future research directions for neuronal plasticity by providing promising evidence for the involvement of epigenetic mechanisms and of a number of new candidate genes in environmentally induced structural plasticity in the honey bee brain. Furthermore, I present data suggesting so far unrecognized functions of DNMT3 which certainly need to be experimentally addressed in the future to fully understand the role of this enzyme. N2 - Das Gehirn ist das zentrale Organ zur Steuerung des Verhaltens von Tieren. Es integriert körperinterne Informationen mit Umweltreizen und sorgt somit für eine Anpassung des Verhaltens an die jeweilige Situation. Diese hohe Flexibilität des Gehirns ist ein entscheidender Überlebensfaktor in einer sich ständig wandelnden Umwelt. Die Fähigkeit des Nervensystems, sich an wechselnde Bedingungen anpassen zu können, wird als Plastizität bezeichnet. In den vergangen Jahrzehnten wurden große Fortschritte zur Identifikation von zellulären und molekularen Mechanismen neuronaler Plastizität erzielt. Neuronale Plastizität beinhaltet zum einen physische Veränderung der Struktur neuronaler Netzwerke, und zum anderen funktionale Modifikationen der internen Antworteigenschaften und synaptischen Übertragung eines Neurons. Diese Veränderungen werden durch ein komplexes Zusammenspiel zwischen Umweltreizen, intrazellulären Signalkaskaden, Proteinmodifikationen, Gentranslation und -Transkription, sowie epigenetischer Genregulation gesteuert. Die genauen Mechanismen umweltbedingter struktureller Plastizität sind jedoch immer noch nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Doktorarbeit bediene ich mich der Honigbiene als innovativen Modellorganismus, um dieses Thema zu untersuchen. Die Honigbiene eignet sich durch ihr vielfältiges und komplexes Verhalten, ihr hochentwickeltes und plastisches Nervensystem, ihr sequenziertes Genom, sowie durch den Besitz einer vollständig epigenetischen Maschinerie besonders gut zur Untersuchung der molekularen Mechanismen umweltbedingter neuronaler Plastizität. Honigbienen führen die ersten drei Wochen ihres Lebens verschiedene Arbeiten innerhalb des dunklen Bienenstocks aus, ehe sie anschließend für den Rest ihres Lebens nach Nahrung außerhalb des Stocks suchen. Der Wechsel vom Innen- zum Außendienst korreliert mit plastischen Veränderungen des Gehirns. Subkompartimente des Pilzkörpers, einer Hirnstruktur, die mit höherer Kognition assoziiert wird, nehmen im Volumen zu. Diese Volumensexpansion lässt sich durch eine wachsende dendritische Verzweigung von Kenyonzellen, welche die intrinsischen Neuronen der Pilzkörper darstellen, erklären. Gleichzeitig findet eine Eliminierung von synaptischen Komplexen, sogenannten Mikroglomeruli, statt. Besonders interessant für diese Doktorarbeit ist die Tatsache, dass die strukturelle Plastizität der Mikroglomeruli und der dendritischen Verzweigungen bereits durch ein einfaches Lichtexponierungsprotokoll induziert werden kann. In dieser Doktorarbeit löse ich durch das Lichtprotokoll synaptische Plastizität unter standardisierten Laborbedingungen aus, um nach zugrundeliegenden molekularen Veränderungen während dieses Vorgangs zu suchen. Ein Vergleich des Transkriptoms zwischen lichtbehandelten und dunkel gehaltenen Bienen mittels Transkriptom-Sequenzierung beider Gruppen erbrachte mehrere differentiell exprimierte Gene (DEGs). Die Liste der DEGs enthält einige konservierte Gene, denen bereits eine Funktion in neuronaler Plastizität nachgewiesen wurde und daher als Kandidatengene für umweltbedingte synaptische Plastizität in der Honigbiene infrage kommen. Außerdem konnten mehrere DEGs ohne bekannten Bezug zu neuronaler Plastizität, oder mit bisher unbekannter Funktion, identifiziert werden, was die Möglichkeit einer bisher unentdeckten Rolle dieser Gene in neuronaler Plastizität impliziert. Des Weiteren sind einige der DEGs in epigenetische Prozesse involviert und aus anderen Studien ist bekannt, dass weitere DEGs Methylierungen aufweisen. Dies weist auf einen starken Einfluss epigenetischer Prozesse bei lichtinduzierter struktureller Plastizität in der Honigbiene hin. Diese Vermutung wird durch die differentielle Methylierung eines plastizitäts-assoziierten DEGs zwischen lichtexponierten und dunkelgehalten Bienen bekräftigt. Ferner ist eine microRNA in lichtbehandelten Bienen hochreguliert, welche als vorhergesagte Ziele Gene zur Zytoskelettformation hat. Dies spricht für einen translationsregulatorischen Mechanismus im Zusammenhang mit struktureller Plastizität in der Honigbiene. Ein weiteres interessantes Ergebnis dieser Arbeit ist der starke Alterseinfluss auf die Expression der identifizierten DEGs. Bei einigen DEGs ist die Amplitude der lichtinduzierten Expression bei sieben Tage alten Bienen höher als bei einem Tag alten, und das Grundexpressionsniveau vieler DEGs in den naiven, dunkel gehaltenen Kontrollbienen unterscheidet sich zwischen den beiden Altersklassen. Dies lässt vermuten, dass die Expression von Plastizitätsgenen als Antwort auf Umweltreize ebenfalls durch ein internes Entwicklungsprogramm beeinflusst wird, was wichtig für eine normale Reifung, sowie zur Regulation altersabhängigen Verhaltens sein könnte. Tatsächlich weist diese Arbeit bei Phototaxis-Experimenten Verhaltensunterschiede zwischen einen- und sieben Tage alten Bienen auf, welche mit transkriptionellen Unterschieden zwischen den beiden Altersklassen korrelieren, die somit wiederum als molekularer Mechanismus zur Steuerung des altersabhängigen Verhaltens in Frage kommen. Zusammengefasst bestätigen die Ergebnisse aus den Transkriptomstudien den Erfolg meines experimentellen Ansatzes zur Identifikation molekularer Kandidatenmechanismen