TY - THES A1 - Waag, Thilo T1 - Funktionalisierung von Nanodiamanten für Wirkstofftransport und Knochenersatzmaterialien T1 - Functionalization of nanodiamonds for drug delivery and alternate bone material N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit ist das Design, die Synthese und das anschließende Testen von Nanodiamant-Wirkstoff-Konjugaten. Dafür müssen zunächst Nanodiamanten mit geeigneten Linkersystemen funktionalisiert werden, um anschließend verschiedene pharmazeutische Wirkstoffe auf der Diamantoberfläche zu immobilisieren. Die Wirksamkeit der so angebundenen Inhibitoren auf die verschiedenen Erreger muss anschließend in vitro und in vivo getestet werden. Auch die Art der Aufnahme der Nanodiamanten in die verschiedenen Zellen muss untersucht werden. Dazu sollen Fluoreszenzfarbstoffe, wie z.B. Oregon Green 488, auf der Diamantoberfläche immobilisiert werden. N2 - Because of its low toxicity and rich surface chemistry nanodiamond is well suited for the application in the fields of biology and medicine. The aim of this work is the development of various nanodiamond conjugates as drug delivery systems and components of bone replacement materials. Before the immobilization of drugs the nanodiamond particles need to be functionalized with acid labile linker systems, in this case hydrazones. After entering the acidic cell compartments the drug is released. First of all, the linkers are isolated as diazonium-tetrafluoroborates and after that immobilized on mechanically deagglomerated nanodiamond. The drugs can be bound to the hydrazine linker systems. In this work several drugs are immobilized to the nanodiamond surface via hydrazine linker systems and the drug release under acidic conditions is analyzed. Further compounds are immobilized for the investigation for future bone replacement materials, namely dyes and growth factors. KW - Nanodiamant KW - nanomateriales KW - nanotherapeutics KW - Diamant KW - Nanostrukturiertes Material KW - Wirkstofffreisetzung KW - Knochenersatz Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94597 ER - TY - THES A1 - Wittmann, Katharina T1 - Adipose Tissue Engineering - Development of Volume-Stable 3-Dimensional Constructs and Approaches Towards Effective Vascularization T1 - Tissue Engineering von Fettgewebe - Generierung volumenstabiler 3-dimensionaler Fettgewebe-Konstrukte und Entwicklung effektiver Vaskularisierungsstrategien N2 - Adipose tissue defects and related pathologies still represent major challenges in reconstructive surgery. Based on to the paradigm ‘replace with alike’, adipose tissue is considered the ideal substitute material for damaged soft tissue [1-3]. Yet the transfer of autologous fat, particularly larger volumes, is confined by deficient and unpredictable long term results, as well as considerable operative morbidity at the donor and recipient site [4-6], calling for innovative treatment options to improve patient care. With the aim to achieve complete regeneration of soft tissue defects, adipose tissue engineering holds great promise to provide functional, biologically active adipose tissue equivalents. Here, especially long-term maintenance of volume and shape, as well as sufficient vascularization of engineered adipose tissue represent critical and unresolved challenges [7-9]. For adipose tissue engineering approaches to be successful, it is thus essential to generate constructs that retain their initial volume in vivo, as well as to ensure their rapid vascularization to support cell survival and differentiation for full tissue regeneration [9,10]. Therefore, it was the ultimate goal of this thesis to develop volume-stable 3D adipose tissue constructs and to identify applicable strategies for sufficient vascularization of engineered constructs. The feasibility of the investigated approaches was verified by translation from in vitro to in vivo as a critical step for the advancement of potential regenerative therapies. For the development of volume-stable constructs, the combination of two biomaterials with complementary properties was successfully implemented. In contrast to previous approaches in the field using mainly non-degradable solid structures for mechanical protection of developing adipose tissue [11-13], the combination of a cell-instructive hydrogel component with a biodegradable porous support structure of adequate texture was shown advantageous for the generation of volume-stable adipose tissue. Specifically, stable fibrin hydrogels previously developed in our group [14] served as cell carrier and supported the adipogenic development of adipose-derived stem cells (ASCs) as reflected by lipid accumulation and leptin secretion. Stable fibrin gels were thereby shown to be equally supportive of adipogenesis compared to commercial TissuCol hydrogels in vitro. Using ASCs as a safe source of autologous cells [15,16] added substantial practicability to the approach. To enhance the mechanical strength of the engineered constructs, porous biodegradable poly(ε caprolactone)-based polyurethane (PU) scaffolds were introduced as support structures and shown to exhibit adequately sized pores to host adipocytes as well as interconnectivity to allow coherent tissue formation and vascularization. Low wettability and impaired cell attachment indicated that PU scaffolds alone were insufficient in retaining cells within the pores, yet cytocompatibility and differentiation of ASCs were adequately demonstrated, rendering the PU scaffolds suitable as support structures for the generation of stable fibrin/PU composite constructs (Chapter 3). Volume-stable adipose tissue constructs were generated by seeding the pre-established stable fibrin/PU composites with ASCs. Investigation of size and weight in vitro revealed that composite constructs featured enhanced stability relative to stable fibrin gels alone. Comparing stable fibrin gels and TissuCol as hydrogel components, it was found that TissuCol