TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Brändle, E.
A1  - Zbinden, G.
T1  - Effect of gum Arabic on aminopyrine demethylation in rats
N2  - Stimulation of aminopyrine demethylation induced in rats by oral or i.p. administration of phenobarbital was partially inhibited in animals receiving daily treatments of 2 x 200 mg/kg gum Arabic p.o.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61146
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Böser, S.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Schwabe, U.
T1  - Affinities of barbiturates for the GABA-receptor complex and A\(_1\) adenosine receptors: A possible explanation of their excitatory effects
N2  - The effects of barbiturates on the GABA·receptor complex and the A\(_1\) adenosine receptor were studied. At the GABA-receptor complex the barbiturates inhibited the binding of [\(^{35}\)S]t-butylbicyclophosphorothionate [\(^{35}\)S]TBPT) and enhanced the binding of [\(^3\)H]diazepam. Kinetic and saturation experiments showed that both effects were allosteric. Whereas all barbiturates caused complete inhibition of [\(^{35}\)S]TBPT binding, they showed varying degrees of maximal enhancement of [\(^3\)H]diazepam binding; (±)methohexital was idenafied as the most efficacious compound for this enhancement. At the A\(_1\) adenosine receptor all barbiturates inhibited the binding of [\(^3\)H]N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (\(^3\)H]PIA) in a competitive manner. The comparison of the effects on [\(^3\)H]diazepam and [\(^3\)H]PIA binding showed that excitatory barbiturates interact preferentially with the A\(_1\) adenosine receptor, and sedative/anaesthetic barbiturates with the GABA-receptor complex. It is speculated that the interaction with these two receptors might be the basis of the excitatory versus sedative/ anaesthetic properties of barbiturates.
KW  - Toxikologie
KW  - GABA-receptor complex
KW  - Adenosine receptors
KW  - Barbiturates
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60250
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Elger, B.
A1  - Lindenborn-Fotinos, J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Schwabe, U.
T1  - Separation of solubilized A\(_2\) adenosine receptors of human platelets from non-receptor [\(^3\)H]NECA binding sites by gel filtration
N2  - Human platelet membranes were solubilized with the zwitterionic detergent CHAPS (3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]- 1-propanesulfonate) and the solubilized extract subjected to gel ftltration. Binding of the adenosine receptor agonist [\(^3\)H]NECA (5'-N-ethylcarboxamidoadenosine) was measured to the eluted fractions. Two [\(^3\)H]NECA binding peaks were eluted, the first of them with the void volume. This first peak represented between 10% and 25% of the [\(^3\)H]NECA binding activity eluted from the column. It bound [\(^3\)H]NECA in a reversible, saturable and GTPdependent manner with an affinity of 46 nmol/1 and a binding capacity of 510 fmol/mg protein. Various adenosine receptor ligands competed for the binding of [\(^3\)H]NECA to the frrst peak with a pharmacological proftle characteristic for the A\(_2\) adenosine receptor as determined from adenylate cyclase experiments. In contrast, most adenosine receptor ligands did not compete for [\(^3\)H]NECA binding to the second, major peak. These results suggest that a solubilized A\(_2\) receptor-Gs protein complex of human platelets can be separated from other [\(^3\)H]NECA binding sites by gel filtration. This allows reliable radioligand binding studies of the A2 adenosine receptor of human plate1ets.
KW  - Toxikologie
KW  - A<sub>2</sub> Adenosine receptor
KW  - Human platelets
KW  - Radioligand binding
KW  - Adenylate cyclase
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60309
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Cristalli, G.
A1  - Franchetti, P.
A1  - Grifantini, M.
A1  - Vittori, S.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
T1  - Adenosine receptor agonists: Synthesis and biological evaluation of 1-deaza analogues of adenosine
N2  - In a search for more selective A\(_1\) adenosine receptor agonists, N\(^6\)-[(R)-(-)-1-methyl-2-phenethyl]-1-deazaadenosine (1-deaza-R-PIA, 3a), N\(^6\)-cyclopentyl-1-deazaadenosine (1-deazaCPA, 3b), N\(^6\)-cyclohexyl-l-deazaadenosine (1-deazaCHA, Sc), and the corresponding 2-chloro derivatives 2a-c were synthesized from 5,7-dichloro-3-ß-D-ribofuranosyl-3Himidazo[ 4,5-b]pyridine (1). On the other band, N-ethyl-1'-deoxy-1'-(1-deaza-6-amino-9H-purin-9-yl)-ß-D-ribofuranuronamide (1-deazaNECA, 10) was prepared from 7-nitro-3-ß-D-ribofuranosyl-3H-imidazo[4,5-b]pyridine (4), in an attempt to find a more selective A\(_2\) agonist. The activity of all deaza analogues at adenosine receptors has been determined in adenylate cyclase andin radioligand binding studies. 1-DeazaNECA (10) proved tobe a nonselective agonist at both subtypes of the adenosine receptor. It is about 10-fold less active than NECA but clearly more active than the parent compound 1-deazaadenosine as an inhibitor of platelet aggregation and as a stimulator of cyclic AMP accumulation. The N\(^6\)-substituted 1-deazaadenosines largely retain the A\(_1\) agonist activity of their parent compounds, but lose some of their A\(_2\) agonist activity. This results in A\(_1\)-selective compounds, of which N\(^6\)cyclopentyl- 2-chloro-1-deazaadenosine (1-deaza-2-Cl-CPA, 2b) was identified as the most selective agonist at A\(_1\) adenosine receptors so far known. The activity of all 1-deaza analogues confirms that the presence of the nitrogen atom at position 1 of the purine ring is not critical for A\(_1\) receptor mediated adenosine actions.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60262
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Schwabe, U.
A1  - Cristalli, G.
A1  - Vittori, S.
A1  - Grifantini, M.
T1  - 2-Chloro-N\(^6\)-cyclopentyladenosine: a highly selective agonist at A\(_1\) adenosine receptors
N2  - 2-Chloro-N\(^6\)-cyclopentyladenosine (CCPA) was synthesized as a potential high affinity ligand for At adenosine receptors. Binding of [\(^3\)H]PIA to A1 receptors of rat brain membranes was inhibited by CCP A with a Ki-value of 0.4 nM, compared to a Ki-value of 0.8 nM for the parent compound N\(^6\)-cyclopentyladenosine (CPA). Binding of [\(^3\)H]NECA to A\(_2\) receptors of rat striatal membranes was inhibited with a Ki-value of 3900 nM, demonstrating an almost 10,000-fold A\(_1\)-selectivity of CCPA. CCP A inhibited the activity of rat fat cell membrane adenylate cyclase, a model for the A\(_1\) receptor, with an IC\(_{50}\)-value of 33 nM, and it stimulated the adenylate cyclase activity of human platelet membranes with an EC\(_{50}\)-value of 3500 nM. The more than 100-fold A\(_1\)-selectivity compares favourably with a 38-fold selectivity of CPA. Thus, CCPA is an agonist at A\(_1\) adenosine receptors with a 4-fold higher selectivity and 2-fold higher affinity than CPA, and a considerably higher selectivity than the standard At receptor agonist R-N\(^6\) -phenylisopropyladenosine (R-PIA). CCP A represents the agonist with the highest selectivity for A\(_1\) receptors reported so far.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Adenylate cyclase
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60279
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Diekmann, E.
A1  - Friedrich, K.
A1  - Schwabe, U.
T1  - 2',3'-Dideoxy-N\(^6\)-cyclohexyladenosine: an adenosine derivative with antagonist properties at adenosine receptors
N2  - Tbe 2',3'-dideoxy analogue of the potent A\(_1\) receptor agonist, N\(^6\)-cyclohexyladenosine (CHA), was synthesized as a potential antagonist for the A\(_1\) adenosine receptor. In sturlies on adenylate cyclase 2',3'-dideoxy-N\(^6\)-cyclohexyladenosine (ddCHA) did not show agonist properties at A\(_1\) or at A\(_2\) receptors. However, it antagonized the inhibition by R-PIA of adenylate cyclase activity of fat cell membranes via A\(_1\) receptors with a K\(_i\) value of 13 \(\mu\)M. ddCHA competed for the binding of the selective A1 receptor antagonist, [\(^3\) HJ8-cyclopentyl-1,3-dipropylxantbine ([\(^3\)H]DPCPX), to rat brain membranes with a K\(_i\) value of 4.8 \(\mu\)M; GTP did not affect the competition curve. In contrast to the marked stereoselectivity of the A\(_1\) receptor for the cx- and the natural ß-anomer of adenosine, the cx-anomer of ddCHA showed a comparable affinity for the A\(_1\) receptor (K\(_i\) value 13.9 \8\mu\)M). These data indicate that the 2'- and 3'-hydroxy groups of adenosine and its derivatives are required foragonist activity at and high affinity binding to A\(_1\) adenosine receptors and for the distinction between the cx- and ß-forms.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Adenylate cyclase
KW  - Adenosine receptor antagonists
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60282
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Chemical modification of A\(_1\) adenosine receptors in rat brain membranes - evidence for histidine in different domains of the ligand binding site
N2  - Chemical modification of amino acid residues was used to probe the ligand recognition site of A\(_1\) adenosine receptors from rat brain membranes. The effect of treatment with group·specific reagents on agonist and antagonist radioligand binding was investigated. The histidine-specific reagent diethylpyrocarbonate (DEP) induced a loss of binding of the agonist R-N\(^6\)-[\(^3\)H]phenylisopropyladenosine ([\(^3\)H]PIA), which could be prevented in part by agonists, but not by antagonists. DEP treatment induced also a loss of binding of the antagonist [\(^3\)H]8- cyclopentyl-1 ,3-dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX). Antagonists protected A\(_1\) receptors from this inactivation while agonists did not. This result provided evidence for the existence of at least 2 different histidine residues involved in ligand binding. Consistent with a modification of the binding site, DEP did not alter the affinity of [\(^3\)H]DPCPX, but reduced receptor number. From the selective protection of [\(^3\)H] PIA and [\(^3\)H]DPCPX binding from inactivation, it is concluded that agonists and antagonists oocupy different domains at the binding site. Sulfhydryl modifying reagents did not influence antagonist binding, but inhibited agonist binding. This effect is explained by modification of tbe inhibitory guanine nucleotide binding protein. Pyridoxal 5-phosphate inactivated both [\(^3\)H]PIA and [\(^3\)H]DPCPX binding, but the receptors could not be protected from inactivation by ligands. Therefore, no amino group seems to be located at the Iigand binding site. In addition, it was shown that no further amino acids witb polar side chains are present. The absence of bydrophilic amino acids frout the recognition site of the receptor apart from histidine suggests an explanation for the lack of hydrophilic ligands with high affinity for A\(_1\) receptors.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60295
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Reddington, M.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Hietel, B.
T1  - Radiation inactivation analysis of the A\(_1\) adenosine receptor: decrease in radiation inactivation size in the presence of guanine nucleotide
N2  - Radiation inactivation analysis of the binding of the A1 adenosine receptor antagonist, 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine to rat brain membranes yielded a radiation inactivation size of 58 kDa. In the presence of GTPyS this was reduced to 33 kDa, in good agreement with the size of the ligand-binding subunit detected after photoaffinity labelling. The data indicate that the structural association of A\(_1\) adenosine receptors with G-protein components is altered in situ in the presence of guanine nucleotides.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptor
KW  - A1
KW  - Radiation inactivation
KW  - Target size
KW  - G-protein
KW  - (Rat brain membrane)
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60318
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Maier, P.
T1  - Genotoxic and epigenetic chemical carcinogenesis: one process, different mechanisms
N2  - Chemieals that induce cancer in an intact organism are called carcinogens. This term does not differentiale between their various modes of action. In this review, Werner Lutz and Peter Maier make a mechanistic distinction between carcinogens that alter the genetic information and carcinogens that interfere with epigenetic processes. They considercardnogenesis tobe an ongoing, part1y unavoidable process which is based on a succession of mutations, most likely in stem cells, leading to autonomaus cellular growth regulation. Chemical carcinogens either induce such changes through mutations (genotoxic carcinogens) or they aceeierate the accumulation of critica1 spontaneaus mut11tions (epigenetic carcinogens). Examples are given for both classes of carcinogens, and for the processes that act at genoto:tic/nuclear 11nd epigenetic/mitotic Ievels.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60884
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Deuber, R.
A1  - Caviezel, M.
A1  - Sagelsdorff, P.
A1  - Friederich, U.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Trenbolone growth promotant: covalent DNA binding in rat liver and in Salmonella typhimurium, and mutagenicity in the Ames test
N2  - DNA binding in vivo: (6,7-\(^3\)H]ß-trenbolone (ß-TBOH) was administered p.o. and i.p. to rats. After 8 or 16 h, DNA was isolated from the livers and purified to constant specific radioactivity. Enzymatic digestion to deoxyribonucleotides and separation by HPLC revealed about 90% ofthe DNA radioactivity eluting in the form of possible TBOH-nucleotide adducts. The extent of this genotoxicity, expressed in units of the Covalent Binding Index, CBI = (~mol TBOH bound per mol nucleotide)/(mmol TBOH administered per kg body weight) spanned from 8 t~ 17, i. e. was in the range found with weak genotoxic carcmogens. Ames test: low doses of ß-TBOH increased the number of revertants in Salmonella strain TAl 00 reproducibly and m a dose-dependent manner. The mutagenic potency was 0.2 revertants per nmol after preincubation of the bacteria (20 min at 37° C) with doses between 30 and 60 \(\mu\)g per plate (47 and 94 \(\mu\)g/ml preincubation mixture). Above this dose, the number of revertants decreased to control values, accompanied by a reduction in survival. The addition of rat liver S9 inhibited the mutagenicity. DNA binding in vitro: calf thymus DNA was incubated with tritiated ß-TBOH with and without rat liver S9 Highest DNA radioactivities were determined in the absence of the "activation" system. Addition of inactive S9 (without cofactors) reduced the DNA binding by a factor of up to 20. Intermediate results were found with active S9. DNA binding in Salmonella: ß-TBOH was irreversibly bound to DNA isolated from S. typhimurium TA100 after incubation of bacteria with [\(^3\)H]ß-TBOH. Conclusions: Covalent DNA binding appears to be the mechanism of an activation-independent ("direct") mutagenicity of TBOH which is not easily detected because of the bactericidal activity. The genotoxicity risk arising from exposure of humans to trenbolone residues in meat was estimated using the in vivo data and compared to that from the exposure to unavoidable genotoxins aflatoxin B1 and dimethylnitrosamine. It ts concluded that trenbolone residues represent only a low genotoxic risk.
KW  - Toxikologie
KW  - Trenbolone
KW  - Anabolieagent
KW  - DNA binding
KW  - Genotoxicity
KW  - Ames test
KW  - Salmonella typhimurium
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60897
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Büsser, M. T.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Stimulation of DNA synthesis in rat and mouse liver by various tumor promoters
N2  - In order to investigate whether the Stimulation of liver DNA synthesis might be used to detect one class of hepatic tumor promoters, the incorporation of orally administered radiolabelled thymidine into liver DNA was detennined in rats and mice 24 h after a single oral gavage of test compounds at various dose Ievels. Three DNA-binding hepatocarcinogens, aflatoxin B1; benzidine and carbon tetrachloride, did not stimulate but rather inhibited DNA synthesis (not for CCla). Four hepatic tumor promoters, clofibrate, DDT, phenobarbital and thioacetamide, gave rise to a Stimulation in a dosedependent manner. Single oral doses between 0.02 and 0.3 mmol/kg were required to double the level of thymidine incorporation into liver DNA (= doubling dose, DD). Differentes between species or sex as obsprved in long-term carcinogenicity studies were reflected by a different stimulation of liver DNA synthesis. In agreement with the bioassay data, aldrin was positive only in male mice (DD = 0.007 mmol/kg) but not in male rats or female mice. 2,3, 7,8-TCDD was positive in male mice (DD = 10\(^{-6}\) mmol/kg) andin female rats (DD = 2 x 10\(^{-6}\) mmol/kg) but not in male rats. The assay was also able to distinguish between structural isomers with different carcinogenicities. [alpha]Hexachlorocyclohexane stimulated Iiver DNA synthesis with a doubling dose of about 0.2 mmol/kg in male rats whereas the [gamma]isomer was ineffective even at l mmol/kg. So far, only one result was inconsistent with carcinogenicity bioassay data. The different carcinogenicity of di(2-ethylhexyl)adipate (negative in rats) and di(2-ethylhe.xyl)phthalate (positive) was not detectable. 8oth plasticizers were positive in.this short-term system with DD's of 0. 7 mmol/kg for DEHA and 0.5 mmol/kg for DEHP. The proposed assay is discussed as an attempt to devise short-term assays for carcinogens not detected by the routine genotoxicity test systems.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60908
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Bösch, R.
A1  - Friederich, U.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Brocker, E.
A1  - Bachmann, M.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Investigations on DNA binding in rat liver and in Salmonella and on mutagenicity in the Ames test by emodin, a natural anthraquinone
N2  - Emodin (1,6,8-trihydroxy-3-methylanthraquinone), an important aglycone found in natural anthraquinone glycosides frequently used in Iaxative drugs, was mutagenic in the Salmonellajmammalian microsome assay (Ames test) with a specificity for strain TA1537. The mutagenic activity was activationdependent with an optimal amount of S9 from Aroclor 1254-treated male Sprague-Dawley rats of 20% in the S9 mix (v jv) for 10 p.g emodin per plate. Heat inactivation of the S9 for 30 min at 60 ° C prevented mutagenicity. The addition of the cytochrome P-448 inhibitor 7,8-benzoflavone (18.5 nmoles per plate) reduced the mutagenic activity of 5.0 p.g emodin per plate to about one third, whereas the P-450 inhibitor metyrapone (up to 1850 nmoles per plate) was without effect. To test whether a metabolite" binds covalently to Salmonella DNA, [10-\(^{14}\)C]emodin was radiosynthesized, large batches of bacteria were incubated with [10-\(^{14}\)C]emodin and DNA was isolated. [G- \(^{3}\)H]Aflatoxin B1 (AFB1) was used as a positive control mutagen known to act via DNA binding. DNA obtained after aflatoxin treatment could be purified to constant specific activity. With emodin, the specific activity of DNA did not remain constant after repeated precipitations so that it is unlikely that the mutagenicity of emodin is due to covalent interaction of a metabolite with DNA. The antioxidants vitamin C and E or glutathione did not reduce the mutagenicity. Emodin was also negative with strain TA102. Thus, oxygen radicals are probably not involved. When emodin was incubated with S9 alone for up to 50 h before heat-inactivation of the enzymes and addition of bacteria, the mutagenic activity did not decrease. It is concluded that the mutagenicity of emodin is due to a chemically stable, oxidized metabolite forming physico-chemical associations with DNA, possibly of the intercalative type. In order to check whether an intact mammalian organism might be able to activate emodin to a DNA-binding metabolite, radiolabelled emodin was administered by oral gavage to male SD rats and liver DNA was isolated after 72 h. Very little radioactivity was associated with the DNA. Considering that DNA radioactivity could also be due to sources other than covalent interactions, an upper limit for the · covalent binding index, CBI = (p.moles chemical bound per moles DNA nucleotides)/(mmoles chemical administered per kg body weight) of 0.5 is deduced. This is 104 times below the CBI of AFB1. The demonstration of a lack of covalent interaction with DNA bothin Salmonellaandin rat liver is discussed in terms of a reduced hazard posed by emodin as a mutagenic drug in use in humans.
KW  - Toxikologie
KW  - DNA binding
KW  - (Rat liver)
KW  - (Salmonella)
KW  - Ames test
KW  - Emodin
KW  - Anthraquinone glycosides
KW  - natural
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60913
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Shephard, S. E.
A1  - Schlatter, C.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Assessment of the risk of formation of carcinogenic N-nitroso compounds from dietary precursors in the stomach
N2  - A literature review has shown that the daily intakes of various N -nitroso-precursor classes in a typical European diet span five orders of magnitude. Amides in the form of protein, and guanidines in the form of creatine and creatinine, are the nitrosatable groups found most abundantly in the diet, approaching Ievels of 100 g/day and 1 gjday, respectively. Approximately 100 mg of primary amines and amino acids are consumed daily, whereas aryl amines, secondary amines and ureas appear to lie in the 1-10 mg range. The ease of nitrosation of each precursor was estimated, the reactivities being found to span seven orders of magnitude, with ureas at the top and amines at the bottom of the scale. From this infonnation and an assessment of the carcinogenicity of the resulting N-nitroso derivatives, the potential health risk due to gastric in vivo nitrosation was calculated. The combined effects of these risk variables were analysed using a simple mathematical model: Risk = [daily intake of precursor] x [gastric concentration of nitrite]\(^n\) x [nitrosatability rate constant} x [carcinogenicity of derivative]. The risk estimates for the various dietary components spanned nine orders of magnitude. Dietary ureas and aromatic amines combined with a high nitrite burden could pose as great a risk as the intake of preformed dimethylnitrosamine in the diet. In contrast, the risk posed by the in vivo nitrosation of primary and secondary amines is probably negligib1y small. The risk contribution by amides (including protein), guanidines and primary amino acids is intermediate between these two extremes. Thus three priorities for future work are a comprehensive study of the sources and Ievels of arylamines and ureas in the diet, determination of the carcinogenic potencies of key nitrosated products to replace the necessarily vague categories used so far, and the development of short-term in situ tests for studying the alkylating power or genotoxicity of N-nitroso compounds too unstable for inclusion in long-term studies.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60925
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Grilli, S.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Parodi, S.
T1  - Possible implications from results of animal studies in human risk estimations for benzene: nonlinear dose-response relationship due to saturation of metabolism
N2  - To date, all risk assessment studies on benzene have been based almost exclusively on epiderniological data. Wehave attempted a more integrated and quantitative evaluation of carcinogenic risk for hurnans, trying to utilize, in addition to the epidemiological data, all data available, specifically data on metabolism, genotoxicity, and carcinogenicity in small rodents. An integrated evaluation of the globality of the available data seems to suggest a progressive saturation of metabolic capacity both for man and rodents between 10 and 100 ppm. The most susceptible target cells seem tobe different in humans (predominant induction of myelogenous leukemia) and small rodents (induction of a wide variety of tumors). Nevertheless, both epidemiological and experimental carcinogenicity data tend to indicate a flattening ofthe response for the highest dosages, again suggesting a general Saturation of mechanisms of metabolic activation, extended to different target tissues. From a quantitative point of view, the data suggest a carcinogenic potency at 10 ppm two to three times higher than that computable by a linear extrapolation from data in the 100 ppm range. These observations are in accord with the recent proposal of the European Economic Community of reducing benzene time-weighted average occupationallevels from 10 to 5 ppm.