für umweltbedingte strukturelle Plastizität im Honigbienengehirn. Zudem liefern die Ergebnisse der Transkriptions-Sequenzierung einen deutlichen Hinweis auf den Einfluss von DNA-Methylierung auf strukturelle neuronale Plastizität. Um die Rolle von DNA-Methylierung im Zusammenhang mit neuronaler- und Verhaltensplastizität besser zu verstehen, zielt das zweite Kapitel dieser Arbeit auf eine genauere Charakterisierung dieses epigenetischen Vorgangs in einem natürlicheren Kontext ab. Dazu wurde die Expression der DNA Methyltransferase 3 (DNMT3) und von Ten-eleven translocation Methylcytosine Dioxygenase (TET) zwischen Bienen im Innen- und Außendienst verglichen. DNMT3 ist zuständig für die de novo DNA-Methylierung, wohingegen TET DNA durch die Konvertierung von methylierten Cytosin (5mC) in hydroxymethyliertes Cytosin (5hmC) demethyliert. Die Ergebnisse dieses Versuchs deuten auf eine altersabhängige, aber auch auf eine umweltbedingte Expression dieser beiden epigenetischen Schlüsselgene hin. Zusätzlich sind zwei untersuchte DEGs in diesem Versuchsaufbau differentiell methyliert, wobei eines dieser Gene mit Plastizitätsbezug, bubblegum (bgm), bereits in den Lichtexperimenten als differentiell methyliert charakterisiert wurde. Dadurch wird der Verdacht des Einflusses von DNA-Methylierung bei neuronaler- und Verhaltensplastizität weiter verstärkt. Resultate der Versuche im zweiten Kapitel lassen weitere Funktionen von DNMT3 und TET über ihre traditionelle Rolle in DNA-Methylierung/Demethylierung hinaus vermuten. In dieser Arbeit ist TET im Honigbienengehirn weit mehr exprimiert als DNMT3. Das steht in starkem Kontrast zu dem relativ geringen Vorkommen von 5hmC im Vergleich zu 5mC und deutet auf zusätzliche Funktionen von TET in der Honigbiene hin, z.B. bei RNA-Modifikationen wie es bei Drosophila nachgewiesen wurde. Eine Antikörperfärbung gegen DNMT3 zeigt eine unerwartet geringe Konzentration dieses Enzyms im Zellkern, dafür aber ein relativ starkes Vorkommen im Zytoplasma. Die Funktion von zytoplasmatischem DNMT3 ist unbekannt, könnte aber einen regulatorischen Mechanismus der DNA-Methylierung durch zytoplasmatisch-nukleare Translokation des Enzyms darstellen, oder aber auf eine zusätzliche Rolle des Proteins bei RNA-Modifikationen, ähnlich wie für TET, hinweisen. Abschließend lässt sich sagen, dass diese Doktorarbeit, durch die vielversprechende Identifizierung von epigenetischen Mechanismen und von aussichtsreichen Kandidatengenen für strukturelle Plastizität im Honigbienengehirn, auf neue Wege in der zukünftigen Erforschung neuronaler Plastizität weist. Des Weiteren präsentiere ich Daten, welche auf bisher unbekannte Funktionen von DNMT3 hinweisen und eine weitere Erforschung dieses Enzyms nötig machen um seine Rolle vollständig zu verstehen. KW - Neuronale Plastizität Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138466 ER - TY - THES A1 - Scholl, Christina T1 - Cellular and molecular mechanisms contributing to behavioral transitions and learning in the honeybee T1 - Zelluläre und molekulare Mechanismen, die zu Verhaltensänderungen und Lernen in der Honigbiene beitragen N2 - The honeybee Apis mellifera is a social insect well known for its complex behavior and the ability to learn tasks associated with central place foraging, such as visual navigation or to learn and remember odor-reward associations. Although its brain is smaller than 1mm² with only 8.2 x 105 neurons compared to ~ 20 x 109 in humans, bees still show amazing social, cognitive and learning skills. They express an age – related division of labor with nurse bees staying inside the hive and performing tasks like caring for the brood or cleaning, and foragers who collect food and water outside the hive. This challenges foragers with new responsibilities like sophisticated navigation skills to find and remember food sources, drastic changes in the sensory environment and to communicate new information to other bees. Associated with this plasticity of the behavior, the brain and especially the mushroom bodies (MBs) - sensory integration and association centers involved in learning and memory formation – undergo massive structural and functional neuronal alterations. Related to this background my thesis on one hand focuses on neuronal plasticity and underlying molecular mechanisms in the MBs that accompany the nurse – forager transition. In the first part I investigated an endogenous and an internal factor that may contribute to the nurse - forager phenotype plasticity and the correlating changes in neuronal network in the MBs: sensory exposure (light) and juvenile hormone (JH). Young bees were precociously exposed to light and subsequently synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the MBs or respectively hemolymph juvenile hormone (JH) levels were quantified. The results show that light input indeed triggered a significant decrease in MG density, and mass spectrometry JH detection revealed an increase in JH titer. Interestingly light stimulation in young bees (presumably nurse bees) triggered changes in MG density and JH levels comparable to natural foragers. This indicates that both sensory stimuli as well as the endocrine system may play a part in preparing bees for the behavioral transition to foraging. Considering a connection between the JH levels and synaptic remodeling I used gene knockdown to disturb JH pathways and artificially increase the JH level. Even though the knockdown was successful, the results show that MG densities remained unchanged, showing no direct effect of JH on synaptic restructuring. To find a potential mediator of structural synaptic plasticity I focused on the