gels were less resilient to degradation and contraction. Composite constructs were fully characterized, showing good cell viability of ASCs and strong adipogenic development as indicated by functional analysis via histological Oil Red O staining of lipid vacuoles, qRT-PCR analysis of prominent adipogenic markers (PPARγ, C/EBPα, GLUT4, aP2) and quantification of leptin secretion. In a pilot study in vivo, investigating the suitability of the constructs for transplantation, stable fibrin/PU composites provided with a vascular pedicle gave rise to areas of well-vascularized adipose tissue, contrasted by insufficient capillary formation and adipogenesis in constructs implanted without pedicle. The biomaterial combination of stable fibrin gels and porous biodegradable PU scaffolds was thereby shown highly suitable for the generation of volume-stable adipose tissue constructs in vivo, and in addition, the effectiveness of immediate vascularization upon implantation to support adipose tissue formation was demonstrated (Chapter 4). Further pursuing the objective to investigate adequate vascularization strategies for engineered adipose tissue, hypoxic preconditioning was conducted as a possible approach for in vitro prevascularization. In 2D culture experiments, analysis on the cellular level illustrated that the adipogenic potential of ASCs was reduced under hypoxic conditions when applied in the differentiation phase, irrespective of the oxygen tension encountered by the cells during expansion. Hypoxic treatment of ASCs in 3D constructs prepared from stable fibrin gels similarly resulted in reduced adipogenesis, whereas endothelial CD31 expression as well as enhanced leptin and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion indicated that hypoxic treatment indeed resulted in a pro-angiogenic response of ASCs. Especially the observed profound regulation of leptin production by hypoxia and the dual role of leptin as adipokine and angiogenic modulator were considered an interesting connection advocating further study. Having confirmed the hypothesis that hypoxia may generate a pro-angiogenic milieu inside ASC-seeded constructs, faster vessel ingrowth and improved vascularization as well as an enhanced tolerance of hypoxia-treated ASCs towards ischemic conditions upon implanatation may be expected, but remain to be verified in rodent models in vivo (Chapter 5). Having previously been utilized for bone and cartilage engineering [17-19], as well as for revascularization and wound healing applications [20-22], stromal-vascular fraction (SVF) cells were investigated as a novel cell source for adipose tissue engineering. Providing cells with adipogenic differentiation as well as vascularization potential, the SVF was applied with the specific aim to promote adipogenesis and vascularization in engineered constructs in vivo. With only basic in vitro investigations by Lin et al. addressing the SVF for adipose repair to date [23], the present work thoroughly investigated SVF cells for adipose tissue construct generation in vitro, and in particular, pioneered the application of these cells for adipose tissue engineering in vivo. Initial in vitro experiments compared SVF- and ASC-seeded stable fibrin constructs in different medium compositions employing preadipocyte (PGM-2) and endothelial cell culture medium (EGM-2). It was found that a 1:1 mixture of PGM-2 and EGM-2, as previously established for co-culture models of adipogenesis [24], efficiently maintained cells with adipogenic and endothelial potential in SVF-seeded constructs in short and long-term culture setups. Observations on the cellular level were supported by analysis of mRNA expression of characteristic adipogenic and endothelial markers. In preparation of the evaluation of SVF-seeded constructs under in vivo conditions, a whole mount staining (WMS) method, facilitating the 3D visualization of adipocytes and blood vessels, was successfully established and optimized using native adipose tissue as template (Chapter 6). In a subcutaneous nude mouse model, SVF cells were, for the first time in vivo, elucidated for their potential to support the functional assembly of vascularized adipose tissue. Investigating the effect of adipogenic precultivation of SVF-seeded stable fibrin constructs in vitro prior to implantation on the in vivo outcome, hormonal induction was shown beneficial in terms of adipocyte development, whereas a strong vascularization potential was observed when no adipogenic inducers were added. Via histological analysis, it was proven that the developed structures were of human origin and derived from the implanted cells. Applying SVF cells without precultivation in vitro but comparing two different fibrin carriers, namely stable fibrin and TissuCol gels, revealed that TissuCol profoundly supported adipose formation by SVF cells in vivo. This was contrasted by only minor SVF cell development and a strong reduction of cell numbers in stable fibrin gels implanted without precultivation. Histomorphometric analysis of adipocytes and capillary structures was conducted to verify the qualitative results, concluding that particularly SVF cells in TissuCol were highly suited for adipose regeneration in vivo. Employing the established WMS technique, the close interaction of mature adipocytes and blood vessels in TissuCol constructs was impressively shown and via species-specific human vimentin staining, the expected strong involvement of implanted SVF cells in the formation of coherent adipose tissue was confirmed (Chapter 7). With the development of biodegradable volume-stable adipose tissue constructs, the application of ASCs and SVF cells as two promising cell sources for functional adipose regeneration, as well as the thorough evaluation of strategies for construct vascularization in vitro and in vivo, this thesis provides valuable solutions to current challenges in adipose tissue engineering. The