KW  - Toxikologie
KW  - Benzene
KW  - Risk estimation
KW  - Carcinogenicity
KW  - Genotoxicity
KW  - Metabolism saturation
KW  - Dose-response relationship
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60936
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jauch, A.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Metallothionein protein variants generated in rat liver as a result of DNA and RNA ethylations by the carcinogen diethylnitrosamine
N2  - Metallothionein (MT) is a protein which contains 20 cysteine residues but no aromatic amino acids. It was tested whether treatment of male rats with the hepatocarcinogen diethylnitrosamine (DENA) could ethylate nucleic acids in such a way that protein variants containing measurable amounts of aromatic amino acid residues could be isolated from the livers of treated animals. To give a low Iimit of detection, the "wrong" amino acid precursors were administered in radiolabelled form at high Ievels of activity (7 mCi/kg each of [\(^3\)H]tyrosine and [\(^3\)H]phenylalanine). 11 \(\mu\)Ci/kg [\(^{14}\)C]cysteine was given as an intemal marker for MT biosynthesis. 6 h after amino acid administration, metallothionein (MT) was isolated from the liver and extensively purified. Afteracid hydrolysis and collection of Cys, Tyr, and Phe from an HPLC analysis of the amino acids, the \(^3\)H/\(^{14}\)C ratio was determined. The carcinogen-treated rats exhibited a significantly higher ratio than the vehicle-treated animals. This type of in vivo assay might find interesting applications in the investigation of nucleic acid alkylations as promutagenic lesions.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60946
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Investigation of the potential for binding of di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) to rat liver DNA in vivo
N2  - It was the aim of this investigation to determine whether or not covalent binding of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) to rat liver DNA could be a mechanism of action contributing to the observed induction of liver tumors after lifetime feeding of rodents with high doses of DEHP. DEHP radiolabeled in different positionswas administered orally to female F344 rats with or without pretreatment for 4 weeks with 1% unlabeled DEHP in the diet. Livu DNA was isolated after 16 hr and analyzed for radioattivity. Administration of [\(^{14}\)C]carboxylate unabeled DEHP resulted in no measurable DNA radioactivity. With DEHP [\(^{14}\)C]· and [\(^{3}\)H]. labeled in the alcohol moiety as well as with 2-ethyl[1-\(^{14}\)C]hexanol, radioactivity was clearly measurable in the DNA. HPLC analysis of enzyme-degraded DNA relvealed that the normal nucleosides had incorporated radiolabel whereas no radioactivity was detectable in those fractions where the carcinogen-modified nucleoside adducts are expected. A quantitative evaluation of the negative data in terms of a Iimit of detection for a covalent binding Index (CBJ) indicates that covalent interaction with DNA is highly unlikely to be the mode of tumorigenic action of DEHP in rodents.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60957
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Quantitative evaluation of DNA binding data for risk estimation and for classification of direct and indirect carcinogens
N2  - Investigation of covalent DNA binding in vivo provided evidence for whether a test substance can be activated to metabolites able to reach and react with DNA in an intact organism. Fora comparison of DNA binding potencies of various compounds tested under different conditions, a normalization of the DNA lesion with respect to the dose is useful. A covalent binding index, CBI = (\(\mu\)mol chemical bound per mol DNA nucleotide )/(mmol chemical administered per kg body weight) can be determined for each compound. Whether covalent DNA binding results in tumor formation is dependent upon additional factors specific to the cell type. Thus far, all compounds which bind covalently to liver DNA in vivo have also proven tobe carcinogenic in a long-term study, although the liver was not necessarily the target organ for tumor growth. With appropriate techniques, DNA binding can be determined in a dose range which may be many orders of magnitude below the dose Ievels required for significant tumor induction in a long-term bioassay. Rat liver DNA bindingwas proportional to the dose of aflatoxin B1 afteroral administration of a dose between 100 \(\mu\)g/kg and 1 ng/kg. The lowest dose was in the range of generat human daily exposures. Demonstration of a lack of liver DNA binding (CBI<0.1) in vivo for a carcinogenic, nonmutagenic compound is a strong indication for an indirect mechanism of carcinogenic action. Carcinogens of this class do not directly produce a change in gene structure or function but disturb a critical biochemical control mechanism, such as protection from oxygen radicals, control of cell division, etc. Ultimately, genetic changes are produced indirectly or accumulate from endogenaus genotoxic agents. The question of why compounds which act via indirect mechanisms are more likely to exhibitanonlinear rangein the dose-response curve as opposed to the directly genotoxic agents or processes is discussed.
KW  - Toxikologie
KW  - Chemical carcinogenesis
KW  - Mechanism of action
KW  - Quantitative risk assessment
KW  - Genotoxicity
KW  - Dose-response relationship
KW  - Aflatoxin B1
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60967
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Endogenous formaldehyde does not produce detectable DNA-protein crosslinks in rat liver
N2  - Formaldehydeis an electrophilic molecule able to crosslink DNA and protein. It has been found to induce tumors in the nasal epithelium in rodents. The safety margin between the maximum tolerated FA concentration in the work place and the concentration found to be tumorigenic in animal studies is very small. Because FA is produced endogenously as a result of a variety of oxidative demethylations, the assessment of the tumor risk from exogenaus FA exposure has tobe related quantitatively to the level of DNA-protein crosslinks induced by endogenaus FA generation. It is reported here that the high level of endogenaus FA formed in the liver after a large dose of methanol or of aminopyrine did not lead to any observable increase in DNA-protein crosslinks. Using positive and negative control data from in vitro incubations of liver homogenate with FA or methanol it is estimated that the endogenous level of DNA damage in the liver must be more than three orders of magnitude below the damage observed at tumorigenic concentrations for the rat nose. The fact that FA is formed endogenously cannot, therefore, be used to claim that exogenous FA merely leads to a negligible increase in DNA damage.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60972
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Koch, R.
A1  - Deger, A.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Schenzle, D.
A1  - Krämer, H.
A1  - Kelm, S.
A1  - Müller, G.
A1  - Rapp, R.
A1  - Weber, U.
T1  - Characterization of solubilized insulin receptors from rat liver microsomes. Existence of two receptor species with  different binding properties
N2  - Insulin receptors were solubilized from rat liver microsomes by the nonionic detergent Triton X-100. After gel filtration of the extract on Sepharose CL-6B, two insulin-binding species (peak I and peak li) were obtained. The structure and binding properties of both peaks were characterized. Gel filtration yielded Stokes radii of 9.2 nm (peak I) and 8.0 nm (peak Il). Both peaks were glycoproteins. At 4°C peak 1 showed optimal insulin binding at pH 8.0 and high ionic strength. In contrast, peak li bad its binding optimum at pH 7.0 and low ionic strength, where peak I bindingwas minimal. For peak I the change in insulin binding under different conditions of pH and ionic strength was due to a change in receptor affinity only. For peak 11 an additional change in receptor number was found. Both peaks yielded non-linear Scatchard plots under most of the buffer conditions examined. At their binding optima at 4 oc the high affinity dissociation constants were 0.50 nM (peak I) and 0.55 nM (peak II). Sodium dodecyl sulfatejpolyacrylamide gel electrophoresis of peak I revealed five receptor bands with Mr 400000, 365000, 320000, 290000, and 245000 under non-reducing conditions. For peak II two major receptor bands with M\(_r\) 210000 and 115000 were found. The peak II receptor bands were also obtained aftermild reduction of peak I. After complete reduction both peaks showed one major receptor band with M\(_r\) 130000. The reductive generation of the peak II receptor together with molecular mass estimations suggest that the peak I receptor is the disulfide-linked dimer of the peak II receptor. Thus, Triton extracts from rat liver microsomes contain two receptor species, which are related, but differ considerably in their size and insulin-binding properties.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60215
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Characterization of the solubilized A\(_1\) adenosine receptor from rat brain membranes
N2  - A\(_1\) adenosine receptors from rat brain membranes were solubilized with the zwitterionic detergent 3-[3-( cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate. The solubilized receptors retained all the characteristics of membrane-bound A\(_1\) adenosine receptors. A high and a low agonist affinity state for the radiolabelled agonist (R)-\(N^6\)-[\(^3\)H]phenylisopropyladenosine([\(^3\)H]PJA) with K\(_D\) values of 0.3 and 12 nM, respectively, were detected. High-affinity agonist binding was regulated by guanine nucleotides. In addition agonist binding was still modulated by divalent cations. The solubilized A\(_1\) adenosine receptors could be labelled not only with the agonist [\(^3\)H]PIA but also with the antagonist I ,3-diethyi-8-[\(^3\)H]phenylxanthine. Guanine nucleotides did not affect antagonist binding as reported for membrane-bound receptors. These results suggest that the solubilized receptors are still coupled to the guanine nucleotide binding protein N; and that all regulatory functions are retained on solubilization. Key Words: A1 adenosine receptors - Solubilization- Rat brain membranes. Klotz K.-N. et al. Characterization of the solubilized A1 adenosine receptor from rat brain membranes. J. Neurochem. 46, 1528-1534 (1986).
KW  - Toxikologie
KW  - A1 adenosine receptors
KW  - solubilization
KW  - rat brain membranes
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60222
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
T1  - The glycoprotein nature of A\(_1\) adenosine receptors
N2  - A\(_1\) adenosine receptors from different tissues and species we~e photoaffinity labelled and then the carbohydrate content was examined by both enzymatic and chemical treatment. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of the labelled membrane receptors shows that neuraminidase treatment alters the electrophoretic mobility of the receptor band indica ting the presence of terminal neurandnie acids. Neuraminidase digestion does not influence the binding characteristics of the receptor. The totally deglycosylated receptor protein obtained by chemical treatment has an apparent molecular weight Of 32,000.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1986
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60231
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lindenborn Fotinos, J.
A1  - Reddington, M.
A1  - Schwabe, U.
A1  - Olsson, R. A.
T1  - 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) - a selective high affinity antagonist radioligand for A\(_1\) adenosine receptors
N2  - The properties of 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) as an antagonist ligand for A\(_1\) adenosirre receptors were examined and conipared with other radioligands for this receptor. DPCPX competitively antagonized both the inhibition of adenylate cyclase activity via A\(_1\) adenosirre receptors and the stimulationvia A\(_2\) adenosirre receptors. The K\(_i\)-values of this antagonism were 0.45 nM at the A\(_1\) receptor of rat fat cells, and 330 nM at the A\(_2\) receptor of human platelets, giving a more than 700-fold A\(_1\)-selectivity. A similar A\(_1\)-selectivity was determined in radioligand binding studies. Even at high concentrations, DPCPX did not significantly inhibit the soluble cAMPphosphodiesterase activity of human platelets. [\(^3\)H]DPCPX (105 Ci/mmol) bound in a saturable manner with high affinity to A\(_1\) receptors in membranes of bovine brain and heart, and rat brain and fat cells (K\(_D\) -values 50-190 pM). Its nonspecific binding was about 1% of total at K\(_D\) , except in bovine myocardial membranes (about 10%). Binding studies with bovine myocardial membranes allowed the analysis of both the high and low agonist affinity states of this receptor in a tissue with low receptor density. The binding properties of [\(^3\)H]DPCPX appear superior to those of other agonist and antagonist radioligands for the A\(_1\) receptor.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Adenylate cyclase
KW  - Phosphodiesterase
KW  - Xanthines
KW  - Radioligands
Y1  - 1987
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60246
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Winkler, F. K.
A1  - Dunitz, J. D.
T1  - Crystal structure of the antibiotic monensin similarities and differences betweeen free acid and metal complex
N2  - The structure of monensin, C36H620 11 , has been deterrnined by X-ray analysis of its crystalline monohydrate (orthorhombic, a = 15.15, b = 23.61, c = 10.65 A, Z = 4, space group P212121). Phases were assigned by direct methods, malring use of the 'tangent formula'. Although the conformation of the free acid resembles that of the silver salt in being cyclic, there are differences in the hydrogen bonding pattern. These featurcs are discussed in relation to the cornplexation of metal ions by m.onensin.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1971
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61228
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Wipf, H. K.
A1  - Simon, W.
T1  - Alkalikationen-Spezifität und Träger-Eigenschaftender Antibiotica Nigerfein und Monensin
T1  - Alkali-cation specificity and carrier qualities of the antibiotics nigericin and monensin
N2  - It is shown by means of IR. spectroscopic methodsthat nigericin and monensin bave a cyclic conformation similar to that of their silver salts. Camplex fonnation constants with sodium and potassium ions follow the selectivity order determined by EMF. measurements on liquid membranes: nigericin: K\(^+\) >Rb\(^+\)> Na\(^+\)> Cs\(^+\) >Li\(^+\); monensin: Na\(^+\)> K\(^+\) >Li\(^+\)> Rb\(^+\)> Cs\(^+\). Transport experiments show that nigericin and monensin facilitate the diffusion of potassium ions across model membranes, although in electrolytic transport experiments the permeability is not affected.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1970
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61233
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Viviani, A.
A1  - Lutz, Werner K.
T1  - Modulation of the binding of the carcinogen benzo(a)pyrene to rat liver DNA in vivo by selective induction of microsomal and nuclear aryl hydrocarbon hydroxylase activity
N2  - The lnfluence of mlcrosomal and nuclear aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) actlvlty on the covalent blndlng of [G·3H]benzo(a )pyrene to rat llver DNA was evaluated in viWJ. lnductlon of mlcrosomal AHH was obtalned alter phenobarbltal treatment (160% of control), whlch also lncreased DNA blndlng to 190%, but left the nuclear actlvlty unchanged. Nuclear AHH was lnduced wlth dleldrln (150%), and the blndlng was decreased to 75%, whereaa the mlcrosomal AHH was at control Ievei. The lncreaslng effect of mlcrosomal AHH lnductlon as weil as the decreaslng effect of nuclear AHH lnductlon on the blndlng was shown clearly when the data of the Individual rata were uaed to solve the equatlon Binding = e•(mlcroeomal AHH) + b•(nuclear AHH) + c Multiple linear regresslon analysls wlth the data from 10 anlmala reaulted ln positive valuea for a and c, a negative value for b, and a good multiple correlatlon coefflclent of r = 0.974. Pretreatment wlth 3-methylcholanthrene ln· duced mlcrosomal AHH to 380% of control and nuclear AHH to 590% and lncreased the blndlng' to 175,.-o. The blndlng was hlgher than predlcted by the formula found, probably because the lncreaslng lnfluence of lnduced mlcrosomal AHH overahadowed the decreaslng effect of the nuclear AHH. The study ahows clearly that the blndlng of a forelgn compound to DNA in viWJ Ia dependent not only on mlcrosomal enzyme actlvltles but also on nuclear actlvltles even lf the latter are conslderably lower than thoae of mlcrosomes.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61150
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jaggi, W.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Covalent binding of ethinylestradiol and estrone to rat liver DNA in vivo
N2  - Thecovalent bindingof [6,7-\(^3\)H]ethinylestradiol (EE)and [6,7-\(^3\)H]estrone (E) to liver DNA of 200 g female ratswas measured 8 h after the administration of 80 \(\mu\)g (9.2 mCi) estrogen by gavage. The binding is 1.5 for EE and 1.1 for E, expressedas binding to DNA/dose, in units of \(\mu\)mol hormonefmol DNA phosphate/mmole honnone/kg body wt. It is in the same order of magnitude as for benzene and about 10 000 tim es below the binding of typical liver carcinogens, such as aflatoxin B\(_1\) or N,N-dimethylnitrosamine.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61162
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Viviant, A.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Nonlinear dose-response relationship for the binding of the carcinogen benzo(a)pyrene to rat liver DNA in vivo
N2  - Wlth radioactive compound of high specific activity, the binding of carcinogene to DNA can be measured wlth doses that are ineffective ln long-term studies. The binding of tritiated benzo(a )pyrene to liver DNA of adult male rats has been determined 50 hr after a singie l.p. injection of doses between 40 1'9/kg and 4 mg/kg. The doseresponse relationship is linear up to 1 mg/kg, shows a step towards 2 mg/kg, and gives a shallow linear slope above that value. The observed binding ranges from 1.7 to 180 nmoles benzo(a)pyrene per mole DNA phosphate. The nonlinearity could be due to an induction of metabolizing enzymes. The microsomal aryl hydrocarbon hydroxylase activity increases significantly 24 hr after a single dose of 4 mg/kg and 48 hr after doses of 2 and 4 mg/kg, but no induction Ia found with 1 mg/kg. The binding from an equimolar dose is 35 times lower than the one found on mouse skin DNA and 300 times lower than that of N,Ndlmethylnitrosamine in rat liver. A good correlatlon exiats to the respective tumor formation in long-term studles.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61179
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Viviani, A.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Time course of the induction of aryl hydrocarbon hydroxylase in rat liver nuclei and microsomes by phenobarbital, 3-methylcholanthrene, 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin, dieldrin and other inducers
N2  - Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) has been measured in male rat Jiver nucJei and microsomes after treatment of adult animals with various inducers for up to 14 days. After daily i.p. injections of 3-methylcholanthrene (MC, 20 mg/kg) the nuclear activity increased to a maximum of 600 per cent of the control activity after 4 days whereas the microsomal activity was 400 per cent of control at the same date. After 12 days, both activities equilibrated at 400 per cent. A similar time course was found after a single i.p. injection of 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD, 0.01 mg/kg) with an induction to .500 and 300 per cent for nuclei and microsomes, respectiveJy. after 2 days, and to 400 per cent for both after 12 days. PhenobarbitaJ (PB) was given continuously in the drinking water (I g/1) and induced the microsomal activity to 200 per cent after 8 days and 170 per cent after 14 days. The nuclear activity was only slightly induced to a constant Ievei of 130 per cent between day 8 and 14. Dieldrin did not significantly increase the microsomal activity after daiJy i.p. injections (20 mg/kg), but the nuclear activity raised to 200 per cent after 3 days and levelled down tocontrol valuesafter 12 days. Other inducers tested were benz[a)anthracene (BA), hexachlorobenzene (HCB} and 1,1.1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane (DDT). The induction pattern with BA was similar tothat of MC, a modeJ compound for the group of cytochrome P448 inducers. The induction by HCB and DDT resembled that by PB. a typical cytochrome P450 inducer.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61182
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Saccharin does not bind to DNA of liver or bladder in the rat [Short Communication]
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1977
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61194
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - Mechanism of the carcinogenic action of benzene: irreversible binding to rat liver DNA
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1977
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61208
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Früh, P. U.
A1  - Simon, W.
T1  - Microcalorimetric determination of ΔH0, ΔG0 and ΔS0 for the interaction of the carrier antibiotics nigericin and monensin with sodium and potassium ions
N2  - The thermodynainic parameters ΔH0, ΔG0 and ΔS0 - and thereby the equilibrium constants - for the complexation of the carrier antibiotics nigericin and monensin with sodium and potassium ions in methanol at 25°C have been determined by microcalorimetry. Tbc results are discussed in terms of the nature of the interaction between ligands and cations.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1971
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61218
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Maurer, K.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Schwabe, U.
T1  - Synergistic effects of calcium-mobilizing agents and adenosine on histamine release from rat peritoneal mast cells
N2  - 1 Adenosine and its metabolically stable analogue N.etbyl-carboxamidoadenosine (NECA) enhance histamine release from rat peritoneal mast cells when tbese are stimulated by calciummobilizing agents. NECA and adenosine shift the concentration-response curve of tbe calcium ionophore A23187 to lower concentrations. 2 The potencies of NECA or adenosinein enhancing A23187-induced histamine release are dependent on the Ievel of stimulated release in tbe absence of adenosine analogues. At high Ievels of release their potencies are up to 20 times higher than at low Ievels. Consequently, averaged concentration-response curves of adenosine and NECA for enhancing bistamine release are shallow. 3 The adenosine transport blocker S-(p-nitrobenzyl)-6-thioinosine (NBTI) has no effect by itself at low Ievels of stimulated histamine release, but abolishes the enhancing effect of adenosine. At high Ievels of release, however, NBTI alone enhances the release of histamine. 4 lt is concluded that adenosine and calcium reciprocally enhance the sensitivity of the secretory processes to the effects of the other agent. The Ievels of intracellular adenosine obtained by trapping adenosine inside stimulated mast cells are sufficient to enhance histamine release substantially, suggesting that this effect may play a physiological and pathophysiological role.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60346
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Jakobs, K. H.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Barbiturates are selective antagonists at A\(_1\) adenosine receptors
N2  - Barbiturates in pharmacologically relevant . concentrations inhibit binding of (R)-\(N^6\)-phenylisopropyl[\(^3\)H]adenosine ([\(^3\)H]PIA) to solubilized A\(_1\) adenosine receptors in a concentration-dependent, stereospecific, and competitive manner. K\(_i\) values are similar to those obtained for membrane-bound receptors and are 31 \(\mu\)M for ( ± )-5-(1 ,3-dimethyl)-5-ethylbarbituric acid [( ± )DMBB] and 89 \(\mu\)M for ( ± )-pentobarbital. Kinetic experiments demoostrate that barbiturates compete directly for the binding site of the receptor. The inhibition of rat striatal adenylate cyclase by unlabelled (R)-\(N^6\)-phenylisopropyladenosine [(R)-PIA] is antagonized by barbiturates in the same concentrations that inhibit radioligand binding. The Stimulation of adenylate cyclase via A\(_2\) adenosine receptors in membranes from NIE 115 neuroblastoma cells is antagonized only by 10-30 times higher concentrations of barbiturates. lt is concluded that barbiturates are selective antagonists at the A1 receptor subtype. In analogy to the excitatory effects of methylxanthines it is suggested that A\(_1\) adenosine receptor antagonism may convey excitatory properties to barbiturates. Key Words: Adenosine receptors-Barbiturates - Adenylate cyclase-Receptor solubilization-[3H]PIA binding-N1E 115 cells. Lohse M. J. et al. Barbiturates are selective antagonists at A1 adenosine receptors.
KW  - Toxikologie
KW  - adenosine receptors
KW  - barbiturates
KW  - adenylate cyclase
KW  - receptor solubilization
KW  - N1E 115 cells
KW  - [3H]PIA binding
Y1  - 1985
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60187
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Cristalli, G.
A1  - Grifantini, M.
A1  - Vittori, S.
A1  - Lohse, M. J.
T1  - Photoaffinity labeling of A\(_1\) adenosine receptors
JF  - The journal of biological chemistry
N2  - The ligand-binding subunit of the A\(_1\)-adenosine receptor has been identified by photoaffinity labeling. A photolabile derivative of R- \(N^6\)-phenylisopropyladenosine, R-2-azido-\(N^6\)-p-hydroxyphenylisopropyladenosine (R-AHPIA), has been synthesized as a covalent specific Iigand for A\(_1\)-adenosine receptors. In adenylate cyclase studies with membranes of rat fat cells and human platelets, R·AHPIA has adenosine receptor agonist activity with a more than 60-fold selectivity for the A\(_1\)-subtype. It competes for [\(^3\)H].\(N^6\)- phenylisopropyladenosine binding to Arreceptors of rat brain membranes with a Ki value of 1.6 nM. After UV irradiation, R-AHPIA binds irreversibly to the receptor, as indicated by a loss of [\(^3\)H)\(N^6\)-phenylisopropyladenosine binding afterextensive washing; the K; value for this photoinactivation is 1.3 nM. The p-hydroxyphenyl substituent of R-AHPIA can be directly radioiodinated to give a photoaffinity Iabel of high specific radioactivity (\(^{125}\)I-AHPIA). This compound has a KD value of about 1.5 nM as assessed from saturation and kinetic experiments. Adenosine analogues compete for \(^{125}\)I-AHPIA binding to rat brain membranes with an order of potency characteristic for A\(_1\)-adenosine receptors. Dissociation curves following UV irradiation at equilibrium demonstrate 30-40% irreversible specific binding. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis indicates that the probe is photoincorporated into a single peptide of M\(_r\) = 35,000. Labeling of this peptide can be blocked specifically and stereoselectively by adenosine receptor agonists and antagonists in a manner which is typical for the A\(_1\)-subtype. The results indicate that \(^{125}\)I-AHPIA identifies the ligand-binding subunit of the A\(_1\)-adenosine receptor, which is a peptide with M\(_r\) = 35,000.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1985
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60198
VL  - 27
IS  - 260
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gross, E.
A1  - Ruzicka, T.
A1  - Restorff, B. von
A1  - Stolz, W.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
T1  - High-affinity binding and lack of growth-promoting activity of 12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid (12(S)-HETE) in a human epidermal cell line
N2  - No abstract available
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60358
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Keil, R.
A1  - Zimmer, F. J.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Guanine nucleotide effects on 8-cyclopentyl-1,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine binding to membrane-bound and solubilized A\(_1\) adenosine receptors of rat brain
N2  - The effects of guanine nucleotides on binding of 8-cyclopentyl-1,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine [\(^3\)H]DPCPX), a highly selective A\(_1\) adenosine receptor antagonist, have been investigated in rat brain membranes and solubilized A\(_1\) receptors. GTP, which induces uncoupling of receptors from guanine nucleotide binding proteins, increased binding of [\(^3\)H]DPCPX in a concentration-dependent manner. The rank order of potency for different guanine nucleotides for increasing [\(^3\)H]DPCPX bindingwas the same as for guanine nuc1eotide-induced inhibition of agonist binding. Therefore, a role for a guanine nucleotide binding protein, e.g., G\(_i\), in the regulation of antagonist binding is suggested. This was confirmed by inactivation ofGi by N-ethylmaleimide (NEM) treatment of membranes, which resulted in an increase in [\(^3\)H]DPCPX binding similar to that seen with addition of GTP. Kinetic and equilibrium binding studies showed that the GTP- or NEM-induced increase in antagonist binding was not caused by an affinity change of A\(-1\) receptors for [\(^3\)H]DPCPX but by an increased Bmu value. Guanine nucleotides had similar effects on membrane-bound and solubilized receptors, with the effects in the solubilized system being more pronounced. In the absence of GTP, when rnost receptors are in a high-affinity state for agonists, only a few receptors are labeled by [\(^3\)H]DPCPX. It is suggested that [\(^3\)H]DPCPX binding is inhibited when receptors are coupled to G\(_i\). Therefore, uncoupling of A\(_1\) receptors from G\(_i\) by guanine nucleotides or by inactivation of G\(_i\) with NEM results in an increased antagonist binding. 