calcium-calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in the second part of my thesis. CaMKII is a protein known to be involved in neuronal and behavioral plasticity and also plays an important part in structural plasticity reorganizing synapses. Therefore it is an interesting candidate for molecular mechanisms underlying MG reorganization in the MBs in the honeybee. Corresponding to the high abundance of CaMKII in the learning center in vertebrates (hippocampus), CaMKII was shown to be enriched in the MBs of the honeybee. Here I first investigated the function of CaMKII in learning and memory formation as from vertebrate work CaMKII is known to be associated with the strengthening of synaptic connections inducing long term potentiation and memory formation. The experimental approach included manipulating CaMKII function using 2 different inhibitors and a specific siRNA to create a CaMKII knockdown phenotype. Afterwards bees were subjected to classical olfactory conditioning which is known to induce stable long-term memory. All bees showed normal learning curves and an intact memory acquisition, short-term and mid-term memory (1 hour retention). However, in all cases long-term memory formation was significantly disrupted (24 and 72 hour retention). These results suggests the necessity of functional CaMKII in the MBs for the induction of both early and late phases of long-term memory in honeybees. The neuronal and molecular bases underlying long-term memory and the resulting plasticity in behavior is key to understanding higher brain function and phenotype plasticity. In this context CaMKII may be an important mediator inducing structural synaptic and neuronal changes in the MB synaptic network. N2 - Die Honigbiene Apis mellifera ist ein soziales Insekt, das bekannt ist für sein komplexes Verhalten und seine Fähigkeiten, Aufgaben in Bezug auf zentrales Sammelverhalten, zum Beispiel visuelle Navigation oder die Assoziation Duft – Belohnung, zu lernen, ist. Obwohl das Bienengehirn kleiner als 1mm² ist und im Vergleich zum dem des Menschen mit ~ 20 x 109 Neuronen nur 8.2 x 105 Neurone besitzt, verfügen Bienen trotzdem über beeindruckende soziale, kognitive und Lernfähigkeiten. Sie praktizieren eine altersabhängige Arbeitsteilung mit Ammen, die im Stock bleiben und Aufgaben wie das Versorgen der Brut übernehmen, und Sammlerinnen, die außerhalb des Stockes Futter und Wasser suchen. Dies fordert die Sammlerinnen zu neuen Aufgaben heraus, zum Beispiel hochentwickelte Navigation, drastischen Änderungen der sensorischen Umwelt, Lernen neuer Assoziationen und die Vermittlung der neuen Informationen an andere Bienen. Diese phänotypische Plastizität geht mit stark strukturellen und funktionell neuronalen Veränderungen im Gehirn und vor allem in den Pilzkörpern – sensorische Integrierungszentren, die an Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sind – einher. Passend dazu liegt ein Schwerpunkt meiner Arbeit darauf, die neuronale Plastizität und die molekularen Mechanismen im Pilzkörper, die mit der Wandlung der Amme hin zur Sammlerin zusammen hängen, zu untersuchen. Im ersten Teil werden ein endogener und ein interner Faktor, die zum Ammen - Sammlerinnen Übergang und den damit einhergehenden Änderungen im neuronalen Netzwerk beitragen könnten, untersucht: sensorische Input (Licht) und Juvenilhormon (JH). Junge Bienen wurden frühzeitig dem Licht ausgesetzt und anschließend synaptische Komplexe (Mikroglomeruli, MG) in den Pilzkörpern beziehungsweise JH aus der Hämolymphe quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss des Lichts tatsächlich eine plastische Verringerung der MG-Dichte auslöst und massenspektrometrische Messungen eine Zunahme an der JH-Menge in der Hämolymphe zeigen. Interessanterweise führt die Stimulation der jungen Ammen mit Licht zu Änderungen in der MG-Dichte und zu JH-Mengen, die vergleichbar sind mit den Werten bei natürlichen Sammlerinnen sind. Dies weist darauf hin, dass sowohl sensorische Stimuli als auch das Hormonsystem einen Beitrag zu der Vorbereitung der Bienen auf die bevorstehende Verhaltensänderung leisten. Um eine Verbindung zwischen der JH-Menge und synaptischen Umstrukturierungen in Betracht zu ziehen, habe ich einen Gen-Knockdown eingesetzt, um JH-Signalwege zu manipulieren und dadurch die JH-Menge künstlich zu erhöhen. Obwohl der Knockdown erfolgreich war, zeigen die Ergebnisse keinen direkten Zusammenhang zwischen der JH-Menge und einer synaptischer Umgestaltung. Um einen möglichen Vermittler von struktureller Plastizität zu finden, habe ich den Fokus im zweiten Teil meiner Arbeit auf die Calcium-Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II (CaMKII) gerichtet. CaMKII ist ein Protein, das für seine Rolle sowohl in neuronaler und Verhaltensplastizität als auch in struktureller Plastizität bekannt ist. Daher ist es ein interessanter Kandidat, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die bei der MG-Umstrukturierung in den Pilzkörpern beteiligt sind. In Übereinstimmung mit dem hohen Vorkommen der CaMKII in Lernzentren in Vertebraten (Hippocampus) kommt CaMKII auch in hohem Maß in den Pilzkörpern der Biene vor. In dieser Arbeit habe ich zuerst die Funktion der CaMKII in Lernvorgängen und bei der Gedächtnisbildung untersucht, da bekannt ist, dass CaMKIII mit verstärkten synaptischen Verbindungen, die Langzeitpotenzierung und Gedächtnisbildung auslösen, in Zusammenhang gebracht wird. Der experimentelle Ansatz beinhaltet die Manipulation der CaMKII mit zwei verschiedenen Inhibitoren und einer spezifische siRNA, um einen CaMKII-Knockdown-Phänotyp zu erzeugen. Alle Substanzen wurden über den medialen Ocellartrakt injiziert, um zu gewährleisten, dass sie den Pilzkörper erreichen. Anschließend wurde eine klassische olfaktorische Konditionierung durchgeführt, die ein stabiles Langzeitgedächtnis induziert. Alle Bienen zeigten ein normales Lernverhalten, Kurzzeitgedächtnis und Mittelzeitgedächtnis (eine Stunde Speicherung) waren intakt. Jedoch war in allen Fällen das Langzeitgedächtnis beschädigt (24 und 72 Stunden Speicherung). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaMKII in den Pilzkörpern essentiell für das Auslösen von frühen und späten Formen des Langzeitgedächtnisses der Biene ist. Die neuronalen und molekularen Grundlagen des Langzeitgedächtnis sind der Schlüssel, um höhere Gehirnfunktionen und phänotypische Plastizität zu verstehen. CaMKII könnte ein wichtiger Vermittler sein, um strukturelle und neuronale synaptische Änderungen im Netzwerk des Pilzkörpers auszulösen. KW - Biene KW - honeybee KW - learning and memory KW - division of labor KW - Lernen KW - Molekularbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115527 ER - TY - THES A1 - Ehmann, Nadine T1 - Linking the active zone ultrastructure to function in Drosophila T1 - Struktur-Funktions-Beziehungen an der aktiven Zone in Drosophila N2 - Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication. Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains. This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron. N2 - Kommunikation zwischen Nervenzellen ist von grundlegender Bedeutung für die Hirnfunktion. An chemischen Synapsen findet diese an hoch spezialisierten interzellulären Kontaktstellen statt, den aktiven Zonen, welche die Voraussetzung für präzise Neurotransmission schaffen und somit die synaptische Kommunikation gewährleisten. In aktiven Zonen befindet sich eine Vielzahl von Proteinen dicht gepackt, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Plastizität der Signaltransduktion vermitteln. Bisher ist es jedoch unklar, in welcher Weise die molekularen Organisationsprinzipien dieser Proteine die Funktion der aktiven Zone beeinflussen. Teilweise ist dies dem Auflösungsvermögen konventioneller Lichtmikroskopie geschuldet, das nicht ausreicht um die Architektur der aktiven Zone im Nanometer Bereich aufzuklären. Unlängst jedoch haben neue Methoden der hochaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie ihren Weg in die Neurowissenschaften gefunden. Diese sind in der Lage die Lücke zwischen optischer Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu schließen, ohne die Identität der Proteinspezies aus den Augen zu verlieren. Besonderes Interesse kommt hierbei sogenannten Lokalisationsmikroskopie Techniken zu. Diese können neben der Darstellung molekularer Organisationen im Idealfall sogar quantitative Informationen über die absolute Anzahl bestimmter Moleküle in subzellulären Bereichen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die auf klassischer Immunohistochemie beruht und dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) nutzt, um die endogene Proteinorganisation in situ zu quantifizieren. Fokussierend auf Brp (Bruchpilot), einem Protein an der aktiven Zone von Drosophila melanogaster, zeigen die Ergebnisse, dass die Zytomatrix an der aktiven Zone modular aufgebaut ist, wobei jedes Modul ~137 Brp Moleküle umfasst. Diese sind zum Großteil in etwa 15 Gruppen mit je 7 Untereinheiten angeordnet. Um auf einen quantitativen Zusammenhang zwischen der Ultrastruktur der aktiven Zone und ihrer Funktion zu schließen, wurden Drosophila Mutanten eingesetzt und mittels Elektrophysiologie funktionell untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass sich spezifische Eigenschaften von Kurzzeitplastizität in der präzisen Anordnung von Brp widerspiegeln, was Rückschlüsse auf verschiedene Ursprünge synaptischer Depression zulässt. Darüber hinaus beschrieben dSTORM Experimente erstmals, dass ein funktioneller Gradient entlang des Motoneurons mit der graduellen Veränderung der Anzahl von Bruchpilotmolekülen pro aktive Zone korreliert. KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synapse KW - Drosophila KW - active zone KW - structure-function relationships KW - super-resolution microscopy KW - electrophysiology KW - Synapses KW - Microscopy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118186 ER - TY - THES A1 - Kropf, Jan T1 - The Dual Olfactory Pathway in the Honeybee Brain: Sensory Supply and Electrophysiological Properties T1 - Der duale olfaktorische Weg im Gehirn der Honigbiene: Sensorischer Eingang und elektrophysiologische Eigenschaften N2 - The olfactory sense is of utmost importance for honeybees, Apis mellifera. Honeybees use olfaction for communication within the hive, for the identification of nest mates and non-nest mates, the localization of food sources, and in case of drones (males), for the detection of the queen and mating. Honeybees, therefore, can serve as excellent model systems for an integrative analysis of an elaborated olfactory system. To efficiently filter odorants out of the air with their antennae, honeybees possess a multitude of sensilla that contain the olfactory sensory neurons (OSN). Three types of olfactory sensilla are known from honeybee worker antennae: Sensilla trichoidea, Sensilla basiconica and Sensilla placodea. In the sensilla, odorant receptors that are located in the dendritic arborizations of the OSNs transduce the odorant information into electrical information. Approximately 60.000 OSN axons project in two parallel bundles along the antenna into the brain. Before they enter the primary olfactory brain center, the antennal lobe (AL), they diverge into four distinct tracts (T1-T4). OSNs relay onto ~3.000-4.000 local interneurons (LN) and ~900 projection neurons (PN), the output neurons of the AL. The axons of the OSNs together with neurites from LNs and PNs form spheroidal neuropil units, the so-called glomeruli. OSN axons from the four AL input tracts (T1-T4) project into four glomerular clusters. LNs interconnect the AL glomeruli, whereas PNs relay the information to the next brain centers, the mushroom body (MB) - associated with sensory integration, learning and memory - and the lateral horn (LH). In honeybees, PNs project to the MBs and the LH via two separate tracts, the medial and the lateral antennal-lobe tract (m/lALT) which run in parallel in opposing directions. The mALT runs first to the MB and then to the LH, the lALT runs first to the LH and then to the MB. This dual olfactory pathway represents a feature unique to Hymenoptera. Interestingly, both tracts were shown to process information about similar sets of odorants by extracting different features. Individual mALT PNs are more odor specific than lALT PNs. On the other hand, lALT PNs have higher spontaneous and higher odor response action potential (AP) frequencies than mALT PNs. In the MBs, PNs form synapses with ~184.000 Kenyon cells (KC), which are the MB intrinsic neurons. KCs, in contrast to PNs, show almost no spontaneous activity and employ a spatially and temporally sparse code for odor coding. In manuscript I of my thesis, I investigated whether the differences in specificity of odor responses between m- and lALT are due to differences in the synaptic input. Therefore, I investigated the axonal projection patterns of OSNs housed in S. basiconica in honeybee workers and compared them with S. trichoidea and S. placodea using selective anterograde labeling with fluorescent tracers and confocal- microscopy analyses of axonal projections in AL glomeruli. Axons of S. basiconica-associated OSNs preferentially projected into the T3 input-tract cluster in the AL, whereas the two other types of sensilla did not show a preference for a specific glomerular cluster. T3- associated glomeruli had previously been shown to be innervated by mALT PNs. Interestingly, S. basiconica as well as a number of T3 glomeruli lack in drones. Therefore I set out to determine whether this was associated with the reduction of glomeruli innervated by mALT PNs. Retrograde tracing of mALT PNs in drones and counting of innervated glomeruli showed that the number of mALT-associated glomeruli was strongly reduced in drones compared to workers. The preferential projections of S. basiconica-associated OSNs into T3 glomeruli in female workers together with the reduction of mALT-associated glomeruli in drones support the presence of a female-specific olfactory subsystem that is partly innervated by OSNs from S. basiconica and is associated with mALT projection neurons. As mALT PNs were shown to be more odor specific, I suppose that already the OSNs in this subsystem are more odor specific than lALT associated OSNs. I conclude that this female-specific subsystem allows the worker honeybees to respond adequately to the enormous variety of odorants they experience during their lifetime. In manuscript II, I investigated the ion channel composition of mALT and lALT PNs and KCs in situ. This approach represents the first study dealing with the honeybee PN and KC ion channel composition under standard conditions in an intact brain preparation. With these recordings I set out to investigate the potential impact of intrinsic neuronal properties on the differences between m- and lALT PNs and on the sparse odor coding properties of KCs. In PNs, I identified a set of Na+ currents and diverse K+ currents depending on voltage and Na+ or Ca2+ that support relatively high spontaneous and odor response AP frequencies. This set of currents did not significantly differ between mALT and lALT PNs, but targets for potential modulation of currents leading to differences in AP frequencies were found between both types of PNs. In contrast to PNs, KCs have very prominent K+ currents, which are likely to contribute to the sparse response fashion observed in KCs. Furthermore, Ca2+ dependent K+ currents were found, which may be of importance for coincidence detection, learning and memory formation. Finally, I conclude that the differences in odor specificity between m- and lALT PNs are due to their synaptic input from different sets of OSNs and potential processing by LNs. The differences in spontaneous activity between the two tracts may be caused by different neuronal modulation or, in addition, also by interaction with LNs. The temporally sparse representation of odors in KCs is very likely based on the intrinsic KC properties, whereas general excitability and spatial sparseness are likely to be regulated through GABAergic feedback neurons. N2 - Der Geruchssinn ist für die Honigbiene, Apis mellifera, von größter Bedeutung. Honigbienen kommunizieren olfaktorisch, sie können Nestgenossinnen und koloniefremde Honigbienen aufgrund des Geruchs unterscheiden, sie suchen und erkennen Nahrungsquellen olfaktorisch, und Drohnen (männliche Honigbienen) finden die Königin mit Hilfe des Geruchssinns. Deshalb dient die Honigbiene als exzellentes Modell für die Untersuchung hochentwickelter olfaktorischer Systeme. Honigbienen filtern Duftmoleküle mit ihren Antennen aus der Luft. Auf diesen Antennen sitzen Sensillen, die die olfaktorischen sensorischen Neurone (OSN) beinhalten. Drei verschiedene olfaktorische Sensillen existieren bei Arbeiterinnen: Sensilla trichoidea, Sensilla basiconica und Sensilla placodea. In diesen Sensillen sind olfaktorische Rezeptorproteine auf den Dendriten der OSN lokalisiert. Diese Duftrezeptoren wandeln die Duftinformationen in