presented findings further open up new perspectives for innovative treatments to cure soft tissue defects and serve as a basis for directed approaches towards the generation of clinically applicable soft tissue substitutes. N2 - In der rekonstruktiven Chirurgie besteht ein ständig wachsender Bedarf an geeigneten Implantaten, um Weichteildefekte nach Tumorresektionen, Traumata, oder aufgrund von kongenitalen Missbildungen adäquat ersetzen zu können [1]. Hierbei stellt körpereigenes Fettgewebe als Weichteilersatz das ideale Substitutionsmaterial dar [2-4]. Derzeit angewandte Wiederherstellungsmethoden verwenden frei transplantierbare und gestielte Lappenplastiken aus autologem Fettgewebe oder greifen auf künstliche Kollagen- und Silikonimplantate zurück [5]. Diese Ansätze sind jedoch zum Teil mit gravierenden Nachteilen behaftet, wie Absorption und Nekrotisierung bei transplantiertem körpereigenem Fettgewebe, sowie Fremdkörperreaktionen und fibrotischen Verkapselungen bei Kollagen und Silikon. Insbesondere die Versorgung großvolumiger Defekte ist mit komplexen chirurgischen Eingriffen verbunden und geht häufig mit Komplikationen wie Infektionen, Narbenbildung und Volumenverlust, sowie Defiziten an der Hebe- und Empfängerstelle einher [1,5-8]. Es besteht daher ein großer Bedarf an innovativen Methoden und der Entwicklung neuer Materialien, die einen dauerhaften körpereigenen Weichteilersatz ermöglichen. Das interdisziplinäre Feld des Tissue Engineerings von Fettgewebe zielt auf die Entwicklung neuer Ansätze zur Regeneration von Weichteildefekten und der Bereitstellung von biologisch äquivalentem Gewebeersatz, vor allem für die Rekonstruktion großvolumiger Defekte. Verringerte Volumenstabilität und unzureichende Blutgefäßversorgung stellen jedoch auch bei durch Tissue Engineering hergestelltem Gewebe zentrale Limitationen dar [5,8,9]. Für die erfolgreiche Substitution von Weichteildefekten mit Methoden des Tissue Engineerings ist es daher essenziell, Gewebekonstrukte mit ausreichender Volumenstabilität bereitzustellen, um auch nach Implantation in vivo langfristig zu bestehen, sowie eine adäquate Blutgefäßversorgung zu gewährleisten, um Zellüberleben und Differenzierung für eine vollständige Geweberegeneration zu garantieren [5,10]. Folglich war es Ziel dieser Arbeit, volumenstabile Fettgewebekonstrukte zu entwickeln und neue Strategien zur Vaskularisierung der generierten Konstrukte zu evaluieren. Als wichtiger Schritt in Bezug auf eine potenzielle klinische Anwendbarkeit wurden außerdem vielversprechende In-vitro-Ansätze auf den In-vivo-Kontext in etablierten Mausmodellen übertragen. Für die Entwicklung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte wurde die Kombination zweier Biomaterialien mit komplementären Eigenschaften verfolgt. So wurden für die Konstruktherstellung Fibrinhydrogele als Zellträger mit hochporösen bioabbaubaren Scaffolds als mechanische Schutzstrukturen kombiniert. Im Gegensatz zu bisherigen Ansätzen zur Verbesserung der Volumenstabilität, in denen hauptsächlich nicht abbaubare, rigide Gerüst- oder Hohlkörperstrukturen zum mechanischen Schutz des entstehenden Gewebes appliziert wurden [11-13], wurden hier ausschließlich bioabbaubare und Gewebe kompatible Materialien verwendet. Dabei konnte auf bereits zuvor entwickelte stabile Fibringele [14] zurückgegriffen werden, die in dieser Arbeit erstmals für das Fettgewebe Engineering als Zellträger für mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells; ASCs) verwendet wurden. Mittels sich ergänzender Analysemethoden auf zellulärer (Oil Red O-Färbung) und molekularer Ebene (Leptin Sekretion; ELISA) konnte erfolgreich die adipogene Differenzierung der in den Fibringelen inkorporierten ASCs nachgewiesen werden. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichem Fibrin (TissuCol, Baxter) zeigten ASCs in den stabilen Fibringelen eine mit TissuCol vergleichbare, gute adipogene Differenzierbarkeit. Durch die Verwendung von ASCs als sichere und autologe Zellquelle [15,16] für die Konstruktherstellung wurde zudem die potenzielle klinische Anwendbarkeit der generierten Zell-Biomaterial-Konstrukte erhöht. Zur Verbesserung der Volumenstabilität wurden bioabbaubare Poly(ε caprolacton)-basierte Polyurethan-Scaffolds als zusätzliche Gerüststruktur evaluiert. Aufgrund ihrer hohen Porosität und Interkonnektivität stellten sich die Scaffolds als besonders geeignet für die Differenzierung von Adipozyten sowie für die Generierung von kohärentem Fettgewebe heraus. Bei direkter Besiedelung mit ASCs wiesen die PU-Scaffolds zwar eine geringe Zelladhäsion und inhomogene Zellverteilung auf, die adipogene Differenzierung der Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt. Daraufhin wurde die Generierung von Fibrin/PU Kompositkonstrukten durch Kombination der PU-Scaffolds mit den zuvor untersuchten stabilen Fibringelen angestrebt (Kapitel 3). Durch Zusammenführung der stabilen Fibringele als Zellträger für ASCs mit den PU Scaffolds als zusätzlicher Gerüststruktur konnten in folgenden Arbeiten erfolgreich homogene und mechanisch stabile Fettgewebekonstrukte hergestellt werden. Die detaillierte Evaluation von Größe und Gewicht zeigte, dass in den Kompositkonstrukten durch die zusätzliche poröse PU-Scaffoldstruktur eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den stabilen Fibringelen als alleinigem Zellträger erreicht werden konnte. Der Vergleich der stabilen Fibringele mit TissuCol als Hydrogelkomponente zeigte, dass TissuCol-Gele unter In vitro Kulturbedingungen stärker kontrahierten und schneller abgebaut wurden. Die in den Kompositkonstrukten inkorporierten ASCs zeigten gute Viabilität sowie deutliche adipogene Differenzierung auf histologischer (Oil Red O-Färbung) als auch auf molekularer Ebene (qRT-PCR; ELISA). In einer In-vivo-Pilotstudie wurden die Kompositkonstrukte auf ihre Transplantierbarkeit hin überprüft und durch mikrochirurgische Insertion eines Durchflussgefäßes bei der