Key Words: Adenosine receptors-8 -Cyclopentyl-1,3-eH]dipropylxanthine-Antagenist binding-Guanine nucleotide effects. Klotz K.-N. et al. Guanine nucleotide etfects on 8-cyclopentyl-1 ,3-eH]dipropylxanthine binding to membrane-bound and solubilized A1 adenosine receptors of rat brain. J. Neurochem. 54, 1988-1994 (1990).
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60369
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Gimpl, G.
A1  - Gerstberger, R.
A1  - Mauss, U.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lang, R. E.
T1  - Solubilization and characterization of active neuropeptide-Y receptors from rabbit kidney
N2  - Active neuropeptide Y receptors were solubilized from rabbit kidney membranes using the zwitterionic detergent 3-[ (3-cholamidopropy l)dimethylammonio ]- 1-propanesulfonic acid (CHAPS). In membrane fragmentsandsoluble extracts neuropeptide Y bindingwas time dependent, saturable, reversible, and of high affinity. Scatchard analysis of equilibrium binding data indicated a single class of binding sites with respective Kn and Bmax values of 0.09 nM and 530 fmol/mg of protein for the membrane-bound receptors and 0.10 nM and 1585 fmol/mg of protein for the soluble receptors. Neuropeptide Y bindingwas specifically inhibited by the nonhydrolyzable GTP analog guanosine 5' -0- (3-thiotripbosphate) in a concentration-dependent manner, with IC\(_{50}\) values of 28 and 0.14 \(\mu\)M for membrane- bound and soluble receptors, respectively, suggesting that neuropeptide Y receptors are functionally coupled to GTP-binding regulatory proteins. CrossHoking studies were performed with the heterobifunctional N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate and the monofunctional neuropeptide Y derivative, azidobenzoyl and led to the identification of a 100 kDa peptide that should represent the covalently labeled neuropeptide Y receptor.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60375
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Vogt, H.
A1  - Tawfik-Schlieper, H.
T1  - Comparison of A\(_1\) adenosine receptors in brain from different species by radioligand binding and photoaffinity labelling
N2  - Radioligand binding to A\(_1\) adenosine receptors at brain membranes from seven species was investigated. The antagonist 8-cyclopentyl-1 ,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX) bound with affinities between 0.17 nM in sheep brain and 2.1 nM in guinea pig brain. Competition of several antagonists for [\(^3\)H]DPCPX binding showed that the most potent compounds were DPCPX with K\(_i\) values of 0.05 nM in bovine brain and 1.1 nM in guinea pig brain and xanthine amine congener (XAC) with K\(_i\) values of 0.03 nM in bovine brain and 5.5 nM in guinea pig brain. The differences in affinity of the agonist radio Iigand 2-chloro-N\(^6\) -[\(^3\)H]cyclopen tyladenosine ([\(^3\)H]CCP A) were less pronounced, rauging from a K\(_D\) value of 0.12 nM (hamster brain) to 0.42 nM (guinea pig brain). Agonist competition for [\(^3\)H]DPCPX binding of photoaffinity labelling, however, exhibited marked species differences. N-Ethylcarboxamidoadenosine (NECA) and S-N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (S-PIA) showed 20 to 25-fold different K\(_D\) values in different species. NECA had a particularly high affinity in guinea pig brain and was only two-fold less potent than R-PIA. Thus, the difference from the "classical" A\(_1\) receptor profile (R-PIA > -NECA > S-PIA) is not sufficient to speculate that A\(_1\) receptor subtypes may exist that are coupled to different effector systems. Our data show that these difference can easily be explained by species differences.
KW  - Toxikologie
KW  - A1 adenosine receptors
KW  - Species differences
KW  - Radioligand binding
KW  - Photoaffinity labelling
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60388
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - van Calker, D.
A1  - Steber, R.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Greil, W.
T1  - Carbamazepine distinguishes between adenosine receptors that mediate different second messenger responses
N2  - The mechanism of the therapeutic and prophylactic effects of carbamazepine (CBZ) in affective psychoses is unknown but may in part be related to the potent competitive interaction of CBZ with adenosine-binding sites in the brain. The antioonvulsant and sedative properties of CBZ are reminiscent of the effects evoked by adenosine-agonists and contrast sharply with the opposite aclions of adenosine-antagonists like caffeine. However. indirect evidence suggests an antagonist- rather than an agonist-like activity of CBZ at adenosi11e-receptors. We have used various model systems, in which adenosine receptor subtypes mediate different second messenger-responses, to investigate this apparent paradox. CBZ was found to antagonize the A\(_1\) receptor-mediated inhibition of cydic AMP accumulation in cultured astroblasts and in GH3-cells. Furthermore, CBZ also inhibits the adenosine-induced increase in the level of cyclic AMP in cultured astroblasts, which is mediated by low-affinity A\(_{2b}\)-receptors. ln contrast, CBZ does not block the inhibition elicited by adenosine-agonists of the agonist-induced increased formation of inositolphosphates in human neutrophils, which is mediated by high-affinity A\(_{2a}\)-receptors. The specific antagonism by CBZ of A\(_1\)- but not of high-affinity A\(_{2a}\)-receptors was further supported by binding experiments using rat brain membranes. These results suggest tbat the paradox of CBZ's antagonistic effects at adenosine-receptors might be at least partially reconciled by a selective antagonistic action of CBZ at A\(_1\)recertors but not at high-affinity A\(_{2a}\)-receptors.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60392
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Bommakanti, R.
A1  - Bokoch, G. M.
A1  - Tolley, J. O.
A1  - Schreiber, R. E.
A1  - Siemsen, D. W.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Jesaitis, A. J.
T1  - Reconstitution of a physical complex between the N-formyl chemotactic peptide receptor and G protein: Inhibition by pertussis toxin-catalyzed ADP ribosylation
N2  - Photoaffinity-labeled N-formyl chemotactic peptide receptors from human neutrophils solubilized in octyl glucoside exhibit two forms upon sucrose density gradient sedimentation, with apparent Sedimentation coefficients of approximately 4 and 7 S. Tbe 7 S form can be converted to the 4 S form by guanosine 5' -0- (3-thiotriphosphate) (GTP-yS) with an EC&o of -20 nM, suggesting that the 7 S form may represent a physical complex of the receptor with endogenous G protein (Jesaitis, A. J., Tolley, J. 0., Bokoch, G. M., and Allen, R. A. (1989) J. Cell Biol. 109, 2783-2790). To probe the nature of the 7 S form, we reconstituted the 7 S form from the 4 S form by adding purified G protein. The 4 S form, obtained by solubilizing GTP-yS-treated neutrophil plasma membranes, was incubated with purified (>95%) G. protein from bovine brain (containing both G\(_{ia1}\) and G\(_{ia2}\)) or with neutrophil G protein (G\(_a\)), and formation of the 7 S complex was analyzed on sucrose density gradients. The EC\(_{50}\) of 7 S complex formation induced by the two G proteins was 70 \(\pm\) 25 and 170 \(\pm\) 40 DM for G\(_a\) and G\(_1\), respectively. No complexation was measurable when bovine transducin (G\(_t\)) was used up to 30 times the EC\(_{50\) for G\(_a\). The EC\(_{50}\) for G\(_t\) was the same for receptors, obtained from formyl peptide-stimulated or unstimulated cells. The addition of 10 \(\mu\)M GTP-yS to the reconstituted 7 S complex caused a complete reversion of the receptor to the 4 S form, and anti-G\(_1\) peptide antisera immunosedimented the 7 S form. ADP-ribosylation of Gt prevented formation of the 7 S form even at 20 times the concentration of unribosylated G. normally used to attain 50% conversion to the 7 S form. These observations suggest that the 7 S species is a pbysical complex containing N-formyl chemotactic peptide receptor and G protein.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1992
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60406
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Cristalli, G.
A1  - Eleuteri, A.
A1  - Vittori, S.
A1  - Volpini, R.
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
T1  - 2-Alkynyl derivatives of adenosine and adenosine-5'-N-ethyluronamides as selective agonists at A\(_2\) adenosine receptors
N2  - In the search for more selective A2-receptor agonists and on the basis that appropriate substitution at C2 is known to impart selectivity for A\(_2\) receptors, 2-alkynyladenosines 2a-d were resynthesized and evaluated in radioligand binding, adenylate cycla.se, and platelet aggregation studies. Binding of [\(^3\)H]NECA to A\(_2\) receptors of rat striatal membranes was inhibited by compounds 2a-d with K\(_i\) values ranging from 2.8 to 16.4 nM. 2-Alkynyladenosines also exhibited high-affmity binding at solubilized A\(_2\) receptors from human platelet membranes. Competition of 2-alkynyladenosines 2a-d for the antagonist radioligand [\(^3\)H]DPCPX and for the agonist [\(^3\)H]CCPA gave K\(_i\) values in the nanomolar range, and the compounds showed moderate A\(_2\) selectivity. In order to improve this selectivity, the correaponding 2-alkynyl derivatives of adenosine-5'-N-ethyluronamide 8a-d were synthesized and tested. A\(_1\) expected, the 5'-N-ethyluronamide derivatives retained the A\(_2\) affinity whereas the A\(_1\) affinity was attenuated, resulting in an up to 10-fold increase in A\(_2\) selectivity. A similar patternwas observed in adenylate cyclase assays andin platelet aggregation studies. A 30- to 45-fold selectivity for platelet A\(_2\) receptors compared to A\(_1\) receptors was found for compounds 8a-c in adenylate cyclase studies.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1992
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60412
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Nolte, D.
A1  - Lorenzen, A.
A1  - Lehr, H.-A.
A1  - Zimmer, F.-J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Messmer, K.
T1  - Reduction of postischemic leukocyte-endothelium interaction by adenosine via A\(_2\) receptor
N2  - The adhesion of leukocytes to the endothelium of postcapillary venules hallmarks a key event in ischemia-reperfusion injury. Adenosine has been shown to protect from postischemic reperfusion injury, presumably through inhibition of postischemic leukocyte-endothelial interaction. This study was performed to investigate in vivo by which receptors the effect of adenosine on postischemic leukocyte-endothelium interaction is mediated. The hamster dorsal skinfold model and fluorescence microscopy were used for intravital investigation of red cell velocity, vessel diameter, and leukocyte-endothelium interaction in postcapillary venules of a thin striated skin muscle. leukocytes were stained in vivo with acridine orange (0.5 mg kg\(^{-1}\) min\(^{-1}\) i.v. ). Parameters were assessed prior to induction of 4 h ischemia to the muscle tissue and 0.5 h, 2 h, and 24 h after reperfusion. ·Adenosine, the adenosine A1-selective agonist 2-chloro-N\(^6\) -cyclopentyladenosine (CCPA), the Arselective agonist CGS 21,680, the non-selective adenosine receptor antagonist xanthine amine congener {XAC), and the adenosine uptake blocker S-(p-nitrobenzyl)-6-thioinosine (NBTI) were infused viajugular vein starting 15 min priortorelease of ischemia until 0.5 h after reperfusion. Adenosine and CGS 21,680 significantly reduced postischemic leukocyte-endothelium interaction 0.5 h after reperfusion (p< 0.01), while no inhibitory effect was observed with CCPA. Coadministration of XAC blocked the inhibitory effects of adenosine. Infusion of NBTI alone effectively decreased postischemic leukocyte-endothelium interaction. These findings indicate that adenosine reduces postischemic leukocyte-endothelium interaction via A\(_2\) receptor and suggest a protective role of endogenous adenosine during ischemia-reperfusion.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Ischemia/reperfusion
KW  - Leukocyte/endothelium interaction
KW  - Microcirculation
Y1  - 1992
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60424
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Ukena, D.
A1  - Schirren, C. G.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Schwabe, U.
T1  - Evidence for an A\(_2\) adenosine receptor in guinea pig lung
N2  - Adenosine receptors in guinea pig lung were characterized by measurement of cyclic AMP formation and radioligand binding. 5'-N-Ethylcarboxamidoadenosine (NECA) increased cyclic AMP Ievels in lung slices about 4-fold over basal values with an EC\(_{50}\) of 0.32 \(\mu\)mol/l. N\(^6\) - R-(- )-Phenylisopropyladenosine (R-PIA) was 5-fold less potent than NECA. 5'-N-Methylcarboxamidoadenosine (MECA) and 2-chloroadenosine had EC\(_{50}\)-values of 0.29 and 2.6 \(\mu\)mol/l, whereas adenosine and inosine had no effect. The adenosine receptors in guinea pig Iung can therefore be classified as A\(_2\) receptors. Several xanthine derivatives antagonized the NECA-induced increase in cyclic AMP levels. 1,3-Diethyl-8-phenylxanthine (DPX; K\(_i\) 0.14 \(\mu\)mol/l) was the most potent analogue, followed by 8-phenyltheophylline (K\(_i\) 0.55 \(\mu\)mol/l), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; K\(_i\) 2.9 \(\mu\)mol/l) and theophylline (K\(_i\) 8.1 \(\mu\)mol/l). In contrast, enprofylline (1 mmol/1) enhanced basal and NECA-stimulated cyclic AMP formation. In addition, we attempted to characterize these receptors in binding studies with [\(^3\)H]NECA. The K\(_D\) for [\(^3\)H] NECA was 0.25 \(\mu\)mol/l and the maximal number of binding sites was 12 pmol/mg protein. In competition experiments MECA (K\(_i\) 0.14 \(\mu\)mol/l) was the most potent inhibitor of [\(^3\)H] NECA binding, followed by NECA (K\(_i\) 0.19 \(\mu\)mol/l) and 2-chloroadenosine (K\(_i\) 1.4 \(\mu\)mol/l). These results correlate well with the EC\(_{50}\)- values for cyclic AMP formation in lung slices. However, the K\(_i\)-values of R-PIA and theophylline were 240 and 270 \(\mu\)mol/l, and DPX and 8-phenyltheophylline did not compete for [\(^3\)H]NECA binding sites. Therefore, a complete characterization of A\(_2\) adenosine receptors by [\(^3\)H] NECA binding was not achieved. In conclusion, our results show the presence of adenylate cyclase-coupled A\(_2\) adenosiile receptors in lung tissue which are antagonized by several xanthines.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Cyclic AMP
KW  - Lung
KW  - Theophylline
Y1  - 1985
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60202
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Schwabe, U.
A1  - Cristalli, G.
A1  - Vittori, S.
A1  - Grifantini, M.
T1  - 2-Chloro-N\(^6\)-[\(^3\)H]cyclopentyladenosine ([\(^3\)H]CCPA) - a high affinity agonist radioligand for A\(_1\) adenosine receptors
N2  - The tritiated analogue of 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine (CCPA), an adenosine derivative with subnanomolar affinity and a 10000-fold selectivity for A1 adenosine receptors, has been examined as a new agonist radioligand. [3H]CCP A was prepared with a specifi.c radioactivity of 1.58 TBqjmmol ( 43 Ci/mmol) and bound in a reversible manner to A1 receptors from rat brain membranes with a high affinity K0 -value of 0.2 nmol/1. In the presence of GTP a K0 -value of 13 nmol/1 was determined for the low affinity state for agonist binding. Competition of several adenosine receptor agonists and antagonists for [3H]CCPA binding to rat brain membranes confrrmed binding to an A1 receptor. Solubilized A1 receptors bound [3H]CCPA with similar affinity for the high affinity state. At solubilized receptors a reduced association rate was observed in the presence of MgC12, as has been shown for the agonist [ 3H]N6-phenylisopropyladenosine ([3H]PIA). [3H]CCPA was also used for detection of A1 receptors in rat cardio myocyte membranes, a tissue with a very low receptor density. A K0 -value of 0.4 nmol/1 and a Bmax-value of 16 fmol/ mg protein was determined in these membranes. In human platelet membranes no specific binding of [3H]CCPA was measured at concentrations up to 400 nmoljl, indicating that A2 receptors did not bind [3H]CCPA. Based on the subnanomolar affinity and the high selectivity for A1 receptors [ 3H]CCPA proved to be a useful agonist radioligand for characterization of A 1 adenosine receptors also in tissues with very low receptor density.
KW  - Toxikologie
KW  - Adenosine receptors
KW  - Radioligauds
KW  - agonists
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60328
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Tawfik-Schlieper, H.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Kreye, V. A. W.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Characterization of the K\(^+\)-channel-coupled adenosine receptor in guinea pig atria
N2  - In the present work we studied the pharmacological profile of adenosine receptors in guinea pig atria by investigating the effect of different adenosine analogues on 86Rb + -efflux from isolated left atria and on binding of the antagonist radioligand 8-cyclopentyl-1 ,3-[\(^3\)H]dipropylxanthine ([\(^3\)H]DPCPX) to atrial membrane preparations. The rate of \8^{86}\)Rb\(^+\) -effiux was increased twofold by the maximally effective concentrations of adenosine receptor agonists. The EC50-values for 2-chloro-N\(^6\)-cyclopentyladenosine (CCPA), R-N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (R-PIA), 5'-Nethylcarboxamidoadenosine (NECA), and S-N\(^6\)-phenylisopropyladenosine (S-PIA) were 0.10, 0.14, 0.24 and 12.9 \(\mu\)M, respectively. DPCPX shifted the R-PIA concentration-response curve to the right in a concentration-dependent manner with a K\(_B\)-value of 8.1 nM, indicating competitive antagonism. [\(^3\)H]DPCPX showed a saturable binding to atrial membranes with a Bmax·value of 227 fmol/mg protein and a K\(_D\)-value of 1.3 nM. Competition experiments showed a similar potency for the three agonists CCPA, R-PIA and NECA. S-PIA is 200 times less potent than R-PIA. Our results suggest that the K\(^+\) channel-coupled adenosine receptor in guinea pig atria is of an A\(_1\) subtype.
KW  - Toxikologie
KW  - A1 Adenosine receptors
KW  - K + -channels
KW  - Atria
KW  - Radioligand binding - 86Rb + -efflux
Y1  - 1989
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60333
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Shephard, S. E.
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - The lacI transgenic mouse mutagenicity assay: quantitative evaluation in comparison to tests for carcinogenicity and cytogenetic damage in vivo
N2  - The detection Iimit of the lacl transgenic mouse mutagenicity assay lies, in practice, at approximately a 50-100% increase in mutant frequency in treated animals over controls. The sensitivity of this assay in detecting genotoxins can be markedly improved by subchronic rather than acute application of the test compound. The lac/ transgenic mouse mutagenicity assay was compared quantitatively to rodent carcinogenicity tests and to presently used in vivo mutagenicity assays. With the genotoxic carcinogens tested thus far, a rough correlation between mutagenic potency and carcinogenic potency was observed: on average, to obtain a doubling in lacl mutant frequency the mice bad to be treated with a total dose equal to 50 times the TD50 daily dose Ievel. This total dose could be administered eilher at a high dose rate within a few days or, preferably, at a low dose rate over several weeks. This analysis also indicated that a lacl experiment using a 250-day exposure period would give a detection Iimit approximately equal to that of a long-term carcinogenicity study. In comparison to the micronucleus test or the chromosome aberration assay, acute sturlies with the presently available lacl system offered no increase in sensitivity. However, subchronic lacl sturlies (3-4-month exposure) resulted in an increase in sensitivity over the established tests by 1-2 orders of magnitude (shown with 2-acetylaminofluorene, N-nitrosomethylamine, N-nitrosomethylurea and urethane). 1t is concluded that a positive result in the lacl test can be highly predictive of carcinogenicity butthat a negative result does not provide a large margin of safety.
KW  - Toxikologie
KW  - Transgenie mice
KW  - Mutagenicity assay
KW  - Sensitivity
KW  - Chromosome aberration
KW  - Micronucleus test
KW  - Carcinogenic potency
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60638
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hintzsche, Henning
T1  - Gentoxizität nichtionisierender Strahlung - Auswirkungen von Mobilfunk- und Terahertzstrahlung auf das Genom
T1  - Genotoxicity of non-ionizing radiation - Effects of mobile phone and terahertz radiation on the genome
N2  - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob nichtionisierende elektromagnetische Strahlung verschiedener Frequenzbereiche Genomschaden hervorrufen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Biomonitoring-Studie zu dieser Thematik konzipiert und durchgeführt. Es wurden 131 Probanden detailliert zu ihrer Mobilfunknutzung befragt. Anschließend wurden Mundschleimhautzellen entnommen und für eine mikroskopische Untersuchung aufbereitet und angefärbt. In den Zellen wurden Mikrokerne und andere Kernanomalien quantifiziert. Es zeigte sich keine Erhöhung der Mikrokernfrequenz in Abhängigkeit von der Dauer der Mobiltelefonnutzung. Auch die anderen abgefragten Parameter hatten keinen Einfluss auf die Höhe des Genomschadens. Als Positivkontrollen wurden vier Patienten, die eine lokale Strahlentherapie (ionisierende Strahlung) erhielten, eingeschlossen. Hier zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Mikrokernfrequenz. Um festzustellen, ob die Mikrokerninduktion erst bei höheren Leistungsflussdichten als denen, die beim Mobilfunk verwendet werden, auftritt, wurden in-vitro-Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Zelllinien einer Strahlung von 900 MHz ausgesetzt wurden. Nach Exposition und einer Postinkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und die Mikrokernfrequenz bestimmt. Neben den Leistungen wurden hier auch die Expositionszeiten und die Postinkubationsperioden variiert. In keinem Fall konnte eine Erhöhung der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Insgesamt konnte ein Einfluss elektromagnetischer Strahlung auf das Genom weder am Menschen im Rahmen einer Biomonitoring-Studie noch an verschiedenen Zelllinien im Rahmen von in-vitro-Versuchen festgestellt werden. Terahertzstrahlung ist elektromagnetische Strahlung im Bereich von 0,1 bis 10 THz, d. h. sie liegt zwischen Mikrowellen und Infrarotlicht. Derzeit wird sie hauptsächlich für spektroskopische Untersuchungen und zur Qualitätskontrolle im Herstellungs-prozess verschiedener Produkte verwendet. Anwendungen in der Sicherheitstechnik (z. B. Ganzkörperscanner) und in der Medizintechnik (z. B. Bildgebung) stehen kurz vor der Markteinführung bzw. sind bereits etabliert. Diese Anwendungen bringen eine Exposition der betroffenen Menschen mit sich. Außerdem wird an weiteren Techniken wie etwa der Datenübertragung gearbeitet. Die Wirkungen auf biologische Systeme sind im Gegensatz zum Mobilfunkbereich bisher nur unzureichend untersucht. Da bisher keine vollständigen Literaturübersichten vorlagen, wurde eine umfassende Literaturrecherche durchgeführt. Ziel war es, alle bisher durchgeführten Studien zu diesem Thema aufzulisten. Um diese Datenbasis zu verbreitern wurden in-vitro-Versuche bei verschiedenen Frequenzen durchgeführt. Als Strahlungsquellen wurden eine Frequenzvervielfacherkaskade (0,106 THz), ein Rückwärtswellen-Oszillator (0,380 THz) und ein Ferninfrarot-Laser (2,520 THz) eingesetzt. Die Strahlung wurde in einen modifizierten Inkubator geführt, so dass die Expositionen bei definierter Temperatur und konstantem CO2-Gehalt durchgeführt werden konnten. Da Terahertzstrahlung durch Wasser sehr stark absorbiert wird, sind bei einer Exposition des Menschen primär die obersten Hautschichten betroffen. Aus diesem Grund wurden primäre Hautfibroblasten und HaCaT-Zellen, eine Keratinozyten-Zelllinie, als biologische Systeme verwendet. Die Zellen wurden für unterschiedliche Zeitperioden mit verschiedenen Leistungsflussdichten exponiert. Anschließend wurden die Zellen für den Comet Assay aufbereitet und analysiert. Der Comet Assay ist eine Methode zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA. Weiterhin wurden die Zellen nach einer Postinkubationsperiode für den Mikrokerntest aufbereitet. Neben unbehandelten Kontrollen und Sham-Expositionen wurden auch Positivkontrollen durchgeführt. Es konnte keine Erhöhung der Anzahl der DNA-Strangbrüche bzw. der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Da bekannt war, dass im Mobilfunkbereich unter bestimmten Bedingungen Störungen der Mitose, nicht aber Erhöhungen der Mikrokernfrequenz, auftreten, wurden Mitosestörungen nach Exposition bei 0,106 THz untersucht. Hierzu wurden AL-Zellen für 30 Minuten exponiert und anschließend ohne Postinkubation direkt fixiert. Analysiert wurden Störungen in allen Phasen der Mitose. Es zeigte sich, dass die Frequenz der Störungen in der Pro- und Metaphase unverändert blieb. Die Störungen in der Ana- und Telophase nahmen dagegen mit steigender Leistungsflussdichte zu. Insgesamt konnte im Terahertzbereich unter den gewählten Expositionsbedingungen kein DNA-Schaden beobachtet werden. Bei 0,106 THz konnten Mitosestörungen als Folge der Exposition gezeigt werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Mitosestörungen und DNA-Schäden, insbesondere der Mikrokerninduktion, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden und bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.