elektrische Informationen um. Die Axone von ca. 60.000 OSN ziehen in zwei Bündeln entlang der Antenne in das Gehirn. Bevor sie das erste olfaktorische Gehirnzentrum, den Antennallobus (AL), erreichen, spalten sie sich in vier distinkte Trakte (T1-T4) auf. Im AL verschalten sie auf 3.000-4.000 lokale Interneurone (LN) und auf etwa 900 Ausgangsneurone des AL, die Projektionsneurone (PN). Die axonalen Endigungen der OSN bilden mit Neuriten der PN und LN kugelförmige Strukturen, die so genannten Glomeruli. Die OSN aus den vier Trakten T1-T4 ziehen in vier zugehörige glomeruläre Cluster. LN verschalten die Information unter den AL Glomeruli, PN leiten olfaktorische Informationen zu den nächsten Gehirnstrukturen, den Pilzkörpern und dem lateralen Horn, weiter. Die Pilzkörper werden als Zentrum für sensorische Integration, Lernen und Gedächtnis gesehen. Die PN, die den AL mit dem Pilzkörper und dem lateralen Horn verbinden, verlaufen in Honigbienen parallel über zwei Bahnen, den medialen und den lateralen Antennallobustrakt (mALT/lALT), aber in entgegengesetzter Richtung. Dieser duale olfaktorische Signalweg wurde in dieser Ausprägung bisher nur in Hymenopteren gefunden. Interessanterweise prozessieren beide Trakte Informationen über die gleichen Düfte. Dabei sind mALT PN duftspezifischer und lALT PN haben höhere spontane Aktionspotentialfrequenzen sowie höhere Aktionspotentialfrequenzen in Antwort auf einen Duftreiz. Im Pilzkörper verschalten PN auf Kenyon Zellen (KC), die intrinsischen Neurone des Pilzkörpers. KC sind im Gegensatz zu PN fast nicht spontan aktiv und kodieren Informationen auf räumlicher und zeitlicher Ebene mit geringer Aktivität. Man spricht von einem so genannten "sparse code". Im ersten Manuskript meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, ob die Unterschiede in der Spezifität der Duftantworten zwischen mALT und lALT PN zumindest zum Teil auf Unterschieden im sensorischen Eingang beruhen. Ich habe die axonalen Projektionen der OSN der S. basiconica in Honigbienen untersucht und mit den Projektionen von OSN in S. trichoidea und S. placodea verglichen. Dazu wurden die OSN in den S. basiconica anterograd mit Fluoreszenzmarkern gefärbt und mit mittels konfokaler Mikroskopie untersucht und quantifiziert. Die Axone von OSN aus S. basiconica ziehen präferentiell in das T3 Glomerulus Cluster, die Axone der anderen beiden Sensillentypen zeigen keine Präferenz für ein spezielles Cluster. Es wurde bereits gezeigt, dass die Glomeruli des T3 Clusters von mALT PN innerviert werden. Interessanterweise fehlen S. basiconica und Teile der T3 Glomeruli in Drohnen. Deshalb habe ich untersucht, ob die T3 Reduzierung in Drohnen mit einer Reduzierung der mALT Glomeruli einhergeht. Retrograde Färbungen der mALT PN in Drohnen zeigten, daß die Zahl der mALT Glomeruli in Drohnen gegenüber Arbeiterinnen deutlich reduziert ist. Die Präferenz der OSN der S. basiconica für das T3 Cluster und die reduzierte Anzahl von mALT Glomeruli in Drohnen weisen auf ein arbeiterinnenspezifisches olfaktorisches Subsystem hin, welches aus S. basiconica, T3 Glomeruli und einer Gruppe von mALT PN besteht. Da die mALT PN duftspezifischer als lALT PN sind, vermute ich, dass auch die OSN, die auf mALT PN verschalten, duftspezifischer antworten als OSN die auf lALT PN verschalten. Daraus schließe ich, daß dieses Subsystem den Arbeiterinnen ermöglicht, passend auf die enorme Breite an Duftstoffen zu reagieren, die diese im Laufe ihres arbeitsteiligen Lebens wahrnehmen müssen. Im zweiten Manuskript meiner Doktorarbeit habe ich die Ionenkanalzusammensetzung der mALT PN, der lALT PN und der KC in situ untersucht. Mein Ansatz stellt die erste Studie dar, die die Ionenkanäle von Neuronen in der Honigbiene unter Standardbedingungen an einer intakten Gehirnpräparation untersucht. Mit diesen Messungen versuche ich die potentiellen bioelektrischen Grundlagen für Unterschiede in der Informationskodierung in mALT PN, lALT PN und Kenyon Zellen zu ergründen. In PN konnte ich eine Gruppe von Na+ Ionenkanälen und Na+ abhängigen, Ca2+ abhängigen sowie spannungsabhängigen K+ Ionenkanälen identifizieren, die die Grundlagen für hohe, spontane Aktionspotentialfrequenzen und hohe Duftantwortfrequenzen schaffen. Diese Ströme unterschieden sich nicht grundsätzlich zwischen m- und lALT PN. Jedoch wurden potentielle Ziele für neuronale Modulation gefunden, welche zu unterschiedlichen Aktionspotentialfrequenzen zwischen PN der beiden Trakte führen könnten. Im Gegensatz zu den PN wurden in Kenyon Zellen in der Relation sehr starke K+ Ionenströme gemessen. Diese dienen sehr wahrscheinlich der schnellen Terminierung von Duftantworten, also dem Erzeugen des zeitlichen "sparse code". Außerdem wurden Ca2+ abhängige K+ Kanäle gefunden, die für Koinzidenzdetektion, Lernen und Gedächtnis von Bedeutung sein können. In der Gesamtsicht folgere ich aus meinen Ergebnissen, dass die Unterschiede in der Duftspezifizität zwischen m- und lALT PN überwiegend auf deren sensorischen Eingängen von unterschiedlichen Populationen von OSN und der Verarbeitung über lokale Interneuronen im AL beruht. Die Unterschiede in der Spontanaktivität zwischen mALT und lALT basieren sehr wahrscheinlich auf neuronaler Modulation und/oder Interaktion mit LN. Die zeitliche Komponente des "sparse code" in KC entsteht höchstwahrscheinlich durch die intrinsischen elektrischen Eigenschaften der KC, wohingegen die generelle Erregbarkeit und der räumliche "sparse code" mit großer Wahrscheinlichkeit auf der Regulation durch GABAerge Neurone beruht. KW - Voltage-Clamp-Methode KW - Biene KW - Neuroanatomie KW - Neurobiology KW - Olfaction KW - Geruchssinn Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108369 