Implantation unmittelbar vaskularisiert. In stabilen Fibrin/PU Konstrukten mit integriertem Gefäßstiel wurde so die Entwicklung von vaskularisiertem Fettgewebe im Vergleich zu ungestielten Konstrukten entschieden verbessert. Mittels der erfolgreichen In-vivo-Implantation der Kompositkonstrukte konnte die Anwendbarkeit der Biomaterialkombination aus stabilem Fibrin und porösen PU Scaffolds für die Generierung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte demonstriert und gleichzeitig der positive Effekt einer direkten Vaskularisierung durch Integration eines Gefäßstiels gezeigt werden (Kapitel 4). Im Rahmen der weiteren Evaluation potenzieller Vaskularisierungsstrategien wurden im Anschluss Ansätze zur Prävaskularisierung in vitro untersucht. Hierbei stellte die hypoxische Vorkultur von mittels Tissue Engineering generierten Fettgewebekonstrukten einen möglichen Ansatz zur Schaffung eines pro-angiogenen, vaskularisierungsfördernden Milieus innerhalb der Konstrukte dar. Ebenso von Interesse waren in diesem Zusammenhang die Auswirkungen von Hypoxie auf die adipogene Differenzierung von ASCs. Erste Versuche im 2D-Kulturformat mit ASCs zeigten, dass das adipogene Potenzial der Zellen unter Hypoxie in der Differenzierungsphase stark vermindert war, wobei der während der Expansionsphase der Zellen bestehende Sauerstoffpartialdruck keinen Einfluss auf die Fettentwicklung hatte. Auch in 3D-Konstrukten basierend auf stabilen Fibringelen konnte eine verringerte adipogene Differenzierung von ASCs unter hypoxischer Kultur nachgewiesen werden, dabei wurden im Gegenzug endotheliale Marker (CD31) und pro angiogene Wachstumsfaktoren, wie z.B. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), aber auch das Adipokin Leptin, stark hochreguliert. Insbesondere die deutliche Veränderung der Leptinsekretion unter hypoxischen Kulturbedingungen und die duale Rolle von Leptin als adipogener und pro-angiogener Faktor ergeben interessante Perspektiven für weiterführende Untersuchungen. Basierend auf den gezeigten Ergebnissen konnte insgesamt bestätigt werden, dass die hypoxische Vorkultur in vitro zur Entstehung eines pro angiogenen und potenziell vaskularisierungsfördernden Milieus beitragen kann. Es gilt nun in Folgestudien das Potenzial der hypoxischen Vorkultur zur Verbesserung der Vaskularisierung in vivo, sowie eine erhöhte Toleranz der implantierten Zellen gegenüber hypoxischen Bedingungen nach der Implantation in etablierten In-vivo-Mausmodellen zu verifizieren (Kapitel 5). Ein weiterer Ansatz zur Generierung von vaskularisiertem Fettgewebe in vitro und in vivo wurde durch den Einsatz der stromalen-vaskulären Fraktion (SVF) als neue Zellquelle für das Fettgewebe-Engineering verfolgt. Bisher wurde die SVF hauptsächlich für das Tissue Engineering von Knochen- und Knorpelgewebe [17-19] oder für Vaskularisierungs- und Wundheilungsansätze [20-22] untersucht. In der SVF enthalten sind sowohl Fettvorläuferzellen als auch Endothelzellen, Perizyten, Fibroblasten und Immunzellen [8]. Durch Verwendung dieses heterogenen Zellgemisches sollte die simultane Entwicklung von Fettzellen und vaskulären Strukturen erreicht werden, und damit eine schnellere und effizientere Fettgewebeentwicklung in vivo. Da sich bisher nur eine In-vitro-Studie explizit dem Tissue Engineering von Fettgewebe mit SVF-Zellen widmet [23], wurden in dieser Arbeit SVF-besiedelte Fettgewebekonstrukte basierend auf Fibringelen als Zellträger zunächst umfassend in vitro charakterisiert und erstmals die Fettgewebeentwicklung der Zellen im Mausmodell in vivo untersucht. In vorbereitenden In-vitro-Arbeiten wurden SVF-besiedelte stabile Fibringele mit den bisher verwendeten ASC-basierten Konstrukten verglichen. Dabei wurde zunächst die adipogene und endotheliale Differenzierbarkeit der SVF in unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Eine 1:1-Mischung aus Präadipozytenmedium (PGM-2) und Endothelzellmedium (EGM-2), die zuvor schon für Kokulturexperimente von ASCs und Endothelzellen verwendet worden war [24], stellte sich als besonders geeignet für die Kurz- und Langzeitkultur der SVF in stabilen Fibringelen heraus. Umfassende histologische Untersuchungen zeigten, dass mit Hilfe dieser Medienkomposition insbesondere das adipogene und endotheliale Differenzierungspotenzial der verschiedenen Zelltypen in der SVF innerhalb der generierten 3D-Konstrukte erhalten werden kann. Die auf zellulärer Ebene gewonnenen Erkenntnisse konnten mittels qRT-PCR-Analyse von adipogenen und endothelialen Markern (PPARγ, aP2, CD31) auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Um in Zukunft die In-vivo-Untersuchung der generierten Fettgewebekonstrukte zu erleichtern, sowie eine strukturelle Analyse des Gewebeverbands und insbesondere die Interaktion von Adipozyten und Blutgefäßen zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining), zunächst unter Verwendung von nativem humanem Fettgewebe, etabliert (Kapitel 6). In einer anschließenden umfassenden Studie in immundefizienten Nacktmäusen (NMRI Foxn1nu/Foxn1nu) wurden SVF-Zellen zum ersten Mal in vivo für das Engineering von vaskularisiertem Fettgewebe untersucht. Hierbei wurden sowohl der Effekt der In vitro Vorkultur der SVF-basierten Konstrukte als auch der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebeentwicklung in vivo evaluiert. Die adipogene Vorkultur der SVF-besiedelten Konstrukte in vitro über einen Zeitraum von 7 Tagen vor Implantation wirkte sich positiv auf die Fettdifferenzierung in vivo aus, wohingegen die Vorkultur unter nicht-induzierten Bedingungen ohne adipogene Induktion verstärkt zur Bildung von vaskulären Strukturen führte. Durch Spezies-spezifische Färbung gegen humanes Vimentin konnte gezeigt werden, dass die beobachteten Strukturen humanen Ursprungs waren und daher von den implantierten SVF-Zellen stammten. Der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebebildung in vivo wurde durch Besiedelung stabiler Fibringele und