N2  - The aim of the present study was to investigate whether non-ionizing radiation of different frequencies can cause genomic damage. Within the course of the present work, a biomonitoring study was designed and performed. 131 participants were interviewed and asked for their mobile phone use customs. Subsequently buccal mucosa cells were retrieved, prepared and stained for microscopy analysis. Micronuclei and other nuclear anomalies indicating genomic damage were quantified. No increase in micronucleus frequency depending on mobile phone use or other retrieved parameters were observed. Four patients receiving radiation therapy (ionizing radiation) were included as positive controls. A clear increase in micronucleus frequency was observed here. To determine whether micronucleus induction only occurs at higher power densities, in vitro investigations with different cell lines exposed to 900 MHz radiation were carried out. After exposition and post-incubation, cells were fixed and the micronucleus frequency was determined. Besides power density also exposition times and post-incubation periods were varied. In no case an increase in micronucleus frequency could be observed. 7. Summary 108 All in all, no influence of electromagnetic radiation on the genome could be observed, neither on humans in the biomonitoring study nor on cell lines in the in vitro study. Terahertz radiation is electromagnetic radiation in the range from 0.1 to 10 THz, i. e. between microwaves and infrared light. Currently it is used in spectroscopy and for quality control procedures in manufacturing processes. Application in security technology (e. g. full body scanners) and medical technology (e. g. medical imaging) have recently been established or are about to enter the market. These applications also involve exposure of humans. Furthermore, other technologies such as data transfer are being developed. So far the effects on biological systems of this frequency range are investigated only insufficiently. A thorough literature search was conducted because no comprehensive literature review was available. The aim was to completely list all available studies on this topic. To enlarge this data basis, in vitro studies at different frequencies were conducted. Radiation sources were a frequency multiplier chain (0.106 THz), a backward wave oscillator (0.380 THz) and a far infrared laser (2.520 THz). The radiation beam was led into a modified incubator in order to perform expositions under controlled temperature and CO2 concentration conditions. Terahertz radiation is strongly absorbed by water, thus in case of exposure of humans the skin will be affected primarily. This is the reason why primary dermal fibroblasts and HaCaT cells, a keratinocyte cell line, were used as biological systems. The cells were exposed to different power densities for different time periods. Subsequently cells were prepared and analyzed using the comet assay which quantifies DNA single and double strand breaks. Also, after a post-incubation period cells were prepared for the micronucleus test. Besides untreated controls and sham expositions also positive controls were 7. Summary 109 performed. No induction of DNA damage, neither as strand breaks nor as micronucleus frequency elevation, was observed. Because it was known that under certain experimental conditions mitotic disturbances but not micronucleus formation occur after exposition to mobile phone radiation, these mitotic disturbances were analyzed after terahertz exposition. AL cells were exposed for 30 minutes with 0.106 THz and fixed directly after the exposition. All phases of mitosis were analyzed, but it turned out that primarily ana- and telophase were affected. These disturbances increased with increasing power density. All in all, no DNA damage could be observed under the applied experimental conditions. After exposition to 0.106 THz mitotic disturbances occurred in AL cells. The link between these mitotic disturbances and the DNA damage, particularly the micronucleus formation, could not be resolved completely and remains subject of further investigations.
KW  - Mutagenität
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - Terahertzbereich
KW  - Mobiles Endgerät
KW  - Gentoxizität
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - Terahertzstrahlung
KW  - Mobilfunkstrahlung
KW  - Angewandte Toxikologie
KW  - genotoxicity
KW  - non-ionizing radiation
KW  - terahertz radiation
KW  - mobil phone radiation
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57684
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bellwon, Patricia
T1  - Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing
T1  - Evaluierung der Kinetik anhand von in vitro Systemen - Ein Beitrag um die Anzahl von Tierversuchen zur Toxizitätsprüfung zu reduzieren
N2  - The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling. 
This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day. 
Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors. 
Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling. 
Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions. 
Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo.
Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies.
N2  - Die Erlassung von Richtlinien und Verordnungen durch die EU führte zu der Entwicklung von alternativen Testmethoden als Ersatz von Tierversuchen zur Risikobewertung von Xenobiotika. Des Weiteren weisen hohe Ausfallraten von Arzneimitteln in der späten Entwicklungsphase auf die Notwendigkeit hin, die bisher verwendeten Testmethoden der präklinischen Phase zu verbessern. Diese Punkte wurden in dem im siebten Rahmenprogramm der EU finanzierten Projekt „Predict-IV“ aufgegriffen. Ziel des Projektes war es, die Vorhersage der Arzneimittelsicherheit durch integrierte „omics“-Technologien, angewendet an etablierten in vitro Ansätzen, zu verbessern. Dabei standen drei Zielorgane bzgl. Arzneimittel-induzierter Organtoxizität im Mittelpunkt: Leber, Niere und zentrales Nervensystem, die jeweils durch Zelllinien oder primäre Zellen vertreten waren. Um die in vitro generierten Dynamik-Daten mit der in vivo Situation in Korrelation zu bringen, muss die Kinetik der Testsubstanz berücksichtigt und die Ergebnisse mit Hilfe von physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung extrapoliert werden. 
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Kinetik-Daten der gewählten Testsubstanzen (Cyclosporin A, Adefovir dipivoxil und Cisplatin) in vitro zu erheben und bzgl. ihrer Zuverlässigkeit sowie ihrer Relevanz verglichen mit in vivo Daten zu beurteilen. Hierfür wurden kultivierte Zellen täglich bzw. jeden zweiten Tag für zwei Wochen mit zwei verschiedenen Konzentrationen (toxisch und nicht toxisch) des Arzneimittels behandelt. Der Gehalt des applizierten Arzneimittels oder die Hauptmetaboliten wurden mittels LC MS/MS oder ICP-MS in Vehikel, Medium und Zellen sowie die vom Plastik adsorbierte Menge in Proben bestimmt, die am ersten und letzten Behandlungstag zu fünf unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurden.
Eine eindeutige Bioakkumulation von Cyclosporin A wurde in primären Rattenhepatozyten nach Behandlung mit der hohen Konzentration festgestellt. Eine effiziente CYP3A4- und CYP3A5-vermittelte Biotransformation von Cyclosporin A wurde für primäre humane Hepatozyten sowie HepaRG Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmten mit der in vivo Situation überein. Ratten sind aufgrund ihrer geringen CYP3A Aktivität schlechte Tiermodelle für CYP3A-Biotransformationsstudien. Des Weiteren wurden Interassay-Schwankungen bei primären human Hepatozyten bemerkt, die auf die biologische Variabilität der CYP3A4- sowie CYP3A5-Aktivität zwischen den menschlichen Spendern zurückzuführen sind. Rattenhepatozyten und HepaRG Zellen hingegen wiesen Interassay-Schwankungen auf, die durch unterschiedliche Cyclosporin A Behandlungskonzentrationen zwischen den Replikaten verursacht wurden. Die Cyclosporin A Biotransformation war in HepaRG Zellen am stärksten ausgeprägt, was durch stabile und wesentlich höhere CYP3A4- und CYP3A5-Aktivität in HepaRG Zellen zu erklären ist. Zusätzlich wurden die in vitro Clearance-Werte bestimmt und auf in vivo Clearance-Werte extrapoliert. Alle extrapolierten Werte waren zu hoch geschätzt (primäre Rattenhepatozyten: 10fach, primäre human Hepatpzyten: 2fach, HepaRG Zellen: 2fach). Diese Ergebnisse sollten mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung sowie durch weitere Experimente überprüft werden, um zu ermitteln, ob diese hohen Schätzungen für jedes System konstant sind und somit durch die Einführung von weiteren Skalierungsfaktoren verringert werden können.
Kultivierte Gehirnzellen, primäre Nervenzellkulturen der Kortex von Mäusen und primäre Hirnzellaggregate der Ratte, zeigten schnell erreichte Cyclosporin A Gleichgewichtskonzentrationen. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Verteilung von Cyclosporin A zwischen der wässrigen und organischen Phase hin, wobei biologische Prozesse nur eine untergeordnete Rolle spielen. Daher scheint die intrazelluläre Cyclosporin A Aufnahme Transporter-vermittelt zu sein. Ergebnisse der Transporter Experimente, die an einer künstlichen Membran und Caco-2 Zellen durchgeführt wurden, unterstützten diese Hypothese. Messungen der Plastikbindung von Cyclosporin A zeigten signifikante, aber für jedes Zellsystem unterschiedliche, Adsorptionsraten, die mittels physiologisch-basierter pharmakokinetischer Modellierung berücksichtigt werden sollten. 
Die Kinetik von Adefovir dipivoxil machte auf die Nachteile von in vitro Versuchen aufmerksam. Für die intrazelluläre Aufnahme von Adefovir sind aktive Transportproteine nötig, die jedoch in der Nierenzelllinie RPTEC/TERT1 nicht funktionell vorhanden sind. Daher war die Aufnahme von Adefovir auf die passive Diffusion von Adefovir dipivoxil beschränkt, das aber auch zeitabhängig unter den experimentellen Konditionen zerfiel. 
Die an RPTEC/TERT1 Zellen untersuchte Kinetik von Cisplatin deutete auf eine intrazelluläre Platin-Anreicherung hin, die jedoch nicht in einer signifikanten Bioakkumulation resultierte. Möglicherweise sind innerhalb von 14 Tagen die Gleichgewichtskonzentrationen von Cisplatin noch nicht erreicht. Die Kinetikprofile von Cisplatin in Medium ließen einen aktiven, von der basolateralen zur apikalen Seite gerichteten Cisplatin Transport erkennen, wie schon in vivo beschrieben, wobei die Geschwindigkeit dieser Transportprozesse in vitro langsamer zu sein scheint als in der intakte Niere. Daher müssen die generierten Daten zur Schätzung von zellulären Prozessen modelliert werden, um durch anschließende Extrapolation mit in vivo Daten verglichen werden zu können.
Abschließend bleibt zu sagen, dass das experimentelle Design vorteilhaft war. Wiederholte tägliche Administration von zwei unterschiedlichen Konzentrationen eines Medikaments ermöglichte die Erfassung von Bioakkumulation bei toxischen Konzentrationen sowie Biotransformation/Export bei nicht-toxischen Konzentrationen. Potenzielle Fehler, die zu einer Fehlinterpretation führen könnten, wurden durch die exakte Bestimmung der tatsächlich applizierten Arzneimittelmenge reduziert, da nicht immer die applizierte Konzentration mit der Nominalkonzentration übereinstimmt. Darüber hinaus erwies es sich als Vorteil, die Arzneimittelkonzentrationen in den einzelnen Kompartimenten (Medium, Zellen und Plastik) zu bestimmen. Somit konnten zum einen Erkenntnisse über die Verteilung der Substanz gewonnen werden und zum anderen Fehleinschätzungen von zellulären Prozessen, z.B. Biotransformation, verhindert werden, was letzten Endes bei die Interpretation von Kinetik-Daten behilflich ist. Jedoch, wurden auch die Grenzen von in vitro Ansätzen deutlich. Für eine korrekte Extrapolation ist es unverzichtbar, dass die untersuchten in vitro Systeme funktionierende Proteine aufweisen, die bei der untersuchten Arzneimittel-induzierten Toxizität eine Schlüsselrolle übernehmen. Abschließend kann festgehalten werden, dass es, unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile, von Nutzen sein kann diesen Versuchsansatz der Langzeitbehandlung zu validieren und darüber hinaus auf Co Kultursysteme sowie Organ-Chips anzuwenden hinsichtlich der Entwicklung von Alternativmethoden für Toxizitätsstudien bei wiederholter Gabe.
KW  - cell culture
KW  - pharmacokinetics
KW  - repeated dose
KW  - in vitro
KW  - toxicity testing
KW  - Zellkultur
KW  - In vitro
KW  - Pharmakokinetik
KW  - Toxizitätstest
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122693
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Chen, Wen
A1  - Gaßner, Birgit
A1  - Börner, Sebastian
A1  - Nikolaev, Viacheslav O.
A1  - Schlegel, Nicolas
A1  - Waschke, Jens
A1  - Steinbronn, Nadine
A1  - Strasser, Ruth
A1  - Kuhn, Michaela
T1  - Atrial natriuretic peptide enhances microvascular albumin permeability by the caveolae-mediated transcellular pathway
JF  - Cardiovascular Research
N2  - Aims 
Cardiac atrial natriuretic peptide (ANP) participates in the maintenance of arterial blood pressure and intravascular volume homeostasis. The hypovolaemic effects of ANP result from coordinated actions in the kidney and systemic microcirculation. Hence, ANP, via its guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor and intracellular cyclic GMP as second messenger, stimulates endothelial albumin permeability. Ultimately, this leads to a shift of plasma fluid into interstitial pools. Here we studied the role of caveolae-mediated transendothelial albumin transport in the hyperpermeability effects of ANP.
Methods and results 
Intravital microscopy studies of the mouse cremaster microcirculation showed that ANP stimulates the extravasation of fluorescent albumin from post-capillary venules and causes arteriolar vasodilatation. The hyperpermeability effect was prevented in mice with conditional, endothelial deletion of GC-A (EC GC-A KO) or with deleted caveolin-1 (cav-1), the caveolae scaffold protein. In contrast, the vasodilating effect was preserved. Concomitantly, the acute hypovolaemic action of ANP was abolished in EC GC-A KO and Cav-1−/− mice. In cultured microvascular rat fat pad and mouse lung endothelial cells, ANP stimulated uptake and transendothelial transport of fluorescent albumin without altering endothelial electrical resistance. The stimulatory effect on albumin uptake was prevented in GC-A- or cav-1-deficient pulmonary endothelia. Finally, preparation of caveolin-enriched lipid rafts from mouse lung and western blotting showed that GC-A and cGMP-dependent protein kinase I partly co-localize with Cav-1 in caveolae microdomains.
Conclusion 
ANP enhances transendothelial caveolae-mediated albumin transport via its GC-A receptor. This ANP-mediated cross-talk between the heart and the microcirculation is critically involved in the regulation of intravascular volume.
KW  - caveolin-1
KW  - microvessel permeability
KW  - atrial natriuretic peptide
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126562
N1  - Lizenzhinweis: The online version of this article has been published under an open access model. Users are entitled to use, reproduce, disseminate, or display the open access version of this article for noncommercial purposes provided that the original authorship is properly and fully attributed; the Journal, Learned Society and Oxford University Press are attributed as the original place of publication with correct citation details given; if an article is subsequently reproduced or disseminated not in its entirety but only in part or as a derivative work this must be clearly indicated.
VL  - 93
IS  - 1
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zink [geb. Sondergeld], Thomas Gerd
T1  - Der Cofilin-Signalweg im Glioblastoma multiforme - Ursachen für den Verlust von Chronophin und Einfluss von LIM-Kinase-Inhibitoren
T1  - The cofilin pathway in glioblastoma multiforme - Reasons for chronophin loss and effect of LIM-kinase inhibitors
N2  - Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2.

Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. 
In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. 

Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf. 

Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe.
N2  - The invasive potential of malignant gliomas is the main reason for the dismal prognosis of this tumor entity. Migration and invasion of tumor cells is crucially determined by the cofilin dependent reorganization of the actin cytoskeleton regulated by the activity of antagonistic cofilin kinases and phosphatases.

This study revealed a progressive loss of expression of the cofilin phosphatase chronophin with increasing malignancy grade of astrocytic glioma, accompanied by an increase of cofilin phosphorylation. Moreover, the analyzed glioma specimens were characterized by a simultaneous increase of expression of the cofilin kinase LIMK-2.

Integrated genetic and epigenetic analysis of the chronophin locus identified an aberrant promoter methylation as a possible mechanism leading to chronophin down-regulation in glioblastoma tissue samples. In contrast, molecular alterations of the chronophin locus were undetectable in glioblastoma cell lines characterized by different chronophin expression levels.       

Analysis of glioblastoma cells demonstrated striking effects of ROCK and LIMK inhibitors on cell morphology, providing first evidence of the induction of a stellate cell-phenotype by the LIMK inhibitor BMS-5. While ROCK and LIMK inhibitors had no detectable effect on the 2D motility of the tumor cells, the inhibitors increased or decreased the 3D-invasiveness of the glioma cells depending on their basal cofilin activity.

The findings of this study stress the importance of the cofilin signaling pathway as a key regulator of glioma migration and invasion, indicate novel targets for glioma therapy, but also warn against a noncritical use of new drugs.
KW  - Cofilin
KW  - Glioblastom
KW  - Chronophin
KW  - Actin
KW  - Rho-Proteine
KW  - PDXP
KW  - LIMK
KW  - BMS-5
KW  - Signalkette
KW  - Rho-GTPasen
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127065
ER  - 
TY  - THES
A1  - Makiol, Christian
T1  - Die Rolle der durch NADPH-Oxidasen produzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Pathophysiologie von Hypertonie und Alterung
T1  - The role of nadph-oxidase produced reactive oxygen species (ROS) in the pathophysiology of hypertension and aging
N2  - Reaktive Sauerstoffradikale spielen eine große Rolle bei der Entstehung von Karzinomen, im Alterungsprozess und bei kardiovaskulären Erkrankungen (Valko et al., 2007). Solche Sauerstoffradikale können unter anderem durch die NADPH-Oxidase gebildet werden (Finkel and Holbrook, 2000). 
Ziel der Arbeit war es, die Rolle von ROS im Alterungsprozess und bei Bluthochdruck aufzuzeigen. Dafür wurden zwei Tiermodelle, eines mit einer geringen ROS-Konzentration und eines mit einer hohen ROS-Konzentration, verwendet. Zum einen handelt es sich um ein p47-Knockout-Mausmodell für die geringere ROS-Konzentration, im Vergleich zu alten und jungen Wildtyp-Tieren. Für die Rolle von ROS bei der Alterung wurden junge mit alten Wildtyp-Tieren verglichen. Um die Rolle der NOX2 in den ROS-Spiegeln der Organe zu ermitteln wurden gleichaltrige Wildtyp- mit p47-Knockout-Tieren verglichen. Zum anderen nutzten wir ein ren2-Tiermodell für die hohe ROS-Konzentration. Hierbei handelt es sich um ein Bluthochdruckmodell, in dem der Blutdruck mit Medikamenten normalisiert werden kann. Die Tiere wurden daher mit Ramipril (ACE-Inhibitor), Apocynin (NADPH-Oxidase-Inhibitor) und Tempol (Radikalfänger) behandelt. Als Maß für die ROS-Konzentration wurden die Superoxidionenspiegel mithilfe einer Dihydroethidium-Färbung ermittelt. Die DNA-Doppelstrangbrüche wurden mit einer γH2AX-Antikörper-Färbung nachgewiesen und die Expression von Sirtuin1 und Hsp70, welche als Anti-Aging Proteine bekannt sind, mittels Western Blot bestimmt.
N2  - Reactive oxygen species play a major role in the etiology of cancer, in the  aging process and cardiovascular diseases (Valko et al., 2007). These oxygen radicals may be formed by the NADPH oxidase enzym complex (Finkel and Holbrook, 2000). 
The aim of the study is to analyse the effect of ROS in the aging process and hypertension. Therefore two models were used. Young and old wild-type animals were used and compared with young p47 knockout mice, which have a reduced ROS level. As a model with increased  ROS levels the ren2-rat model was applied. Those animals were treated with different drugs such as ramipril (ACE inhibitor), apocynin (NADPH oxidase inhibitor) and tempol (radical scavenger). The superoxide concentration was determined in kidney and heart by using dihydroethidium-staining. The DNA double strand breaks were detected by staining with an γH2AX antibody and the expression of Sirtuin1 and Hsp70 which are known as anti-aging proteins, were determined by Western Blot.
KW  - Reaktive Sauerstoffspezies
KW  - Hypertonie
KW  - Alterung
KW  - NADPH-Oxidase
KW  - reaktive Sauerstoffspezies
KW  - Hypertonie
KW  - Alterung
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109901
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mandel, Philipp
T1  - Entstehung von oxidativen Stressmarkern in DNA und RNA nach der Behandlung mit den Hormonen Angiotensin II und Aldosteron in vitro und in vivo : Vergleich von drei Analysemethoden zum Nachweis von 8-Oxo-2'-desoxyguanosin in LLC-PK1-Zellen
T1  - Formation of oxidative stress markers in DNA and RNA after treatment with aldosterone and angiotensin II in vitro and in vivo
N2  - The detection of oxidative stress markers has gained increasing importancy in the early investigation of diseases like diabetes, cancer or hypertension. 8 oxo 2' deoxyguanosine (8-oxodG) is the main marker, which is used for the intracellular detection of oxidative stress levels. However, the oxidative stress markers 8 oxoguanine (8-oxoGua), a product of the DNA base excision repair and 8 oxoguanosine (8-oxoGuo), a marker for oxidative damaged RNA have received less attention up to now.
The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) plays an important role in the regulation processes of the blood pressure system. During hypertension angiotensin II (Ang II) and aldosterone (Aldo) are released in high concentrations over a longer period leading to non-physiological effects of the RAAS hormones. Subsequently, an increase of the intracellular oxidative stress level in kidney cells can be measured. The aim of this thesis is the in vitro and in vivo detection of the oxidative damage in DNA and RNA by measuring oxidative stress markers, especially 8-oxodG which is triggered by Ang II and Aldo.
In vitro experiments were carried out in LLC-PK1, a cell line originated from porcine kidney cells. It could been shown that Ang II and Aldo led to a dose-dependent increase of DNA damage in the cells. A time-dependent increase was detected for the first 30 minutes of the treatment. For the rest of the experimental set up (4 h) the level of detected DNA damage remained constant. The FPG comet assay and the immunocytochemical staining showed a significant increase of 8-oxodG in the cells, whereas the HPLC-MS/MS measurement only detected a small increase of 8-oxodG in the DNA. The FPG enzyme, which recognises also other oxidized purines besides 8-oxodG, which led to an overestimation of 8-oxodG in the comet assay. Also, the 8 oxodG antibody, which was used in the immunocytochemical analysis, detected higher amounts of 8-oxodG most likely due to its side reactions with other oxidized DNA structures. One of the main advantages of the last mentioned methods is the direct measurement in damaged cells, whereas the HPLC-MS/MS requires an isolation of the DNA. During this isolation process the oxidative stress markers can be oxidized and the detection can become imprecise.
The main purpose of the in vivo experiments was the detection of the oxidative stress marker 8-oxoGua, 8-oxodG and 8-oxoGuo in the urine of test animals. The treatment of C57BL/6 mice and Sprague Dawley (SD) rats with the RAAS hormones led to an increase of the blood pressure, higher DNA damage due to oxidative stress as well as an increased excretion rate of oxidative stress markers. The inhibition of the angiotensin II type 1- or mineralocorticoid receptor and a mutation of the AT1a gene could show, that the DNA damage is independent from the hypertension. In addition, it was shown that the NOX4 is not alone responsible for the oxidative stress. Other NADPH oxidases must contribute to the induction of oxidative stress inside the cell. Moreover, the activation of the Nrf2 pathway has an influence on the effect of Aldo in SD rats.