ER - TY - THES A1 - Fleischmann, Pauline Nikola T1 - Starting foraging life: Early calibration and daily use of the navigational system in \(Cataglyphis\) ants T1 - Start in den Außendienst: Zur anfänglichen Kalibrierung und alltäglichen Nutzung des Navigationssystem in \(Cataglyphis\)-Ameisen N2 - Cataglyphis ants are famous for their navigational abilities. They live in hostile habitats where they forage as solitary scavengers covering distances of more than hundred thousand times their body lengths. To return to their nest with a prey item – mainly other dead insects that did not survive the heat – Cataglyphis ants constantly keep track of their directions and distances travelled. The navigational strategy is called path integration, and it enables an ant to return to the nest in a straight line using its home vector. Cataglyphis ants mainly rely on celestial compass cues, like the position of the sun or the UV polarization pattern, to determine directions, and they use an idiothetic step counter and optic flow to measure distances. In addition, they acquire information about visual, olfactory and tactile landmarks, and the wind direction to increase their chances of returning to the nest safe and sound. Cataglyphis’ navigational performance becomes even more impressive if one considers their life style. Most time of their lives, the ants stay underground and perform tasks within the colony. When they start their foraging careers outside the nest, they have to calibrate their compass systems and acquire all information necessary for navigation during subsequent foraging. This navigational toolkit is not instantaneously available, but has to be filled with experience. For that reason, Cataglyphis ants perform a striking behavior for up to three days before actually foraging. These so-called learning walks are crucial for the success as foragers later on. In the present thesis, both the ontogeny and the fine-structure of learning walks has been investigated. Here I show with displacement experiments that Cataglyphis ants need enough space and enough time to perform learning walks. Spatially restricted novices, i. e. naïve ants, could not find back to the nest when tested as foragers later on. Furthermore, ants have to perform several learning walks over 1-3 days to gain landmark information for successful homing as foragers. An increasing number of feeder visits also increases the importance of landmark information, whereas in the beginning ants fully rely on their path-integration vector. Learning walks are well-structured. High-speed video analysis revealed that Cataglyphis ants include species-specific rotational elements in their learning walks. Greek Cataglyphis ants (C. noda and C. aenescens) inhabiting a cluttered pine forest perform voltes, small walked circles, and pirouettes, tight turns about the body axis with frequent stopping phases. During the longest stopping phases, the ants gaze back to their nest entrance. The Tunisian Cataglyphis fortis ants inhabiting featureless saltpans only perform voltes without directed gazes. The function of voltes has not yet been revealed. In contrast, the fine structure of pirouettes suggests that the ants take snapshots of the panorama towards their homing direction to memorize the nest’s surroundings. The most likely hypothesis was that Cataglyphis ants align the gaze directions using their path integrator, which gets directional input from celestial cues during foraging. To test this hypothesis, a manipulation experiment was performed changing the celestial cues above the nest entrance (no sun, no natural polarization pattern, no UV light). The accurately directed gazes to the nest entrance offer an easily quantifiable readout suitable to ask the ants where they expect their nest entrance. Unexpectedly, all novices performing learning walks under artificial sky conditions looked back to the nest entrance. This was especially surprising, because neuronal changes in the mushroom bodies and the central complex receiving visual input could only be induced with the natural sky when comparing test animals with interior workers. The behavioral findings indicated that Cataglyphis ants use another directional reference system to align their gaze directions during the longest stopping phases of learning walk pirouettes. One possibility was the earth’s magnetic field. Indeed, already disarraying the geomagnetic field at the nest entrance with an electromagnetic flat coil indicated that the ants use magnetic information to align their looks back to the nest entrance. To investigate this finding further, ants were confronted with a controlled magnetic field using a Helmholtz coil. Elimination of the horizontal field component led to undirected gaze directions like the disarray did. Rotating the magnetic field about 90°, 180° or -90° shifted the ants’ gaze directions in a predictable manner. Therefore, the earth’s magnetic field is a necessary and sufficient reference system for aligning nest-centered gazes during learning-walk pirouettes. Whether it is additionally used for other navigational purposes, e. g. for calibrating the solar ephemeris, remains to be tested. Maybe the voltes performed by all Cataglyphis ant species investigated so far can help to answer this question.. N2 - Cataglyphis-Ameisen sind für ihre Navigationsfähigkeiten berühmt. Sie bewohnen lebens- feindliche Regionen in denen sie einzeln und über weite Strecken Futter suchen müssen. Um mit Beute (meist ein totes Insekt, das die große Hitze nicht überlebt hat) zu ihrem Nest zurückzukehren, bedienen sie sich einer Navigationsstrategie, die als Wegintegration