TissuCol-Gele mit SVF-Zellen verglichen. Die Konstrukte wurden ohne In-vitro-Vorkultur direkt nach der Herstellung implantiert. Hier zeigte sich in stabilen Fibringelen nach 4 Wochen in vivo keine nennenswerte Gewebeentwicklung, wobei auch der Anteil an humanen Zellen innerhalb der Konstrukte zum Zeitpunkt der Explantation stark verringert war. Im Gegensatz dazu konnte in TissuCol-Gelen die Entwicklung von kohärentem und maturem Fettgewebe nachgewiesen werden von dem große Teile humanen Ursprungs waren. Die histologischen Ergebnisse wurden mittels histomorphometrischer Quantifizierung von Adipozyten und Blutgefäßstrukturen verifiziert, wodurch das herausragende Potenzial der SVF für das Fettgewebe-Engineering in vivo nochmals verdeutlicht wurde. Unter Verwendung der zuvor etablierten 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining) konnten anschließend Adipozyten und Blutgefäße innerhalb des entstandenen kohärenten Gewebeverbands in TissuCol-Gelen visualisiert werden. Mit Hilfe einer humanspezifischen Färbung in 3D konnte zusätzlich die weitreichende Beteiligung der implantierten SVF Zellen bei der Gewebeentwicklung nachgewiesen werden (Kapitel 7). Die in der Dissertation entwickelten bioabbaubaren volumenstabilen Fettgewebekonstrukte, die Untersuchung von ASCs und SVF-Zellen als vielversprechende regenerative Zellquellen für die Generierung funktioneller Konstrukte, sowie die Evaluation unterschiedlicher Vaskularisierungsstrategien in vitro und in vivo leisten einen wichtigen Beitrag zu neuen und innovativen Ansätzen im Bereich des Tissue Engineerings von Fettgewebe. Die Ergebnisse stellen eine Grundlage für die zielgerichtete Entwicklung regenerativer Implantate dar und eröffnen neue Perspektiven für die Generierung klinisch anwendbarer Fettgewebekonstrukte als Weichteilersatz. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Tissue Engineering KW - Adipose Tissue KW - Vascularization KW - Fibrin Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107196 ER - TY - INPR A1 - Wohlgemuth, Matthias A1 - Miyazaki, Mitsuhiko A1 - Tsukada, Kohei A1 - Weiler, Martin A1 - Dopfer, Otto A1 - Fujii, Masaaki A1 - Mitrić, Roland T1 - Deciphering environment effects in peptide bond solvation dynamics by experiment and theory T2 - Physical Chemistry Chemical Physics N2 - Most proteins work in aqueous solution and the interaction with water strongly affects their structure and function. However, experimentally the motion of a specific single water molecule is difficult to trace by conventional methods, because they average over the heterogeneous solvation structure of bulk water surrounding the protein. Here, we provide a detailed atomistic picture of the water rearrangement dynamics around the –CONH– peptide linkage in the two model systems formanilide and acetanilide, which simply differ by the presence of a methyl group at the peptide linkage. The combination of picosecond pump–probe time-resolved infrared spectroscopy and molecular dynamics simulations demonstrates that the solvation dynamics at the molecular level is strongly influenced by this small structural difference. The effective timescales for solvent migration triggered by ionization are mainly controlled by the efficiency of the kinetic energy redistribution rather than the shape of the potential energy surface. This approach provides a fundamental understanding of protein hydration and may help to design functional molecules in solution with tailored properties. KW - hydration dynamics KW - trans-formanilide KW - water migration KW - protein hydration KW - infrared-spectra Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159483 UR - http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/cp/c7cp03992a N1 - Submitted version ER - TY - THES A1 - Zieschang, Fabian T1 - Energy and Electron Transfer Studies of Triarylamine-based Dendrimers and Cascades T1 - Energie- und Elektron-Transfer Studien von triarylamin-basierten Dendrimeren und Kaskaden N2 - In this work the synthesis of dendritic macromolecules and small redox cascades was reported and studies of their energy and electron transfer properties discussed. The chromophores in the dendrimers and the redox cascades are linked via triazoles, which were built up by CuAAC. Thereby, a synthetic concept based on building blocks was implemented, which allowed the exchange of all basic components. Resulting structures include dendrimers composed exclusively of TAAs (G1–G3), dendrimers with an incorporated spirobifluorene core (spiro-G1 and spiro-G2) and the donor-acceptor dendrimer D-A-G1, in which the terminal groups are exchanged by NDIs. Furthermore, a series of model compounds was synthesised in order to achieve a better understanding of the photophysical processes in the dendrimers. A modification of the synthetic concept for dendrimers enabled the synthesis of a series of donor-acceptor triads (T-Me, T-Cl and T-CN) consisting of two TAA donors and one NDI acceptor unit. The intermediate TAA chromophore ensured a downhill redox gradient from the NDI to the terminal TAA, which was proved by cyclic voltammetry measurements. The redox potential of the intermediate TAA was adjusted by different redox determining substituents in the “free” p-position of the TAA. Additionally, two dyads (Da and Db) were synthesised which differ in the junction of the triazole to the TAA or the NDI, respectively. In these cascades a nodal-plane along the N-N-axes in the NDI and a large twist angle between the NDI and the N-aryl substituent guaranteed a small electronic coupling. The photophysical investigations of the dendrimers focused on the homo-energy transfer properties in the TAA dendrimers G1–G3. Steady-state emission spectroscopy revealed that the emission takes place from a charge transfer state. The polar excited state resulted in a strong Stokes shift of the emission, which in turn led to a small spectral overlap integral between the absorption of the