The excretion rate of the oxidative stress markers in the 20 h urine of the treated animals showed how the equilibrium between the DNA repair and the oxidative stress level was changing over time. The measurement of 8-oxoGuo became more and more popular, because up to the fact that 80 % of the DNA is translated into RNA. Overall, the detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo is feasible for monitoring the disease or the healing process, because the measurement is non-invasive. The detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo in nucleic acids is a first step into the field of basic research methods, because it reveals a snapshot of the nucleic acid damage in the cell at a specific time point. Usually, there will be an overestimation of the oxidative stress marker resulting from the analytical method. Although, it is possible to detect an underestimation of oxidative stress markers in tissue samples if not all cell types are damaged equally. Therefore, a primary goal should be the detection of a stable oxidation product of guanine to insure a reliable detection strategy and for a better understanding of the equilibrium of DNA oxidation and repair.
N2  - Der Nachweis von oxidativen Stressmarkern hat bei der Untersuchung von Krankheiten wie Diabetes, Krebs und Hypertonie an großer Bedeutung gewonnen. Vor allem 8-Oxo-2’-desoxyguanosin (8-oxodG) wird gezielt mit verschiedenen Methoden gemessen und als Marker für oxidativen Stress herangezogen. Daneben haben 8 Oxoguanin (8-oxoGua), als Produkt aus der Basenexzisionsreparatur der DNA, sowie 8-Oxoguanosin (8-oxoGuo), als Biomarker für oxidativ geschädigte RNA, bisher weniger Aufmerksamkeit bekommen. Das Renin-Angiotensin Aldosteron System (RAAS) spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung des Blutdrucks. Im Falle einer Hypertonie werden Angiotensin II (Ang II) und Aldosteron (Aldo) über einen langen Zeitraum in erhöhter Konzentration ausgeschüttet. Dieser Umstand bewirkt eine nicht physiologische Wirkung der Hormone des RAAS, welche zu einer Induktion von oxidativem Stress führt. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die oxidative Schädigung, ausgelöst durch Ang II und Aldo, in der DNA und der RNA in vitro und in vivo nachzuweisen und dabei speziell den Biomarker 8-oxodG zu untersuchen.
In-vitro-Experimente wurden mit LLC PK1-Zellen, einer Schweinenierenzelllinie, durchgeführt. Ang II und Aldo lösten einen dosisabhängigen Anstieg der DNA Schäden in LLC PK1 Zellen aus. Eine Zeitabhängigkeit wurde für die ersten 30 Minuten gezeigt. Für die restliche Zeit (4 h) blieb der nachgewiesene DNA Schaden konstant. Der FPG Comet-Assay und die immunzytochemische Färbung zeigten jeweils eine signifikante Zunahme von 8-oxodG in LLC-PK1-Zellen an, während die HPLC MS/MS Messung nur geringe Veränderungen nachwies. Das FPG Enzym erkennt neben 8-oxodG auch andere oxidierte Purine und sorgte so für eine Überbestimmung des DNA-Schadens. Bei der immunzytochemischen Färbung entsteht die Überbestimmung durch Kreuzreaktionen des 8 oxodG Antikörpers mit oxidierten Strukturen in der DNA. Der Vorteil beider Analysemethoden ist die direkte Messung von Schädigungen in der Zelle, während die HPLC-MS/MS eine Isolierung der Nukleinsäuren voraussetzt. Bei diesem Schritt kann es zur Oxidation der Marker für oxidativen Stress kommen, welche einen genauen Nachweis erschwert.
In vivo-Versuche hatten zum Ziel, die oxidativen Stressmarker 8-oxoGua, 8-oxodG und 8-oxoGuo im Urin nachzuweisen. Die Behandlung der C57BL/6-Mäuse und Sprague Dawley-Ratten (SD-Ratten) mit den Hormonen des RAAS zeigten einen Anstieg des Blutdrucks, erhöhte DNA Schäden durch oxidativen Stress sowie erhöhte Exkretionsraten der oxidativen Stressmarker. Durch eine Inhibierung des Angiotensin II-Typ1- oder Mineralkortikoidrezeptors sowie die Mutation des Gens AT1a konnte gezeigt werden, dass die Schädigungen unabhängig vom Blutdruck sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass neben NOX4 auch andere NADPH Oxidasen für den oxidativen Stress verantwortlich sein müssen. Eine Aktivierung des Nrf2 Signalweges in den SD-Ratten hat Einfluss auf die Wirkung von Aldo.
Die Exkretionsrate der oxidativen Biomarker im 20-h-Urin der behandelten Tiere zeigen, wie sich das Gleichgewicht zwischen DNA-Reparatur und oxidativem Stress verändert. Da 80 % der DNA in RNA umgeschrieben werden, ist der Nachweis von 8 oxoGuo in den Fokus gerückt. In der praktischen Anwendung kann mit der Messung von 8 oxodG und 8-oxoGuo ein Krankheits- oder Heilungsprozess auf nicht  invasive Weise verfolgt werden. Der Nachweis von 8-oxodG und 8-oxoGuo in den Nukleinsäuren stellt einen Einstieg für die Grundlagenforschung dar, da sie nur eine Momentaufnahme der Nukleinsäureschädigung in der Zelle zeigen. Meist findet eine Überbestimmung, ausgelöst durch die Messmethode, statt. In Gewebeproben kann eine Unterbestimmung vorliegen, falls nicht alle Zelltypen vom oxidativen  Stress  betroffen sind. Daher sollte es ein vorrangiges Ziel sein,  ein stabileres  Oxidationsprodukt des Guanins nachzuweisen, um das Gleichgewicht der DNA-Oxidation und Reparatur besser zu verstehen.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Aldosteron
KW  - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
KW  - Angiotensin II
KW  - LC-MS
KW  - oxidative Stressmarker
KW  - 8-Oxo-2’-desoxyguanosin
KW  - Hydroxylradikal
KW  - DNA-Reparatur
KW  - Mineralokortikoidrezeptor
KW  - 8-oxo-2'-deoxyguanosine
KW  - DNA base excision repair
KW  - hypertension
KW  - oxidative stress marker
KW  - RNA degradation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111190
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Rychlik, Michael
A1  - Humpf, Hans-Ulrich
A1  - Marko, Doris
A1  - Dänicke, Sven
A1  - Mally, Angela
A1  - Berthiller, Franz
A1  - Klaffke, Horst
A1  - Lorenz, Nicole
T1  - Proposal of a comprehensive definition of modified and other forms of mycotoxins including “masked” mycotoxins
JF  - Mycotoxin Research
N2  - As the term "masked mycotoxins" encompasses only conjugated mycotoxins generated by plants and no other possible forms of mycotoxins and their modifications, we hereby propose for all these forms a systematic definition consisting of four hierarchic levels. The highest level differentiates the free and unmodified forms of mycotoxins from those being matrix-associated and from those being modified in their chemical structure. The following lower levels further differentiate, in particular, "modified mycotoxins" into "biologically modified" and "chemically modified" with all variations of metabolites of the former and dividing the latter into "thermally formed" and "non-thermally formed" ones. To harmonize future scientific wording and subsequent legislation, we suggest that the term "modified mycotoxins" should be used in the future and the term "masked mycotoxins" to be kept for the fraction of biologically modified mycotoxins that were conjugated by plants.
KW  - definition
KW  - mycotoxins
KW  - masked mycotoxins
KW  - modified mycotoxins
KW  - hidden mycotoxins
KW  - mycotoxin derivates
KW  - mycotoxin metabolites
KW  - conjugated mycotoxins
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121240
VL  - 30
IS  - 4
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Ott, Ilka
A1  - Lohse, Martin J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Vogt-Moykopf, Ingolf
A1  - Schwabe, Ulrich
T1  - Effects of Adenosine on Histamine Release from Human Lung Fragments
JF  - International Archives of Allergy and Immunology
N2  - The actions of adenosine on histamine release of human lung fragments were investigated. Histamine release was stimulated either with the calcium ionophore A 23187 orwith concanavalin A. Adenosine and its analogue 5'-N-ethylcarboxamidoadenosine alone had no significant effect on basal release or on the release elicited by A 23187 or concanavalin A. However, in the presence of the adenosine receptor antagonist 8-[4-[[[[(2-aminoethyl)amino]-carbonyl] methyloxy]-phenyl]-1,3-dipropylaxanthine (XAC), which itself did not affect the release, adenosine increased the stimulated histamine release. On the other hand, in the presence of the nucleoside transport inhibitor S-(p-nitrobenzyl)-6-thioninosine (NBTI), adenosine caused a reduction in stimulated histamine release. NBTI itself caused a stimulation of release. Thus, a stimulatory effect of adenosine was seen in the presence ofXAC, whereas an inhibitory effect was unmasked by NBTI. From these data it is concluded that adenosine exerts two opposing effects on histamine release in the human lung which neutralize each other: it inhibits release via a si te antagonized by XAC, which presumably represents an A2 adenosine receptor, and it stimulates release via a mechanism that is blocked by NBTI, suggesting that adenosine needs to reach the interior of cells to exert this effect. The slight stimulatory effect of NBTI alone demonstrates that trapping intracellularly formed adenosine inside mast cells leads to sufficient concentrations of adenosine to stimulate histamine release. These findings suggest an important bimodal role of adenosine in regulating histamine release in the human lung.
KW  - mast cells
KW  - adenosine
KW  - histamine release
KW  - human lung
Y1  - 1982
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127877
VL  - 98
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, Martin J.
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Salzer, Manfred J.
A1  - Schwabe, Ulrich
T1  - Adenosine regulates the \(Ca^{2+} \) sensitivity of mast cell mediator release : (histamine secretion/inositol phosphates/calcium)
JF  - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
N2  - Mast cells release histamine and other mediators of allergy in response to stimulation of their IgE receptors. This release is generally thought to be mediated by an elevation of cytosolic \(Ca^{2+}\). Recent evidence suggests that there might be factors that modulate the coupling between \(Ca^{2+}\) levels and mediator release. The present report identifies adenosine as one such modulator. Adenosine and several of its metabolically stable analogues were shown to enhance histamine release from rat peritoneal mast cells in response to stimuli such as concanavalin A. Metabolizing endogenous adenosine with adenosine deaminase dampened the response to stimuli, whereas trapping endogenous adenosine inside mast cells with nucleoside-transport inhibitors markedly enhanced stimulated histamine release. The metabolically stable adenosine analogue 5' -(N-ethylcarboxamido)adenosine (NECA) did not affect the initial steps in the sequence from IgE-receptor activation to mediator release, which are generation of inositol trisphosphate and increase of cytosolic \(Ca^{2+}\). However, NECA did enhance the release induced in ATP-permeabilized cells by exogenous \(Ca^{2+}\), but it had no effect on the release induced by phorbol esters. These data suggest that adenosine sensitizes mediator release by a mechanism regulating stimulus-secretion coupling at a step distal to receptor activation and second-messenger generation.
Y1  - 1988
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127883
VL  - 85
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lohse, M. J.
A1  - Klotz, K.-N.
A1  - Ukena, D.
A1  - Schwabe, U.
T1  - Characterization of \([^3H]\)Phenobarbital Binding to Rat Brain Membranes
JF  - Neuroscience Letters
N2  - The binding of \([^3H]\)phenobarbital to rat brain membranes was studied in order to determine its characteristics and specificity. The binding reaction was rapid and occurred at sites of low affinity. \((K_d = 700 μM)\) and very high density \((B_{max} = 2.7 nmoll/mg protein)\). It was unaffected by temperature changes from O°C to 95°C and was maximal at pH 5. Detergents in low concentrations markedly decreased the binding, apparently without solubilizing the binding sites. It is concluded that the binding of \([^3H]\) phenobarbital is a rather non-specific interaction with the plasma membrane.
KW  - barbiturates
KW  - radioligand binding
KW  - rat brain membranes
Y1  - 1984
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127894
VL  - 52
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Boivin, Valérie
A1  - Beyersdorf, Niklas
A1  - Palm, Dieter
A1  - Nikolaev, Viacheslav O.
A1  - Schlipp, Angela
A1  - Müller, Justus
A1  - Schmidt, Doris
A1  - Kocoski, Vladimir
A1  - Kerkau, Thomas
A1  - Hünig, Thomas
A1  - Ertl, Georg
A1  - Lohse, Martin J.
A1  - Jahns, Roland
T1  - Novel Receptor-Derived Cyclopeptides to Treat Heart Failure Caused by \(Anti-β_1-Adrenoceptor\) Antibodies in a Human-Analogous Rat Model
JF  - PLoS One
N2  - Despite recent therapeutic advances the prognosis of heart failure remains poor. Recent research suggests that heart failure is a heterogeneous syndrome and that many patients have stimulating auto-antibodies directed against the second extracellular loop of the \(β_1\) adrenergic receptor \((β_1EC2)\). In a human-analogous rat model such antibodies cause myocyte damage and heart failure. Here we used this model to test a novel antibody-directed strategy aiming to prevent and/or treat antibody-induced cardiomyopathy. To generate heart failure, we immunised n = 76/114 rats with a fusion protein containing the human β1EC2 (amino-acids 195–225) every 4 weeks; n = 38/114 rats were control-injected with 0.9% NaCl. Intravenous application of a novel cyclic peptide mimicking \(β_1EC2\) (\(β_1EC2-CP\), 1.0 mg/kg every 4 weeks) or administration of the \(β_1-blocker\) bisoprolol (15 mg/kg/day orally) was initiated either 6 weeks (cardiac function still normal, prevention-study, n = 24 (16 treated vs. 8 untreated)) or 8.5 months after the 1st immunisation (onset of cardiomyopathy, therapy-study, n = 52 (40 treated vs. 12 untreated)); n = 8/52 rats from the therapy-study received \(β_1EC2-CP/bisoprolol\) co-treatment. We found that \(β_1EC2-CP\) prevented and (alone or as add-on drug) treated antibody-induced cardiac damage in the rat, and that its efficacy was superior to mono-treatment with bisoprolol, a standard drug in heart failure. While bisoprolol mono-therapy was able to stop disease-progression, \(β_1EC2-CP\) mono-therapy -or as an add-on to bisoprolol- almost fully reversed antibody-induced cardiac damage. The cyclo¬peptide acted both by scavenging free \(anti-β_1EC2-antibodies\) and by targeting \(β_1EC2\)-specific memory B-cells involved in antibody-production. Our model provides the basis for the clinical translation of a novel double-acting therapeutic strategy that scavenges harmful \(anti-β_1EC2-antibodies\) and also selectively depletes memory B-cells involved in the production of such antibodies. Treatment with immuno-modulating cyclopeptides alone or as an add-on to \(β_1\)-blockade represents a promising new therapeutic option in immune-mediated heart failure.
KW  - memory B cells
KW  - antibodies
KW  - T cells
KW  - B cells
KW  - heart
KW  - heart failure
KW  - kidneys
KW  - enzyme-linked immunoassays
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126028
VL  - 10
IS  - 2
ER  - 
TY  - THES
A1  - Segerer, Gabriela
T1  - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM
T1  - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM
N2  - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer.
Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized.
This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos.
To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation.
The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells.
These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling.
Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase.
To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions.
Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under
hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP).
Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism.
Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism.
N2  - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus.
Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht.
Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert.
Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität.
Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden.
Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert.
Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären.
PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf.
Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen.
KW  - Phosphoglykolatphosphatase
KW  - Phosphoglykolat-Phosphatase
KW  - Maus
KW  - Cytologie
KW  - Physiologie
KW  - Phosphatasen
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stumpf, Anette D.
T1  - Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors
T1  - Entwicklung fluoreszenter FRET Rezeptor-Sensoren zur Untersuchung von Konformationsänderungen in Adenosin A1 und A2A Rezeptoren
N2  - Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors
A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements.
For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement
of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can
lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future.
N2  - Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen
den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche
mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den
A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende
mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der
Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet
werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte.
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Adenosine receptors
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Calebiro, Davide
A1  - Maiellaro, Isabella
T1  - cAMP signaling microdomains and their observation by optical methods
JF  - Frontiers in Cellular Neuroscience
N2  - The second messenger cyclic AMP (cAMP) is a major intracellular mediator of many hormones and neurotransmitters and regulates a myriad of cell functions, including synaptic plasticity in neurons. Whereas cAMP can freely diffuse in the cytosol, a growing body of evidence suggests the formation of cAMP gradients and microdomains near the sites of cAMP production, where cAMP signals remain apparently confined. The mechanisms responsible for the formation of such microdomains are subject of intensive investigation. The development of optical methods based on fluorescence resonance energy transfer (FRET), which allow a direct observation of cAMP signaling with high temporal and spatial resolution, is playing a fundamental role in elucidating the nature of such microdomains. Here, we will review the optical methods used for monitoring cAMP and protein kinase A (PKA) signaling in living cells, providing some examples of their application in neurons, and will discuss the major hypotheses on the formation of cAMP/PKA microdomains.
KW  - G protein-coupled receptor
KW  - cyclic AMP
KW  - signaling microdomain
KW  - fluorescence resonance energy transfer
KW  - neurons
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118252
SN  - 1662-5102
VL  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kopp, Eva Katharina
T1  - Biotransformation and Toxicokinetics of Acrylamide in Humans
T1  - Biotransformation und Toxikokinetik von Acrylamid im Menschen
N2  - The widely used chemical acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen. This classification was based on positive results in rodent carcinogenicity studies as well as on a number of in vitro mutagenicity assays. In 2002, AA was discovered to be formed during the preparation of starch-containing foods. According to the latest FDA exposure assessment (2006), the average daily intake has been estimated from AA levels in foodstuffs and from nutritional habits to be around 0.4 µg/kg b.w. with a 90th percentile of 0.95 µg/kg b.w.. In children and adolescents however, the daily AA intake is about 1.5 times higher, due to lower body weight and differing consumption patterns. Apart from the diet, humans may be exposed to AA during the production or handling of monomeric AA, from AA residues in polyacrylamides, and from cigarette smoke. After oral administration, AA is readily absorbed and distributed throughout the organism. AA is metabolized to the reactive epoxide glycidamide (GA) via the CYP 450 isoenzyme CYP 2E1. Both, AA and GA are conjugated with glutathione. After enzymatic processing, the mercapturic acids N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)-L-cysteine (AAMA) as well as the regioisomers N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cysteine (GAMA) and N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxy-ethyl)-L-cysteine (iso-GAMA) are excreted with urine. An additional pathway for the metabolic conversion of GA is the epoxide hydrolase mediated hydrolysis to the diol compound glyceramide. Following administration of AA at doses exceeding the daily dietary intake by a factor of 1000 - 6000 to human subjects, a new urinary metabolite was found, which could be identified as the S-oxide of AAMA (AAMA-sulfoxide). In general, data from animal studies are used for risk assessment of (potential) human carcinogens. However, inter-species differences in toxicodynamics or toxicokinetics, e.g. in biotransformation may lead to under- or overestimation of human risk. The objective of this work was to establish a highly specific and sensitive analytical method to quantify the major urinary metabolites of AA. Other aims apart from measurements concerning the human background exposure were the evaluation of biotransformation and toxicokinetics of AA in humans and rats after oral administration of 13C3-AA. The obtained data was intended to help avoid linear extrapolation from animal models for future risk assessments of AA carcinogenicity.
N2  - Die weitverbreitete Chemikalie Acrylamid (AA) wurde als möglicherweise krebserregend im Menschen eingestuft. Diese Klassifizierung beruhte auf positiven Ergebnissen aus Kanzerogenitätsstudien in Nagern sowie einer Reihe von in vitro Mutagenitätstests. Im Jahr 2002 wurde entdeckt, dass AA während der Zubereitung von stärkehaltigen Nahrungsmitteln entsteht. Nach den neuesten Expositionsabschätzungen der FDA (2006) wurde auf der Basis von AA-Gehalten in Lebensmitteln und Ernährungsgewohnheiten eine tägliche Aufnahme von etwa 0.4 µg/kg KG (Körpergewicht) errechnet. Die 90. Percentile lag bei 0.95 µg/kg KG. In Kindern und Heranwachsenden ist die tägliche AA Aufnahme jedoch um etwa Faktor 1.5 höher. Dies beruht auf einem vergleichsweise geringeren Körpergewicht und anderen Ernährungsvorlieben (175). Außer über die Nahrung können Menschen während der Produktion oder Verarbeitung von monomerem AA, über Rückstände in Polyacrylamiden und über Zigarettenrauch gegenüber AA exponiert sein. Nach oraler Gabe wird AA schnell resorbiert und im ganzen Organismus verteilt . AA wird über das Cytochrom P450 Isoenzym CYP 2E1 in das reaktive Epoxid Glycidamid (GA) umgewandelt. Sowohl AA als auch GA binden an Glutathion. Nach enzymatischer Verstoffwechslung werden die Mercaptursäuren N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)-L-cystein (AAMA) sowie die Regioisomere N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cystein (GAMA) und N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-L-cystein (iso-GAMA) mit dem Urin ausgeschieden. Ein weiterer Weg für die metabolische Umwandlung von GA ist die durch Epoxidhydrolase katalysierte Hydrolyse zum Diol Glyceramid. Nach der Verabreichung von AA an Menschen in Dosen, die die tägliche Aufnahme über die Nahrung um das 1000 bis 6000-fache überschritten, wurde ein neuer Metabolit im Urin entdeckt, der als das S-oxid von AAMA identifiziert werden konnte. Im Allgemeinen werden Daten aus Tierstudien für die Risikobewertung von (möglichen) Kanzerogenen im Menschen verwendet. Spezies-Unterschiede bezüglich der Biotransformation können demzufolge zu Unter- oder Überbewertung des Risikos für den Menschen führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine hochspezifische und empfindliche analytische Methode für die Quantifizierung der wichtigsten Metaboliten von AA im Urin zu entwickeln. Neben Messungen bezüglich der Hintergrundbelastung im Menschen sollten Biotransformation und Toxikokinetik von AA in Menschen und Ratten nach oraler Gabe von 13C3-AA bestimmt werden. Die gewonnenen Daten sollten dazu beitragen, lineare Extrapolation ausgehend von Tiermodellen für zukünftige Risikoabschätzungen zu vermeiden.