beze- ichnet wird. Dabei müssen die Ameisen die zurückgelegten Distanzen messen und jeden Richtungswechsel registrieren, um schließlich in gerader Linie nachhause zurückkehren zu können. Als Kompass nutzen sie Himmelsinformationen, wie den Stand der Sonne oder das UV-Polarisationsmuster, und für die Distanzmessung verwenden sie einen inneren Schrittzäh- ler sowie optischen Fluss. Außerdem nutzen sie alle weiteren Informationen, die hilfreich sein könnten, um sicher zum Nest zurückzukehren. Dazu gehören visuelle, olfaktorische und taktile Landmarken sowie die Richtung des Windes. Die Navigationsleistungen von Cataglyphis-Ameisen sind insbesondere dann bemerkenswert, wenn man sich bewusst macht, dass sie die meiste Zeit ihres Lebens unter der Erde verbringen. Dort übernehmen sie Auf- gaben im Nest bis sie dann schließlich alt genug sind, um draußen Futter zu suchen. Dann müssen sie ihre Kompasssysteme kalibrieren und alle Informationen lernen, die sie für eine erfolgreiche Futtersuche brauchen. Dieses sogenannte Navigations-Toolkit steht den Ameisen nicht automatisch zur Verfügung, vielmehr müssen sie es mit eigener Erfahrung füllen. Dafür nutzen sie die ersten ein bis drei Tage außerhalb des Nestes. Während dieser Zeit suchen sie kein Futter, sondern vollführen sogenannte Lernläufe. Lernläufe sind unabdingbar, um später als Fourageur erfolgreich zu sein. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde sowohl die zeitliche und räumliche Entwicklung der Lernläufe als auch deren Feinstruktur untersucht. Mit Versetzungsexperimenten konnte ich zeigen, dass Ameisen genügend Zeit und Raum brauchen, um Lernläufe durchzuführen. Wurden Neulinge während ihrer Lernläufe räumlich eingeschränkt, so konnten sie nicht zum Nest zurückfinden, wenn sie als erfahrene Fourageure getestet wurden. Außerdem brauchen die Ameisen ein bis drei Tage Zeit, um ein Landmarkenpanorama zu erlernen, das sie dann später erfolgreich zur Landmarkenorientierung nutzen können. Eine größere Anzahl an Besuchen am Futterplatz erhöht die Wichtigkeit von Landmarkeninformation für die Ameisen, die anfangs nur ihren Wegintegrator nutzen. Lernläufe weisen eine beeindruckende Struktur auf. Mit High-Speed-Videoaufnahmen konnte gezeigt werden, dass Cataglyphis-Ameisen artspezifische Drehungen während der Lernläufe vollführen. Die griechischen Cataglyphis-Ameisen (C. noda und C. aenescens) leben in einem Pinienwald, der ihnen ein vielfältiges und landmarkenreiches Panorama bietet. Ihre Lernläufe beinhalten zwei Drehungsformen, nämlich sogenannte Volten (kleine gelaufene Kreise) und Pirouetten (enge Drehungen um die eigene Körperachse mit häufigen Stoppphasen). Während der längsten Stoppphase einer Pirouette schauen die Ameisen zurück in die Richtung ihres Nesteingangs, obwohl sie ihn nicht direkt sehen können. Die tunesischen Cataglyphis-Ameisen (C. fortis ) leben auf einem landmarkenarmen Salzsee. Sie vollführen nur Volten und machen keine Pirouetten während ihrer Lernläufe. Die Funktion von Volten ist noch unbekannt, wohingegen die Feinstruktur der Pirouetten die Vermutung nahelegt, dass die Ameisen sogenannte Schnappschüsse von der Umgebung ihres Nestes machen, um dorthin zurückkehren zu können. Es schien wahrscheinlich, dass die Ameisen ihren Wegintegrator nutzen, um ihre Blickrich- tungen zum Nest auszurichten. Während der Futtersuche bekommt der Wegintegrator seine Richtungsinformationen vom Himmelskompass. Daher wurde ein Experiment geplant und durchgeführt bei dem die Himmelsinformationen über dem Nesteingang manipuliert wurden (keine Sicht auf die Sonne, kein natürliches Polarisationsmuster oder kein UV-Licht). Die nest- zentrierten Blickrichtungen der Ameisen ermöglichen es relativ einfach zu überprüfen, ob die Ameisen die Position des Nesteingangs kennen. Überraschenderweise schauten die Ameisen unter allen Bedingungen weiterhin zurück zum Nesteingang. Dies war insbesondere be- merkenswert, da die Himmelsmanipulation neuronale Veränderungen in den Pilzkörpern und dem Zentralkomplex (das sind Regionen im Gehirn der Ameisen, die visuelle Informationen verarbeiten) bewirkten bzw. diese verhinderten. Nur unter natürlichen Bedingungen, also bei freiem Blick auf die Sonne, gab es Unterschiede auf neuronaler Ebene zwischen den Testtieren und den Innendiensttieren, die als Kontrolle dienten. Die Ergebnisse des Verhaltensversuchs deuteten darauf hin, dass die Ameisen ein anderes direktionales Referenzsystem nutzen, um ihre Blickrichtungen zu kontrollieren. Eine Möglichkeit war das Erdmagnetfeld. Tatsächlich zeigte schon die experimentelle Streuung des Magnetfelds am Nesteingang mittels einer elektromagnetischen Flachspule, dass die Ameisen tatsächlich Magnetinformationen nutzen, um ihre Blicke auszurichten. Die Blickrichtungen während der längsten Stoppphasen waren nicht mehr zum Nesteingang gerichtet. Um dies genauer zu untersuchen wurden die Ameisen mit dem kontrollierten Magnetfeld einer Helmholtzspule konfrontiert. Die Eliminierung der Horizontalkomponente des Magnetfelds bewirkte wiederum, dass die Ameisen nicht zum Nesteingang zurückschauten. Wurde die Horizontalkomponente jedoch um 90◦, 180◦ oder -90◦ gedreht, so folgten die Blickrichtungen der Ameisen dieser Drehung voraussagbar im selben Winkel. Dies zeigt, dass das Erdmagnetfeld tatsächlich das Referenzsystem für die Ausrichtungen der Blicke während der Lernlaufpirouetten darstellt. Ob es auch noch an- deren Navigationszwecken, wie beispielsweise der Kalibrierung der solaren Ephemeris dient, muss zukünftig überprüft werden. Vielleicht können die Volten, die alle bisher untersuchten KW - Cataglyphis KW - Learning walk Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159951 ER -