acceptor and the emission of the donor in the solvent relaxed state. According to the Förster theory, the overlap integral strongly determines the energy transfer rate. Fluorescence up-conversion measurements showed a strong and rapid initial fluorescence anisotropy decay and a much slower decrease on the longer time scale. The experiment revealed a fast energy transfer in the first 2 ps followed by a much slower energy hopping. Time resolved emission spectra (TRES) of the model compound M indicated a solvent relaxation on the same time scale as the fast energy transfer. The Förster estimation of energy transfer rates in G1 explains fast energy transfer in the vibrotionally relaxed state before solvent relaxation starts. Thereby, the emission spectrum of G1 in cyclohexane served as the time zero spectrum. Thus, solvent relaxation and fast energy transfer compete in the first two ps after excitation and it is crucial to discriminate between energy transfer in the Franck-Condon and in the solvent relaxed state. Furthermore, this finding demonstrates that fast energy transfer occurs even in charge transfer systems where a large Stokes shift prevents an effective spectral overlap integral if there is a sufficient overlap integral in before solvent relaxation. Energy transfer upon excitation was also observed in the spiro dendrimers spiro-G1 and spiro-G2 and identified by steady-state emission anisotropy measurements. It was assumed that the energy in spiro-G1 is completely distributed over the entire molecule while the energy in spiro-G2 is probably distributed over only one individual branch. This finding was based on a more polarised emission of spiro-G2 compared to spiro-G1. This issue has to be ascertained by e.g. time resolved emission anisotropy measurements in further energy transfer studies. Concerning the electron transfer properties of TAA-triazole systems the radical cations of G1–G2, spiro-G1 and spiro-G2 and of the model compound M were investigated by steady-state absorption spectroscopy. Experiments showed that the triazole bridge exhibits small electronic communication between the adjacent chromophores but still possesses sufficient electronic coupling to allow an effective electron transfer from one chromophore to the other. Due to the high density of chromophores, their D-A-D structure and their superficial centrosymmetry, the presented dendrimers are prospective candidates for two-photon absorption applications. The dyads, triads and the donor-acceptor dendrimer D-A-G1 were investigated regarding their photoinduced electron transfer properties and the effects that dominate charge separation and charge recombination in these systems. The steady-state absorption spectra of all cascades elucidated a superposition of the absorption characteristics of the individual subunits and spectra indicated that the chromophores do not interact in the electronic ground state. Time resolved transient absorption spectroscopy of the cascades was performed in the fs- and ns-time regime in MeCN and toluene as solvent. Measurements revealed that upon with 28200 cm-1 (355) nm and 26300 cm-1 (380 nm), respectively, an electron is transferred from the TAA towards the NDI unit yielding a CS state. In the triads at first a CS1 state is populated, in which the NDI is reduced and the intermediate TAA1 is oxidised. Subsequently, an additional electron transfer from the terminal TAA2 to TAA1 led to the fully CS2 state. Fully CS states of the dyads and triads exhibit lifetimes in the ns-time regime. In contrast for Db in MeCN, a lifetime of 43 ps was observed for the CS state together with the population of a 3NDI state. The signals of the other CS states decay biexponentially, which is a result of the presence of the 1CS and the 3CS states. While magnetic field dependent measurements of Db did not show an effect due to the large singlet-triplet splitting, T-CN exhibited a strong magnetic field dependence which is an evidence for the 1CS/3CS assignment. Further analysis of the singlet-triplet dynamics are required and are currently in progress. Charge recombination occurred in the Marcus inverted region for compounds solved in toluene and in the Marcus normal region for MeCN as solvent. However, a significant inverted region effect was observed only for Db. Triads are probably characterised by charge recombination rates in the inverted and in the normal region near to the vertex of the Marcus parabola. Hence the inverted region effect is not pronounced and the rate charge recombination rates are all in the same magnitude. However, compared to the charge recombination rate of Db the enlarged spatial distance between the terminal TAA and the NDI in the fully CS2 states in the triads resulted in reduced charge recombination rates by ca. one order of magnitude. More important than a small charge recombination rate is an overall lifetime of the CS states and this lifetime can significantly be enhanced by the population of the 3CS state. The reported results reveal that a larger singlet-triplet splitting in the dyads led to a CS state lifetime in the us time regime while a lifetime in the ns-time regime was observed in cases of the triads. Moreover, the singlet-triplet splitting was found to be solvent dependent in the triads, which is a promising starting point for further investigations concerning singlet-triplet splitting. The donor-acceptor dendrimer D-A-G1 showed similar characteristics to the dyads. The generation of a CS state is assumed due to a clear NDI radical anion band in the transient absorption spectrum. Noteworthy, the typical transient absorption band of the TAA radical cation is absent for D A-G1 in toluene. Bixon-Jortner analysis yielded a similar electronic coupling in D-A-G1 compared to the dyads. However, the charge recombination rate is smaller than of Db due to a more energetic CS state, which in the inverted region slows down charge recombination. In combination a singlet-triplet splitting similar to the dyads prolongs the CS state lifetime up to 14 us in diluted solution. Both effects result in an even better performance of D-A-G1 concerning energy conversion. D A-G1 is therefore a promising key structure for further studies on light harvesting applications. In a prospective study a second generation donor-acceptor dendrimer D-A-G2 might be an attractive structure accessible by “click reaction” of 13 and 8. D-A-G2 is expected to exhibit a downhill oriented gradient of CS states as assumed from the CV studies on G1–G3. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Synthese sowohl von dendritischen Makromolekülen als auch von kleineren Donor-Akzeptor-Systemen realisiert. Des Weiteren wurden diese Verbindungen bezüglich ihrer Energie- und Elektron-Transfer-Eigenschaften untersucht. In allen untersuchten Systemen wurden die eingebauten Chromophore durch Triazole miteinander verknüpft. Dabei sind die Triazole das Ergebnis einer Kupfer(I)-katalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition zwischen einem terminalen Alkin und einem Azid. Für die Darstellung der vorgestellten Verbindungen wurde ein synthetisches Konzept auf der Basis von molekularen Bausteinen entwickelt, das den Austausch aller elementaren Komponenten ermöglicht. Die so erhaltenen Systeme bestehen aus Dendrimeren, die auschließlich aus Triarylaminen (TAA) aufgebaut sind (G1-G3), Dendrimeren mit einem Spirobifluoren-Gerüst als Kern (spiro-G1 und spiro-G2) und dem Donor-Akzeptor Dendrimer (D-A-G1), in dem Naphthalindiimid-Akzeptoren (NDI) als Endgruppen fungieren. Zusätzlich wurde eine Reihe von Modellverbindung verwirklicht, um mit ihrer Hilfe ein besseres Verständnis der photophysikalischen Prozesse in den Dendrimeren zu erlangen. Durch eine Modifikation des synthetischen Baukastensystems, welches den Zugang zu den Dendrimeren ermöglichte, wurde außerdem die Darstellung einer Reihe von Donor-Akzeptor-Triaden (T-Me, T-Cl und T-CN) verwirklicht. Diese Triaden bestehen dabei aus zwei TAA-Donoren und einem NDI-Akzeptor. Mit Hilfe der Cyclovoltammetrie konnte ein abwärtsgerichteter Redoxgradient vom NDI zum endständigen TAA in den Triaden bestätigt werden. Realisiert wurde dieser Redoxgradient, indem das Redoxpotential des mittleren TAAs durch geeignete Substitutenten in der „freien” p-Position des TAAs gezielt beeinflusst wurde. Des Weiteren wurden zwei Dyaden (Da und Db) synthetisiert, die sich nur in der Verknüpfung des TAAs bzw. des NDIs an das Triazol unterscheiden. In all diesen Kaskaden sorgen sowohl eine Knotenebene entlang der N-N-Achse des NDIs als auch ein großer Verdrillungswinkel zwischen dem NDI Kerngerüst und dem N-Arylsubstituenten für eine kleine elektronische Kopplung. Bei den Untersuchungen der photophysikalischen Eigenschaften der Dendrimere lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der TAA-Dendrimere G1-G3 bezüglich ihrer Homo-Energie-Transfer-Eigenschaften. Die Beobachtung eines starken Stokes Shifts in der Fluoreszenz dieser Makromoleküle ist das Ergbnis einer Emission aus einem polaren Ladungs-Transfer-Zustand und einer großen Reorganisationsenergie l. Dadurch gibt es im Lösungsmittel-relaxierten Zustand nur ein kleines Überlapp-Integral zwischen der Absorption des Akzeptors und der Emission des Donors. Gerade dieses Überlapp-Integral bestimmt gemäß der Förster-Theorie maßgeblich die Geschwindigkeitskontante des Energie-Transfers. In Untersuchungen auf der Basis der Fluoreszenz-Aufkonversion wurde eine starke und schnelle Abnahme der Anfangsfluoreszenzanisotropie beobachtet, gefolgt von einem deutlich langsameren Abfall auf der längeren Zeitskala. Demnach kommt es zunächst zu einem schnellen Energie-Transfer in den ersten 2 ps nach der Anregung und anschließend zu einem langsameren Energie-Hüpfen. Zeitaufgelöster Emissionsspektren (TRES) der Modellverbindung M haben gezwigt, dass die Lösungsmittel-Relaxation auf derselben Zeitskala wie der schnelle Energie-Transfer stattfindet. Nach einer Abschätzung der Geschwindigkeitskonstanten für den Energie-Transfer in G1 auf Grundlage der Förster-Theorie findet der schnelle Energie-Transfer im Schwingungs-relaxierten Zustand statt, noch bevor die Lösungsmittel-Relaxation beginnt. Für diese Abschätzung wurde ein Fluorezenzspektrum von G1 in Cyclohexan als Spektrum zum Zeitnullpunkt verwendet. Der Analyse zur Folge konkurrieren in den ersten 2 ps nach der Anregung sowohl die Lösungsmittel-Relaxation als auch der schnelle Energie-Transfer-Prozess miteinander. Daher ist es unerlässlich zwischen dem Energie-Transfer im Franck-Condon- und im Lösungsmittel-relaxierten Zustand zu unterscheiden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein schneller Energie-Transfer auch in Ladungs-Transfer-Systemen möglich ist, in denen ein großer Stokes Shift einen effektiven spektralen Überlapp verhindert, wenn ein ausreichend großer spektraler Überlapp vor der Lösungsmittel-Relaxation vorliegt. Auch in den Spiro-Dendrimeren spiro-G1 und spiro-G2 konnte ein Energie-Transfer nach der Anregung mit Hilfe von stationären Emissions-Anisotropie-Experimenten beobachtet werden. Dabei wurde angenommen, dass die Anregungsenergie in spiro-G1 über das gesammte Molekül verteilt ist. Eine stärker polarisierte Fluoreszenz in spiro-G2 im Vergleich zu spiro-G1 legt den Schluss nahe, dass die Energie in spiro-G2 wahrscheinlich nur über einen einzelnen Ast verteilt ist. Um dieser Fragestellung nachzugehen sind allerdings weiter Untersuchungen der Energie-Transfer-Prozesse durch z.B. zeitaufgelöste Emissions-Anisotropie-Messungen notwendig. Zudem wurden stationäre Absorptionsspektroskopie-Messungen an den Radikal-Kationen von G1-G2, spiro-G1 und spiro-G2 und M durchgeführt, um die Elektron-Transfer-Eigenschaften von TAA-Triazol-Systemen zu untersuchen. Laut dieser Messungen erlaubt die Verwendung von Triazolen als Brückeneinheit in den Verbindungen in denen Elektron-Transfer-Prozesse untersucht