KW  - Acrylamid
KW  - Metabolismus
KW  - Toxikokinetik
KW  - Risikobewertung
KW  - Speziesunterschiede
KW  - Acrylamide
KW  - Metabolism
KW  - Toxicokinetics
KW  - Risk Assessment
KW  - Species Differences
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37273
ER  - 
TY  - THES
A1  - Merkle, Sabine
T1  - Kardiale Caspase-1 ist ein proapoptotischer Induktor für Herzinsuffizienz
T1  - A role for Caspase-1 in heart failure
N2  - Herzmuskelschwäche (Herzinsuffizienz) ist in industralisierten Ländern neben malignen Erkrankungen noch immer die zweithäufigste Todesursache. Das Zusammenspiel der zu einer Herzmuskelschwäche führenden, molekularen Signalwege und die zugrunde liegenden Mechanismen sind trotz intensiver Forschung bisher noch weitgehend unverstanden. Ein detailierteres Verständnis der Entstehung einer Herzinsuffizienz könnte somit entscheidend zur Entwicklung innovativer Therapiestrategien beitragen. Mit Hilfe eines cDNA Expressions Arrays wurde die differentielle Genexpression in einem murinen Herzinsuffizienzmodell untersucht. Die Cysteinprotease Caspase-1 ist eines der in diesem Array identifizierten Kandidatengene. Die verstärkte Expression der Caspase-1 konnte zunächst sowohl für die murine als auch die humane Herzinsuffizienz verifiziert werden. Caspasen werden klassischerweise, ihrer Funktion entsprechend, in proinflammatorische und proapoptotische Caspasen unterteilt. In der Literatur ist Caspase-1 als ein über die Generierung von aktivem IL-1? und IL-18 wirkender, proinflammatorischer Mediator beschrieben. IL-? und IL-18 sind proinflammatorische Zytokine und als solche zentrale Mediatoren bei entzündlichen Prozessen. Während die Funktion der proapoptotischen Caspasen bei Herzmuskelschwäche weitgehend bekannt ist, ist unklar, welche Bedeutung der verstärkten kardialen Expression der Caspase-1 bei der Entstehung und Progression der Herzmuskelschwäche zukommt. Zur funktionellen Analyse der verstärkten Expression der Caspase-1 in vivo wurde die Caspase-1 in einem transgenen Mausmodell kardial überexprimiert. Herzen mit verstärkter Expression der Caspase-1 entwickelten ab dem vierten Lebensmonat morphologische und funktionelle Veränderungen, die charakteristisch für eine angehende Herzinsuffizienz sind. Dennoch war, trotz progressiver Kardiomyozytenhypertrophie und Myokardfibrose, zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraumes (ein bis vierzehn Monate alt) eine Zunahme des Ventrikelgewichtes evident. Die funktionelle Analyse der Herzfunktion von neun Monate alten Caspase-1-transgenen Mäusen zeigte eine signifikante Einschränkung der Linksherzkontraktilität. Diese Herzinsuffizienz war schließlich auch makroskopisch an einer starken Linksherzdilatation als auch an einer Reduktion der linksventrikulären Wandstärke erkennbar. Ist die Induktion einer Herzinsuffizienz durch Caspase-1 als proinflammatorischer Mediator im Herzen zu erklären? In einer Reihe von Versuchen konnten keine Hinweise auf eine Induktion inflammatorischer Prozesse durch kardiale Caspase-1 festgestellt werden. Weder eine verstärkte Bildung der proinflammatorischen Zytokine IL-1? und IL-18, noch eine vermehrte Infiltration von Entzündungszellen oder eine verstärkte Proteinexpression weiterer Zytokine waren detektierbar. Ferner waren der oxidative Stresstatus und der nekrotische Gewebeuntergang im linksventrikulären Myokard Caspase-1-transgener Mäuse unverändert. Doch besonders im Herzmuskelgewebe junger Caspase-1-transgener Mäuse zeigte sich eine deutliche, mit fortschreitendem Alter bestehende Zunahme des apoptotischen Zelltods von Herzmuskelzellen. Diese direkte, proapoptotische Wirkung der kardialen Caspase-1 konnte ebenfalls in isolierten Kardiomyozyten von Caspase-1-transgenen Mäusen ex vivo und in vitro, nach adenoviraler Infektion von neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCM) mit Caspase-1, demonstriert werden. Durch Infektion von NRCM mit dem Caspase-1-exprimierenden Adenovirus (Adv-Casp-1) konnte eine selektive Aktivierung des intrinsischen apoptotischen Signaltransduktionsweges durch Caspase-1 nachgewiesen werden. Ist die endogen exprimierte Caspase-1 ein westenlicher Regulator kardialer Apoptose? In dem Kardiomyozytenapoptose-induzierenden Schädigungsmodell der Ischämie/Reperfusion waren die Caspase-1-defizienten Mäuse durch eine Reduktion der Kardiomyozytenapoptose um nahezu 75% gegenüber der Kontrollgruppe deutlich begünstigt. Des Weiteren zeigte die Ausschaltung der endogenen Caspase-1 in dem Herzinsuffizienzmodell des operativen Herzinfarkts eine deutliche Verminderung der reaktiven Kardiomyozytenhypertrophie und eine geringere Einschränkung der Herzkontraktilität. Diese Verbesserung des kardialen Phänotyps spiegelte sich ferner in einer reduzierten Sterblichkeit gegenüber der Kontrollgruppe wieder. Eine Inhibition der Caspase-1 stellt somit ein interessantes therapeutisches Target zur Prävention der Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar.
N2  - To date, heart failure is still, besides malignant diseases, one of the most frequent causes of death in industrialized countries. Despite intensive research progress, the interplay of molecular signaling pathways and the underlying mechanisms leading to heart failure are still poorly understood. However, more detailed insights in the development of heart failure are essential to develope novel therapeutic strategies. A cDNA-array was performed to identify differentially expressed genes in a murine heart failure model. Thereby, the cystein protease caspase-1 was identified as a novel potential target gene for heart failure development. First, the increased expression of caspase-1 was confirmed for murine and human heart failure. Accordingly to their function, caspases are traditionally divided into proinflammatory and proapoptotic caspases. Due to the generation of active IL-1? and IL-18, caspase-1 has been described as a potent proinflammatory mediator. The proinflammatory cytokines IL-1? and IL-18 are central mediators during inflammatory processes. While the function of the proapoptotic caspases during heart failure has been intensively studied, the role of caspase-1 during the development and progession of heart failure is unknown. To study the functional effect of an increased caspase-1 expression in vivo, transgenic mice with cardiac specific expression of caspase-1 were generated. From four month onwards, hearts with increased transgenic expression of caspase-1 displayed morphological and functional changes characteristic for heart failure. Despite progressive cardiomyocyte hypertrophy and myocardial fibrosis, the ventricular weight was not increased at any age studied (one to fourteen months old). The analysis of cardiac function revealed a significant impairment of left ventricular contractility at nine months of age. Finally, the manifest heart failure was also seen in a massive dilatation of the left ventricle and a reduced left ventricular wall thickness. Is the induction of heart failure originating from caspase-1 being a proinflammatory mediator in the heart? In a set of experiments, no indices for a induction of proinflammatory processes via cardiac caspase-1 were seen. Neither increased formation of the proinflammatory cytokines IL-1? and IL-18 nor enhanced infiltration of inflammatory cells nor increased production of other cytokines was detectable. Moreover, there were no signs for a raised oxidative stress and necrotic cell death in left ventricular tissue of caspase-1-transgenic mice. Heart sections of young caspase-1-transgenic mice in particular, displayed a pronounced and robust increase in cardiomyocyte apoptosis that was persistent at all ages studied. The direct proapoptotic effect of cardiac caspase-1 was corroborated by assessing apoptosis in isolated caspase-1-transgenic cardiomyocytes ex vivo and by further in vitro experiments with neonatal rat cardiomyocytes (NRCM). Moreover, adenovirally expressed caspase-1 in NRCM induced a selective activation of the intrinsic apoptotic signaling pathway. Can the proapoptotic function of overexpressed caspase-1 also be seen for the endogenous caspase-1? Caspase-1-deficient mice were protected from ischemia-reperfusion induced cardiomyocyte apoptosis by almost 75%, as compared to the corresponding wild-type control group. In the setting of heart failure after myocardial infarction, the deletion of endogenous caspase-1 significantly ameliorated reactive hypertrophic growth of cardiac myocytes and partly preserved cardiac contractility. Furthermore, the improved cardiac phenotype was reflected in a reduced mortality of caspase-1-deficient mice after myocardial infarction. To conclude, the inhibition of caspase-1 represents a potential therapeutic strategy to inhibit development and progression of heart failure.
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Apoptosis
KW  - Caspase-1
KW  - Transgenes Mausmodell
KW  - Heart failure
KW  - Apoptosis
KW  - Caspase-1
KW  - Transgenic mice
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25938
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kampfinger, Katja
T1  - Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen
T1  - Evidence of a mismatch repair deficiency in L5178Y Tk+/--3.7.2C mouse lymphoma cells
N2  - Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.
N2  - The development and approval of pharmaceuticals as well as the evaluation of xenobiotics require several test systems for the detection of genotoxicity. There is a number of established genotoxicity test systems, which are often based on cancer cell lines. In addition to mutations that are essential for genotoxicity testing, cancer cell lines may also carry mutations that might cause reactions not occurring in the primary cells of the organism. Therefore the knowledge of the genetic background of the cell line used is important for the evaluation of test results and the subsequent genotoxicity risk assessment. Among test systems that are based on cancer cells the mouse lymphoma cell line L5178Y adopts a very prominent position due to its worldwide application for genotoxicity testing. The dissertation on hand provides evidence that there are mutations in the L5178Y cell line that are related to the mismatch-repair system (MMR system). MMR participates in safeguarding the genomic integrity. In MMR-proficient cells, DNA defects that arise during replication, homologous recombination or as a result of genotoxic effects are either recognized and repaired or the genetically altered cells are eliminated by induction of apoptosis. MMR-deficient cells, however, survive despite serious DNA defects and accumulate them. The accumulation of DNA damage as result of treatment with alkylating agents had been observed in L5178Y cells while other cell lines had reacted with an induction of apoptosis. The induction of apoptosis after treatment with alkylating agents is described in the literature as a typical behaviour for MMR-deficient cells. From this the hypothesis was established, that L5178Y-cells might exhibit a MMR-deficient phenotype. This MMR-deficient phenotype was proven by selective treatment of L5178Y cells and cells with known MMR status with the alkylating agent MNNG followed by the subsequent comparison of the different reactions. The comparison was carried out by the detection of genotoxic effects using the micronucleus test and the comet assay. On the protein level there was not an indication that the observed MMR-deficiency was related to the the three most important MMR-proteins MSH2, MLH1 and MSH6: All proteins demonstrated expression levels that were comparable to the levels of the MMR-proficient control cells. On the DNA level, however, several mutations were detected by sequence analysis of the coding regions of all genes known to be involved in MMR. The most important among these mutations was an insertion mutation (964(insC)) in pms2, that caused a frameshift after 260 amino acids. By this frameshift, a stop-codon was introduced, leading to an interruption of the sequence after 313 amino acids. While the information of the N-terminal region of pms2 containing the DNA-binding domain as well as the ATPase active sites is still present, the information of the C-terminus is lost. This region is responsible for the dimerisation with the MMR-protein MLH1. Therefore, the MMR-function that is due to this complex, is missing. In conclusion, a MMR-deficiency of L5178Y cells was demonstrated. This MMR-deficiency is explained by an insertion-mutation in pms2 (964(insC)). Consideration of this MMR-deficiency enhances the meaningfulness of the evaluation of test results with L5178Y mouse lymphoma cells in risk assessment.
KW  - Maus
KW  - Zelle
KW  - L5178Y-Zellen
KW  - MMR-Reparatur
KW  - pms2
KW  - Genotoxizität
KW  - Alkylantien
KW  - L5178Y cells
KW  - mismatch repair
KW  - pms2
KW  - genotoxicity
KW  - alkylating agent
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klenk, Johann Christoph
T1  - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1
T1  - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1
N2  - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
N2  - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2.
KW  - Parathormon
KW  - Proteolyse
KW  - Endokrinologie
KW  - Calcium
KW  - Rezeptor
KW  - Retinales S-Antigen
KW  - GPCR
KW  - Matrix-Metalloprotease
KW  - NHERF
KW  - Signaltransduktion
KW  - G-Protein
KW  - GPCR
KW  - Matrix-Metalloproteinase
KW  - NHERF
KW  - signal transduction
KW  - G-protein
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schewe, Victoria Kristina
T1  - Mikrokernbildung in Mundschleimhautzellen von Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren während Radio-/Radiochemotherapie
T1  - Micronucleus formation kinetics in buccal mucosa cells of head and neck cancer patients undergoing radio-/radiochemotherapy
N2  - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Mikrokernbildung in Mundschleimhautzellen von 35 Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren während einer sechswöchigen Radio-/Radiochemotherapie und sechs Wochen danach darzustellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren im Vergleich zu gesunden Probanden erhöhte Mikrokernraten aufwiesen. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass es zu einer vermehrten Bildung von Mikrokernen während einer sechswöchigen Radio-/Radiochemotherapie kam. Nach Therapiebeendigung sanken die Werte nach drei bis sechs Wochen und lagen unter dem Ausgangswert, in dem Bereich von spontan entstehenden Mikrokernen. In Bezug auf die Tumorgröße konnte nur in der zweiten Woche ein signifikanter Unterschied in der Mikrokernrate zwischen T1- und T4-Stadium beobachtet werden. Es konnte keine Korrelation zwischen einer zusätzlich verabreichten Chemotherapie, Grading des Tumors, Alter sowie Geschlecht der Patienten und einem Anstieg der Mikrokernrate festgestellt werden.
N2  - In the present Study, normal tissue buccal mucosa cells from 35 patients with head and neck cancer were analyzed for formation of micronuclei during a 6-week radio-/radiochemotherapy and 6 weeks afterwards. The results showed that patients with head and neck cancer had increased micronucleus rates compared to healthy test persons. It could also be observed that there was an increased formation of micronuclei during a 6-week radio-/radiochemotherapy. After the end of therapy, the values decreased after three to six weeks. The tumor size showed in the second week a significant difference in the micronucleus rate between T1 and T4 stage. Age, gender, and tumor stage did not have an influence on the micronuclei formation kinetics.
KW  - Kleinkern
KW  - Mundschleimhaut
KW  - Strahlentherapie
KW  - Chemotherapie
KW  - Hals-Nasen-Ohren-Tumor
KW  - Mikrokern
KW  - micronucleus
KW  - Kopf-Hals-Tumor
KW  - head and neck cancer
KW  - Mundschleimhaut
KW  - buccal mucosa
KW  - Bestrahlung
KW  - radiation
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215354
ER  - 
TY  - THES
A1  - Witzinger, Linda
T1  - Rolle der Pyridoxal 5´-Phosphat Phosphatase PDXP im Vitamin B6-Metabolismus muriner Erythrozyten und Hippocampi
T1  - Role of the pyridoxal 5´-phosphate phosphatase PDXP in the vitamin B6 metabolism of murine red blood cells and hippocampi
N2  - Die Phosphatase PDXP (auch bekannt als Chronophin) gehört zur Familie der HAD Phosphatasen, einer ubiquitär exprimierten Enzymklasse mit wichtigen physiologischen Funktionen. PDXP zeigt Phosphatase-Aktivität gegenüber seinem Substrat Pyridoxal 5´-Phosphat (PLP), der aktivierten Form von Vitamin B6. PDXP-defiziente Mäuse (Knockout-Mäuse) weisen im Vergleich zu Wildtypen verdoppelte PLP-Konzentrationen in Erythrozyten sowie im Gesamthirn auf. Vermutlich kommt PDXP daher eine wichtige Funktion in Erythrozyten und im Hirn zu. Ziel dieser Arbeit war es, erste Einblicke in diese Funktion(en) von PDXP zu erlangen. 
Hierzu wurden HPLC-basierte Analysen der erythrozytären PLP-Konzentrationen in Wildtyp- sowie PDXP-defizienten Mäusen durchgeführt. Dabei ließen sich die rund doppelt so hohen erythrozytären PLP-Level in den KO-Mäusen bestätigen. Zudem ist es gelungen, eine Methode zur Messung der endogenen Phosphatase-Aktivität von PDXP in Erythrozytenlysaten zu etablieren. So konnte im Wildtyp anhand der Verringerung der PLP-Konzentrationen pro Zeiteinheit eine erythrozytäre PDXP-Aktivität nachgewiesen werden. Dazu waren die Inkubation mit Pyridoxin, sowie die Anwendung eines Inhibitors der PDXK notwendig. Eine bis dato vermutete Funktion der PDXP, zur Mobilisation von erythrozytärem PLP während Fastenzeiten, konnte ausgeschlossen werden. So zeigte der Vergleich der erythrozytären PLP-Konzentrationen aus gefasteten mit normal gefütterten Tieren in beiden Genotypen exakt dieselbe prozentuale PLP-Verringerung. Während Nahrungszufuhr ließ sich jedoch eine Funktion der Phosphatase PDXP als „Converter“ von Pyridoxin zu Pyridoxal erkennen. Ausgehend von PN konnte im Wildtyp (über die Zwischenprodukte PNP und PLP) eine PDXP-abhängige Dephosphorylierung von PLP zu PL erfolgen. So wies der Wildtyp eine rund vierfach höhere PL-Produktion auf, verglichen mit der PDXP-defizienten Maus. Die Phosphatase PDXP erwies sich als essenziell für die erythrozytäre Konversion von Pyridoxin zu Pyridoxal. Dadurch erreicht der Organismus eine metabolische Flexibilität, die ihn bis zu einem gewissen Grad unabhängig von der Nahrungsauswahl macht. Zudem können Zellen oder Organe, denen durch das Fehlen der PNPO, die Konversion zu PLP nicht möglich ist, mit PL versorgt werden. 
Aus der hohen Reaktivität von PLP mit umliegenden Nucleophilen ergibt sich eine gewisse Problematik für die Zelle im Umgang mit freiem PLP. So liegt der Großteil des erythrozytären PLPs gebunden an Proteine (vor allem Hämoglobin) vor. Anhand von Filtern (MWCO, 3000) ließ sich zwischen der hier definiert als „freien“ und der „gebundenen“ Form von PLP differenzieren. So konnten erste Erkenntnisse zur Rolle von PDXP als Determinator freier PLP-Konzentrationen in Erythrozyten und insbesondere im Hippocampus erlangt werden. Im Hippocampus ergaben sich insgesamt deutlich höhere Konzentrationen an freiem PLP als in den Erythrozyten und es bestand zudem ein Unterschied zwischen den Genotypen. So wiesen die KO-Mäuse ~1/3 höhere freie PLP-Konzentrationen im Vergleich zu den Wildtypen auf. Schließlich konnte ein Effekt des Tieralters auf den PLP-Metabolismus festgestellt werden. Sowohl in den Erythrozyten als auch im Hippocampus ergaben sich alterskorrelierte Änderungen ihrer PLP-Konzentrationen. Zudem zeigten Western Blot Analysen altersbedingte Unterschiede ihrer Vitamin B6-Enzymexpressionen. So wiesen ältere Wildtypen im Hippocampus eine fünffach erhöhte PDXP-Expression verglichen mit jüngeren Tieren auf. In den Erythrozytenlysaten hingegen zeigten ältere Tiere beider Genotypen eine rund vierfach geringere PNPO-Expression gegenüber jüngeren Tieren. Die mit dem Alter eintretende physiologische Verringerung der erythrozytären PNPO-Expression würde somit für den Organismus einen Verlust seiner metabolischen Flexibilität bedeuten, die mit der Konversion von PN zu PL einhergeht.
N2  - The phosphatase PDXP, also called Chronophin, is a member of the ubiquitously expressed HAD-phosphatases, which have some important physiological functions in the organism. Its substrate pyridoxal 5´-phosphate (PLP) is the active form of vita-min B6, an important cofactor of several reactions. PDXP-deficient mice (KO-mice) have PLP-concentrations in erythrocytes and in the whole brain twice as high as wildtype mice. It is assumed that PDXP therefore has an important function in erythrocytes and in the brain. The aim of the study was to gain initial insights into these functions of PDXP. 
For this purpose, HPLC-based analyses of the PLP-concentrations in erythrocytes from WT- and KO-mice were carried out. The doubled PLP-levels in the RBCs of KO-mice could be confirmed. In addition, a method for measuring the endogenous phosphatase activity of PDXP in red cell lysates was established. The activity of PDXP could be measured by the reduction of its substrate PLP over time. This required the incubation with pyridoxine and the inhibition of PDXK by ginkgotoxine. An assumed function of PDXP in mobilization of PL(P) from the erythrocytes in fasting conditions could be ruled out. Therefore, a comparison between the PLP-concentrations in RBCs of fasted mice with normal fed ones was done. Surprisingly the fasted KO-mice showed the same percentaged decrease of cellular PLP-level as the fasted WT-mice. During vitamin B6 intake however, a function of PDXP as being a “converter” of pyridoxine to pyridoxal was found. Starting with PN, a PDXP-mediated dephosphorylation from PLP to PL could take place in the wildtype mice (via the intermediate steps PNP and PLP). Consequently, the WT´s production of PL quadrupled compared to the KO´s. PDXP turned out to be essential for the conversion of pyridoxine to pyridoxal in erythrocytes. This conversion confers some metabolic flexibility to the organism and to a certain extent makes it independent of the choice of food. Moreover, cells and organs, that due to the absence of PNPO cannot produce PL(P) themselves, can be provided via erythrocytes. 
The high reactivity of PLP with surrounding nucleophiles poses a certain problem for the cell in dealing with free PLP. The majority of the PLP in RBCs is bound to proteins (primarily hemoglobin). It was distinguished between the here termed “free” PLP and the bound PLP by using filter devices with a MWCO at 3 kDa. First insights could be gained about PDXP as a determinant of free PLP-levels in erythrocytes and hippocampus. The amount of free PLP in the hippocampus was significantly higher than in the RBCs. Additionally, the hippocampus showed some differences in the con¬centration of free PLP between WT- and KO-mice. The level of free PLP in PDXP deficient mice was one third higher than in wildtype mice. Finally, some correlation between the age of the mice and their PLP-metabolism was found. The results revealed changes of the PLP-concentrations with age in the RBCs and the hippocampus. Moreover, western blot analyses showed some age-related differences in the expression of vitamin B6 enzymes. In the hippocampus older wildtype mice showed a quintupled expression of PDXP compared to younger ones. However, western blot analyses of red blood cell lysates from older animals revealed a lower expression of PNPO by a factor of four. For the organism this physiological reduction of its PNPO expression with age would mean a loss of metabolic flexibility, that is accompanied by the conversion from PN to PL.
KW  - Vitamin B6
KW  - Vitamin-B6-Stoffwechsel
KW  - Pyridoxalphosphat
KW  - Erythrozyt
KW  - Phosphatasen
KW  - PDXP
KW  - PLP
KW  - HAD-Phosphatasen
KW  - Vitamin B6 Metabolismus
KW  - pyridoxal phosphate
KW  - red blood cells
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216546
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sieber, Maximilian
T1  - Evaluation of 1H-NMR and GC/MS-based metabonomics for the assessment of liver and kidney toxicity
T1  - Bewertung von 1H-NMR und GC/MS-Metabonomics zur Erkennung von Leber- und Nierentoxizität
N2  - For the assessment of metabonomics techniques for the early, non-invasive detection of toxicity, the nephrotoxins gentamicin (s.c. administration of 0, 60 and 120 mg/kg bw 2x daily for 8 days), ochratoxin A (p.o. administration of 0, 21, 70 and 210 µg/kg bw 5 days/week for 90 days) and aristolochic acid (p.o. administration of 0, 0.1, 1.0 and 10 mg/kg bw for 12 days) were administered to rats and urine samples were analyzed with 1H-NMR and GC/MS. Urine samples from the InnoMed PredTox project were analyzed as well, thereby focusing on 1H-NMR analysis and bile duct necrosis as histopathological endpoint. 1H-NMR analysis used water supression with the following protocol: 1 M phosphate buffer, D2O as shift lock reagent, D4-trimethylsilyl­propionic acid as chemical shift reference, noesygppr1d pulse sequence (Bruker). For multivariate data analysis, spectral intensity was binned into 0.04 ppm wide bins. GC/MS analysis of urine was carried out after protein precipitation with methanol, drying, derivatization with methoxyamine hydrochloride in pyridine and with methyl(trimethylsilyl)­trifluoroacetamide on a DB5-MS column using EI ionization. The chromatograms were prepared for multivariate data analysis using the R-program based peak picking and alignment software XCMS version 2.4.0. Principal component analysis (PCA) to detect and visualize time-point and dose-dependent differences between treated animals and controls and orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) for identification of potential molecular markers of toxicity was carried out using SIMCA P+ 11.5 1H-NMR-based markers were identified and quantified with the Chenomx NMR Suite, GC/MS based markers were identified using the NIST Mass Spectral Database and by co-elution with authentic reference standards. PCA of urinary metabolite profiles was able to differentiate treated animals from controls at the same time as histopathology. An advantage over classical clinical chemistry parameters regarding sensitivity could be observed in some cases. Metabonomic analysis with GC/MS and 1H-NMR revealed alterations in the urinary profile of treated animals 1 day after start of treatment with gentamicin, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate, trigonelline and 3-indoxylsulfate increased excretion of 5-oxoproline, lactate, alanine and glucose were observed. Ochratoxin A treatment caused decreased excretion of citrate, 2-oxoglutarate and hippurate and and increased excretion of glucose, myo-inositol, N,N-dimethylglycine, glycine, alanine and lactate as early as 2 weeks after start of treatment with 210µg OTA/kg bw, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Integration of histopathology scores increased confidence in the molecular markers discovered. Aristolochic acid treatment resulted in decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate and creatinine as well as increased excretion of 5-oxoproline, N,N-dimethylglycine, pseudouridine and uric acid. No alterations in clinical chemistry parameters or histopathology were noted.Decreased excretion of hippurate indicates alterations in the gut microflora, an effect that is expected as pharmacological action of the aminoglycoside antibiotic gentamicin and that can also be explained by the p.o. administration of xenobiotica. Decreased Krebs cycle intermediates (citrate and 2-oxoglutarate) and increased lactate is associated with altered energy metabolism. Increased pseudouridine excretion is associated with cell proliferation and was observed with aristolochic acid and ochratoxin A, for which proliferative processes were observed with histopathology. 5-oxoproline and N,N-dimethylglycine can be associated with oxidative stress. Glucose, a marker of renal damage in clinical chemistry, was observed for all three nephrotoxins studied. Single study analysis with PCA of GC/MS chromatograms and 1H-NMR spectra of urine from 3 studies conducted within the InnoMed PredTox project showing bile duct necrosis revealed alterations in urinary profiles with the onset of changes in clinical chemistry and histopathology. Alterations were mainly decreased Krebs cycle intermediates and changes in the aromatic gut flora metabolites, an effect that may result as a secondary effect from altered bile flow. In conclusion, metabonomics techniques are able to detect toxic lesions at the same time as histopathology and clinical chemistry. The metabolites found to be altered are common to most toxicities and are not organ-specific. A mechanistic link to the observed toxicity has to be established in order to avoid confounders such as body weight loss, pharmacological effects etc. For pattern recognition purposes, large databases are necessary.
N2  - Zur Bewertung von Metabonomics-Techniken zur frühen, nicht-invasiven Erkennung von Toxizität wurde Rattenurin nach wiederholter Gabe von Nephrotoxinen mit 1H-NMR und GC/MS analysiert. Untersucht wurden Gentamicin (s.c.-Gabe von 0, 60 und 120 mg/kg Körpergewicht (KG) 2x tägl. über 8 Tage), Ochratoxin A (p.o.-Gabe von 0, 21, 70 und 210 µg/kg KG 5xl wöchentlich für 90 Tage) und Aristolochiasäure (p.o.-Gabe von 0, 0.1, 1.0 und 10 mg/kg KG über 12 Tage). Proben von 16 Studien des InnoMed PredTox Projekts wurden mit 1H-NMR auf den histopathologischen Endpunkt Gallengangnekrose (BDN) untersucht. Folgende Parameter wurden zur 1H-NMR-Analyse mit Wasserunterdrückung verwendet: 1 M Phosphatpuffer, shift lock Reagenz D2O und Referenzierung der chemischen Verschiebung auf D4-Trimethylsilyl­propionsäure, noesygppr1d-Pulssequenz (Bruker). Zur multivariaten Datenanalyse wurden die Spektren in 0.04 ppm große „bins“ unterteilt. Zur GC/MS-Analyse wurden nach Proteinfällung mit Methanol die Urinproben getrocknet und mit Methoxyaminhydrochlorid in Pyridin und Methyl(trimethylsilyl)trifluoracetamid derivatisiert und auf einer DB5-MS -Säule getrennt. Die GC/MS-Chromatogramme wurden mit dem R-Programm-basierten XCMS-Softwarepaket Version 2.4.0 zur multivariaten Datenanalyse vorbereitet. Hauptkomponentenanalyse (PCA) zur Visualisierung von zeit- und dosisabhängigen Unterschieden zwischen Kontrollen und behandelten Tieren und „orthogonal projection to latent structures“-Diskriminantenanalyse (OPLS-DA) zur Identifizierung von Toxizitätsmarkern erfolgte mit SIMCA P+11.5 Die Chenomx-NMR-Suite wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von 1H NMR-basierten Markern verwendet; GC/MS-basierte Marker wurden mit der „NIST Mass Spectral Database“ und durch Koelution mit Referenzstandards identifiziert. PCA unterschied Kontroll- von behandelten Tieren zum gleichen Zeitpunkt wie Histopathologie. Gegenüber klinisch-chemischen Parametern war Metabonomics in einigen Fällen empfindlicher. Gentamicin induzierte nach Tag 1 erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat, Hippurat, Trigonellin und 3-Indoxylsulfat Urin, sowie erhöhte Ausscheidung von Lactat, Alanin, 5-Oxoprolin und Glucose, begleitet von geringfügigen Änderungen in klinisch-chemischen Parametern. Ochratoxin A verursachte nach zwei Wochen in einzelnen Tieren eine erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat und Hippurat sowie eine erhöhte Ausscheidung von Glucose, myo-Inositol, N,N-Dimethylglycin, 5-Oxoprolin, Glycin, Alanin und Lactat, korrelierend mit Veränderungen in klinisch-chemischen Parametern und in der Histopathologie. Verwendung von Histopathologiedaten in multivariaten Modellen zur Markeridentifizierung erhöhte die Konfidenz der Marker. Aristolochiasäure induzierte eine erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat, Hippurat und Creatinin und eine erhöhte Ausscheidung von 5-Oxoprolin, N,N-Dimethylglycin und Pseudouridin, ohne Veränderung der klinisch-chemischen Parameter oder der Histopathologie. Erniedrigte Ausscheidung von Hippurat weist auf eine veränderte Darmmikroflora hin; für das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin ist dies ein pharmakologischer Effekt, der für die perorale Gabe von Xenobiotica zu erwarten ist. Erniedrigte Ausscheidung von Citrat und 2-Oxoglutarat und erhöhte Ausscheidung von Lactat zeigt einen veränderten Energiestoffwechsel. Erhöhte Ausscheidung von Pseudouridin ist mit Zell­proliferation assoziiert und wurde nach Gabe der Kanzerogene Ochratoxin A und Aristolochiasäure beobachtet, bei denen proliferative Prozesse in der Histopathologie gefunden wurden. 5-Oxoprolin und N,N-Dimethyl­glycin deuten auf erhöhten oxidativen Stress hin. Erhöhte Glucose im Urin, ein Parameter zur Diagnose von Nierenschäden in der klinischen Chemie, wurde in allen drei Studien mit Nephrotoxinen beobachtet. GC/MS- und 1H-NMR-Daten von InnoMed-Studien mit Gallengang­nekrosen als histopathologischen Endpunkt zeigten Veränderung im Urin zeitgleich mit klinisch-chemischen Parametern und Histopathologie; hauptsächlich erniedrigte Ausscheidung von Citratzyklusintermediaten und Veränderungen bei Darmflora-assoziierten Metaboliten, – ein Effekt, der wahrscheinlich veränderten Gallenfluss zurückzuführen ist. Metabonomics ist prinzipiell zum gleichen Zeitpunkt wie klinisch-chemische Parameter und Histopathologie zur Erkennung von toxischen Veränderungen geeignet. Die veränderten Metaboliten sind jedoch zumeist nicht organspezifisch und können mit allgemeinen Toxizitätsmechanismen, wie oxidativem Stress oder Zellproliferation, in Verbindung gebracht werden. Für die Bewertung der Ergebnisse von Metabonomics-Studien ist ein mechanistisches Verständnis der Veränderungen im Urinprofil notwendig, um eine Trennung von toxischen Effekten und solchen, die auf pharmakologische Wirkung, Körpergewichtsverlust etc. zurückzuführen sind, zu erreichen. Für eine Vorhersage von toxischen Mechanismen aufgrund der Urinprofile ist eine größere Datengrundlage notwendig.
KW  - Toxikologie
KW  - Protonen-NMR-Spektroskopie
KW  - GC-MS
KW  - Multivariate Analyse
KW  - Niere
KW  - Leber
KW  - Metabonomics
KW  - Toxicology
KW  - Metabonomics
KW  - GC/MS
KW  - 1H-NMR-Spectroscopy
KW  - multivariate analysis
KW  - kidney
KW  - liver
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43052
ER  - 
TY  - THES
A1  - Werthmann, Ruth
T1  - Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abhängigen Änderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen
T1  - Real-time monitoring of thrombin-dependent changes of the cAMP concentration in living endothelial cells
N2  - Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener &#946;-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne &#946;-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes.
N2  - Endothelial cells form a semi permeable barrier between blood and interstitial tissues. The permeability of this barrier is mainly regulated by the second messengers Ca2+ and cAMP. While Ca2+ increases the permeability by inducing cell contraction, cAMP increases the adherence of the cells and, thereby, supports the barrier function. The Ca2+-elevating agent thrombin was demonstrated to increase endothelial permeability and to decrease cAMP levels. The aim of this thesis was to investigate thrombin-induced changes of the cAMP concentration in real time in living endothelial cells via fluorescence resonance energy transfer (FRET). Therefore, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were transfected with the FRET-based cAMP sensor Epac1-camps. Binding of cAMP to the binding domain of Epac1-camps induces a conformational change of the sensor that results in a decrease of FRET. With help of this sensor, changes in cAMP concentration can be monitored with high temporal resolution. First, the influence of thrombin on cAMP levels was investigated after elevating cAMP levels by stimulation of &#946;-adrenergic receptors. Thrombin led to a Ca2+-dependent decrease of cAMP levels by approximately 30 %. The decrease of cAMP levels was delayed compared to the thrombin-induced Ca2+ signal. This decrease was also transient and reached a minimum value 30 s after thrombin stimulation. A siRNA-mediated downregulation of the Ca2+-inhibited adenylyl cyclase 6 (AC6) completely abolished the thrombin-induced decrease of cAMP concentration. This provided the first direct evidence that the Ca2+-mediated inhibition of AC6 accounts for the thrombin-induced decrease in cAMP levels. In the absence of a &#946;-adrenergic-mediated increase of cAMP concentration, thrombin led to a slow increase in cAMP concentration that lasted for several minutes. This increase in cAMP concentration was caused by the Ca2+-dependent activation of phospholipase A2 (PLA2). PLA2 releases arachidonic acid, which represents the substrate for prostaglandin synthesis. It was confirmed by pharmacological interference of cyclooxygenases and prostacyclin receptors that the synthesis of prostacyclin and subsequent stimulation of Gs-protein-coupled prostacyclin receptors caused the thrombin-induced increase in cAMP concentration. The real time monitoring of changes in cAMP concentration in endothelial cells within the vascular system is highly important as the physiology of endothelial cells in vivo is strongly influenced by factors contained in the surrounding blood or tissue. Therefore, a further aim of this thesis was the generation of transgenic mice expressing the FRET-based sensor Epac1-camps specifically in endothelial cells. Using a Cre-recombinase/loxP-approach transgenic mice were generated that specifically expressed Epac1-camps in endothelial cells, and the functionality of the transgenic sensor was proven in isolated pulmonary endothelial cells. Real time monitoring of thrombin-induced changes of cAMP concentration in endothelial cells revealed a temporally complex crosstalk between Ca2+ and cAMP signals that will affect endothelial barrier function. The transgenic expression of Epac1-camps opens the door for the investigation of thrombin-induced changes of cAMP levels and of endothelial permeability within intact vessels.
KW  - Cyclo-AMP
KW  - Endothelzelle
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Thrombin
KW  - cyclo-AMP
KW  - endothelial cells
KW  - fluorescence resonance energy transfer
KW  - thrombin
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zürn, Alexander
T1  - Spezifische Markierungsverfahren von Rezeptoren mit kleinen Fluorophoren zur Analyse der Rezeptoraktivierung mittels FRET
T1  - Specific labelling techniques with small fluorophores for visualzing ligandselective conformations on receptors with FRET
N2  - Es gibt viele Hinweise, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bei ihrer Aktivierung durch einen Agonisten ligandenselektive Konformationen eingehen. Ein tatsächlichen Beleg hierfür konnte bisher in lebenden Zellen noch nicht erbracht werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Ansatz gewählt, um ligandenselektive Konformationen in der dritten intrazellulären Schleife des &#945;2a-adrenergen Rezeptors (&#945;2a-AR) in lebenden Zellen darzustellen. Dazu wurden Rezeptorsensoren erstellt, welche jeweils ein CFP am Ende des C-Terminus trugen und in der dritten intrazellulären Schleife an verschiedenen Stellen mit einem Tetracysteinmotiv versehen wurden. Drei Konstrukte wurden verglichen, die das Tetracysteinmotiv N-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne V (I3-N), in der Mitte der dritten intrazellulären Schleife (I3-M) beziehungsweise C-terminal in der Nähe der Transmembrandomäne VI (I3-C) trugen. Die drei Rezeptorsensoren unterschieden sich hinsichtlich ihrer Ligandenbindung sowie ihrer G-Proteinaktivierung nicht vom Wildtyp &#945;2a-AR. Durch das Tetracysteinmotiv ist es möglich, den Rezeptor spezifisch mit dem niedermolekularen Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) zu markieren, welcher als Akzeptor für den Donor CFP in FRET-Experimenten dient. Die Änderung des FRET-Signals zwischen den beiden Fluorophoren, das durch den vollen Agonist Norepinephrin ausgelöst wurde, war bei allen drei Rezeptorsensoren vergleichbar. Der starke partielle Agonist Clonidin war ebenfalls in der Lage, in allen drei Konstrukten ein ähnliches FRET-Signal hervorzurufen. Dagegen zeigte der partielle Agonist Dopamin an dem Konstrukt I3-N ein signifikant schwächeres Signal, als an I3-C. Die schwachen partiellen Agonisten Octopamin und Norphenephrin konnten an den Konstrukten I3-N und I3-M keine Änderung des FRET-Signals bewirken, wobei an I3-C eine deutliche Signaländerung detektiert wurde. Dies legt nahe, dass die Transmembrandomäne V bei der Aktivierung des Rezeptors eine kleinere Bewegung eingeht als die Transmembrandomäne VI, und bestätigt damit ein auf Röntgenstrukturanlysen basierendes Modell der Rezeptorbewegung. Außerdem wurden die Aktivierungskinetiken für die Agonisten Norepinephrin und Dopamin verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die durch Norepinephrin ausgelöste Bewegung an allen beobachteten Punkten gleich schnell war. Im Gegensatz dazu aktivierte Dopamin I3-C und I3-M ca. 1,5-mal langsamer, als Norepinephrin. Für das I3-N Konstrukt wurde sogar eine 3-mal langsamere Aktivierung gemessen. Diese Daten zeigen, dass unterschiedliche Agonisten in der dritten intrazellulären Schleife spezifische Konformationen auslösen können. Die Untersuchungen zur Rezeptorbewegung im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit dem kleinen Fluorophor FlAsH in Kombination mit einer großen GFP-Variante durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der es möglich ist Proteine spezifisch mit beiden kleinen Fluorophoren FlAsH und ReAsH in einer lebenden Zelle zu markieren. Hierfür wurden zwei Tetracysteinmotive, CCPGCC und FLNCCPGCCMEP, gewählt, an die beide kleine Fluorophore kovalent binden. Durch Verdrängungsexperimente mit BAL konnte gezeigt werden, dass FlAsH für beide Motive eine dreifach höhere Affinität besitzt, als ReAsH. Dabei besitzt das FLNCCPGCCMEP-Motiv jedoch eine dreifach höhere Affinität zu dem jeweiligen Fluorophor besitzt als CCPGCC. Durch Ausnutzung dieser Affinitätsunterschiede konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem es möglich ist, beide Motive in einer Zelle zu markieren. Dabei werden zunächst beide Motive mit ReAsH markiert. Durch anschließendes Waschen mit einer geeigneten Konzentration von BAL wird das ReAsH ausschließlich von der CCPGCC-Sequenz verdrängt, wohingegen die FLNCCPGCCMEP-Sequenz mit ReAsH markiert bleibt. Die nun unbesetzte CCPGCC-Sequenz kann dann anschließend mit FlAsH markiert werden, ohne dabei die Bindung des ReAsH an die FLNCCPGCCMEP-Sequenz zu beeinflussen. Um die Funktionalität dieses Protokolls zu überprüfen, sollten zwei verschiedene Proteine mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisation in einer lebenden Zelle spezifisch mit jeweils einem kleinen Fluorophor markiert werden. Hierzu wurden ein PTH-Rezeptor, in dem im C-Terminus die FLNCCPGCCMEP-Sequenz eingebracht wurde, mit ReAsH und ein &#946;-Arrestin-2, dem die CCPGCC-Sequenz eingebracht wurde, in Zellen co-exprimiert und gemäß dem Protokoll mit FlAsH und ReAsH markiert. Beide Proteine konnten spezifisch markiert werden, wobei der mit ReAsH markierte PTH-Rezeptor eine deutliche Lokalisation in der Zellmembran zeigte. Durch sequentielle Exzitation konnte in der gleichen Zelle das zytosolisch lokalisierte, mit FlAsH markierte &#946;-Arrestin-2 detektiert werden. Wurden die so markierten Zellen mir 1 µM PTH stimuliert, wurde das FlAsH-markierte &#946;-Arrestin-2 an die Zellmembran rekrutiert. Somit konnte durch die Entwicklung dieses Protokolls eine duale spezifische Markierung von Proteinen mit zwei kleinen Fluorophoren zu innerhalb einer Zelle erreicht werden.
N2  - Several lines of evidence suggest that G-protein-coupled receptors can adopt different active conformations, but their direct demonstration in intact cells is still missing. Using a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based approach we studied conformational changes in &#61537;2A-adrenergic receptors (&#61537;2A-AR) in intact cells. The receptors were C-terminally labeled with cyan fluorescent protein (CFP) and with fluorescein arsenical hairpin binder (FlAsH) bound at a tetracysteine-motif at different sites in the third intracellular loop: N-terminally close to transmembrane domain V (I3-N), in the middle of the loop (I3-M), or C-terminally close to transmembrane domain VI (I3-C). All constructs retained normal ligand binding and signaling properties compared to the wildtype-&#61537;2A-AR. Changes in FRET between the labels were determined in intact cells in response to different agonists. The full agonist norepinephrine evoked similar FRET-changes for all three constructs. The strong partial agonist clonidine induced partial FRET-changes for all constructs. The partial agonist dopamine envoked a significantly weaker FRET-signal in I3-N than in I3-C. However, the weak partial agonists octopamine and norphenephrine only induced detectable changes in the construct I3-C, but no change in I3-M and I3-N. This agrees with X-ray receptor structures indicating larger agonist-induced movements at the cytoplasmic ends of transmembrane domain VI than V and suggests that partial agonism is linked to distinct conformational changes within a G-protein-coupled receptor. The kinetics of the receptor activation was compared between dopamine and norepinephrine. The kinetics for norepinephrine were similar for all three constructs. Dopamine-induced FRET-signals were &#8776;1.5-fold slower than those for norepinephrine in I3-C and I3-M, but >3-fold slower in I3-N. Our data indicate that the different ligands induced conformational changes in the receptor that were sensed differently in different positions of the third intracellular loop. Specific labeling of proteins in living cells with two different molecular probes would be an important further development for multiparameter imaging of cellular functions. Here we report a strategy to selectively label two different proteins in living cells with two different fluorophores, FlAsH and ReAsH. Recently improved tetracysteine binding motifs have been described to selectively bind FlAsH or ReAsH. We compared the six amino acid motif CCPGCC and the twelve amino acid motif FLNCCPGCCMEP with respect to their affinity for FlAsH and ReAsH. For both fluorophores, we observed a 3-fold higher affinity for the FLNCCPGCCMEP motif compared to CCPGCC, when washed off with BAL (british anit lewisite; 2,3-Dimercaptopropanol). For both target sequences, FlAsH showed more stable interactions than ReAsH. Based on these observations, we developed a protocol to demonstrate selective labeling of different proteins in the same cell. We used two target proteins that are localized in different cellular compartments. As model proteins we chose a plasmamembrane localized G protein-coupled receptor for PTH (PTH-receptor) which was C-terminally modified with the FLNCCPGCCMEP motif for labeling with ReAsH, and the cytosolic &#61538;-arrestin-2 protein which was C-terminally modified with the CCPGCC motif for labeling with FlAsH. Both proteins were specifically labelled with the respective Fluorophores and &#61538;-arrestin-2 will translocate to the plasmamembrane upon agonist stimulation of the PTH receptor. Taken together our data demonstrate that FlAsH and ReAsH can be used for orthogonal labeling to different binding motifs fused to different target proteins in living cells.
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Fluoreszenz
KW  - Fluoreszenz <Motiv>
KW  - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
KW  - GPCR
KW  - Konformationsänderung
KW  - ligandenselektive Konformationen
KW  - Mikroskopie
KW  - FlAsH
KW  - ReAsH
KW  - Tetracystein-Motivee
KW  - GPCR
KW  - lignaselective conformations
KW  - FlAsH
KW  - ReAsH
KW  - Tetracystein-Motive
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35961
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rached, Eva Katharina
T1  - Neue Ansätze zur Entwicklung von Alternativmethoden zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität
N2  - Die Niere ist eines der wichtigsten Zielorgane für Toxizität, allerdings stellt die frühzeitige Erkennung einer Nierenschädigung und/oder kanzerogenen Wirkung infolge einer wiederholten Exposition gegenüber toxischen Verbindungen ein großes Problem dar, da traditionelle Marker für Nierenfunktionsstörungen wenig empfindlich sind. Daher ist es notwendig, verbesserte Testmethoden (Alternativmethoden) zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war es daher, mögliche Alternativmethoden zur Prüfung auf Nephrotoxizität nach wiederholter Exposition zu untersuchen. Zum einen wurden dazu in einem in vivo-Modell für chronische Nierentoxizität neue Biomarker für Stress und Gewebeschädigung untersucht, deren erhöhte Genexpression in mehreren Modellen für akute Schädigung des Nierengewebes gezeigt wurde, einschließlich kidney injury molecule-1 (KIM-1), Lipocalin-2 (LCN2), Clusterin (CLU), Osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), Vimentin (VIM) und Hämoxygenase-1 (HO-1). Diese Marker wurden nachfolgend auch in einem zellkulturbasierten in vitro-Modell untersucht. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit Veränderungen der Zellteilung als möglicher Marker für die Früherkennung kanzerogener Effekte. Das in vivo-Modell bestand in einer Studie in männlichen F344/N-Ratten, die 14, 28 oder 90 Tage oral mit 0, 21, 70 oder 210 µg/kg Körpergewicht (KG) Ochratoxin A (OTA) behandelt wurden. OTA ist ein Mykotoxin, das in Ratten bei wiederholter Gabe eine Nierenschädigung und Nierenkrebs verursacht. Die Analyse der mRNA-Expression der neuen Biomarker in Nierengewebe zeigte bei Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden, eine frühzeitige, zeit- und dosisabhängige Induktion von KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN und CLU, die mit histopathologischen Veränderungen in Form von Zelldegeneration und Regeneration einherging und das Fortschreiten der Schädigung gut widerspiegelte. Auch die mRNA-Expression von HO 1 und VIM wurde durch OTA moduliert, allerdings war eine Erhöhung nicht zu allen Zeitpunkten zu messen bzw. trat nicht so früh auf wie bei den anderen Markern. Effekte auf traditionelle Marker für Nephrotoxizität (Serum-Kreatinin, N-Acetyl-&#946;-D-glucosaminidase und &#947;-Glutamyltransferase im Urin) wurden im Vergleich zu den neuen Markern zu einem späteren Zeitpunkt und zumeist nur in der Hochdosisgruppe festgestellt. Zusätzlich zu den Effekten auf die Genexpression konnte in den Zielzellen von OTA im proximalen Tubulusepithel eine erhöhte Proteinexpression von KIM-1, CLU, OPN und VIM gezeigt werden; nur für KIM-1 wurde allerdings auch im Urin eine erhöhte Konzentration nachgewiesen, die mit den Effekten auf die mRNA- und Proteinkonzentration im Gewebe korrelierte. Damit stellt KIM-1 in dieser Studie hinsichtlich Empfindlichkeit und Messbarkeit den empfindlichsten Biomarker für Nephrotoxizität dar. Die Untersuchung der Zellteilung nach wiederholter Gabe von OTA zeigte einen dramatischen, zeit- und dosisabhängigen Anstieg der Proliferation von proximalen Tubulusepithelzellen in Nieren von Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden. Dagegen wurden nach wiederholter Exposition gegenüber 21 µg/kg KG über 90 Tage keine OTA-abhängigen Effekte auf die renale Zellproliferation festgestellt. Somit korrelieren die Veränderungen der Zellteilung in der Niere in der 90-Tages-Studie sehr gut mit dem Ergebnis der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie mit OTA, in der Nierentumoren nur nach Behandlung mit 70 oder 210 µg/kg KG auftraten. Ausgehend von den verschiedenen Endpunkten für Toxizität, die in der Studie untersucht wurden, liegt der no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) bei 21 µg/kg KG OTA. Dies entspricht dem NOAEL der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die neuen in vivo-Biomarker für Nephrotoxizität in NRK 52E-Zellen als in vitro-Modell ausgetestet. Allerdings konnte eine erhöhte mRNA-Expression von KIM-1, einem sensitiven Marker in vivo, nach 24 oder 48 Stunden Behandlung mit verschiedenen nephrotoxischen Modellverbindungen (OTA, Kaliumbromat (KBrO3), Cisplatin oder Cadmiumchlorid (CdCl2)) in den Zellen nicht nachgewiesen werden. Die mRNA-Expression anderer Marker (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) war dagegen in unbehandelten Zellen bereits so hoch, dass die Behandlung mit Nephrotoxinen zu keiner weiteren Induktion führte. Allein die Gen- und Proteinexpression von HO-1 wurde durch CdCl2, KBrO3 und OTA induziert und könnte daher einen potentiellen Marker für screening-Studien in vitro darstellen. Insgesamt war der Nachweis zytotoxischer Wirkungen jedoch der empfindlichste Endpunkt in der Zellkultur. Die Ergebnisse stützen somit die Verwendung der neuen in vivo-Biomarker als gewebespezifische Marker für Nephrotoxizität in vitro nicht.