wurden nur eine geringe elektronische Kommunikation zwischen den verknüpften Redox-Zentren. Allerdings ist die elektronische Kopplung genügend groß, um einen effektiven Elektronen-Transfer zwischen den Zentren zu ermöglichen. Sowohl die Dyaden (Da und Db) und Triaden (T-Me, T-Cl und T-CN) als auch das Donor-Akzeptor Dendrimer D-A-G1 wurden in Bezug auf ihre Eigenschaften in photoinduzierten Elektron-Transfer-Prozessen untersucht, insbesondere die Faktoren, die die Prozesse von Ladungsseparation und Ladungsrekombination beeinflussen. Der stationären Absorptionspektroskopie zur Foelge stellen die Absorptionsspekten der Kaskaden eine Superposition der Absorptionsspektren der einzelnen Chromophore dar. Demnach wechselwirken die einzelnen Chromophore in den Kaskaden im elektronischen Grundzustand nicht miteinander. Des Weiteren wurden für die Kaskaden zeitaufgelöste ns- und fs-transiente Absorptionsspektroskopie-Messungen in Toluol und MeCN als Lösungsmittel durchgeführt. Diese Messungen zeigten, dass der Anregung bei einer Energie von 28200 cm-1 (355 nm) beziehungsweise 26300 cm-1 (380 nm) ein Elektron-Transfer vom TAA zum NDI folgt und ein ladungsgetrennter (CS) Zustand gebildet wird. Dabei wird in den Triaden zunächst ein ladungsgetrennter (CS1) Zustand populiert, in dem das NDI reduziert und das mittlere TAA oxidiert vorliegt. Nachfolgend wird duch einen zusätzlichen Elektronen-Transfer vom endständigen TAA zum mittleren TAA der CS2-Zustand generiert. Die energetisch niedrigsten CS-Zustände sowohl der Triaden als auch der Dyaden weisen Lebenzeiten auf der ns-Zeitskala auf. Im Gegensatz dazu besitzt der CS-Zustand von Db in MeCN nur eine Lebenszeit von etwa 43 ps auf. Zudem konnte hier die Bildung eines 3NDI-Zustands beobachtet werden. Alle anderen CS Zustände zeigen einen biexpontiellen Abfall, als Folge der Ausbildung sowohl eines 1CS- als auch eines 3CS-Zustands. In magnetfeld-abhängigen Messungen wurde für Db kein nennenswerter Effekt beobacht, was auf eine große Singulett-Triplett-Aufspaltung in den Dyaden zurückzuführen ist. Die Triaden besitzen eine deutlich kleinere Singulett-Triplett-Aufspaltung. Daher zeigte T-CN eine starke Abhängigkeit vom angelegten Magnetfeld, was zudem ein Beleg für die 1CS/3CS Zuordung darstellt. An dieser Stelle sind weitere Analysen der Singlet-Triplett-Dynamiken notwendig, die gegenwärtig durchgeführt werden. Die Ladungsrekombination findet für alle Systeme in Toluol in der Marcus invertierten Region und in MeCN in der Marcus normalen Region statt. Allerdings konnte nur für Db ein ausgeprägter invertierte Region-Effekt beobachtet werden. In den Triaden sind die Geschwindigkeitskonstanten für die Ladungsrekombination in der normalen und in der invertierten Region wahrscheinlich nah am Scheitelpunkt der Marcus Parabel. Somit ist der invertierte Region-Effekt bei ihnen nur sehr gering ausgeprägt und die Geschwindigkeitskonstanten für die Ladungsrekombination befinden sich in derselben Größenordnung. Im Vergleich mit den Geschwindigkeitskonstanten für die Ladungsrekombination von Db führt die größere räumliche Distanz der beiden Ladungen im CS2-Zustand in den Triaden zu verringerten Geschwindigkeitskonstanten für die Ladungsrekombination von ca. einer Größenordnung. Allerdings ist die Gesamtlebensdauer der CS-Zustände wichtiger als eine kleine Geschwindigkeitskonstante für die Ladungsrekombination. Gerade diese Lebensdauer kann maßgeblich durch die Population des 3CS-Zustandes verlängert werden. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die größere Singulett-Triplett-Aufspaltung in den Dyaden zu einer Lebensdauer des CS-Zustands von mehreren us führt, während sich die Lebensdauern der CS-Zustände in den Triaden im ns-Zeitbereich befinden. Des Weiteren konnte eine Lösungsmittelabhängigkeit der Singulett-Triplett-Aufspaltung in den Triaden beobachtet werden. Dies stellt einen vielversprechenden Ansatzpunkt für weitere Studien bezüglich der Singulett-Triplett-Aufspaltung dar. Das Donor-Akzeptor-Dendrimer D-A-G1 zeigt ähnliche Eigenschaften wie die beiden Dyaden (Da und Db). Durch das deutliche Auftreten einer NDI-Radikal-Anion-Bande im transienten Absorptionsspektrum kann auch nach der Anregung von D-A-G1 die Bildung eines CS-Zustandes angenommen werden. Bemerkenswerterweise wurde die transiente Absorptionsbande des TAA-Radikal-Kation für D A G1 in Toluol nicht beobachtet. Eine Bixon-Jortner-Analyse lieferte eine elektronische Kopplung für D-A-G1, die der für die Dyaden (Da und Db) vergleichbar ist. Durch einen energetisch höherliegenden CS-Zustand in D-A-G1, der die Ladungsrekombination in der invertierten Region verlangsamt, ist die Geschwindigkeitskonstante für die Ladungsrekombination bei D-A-G1 kleiner als bei Db. In Kombination mit einer Singulett-Triplett-Aufspaltung vergleichbar mit der, der Dyaden, führt dies zu einer verlängerten Lebensdauer des CS-Zustands bis zu 14 us in verdünnter Lösung. Beide Charakteristiken führen zu verbesserten Eigenschaften von D A-G1 hinsichtlich einer möglichen Verwendung als System für die Energieumwandlung von Sonnenlicht. Daher stellt D-A-G1 eine vielversprechende Leitstruktur für weitere Untersuchungen bezüglich Lichtsammelsysteme dar. In einer zukünftigen Studie könnte das Donor-Akzteptor-Dendrimer zweiter Generation D-A-G2 von Interesse sein. Synthetisch wäre es über eine “Click-Reaktion” zwischen 13 und 8 realisierbar. Den cyclovoltammetrischen Untersuchungen von G1-G3 zur Folge, sollte in D-A-G2 ein abwährtsgerichteter Gradient an CS Zuständen vorliegen. KW - Sternpolymere KW - Triarylamine KW - Dendrimers KW - Energy Transfer KW - Electron Transfer KW - Transient Absorption KW - Fluorescence Upconversion KW - Dendrimere KW - Energie-Transfer KW - Elektron-Transfer KW - Transiente Absorption KW - Fluoreszenz Aufkonversion KW - Donorgruppe KW - Akzeptorgruppe KW - Elektronentransfer KW - Cascades KW - Kaskaden Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101866 ER -