N2  - The kidney is a main target organ of toxicity, but early detection of kidney damage and/or carcinogenic effects following the repeated exposure to toxic substances presents a major problem, since traditional markers of renal malfunction suffer from lack of sensitivity. Therefore, nephrotoxic effects are often detected only in long-term experiments in animals. Ethical reasons as well as the immense time and costs required for these animal studies have prompted the search for alternative methods by which animal numbers and duration of studies can be reduced. A further, albeit challenging, attempt is to replace experiments in animals by studies in vitro. The aim of this work was to test possible alternative methods for the detection of nephrotoxicity after repeated exposure. One the one hand, the expression of new biomarkers of stress and tissue damage was studied in an in vivo-model of chronic nephrotoxicity; enhanced gene expression of these biomarkers, including kidney injury molecule-1 (KIM-1), lipocalin-2 (LCN2), clusterin (CLU), osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), vimentin (VIM), and heme oxygenase-1 (HO-1), had been demonstrated before in several models of acute kidney damage. In addition to the experiments in vivo, the markers were also studied in a cell culture-based in vitro-model to assess their use as sensitive endpoints of toxicity in vitro. A further part of this work included the determination of cell proliferation as potential early marker of toxin-induced carcinogenic effects. As an in vivo-model, a toxicity study in male F344/N rats was performed. Rats were treated 14, 28 or 90 days with 0, 21, 70 or 210 µg/kg body weight (bw) ochratoxin A (OTA) by oral administration. OTA is a mycotoxin that is known to cause kidney damage and renal tumors in rats after repeated exposure. Analysis of mRNA expression of the new biomarkers showed early, time- and dose-dependent induction of KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN and CLU in kidney tissue of animals treated with 70 or 210 µg/kg bw. The induction of these biomarkers accompanied histopathological changes like cell degeneration and regeneration and mirrored well the progression of tissue damage. mRNA expression of HO-1 and VIM was also modulated by OTA, but overexpression was not evident at all time points or occurred later than for the other markers. Compared with the new biomarkers, effects on traditional markers of nephrotoxicity (serum creatinine, urinary N-acetyl-&#946;-D-glucosaminidase and &#947;-glutamyltransferase) were restricted to later time points and the high dose group. In addition to the effects on gene expression, enhanced protein expression of KIM-1, CLU, OPN and VIM was observed in target cells of OTA in the proximal tubule epithelium; however, only for KIM-1, increased protein levels were also measured in urine, which correlated with the effects on the gene and protein expression in kidney tissue. Therefore, KIM-1 appeared to be the most sensitive biomarker of nephrotoxicity in this study. The study of the renal cell division after repeated administration of OTA demonstrated a dramatic, time- and dose-dependent increase in the proliferation of proximal tubule epithelial cells in kidneys of rats exposed to 70 or 210 µg/kg bw. In contrast, no OTA-dependent effects on renal cell proliferation were observed after repeated administration of 21 µg/kg bw. Thus, changes of renal cell proliferation in this 90-day-study correlate well with the results of the 2-year-carcinogenicity study with OTA, where renal tumors were only detected at 70 or 210 µg/kg bw. Based upon the different endpoints of toxicity determined in this study, the no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) is 21 µg/kg KG OTA. This is consistent with the result of the 2-year-carcinogenicity study. In another part of this work, the new in vivo biomarkers of nephrotoxicity were studied in NRK-52E cells as in vitro-model. However, mRNA expression of KIM-1, one of the best biomarkers in vivo, was not detected in the cells after treatment for 24 or 48 hours with several nephrotoxic model substances (OTA, potassium bromate (KBrO3), cisplatin or cadmium chloride (CdCl2)). In contrast, high basal mRNA expression of other markers (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) was evident even in untreated cells and treatment with nephrotoxins did not further enhance marker gene expression. Only in the case of HO-1, both gene and protein expression were induced by CdCl2, KBrO3 and OTA, and could therefore represent potential markers in screening studies in vitro. In summary, measurement of cytotoxicity was still the most sensitive endpoint of toxicity in vitro. Thus, results from this study do not support the use of the new in vivo-biomarkers as tissue-specific markers of nephrotoxicity in vitro.
KW  - Niere
KW  - Toxizität
KW  - Biomarker
KW  - Carcinogenese
KW  - Niere
KW  - Toxizität
KW  - Biomarker
KW  - Carcinogenese
KW  - nephrotoxicity
KW  - biomarker
KW  - carcinogenesis
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47812
ER  - 
TY  - THES
A1  - von Hayn, Kathrin
T1  - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten
T1  - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells
N2  - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 &#956;M freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden.
N2  - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 &#956;M free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells.
KW  - Glatte Muskulatur
KW  - Cyclo-AMP
KW  - Calcium
KW  - Calcium
KW  - cAMP
KW  - vaskuläre glatte Muskelzellen
KW  - FRET
KW  - calcium
KW  - cAMP
KW  - vascular smooth muscle cells
KW  - FRET
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kreutzmann, Moritz Paul
T1  - Untersuchung von Markern für oxidativen Stress und DNA-Schäden bei arterieller Hypertonie
T1  - Investigation of markers for oxidative stress and DNA damage in arterial hypertension
N2  - Patienten mit arterieller Hypertonie haben ein erhöhtes Risiko eine Tumorerkrankung, insbesondere Nierenzellkarzinome, zu entwickeln. Die arterielle Hypertonie ist über die Entstehung von oxidativem Stress mit der Entwicklung von DNA-Schäden verknüpft, wobei ein hochreguliertes Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) eine entscheidende Rolle einnimmt. Das Ziel dieser Arbeit war es zum einen Hypertoniker (HypAll) und gesunde Kontrollen und zum anderen gut (HypGut) und schlecht (HypSch) eingestellte Hypertoniker unter Berücksichtigung der eingenommenen Antihypertensiva bezüglich ihrer Level an oxidativem Stress und DNA-Schäden zu vergleichen. Zusätzlich erfolgte im Rahmen einer Längsschnittanalyse der intraindividuelle Vergleich unter den Hypertonikern. Hierfür erfolgte die Bestimmung von SHp, D-ROM und 3-Nitrotyrosin als Marker für oxidativen Stress im Plasma, von 8-oxodG, 15-F2t-Isoprostan und Malondialdehyd als Marker für oxidativen Stress im Urin und von γ-H2AX und Mikrokernen als Marker für DNA-Schäden in Lymphozyten.
Dabei konnte ein erhöhter oxidativer Stress in der HypAll-Gruppe verglichen zu den Kontrollen anhand aller Marker für oxidativen Stress mit Ausnahme von Malondialdehyd festgestellt werden. Nach Altersadjustierung zeigte sich dieser Gruppenunterschied nur noch für die Proteinstressmarker SHp und 3-Nitrotyrosin signifikant. Bezüglich der Marker für DNA-Schäden ergab sich kein Unterschied zwischen HypAll und Kontrollen. Ebenso zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Leveln für oxidativen Stress und DNA-Schäden zwischen der HypGut- und HypSch-Gruppe. Zuletzt konnte im Rahmen der Längsschnittstudie ein positiver Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Blutdrucks und des oxidativen Stresses anhand der Veränderung von D-ROM und des systolischen Blutdrucks beobachtet werden.
Die teils nicht-signifikanten und teils mangelnden Unterschiede zwischen HypAll und Kontrollen sowie zwischen HypGut und HypSch sind am ehesten durch das besondere Patientengut, welches sich auch grundlegend von dem anderer vergleichbarer Studien unterscheidet, erklärbar. Die Patienten mit therapieresistenter Hypertonie (TRH) zeichnen sich durch eine langjährige Einnahme zahlreicher Antihypertensiva aus. Diese, insbesondere die RAAS-wirksamen, besitzen eine über die reine Blutdrucksenkung hinausgehende antioxidative und antigenotoxische Wirkung, welche vermutlich zu einer Angleichung der Level für oxidativen Stress und DNA-Schäden geführt hat. 
Um die Dynamik der Biomarker und den Einfluss der Antihypertensiva auf oxidativen Stress und DNA-Schäden besser zu verstehen, sind weitere Studien über einen längeren Beobachtungszeitraum sowie mit zusätzlich therapienaiven Hypertonikern sinnvoll. Die weitere Erforschung von Biomarkern, um sie im klinischen Alltag zur Verbesserung der Patientenbehandlung einsetzen zu können, ist notwendig.
N2  - Patients with arterial hypertension are at an increased risk of developing tumors, especially renal cell carcinoma. Arterial hypertension is linked to the development of DNA damage through the development of oxidative stress, with an upregulated renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) playing a decisive role.
The aim of this work was to compare 1. hypertensive patients (HypAll) and healthy controls and 2. hypertensive patients with good (HypGut) and poorly (HypSch) adjusted hypertension with regard to their level of oxidative stress and DNA damage. For this purpose, SHp, D-ROM and 3-nitrotyrosine were determined as markers for oxidative stress in plasma, 8-oxodG, 15-F2t-isoprostane and malondialdehyde as markers for oxidative stress in urine and γ-H2AX and micronuclei as markers for DNA damage in lymphocytes.
An increased oxidative stress was found in the HypAll group compared to the controls as measured by all markers for oxidative stress with the exception of malondialdehyde. After adjusting for age, this group difference was only significant for the protein stress markers SHp and 3-nitrotyrosine. With regard to the markers for DNA damage, there was no difference between HypAll and controls. Also there was no significant difference in the levels of oxidative stress and DNA damage between the HypGut and HypSch groups. 
The partly insignificant and partly lacking differences between HypAll and controls as well as between HypGut and HypSch can best be explained by the special patient population, which is also fundamentally different from that of other comparable studies. The patients with therapy-resistant hypertension are characterized by long-term use of numerous antihypertensive drugs. These, especially the RAAS-effective ones, have an antioxidant and antigenotoxic effect that goes beyond the pure lowering of blood pressure. This has presumably led to an equalization of the levels for oxidative stress and DNA damage.
In order to better understand the dynamics of the biomarkers and the influence of antihypertensive drugs on oxidative stress and DNA damage, further studies over a longer observation period and with additional therapy-naive hypertensive patients are useful. Further research into biomarkers is necessary so that they can be used in everyday clinical practice to improve patient treatment.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Biomarker
KW  - Hypertonie
KW  - Mikrokern
KW  - γ-H2AX
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243380
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reimann, Hauke
T1  - Schicksal von Mikrokernen bzw. mikrokernhaltigen Zellen und Bedeutung von Mikrokernen als Biomarker
T1  - Fate of micronuclei and micronucleated cells along with relevance of  micronuclei as biomarker
N2  - Mikrokerne sind als wichtiger Biomarker in der Gentoxizitätsforschung seit langer Zeit etabliert und ihre Bildung ist mechanistisch gut verstanden, wohingegen das Mikrokernschicksal und die genaue Funktion von Mikrokernen in der Kanzerogenese unzureichend erforscht sind. Um das Schicksal von Mikrokernen und mikrokernhaltigen Zellen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen, die mit einem GFP-markierten Histon H2B transfiziert worden sind, mittels Lebendzellmikroskopie nach Behandlung mit verschiedenen gentoxischen Agenzien für 96 h untersucht. Parameter wie die Mitose- oder Zelltodrate wurden dabei ebenso wie das Schicksal der Mikrokerne dokumentiert. Während Persistenz und Reinkorporation von Mikrokernen häufig beobachtet wurden, waren Degradation und Auswurf von Mikrokernen selten bis gar nicht zu sehen. Auch konnte ein Teil der mikrokernhaltigen Zellen über mehrere Zellteilungen persistieren und proliferieren, wodurch die in Mikrokernen manifestierte chromosomale Instabilität unverändert bleiben kann. Ein eindeutiger Substanzeinfluss auf das Mikrokernschicksal konnte nicht ausgemacht werden. Extrusion sollte weiterhin durch Behandlung mit Hydroxyurea oder Cytochalasin B in Kombination mit gentoxischer Behandlung induziert werden, es wurde jedoch kein Effekt auf die Extrusionsrate beobachtet. Degradation wurde mittels γH2AX-Antikörperfärbung und transduziertem dsRed-markierten Autophagiemarker LC3B in HeLa-H2B-GFP-Zellen untersucht. Trotz erhöhter DNA-Degradation in Mikrokernen wurde nur selten eine Ko-Lokalisierung mit LC3B beobachtet. Dafür gab es in HeLa-H2B-GFP-Zellen, die zusätzlich mit dsRed markierten Kernmembranmarker Lamin B1 transduziert worden sind, Anzeichen für eine eingeschränkte Mikrokernmembranintegrität. Weiterhin wurden Zytokinese-Block Mikrokerntests nach Behandlung mit Thebain mit und ohne metabolische Aktivierung sowie Celecoxib und Celecoxibderivaten durchgeführt. Hierbei wurde nach Thebainbehandlung nur ohne metabolische Aktivierung und bei Anwesenheit von Zytotoxizität mehr Mikrokerne gefunden, während nach Behandlung mit Celecoxib und Celecoxibderivaten kein Anstieg beobachtet wurde. Zusätzlich wurde der Einfluss durch neurodegenerative Veränderungen auf Mundschleimhautzellen in zwei großen Kohorten untersucht, wobei keine Effekte auf die Häufigkeit von Mikrokernen oder mikrokernhaltigen Zellen zugeordnet werden konnten, während es teilweise bei Parametern, die auf Zytotoxizität hindeuten, zu Veränderungen kam. Es konnte insgesamt gezeigt werden, dass Mikrokerne und mikrokernhaltige Zellen zusätzlich zu ihrer Funktion als Biomarker über wenigstens mehrere Zellteilungen bestehen bleiben können. Auf diese Weise können sie z. B. über Chromothripsis zu einer beschleunigten Kanzerogenese führen, was zu einer schlechten Prognose für Krebspatienten führen kann.
N2  - Micronuclei have been established as biomarkers long ago in genotoxicity research and although formation is mechanistically well understood, the fate of micronuclei as well as micronuclei function in carcinogenesis are poorly investigated. To explore the long-term fate of micronuclei and micronucleated cells, HeLa cells transfected with GFP-tagged histone H2B were examined via live cell imaging after treatment with various genotoxic agents for 96 h. Parameters like mitosis or cell death rate as well as the development of micronuclei were analysed. While persistence and reincorporation of micronuclei were frequently observed, degradation and extrusion of micronuclei were found only rarely or never. A subset of micronucleated cells could persist and proliferate over multiple cell divisions, so that micronuclei as manifestation of chromosomal instability also persisted. No clear substance-related effect on micronucleus fate could be determined. Extrusion of micronuclei was furthermore investigated after treatment with hydroxyurea or after combination treatment with cytochalasin B and a genotoxic agent, but no effect on the extrusion rate was observed. Degradation of micronuclei was investigated in detail by γH2AX antibody staining and transduction of dsRed-tagged autophagy marker LC3B in HeLa-H2B- GFP-cells. Although enrichment of DNA degradation in micronuclei were identified, co-localisation with LC3B was observed only rarely. In HeLa-H2B-GFP-cells transduced with dsRed-tagged nuclear membrane marker lamin B1, evidence for impaired nuclear membrane integrity was found. In addition, cytokinesis-block micronucleus tests after treatment with thebaine with and without metabolic activation as well as celecoxib and celecoxib derivatives were conducted. After thebaine treatment, increased micronucleus frequency was only observed without metabolic activation and together with cytotoxicity, while treatment with celecoxib and celecoxib derivatives caused no effect on micronucleus frequency. Effects of neurodegenerative disease on DMA damage in buccal cells of two large cohorts were furthermore investigated, but no effect on the frequency of micronuclei and micronucleated cells was observed, while parameters indicating cytotoxicity showed alterations. All in all, it could be demonstrated, that micronuclei and micronucleated cells, apart from their role as biomarker, can persist for multiple cell divisions. This way, cancerogenesis can be accelerated e.g. via chromothripsis, potentially leading to poor prognosis for cancer patients.
KW  - Kleinkern
KW  - Mutagenität
KW  - Thebain
KW  - Celecoxib
KW  - Kognitive Beeinträchtigung
KW  - Mundschleimhautzellen
KW  - Lebendzellmikroskopie
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240109
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dekant, Raphael
A1  - Langer, Michael
A1  - Lupp, Maria
A1  - Adaku Chilaka, Cynthia
A1  - Mally, Angela
T1  - In vitro and in vivo analysis of ochratoxin A-derived glucuronides and mercapturic acids as biomarkers of exposure
JF  - Toxins
N2  - Ochratoxin A (OTA) is a widespread food contaminant, with exposure estimated to range from 0.64 to 17.79 ng/kg body weight (bw) for average consumers and from 2.40 to 51.69 ng/kg bw per day for high consumers. Current exposure estimates are, however, associated with considerable uncertainty. While biomarker-based approaches may contribute to improved exposure assessment, there is yet insufficient data on urinary metabolites of OTA and their relation to external dose to allow reliable estimates of daily intake. This study was designed to assess potential species differences in phase II biotransformation in vitro and to establish a correlation between urinary OTA-derived glucuronides and mercapturic acids and external exposure in rats in vivo. In vitro analyses of OTA metabolism using the liver S9 of rats, humans, rabbits and minipigs confirmed formation of an OTA glucuronide but provided no evidence for the formation of OTA-derived mercapturic acids to support their use as biomarkers. Similarly, OTA-derived mercapturic acids were not detected in urine of rats repeatedly dosed with OTA, while indirect analysis using enzymatic hydrolysis of the urine samples prior to LC–MS/MS established a linear relationship between urinary glucuronide excretion and OTA exposure. These results support OTA-derived glucuronides but not mercapturic acids as metabolites suitable for biomonitoring.
KW  - ochratoxin A
KW  - biomarker of exposure
KW  - glucuronide
KW  - mercapturic acid
KW  - mycotoxin
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245146
SN  - 2072-6651
VL  - 13
IS  - 8
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hoffmann, Linda S
A1  - Schmidt, Peter M
A1  - Keim, Yvonne
A1  - Hoffmann, Carsten
A1  - Schmidt, Harald H H W
A1  - Stasch, Johannes-Peter
T1  - Fluorescence Dequenching Makes Haem-Free Soluble Guanylate Cyclase Detectable in Living Cells
JF  - PLOS ONE
N2  - In cardiovascular disease, the protective NO/sGC/cGMP signalling-pathway is impaired due to a decreased pool of NO-sensitive haem-containing sGC accompanied by a reciprocal increase in NO-insensitive haem-free sGC. However, no direct method to detect cellular haem-free sGC other than its activation by the new therapeutic class of haem mimetics, such as BAY 58-2667, is available. Here we show that fluorescence dequenching, based on the interaction of the optical active prosthetic haem group and the attached biarsenical fluorophor FlAsH can be used to detect changes in cellular sGC haem status. The partly overlap of the emission spectrum of haem and FlAsH allows energy transfer from the fluorophore to the haem which reduces the intensity of FlAsH fluorescence. Loss of the prosthetic group, e. g. by oxidative stress or by replacement with the haem mimetic BAY 58-2667, prevented the energy transfer resulting in increased fluorescence. Haem loss was corroborated by an observed decrease in NO-induced sGC activity, reduced sGC protein levels, and an increased effect of BAY 58-2667. The use of a haem-free sGC mutant and a biarsenical dye that was not quenched by haem as controls further validated that the increase in fluorescence was due to the loss of the prosthetic haem group. The present approach is based on the cellular expression of an engineered sGC variant limiting is applicability to recombinant expression systems. Nevertheless, it allows to monitor sGC's redox regulation in living cells and future enhancements might be able to extend this approach to in vivo conditions.
KW  - spontaneously hypersensitive-rats
KW  - nitric-oxide
KW  - down-regulation
KW  - energy-transfer
KW  - cyclic-gmp
KW  - protein
KW  - activation
KW  - identification
KW  - in-vivo
KW  - no
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139631
VL  - 6
IS  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Spiegel, Silvana
T1  - Mikrokernfrequenzanalyse unter dem Einfluss von Methylphenidat und chronischem Stress bei adultem ADHS
T1  - Influence of methylphenidate and chronic stress on micronucleus assay in adult ADHD
N2  - Einleitung: Methylphenidat (MPH) als Medikament der ersten Wahl bei Patienten mit einem Aufmerksamkeitsdefizit- /Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) ist für die Therapie von Kindern aber auch von Erwachsenen weit verbreitet. Weil es immer noch Sicherheitsbedenken  gegen  dieses Medikament gibt, wurde in der vorliegenden Studie untersucht, ob die Langzeiteinnahme von MPH unschädlich hinsichtlich eines zytogenetischen Effektes ist. Ein weiteres Ziel war die Beurteilung von chronischer psychosozialer Stressbelastung von Patienten im Vergleich zu Kontrollprobanden und zu beurteilen ob die Medikation einen Einfluss auf die Höhe des Stresses hat. Nicht zuletzt war das dritte Ziel der Studie zu untersuchen, ob Stress selbst zu zytogenetischen Schäden führt.
Material und Methoden: Lymphozyten von 72 (42 ADHS- und 28 gesunde Kontrollprobanden) geschlechts- und altersgematchte Probanden im Alter von 18-28 Jahren, wurden aus venösem Blut für den Mikronukleusassay isoliert. Hauptendpunkt der Studie war die Mikrokernanzahl in binukleären Zellen.
Die psychosoziale Stressbelastung der letzten drei Monate wurde mit dem Trier Inventar zum chronischen Stress (TICS) gemessen. Zusätzlich wurden Speichelproben für eine Cortisolmessung gesammelt. 
Ergebnisse: Ein Einfluss der MPH-Einnahme auf die Mikrokernfrequenz konnte nicht gefunden. ADHS-Patienten wiesen eine signifikant höhere Stressbelastung  im Vergleich zu den Kontrollprobanden auf. Ein signifikanter positiver Einfluss auf das chronische Stresserleben unter MPH-Einnahme konnte bei Einnahme von mehr als 1 Jahr beobachtet werden.
Die Stressbelastung der ADHS-Patienten und Kontrollprobanden zeigte keine Korrelation zu zytogenetischen Endpunkten. Eine kleine Untergruppe, ADHS-Patienten mit Komorbidität Depression, zeigte jedoch signifikante erhöhte Mikrokernfrequenzanzahlen unter stark erhöhtem chronischen Stress.
Aussichten: Aus unserer Sicht kann MPH auch in der Langzeittherapie sicher hinsichtlich eines Krebsrisikos in gewichts- und symptomadaptierter Dosis eingesetzt werden.
Weitere Studien sind nötig um das Krebsrisiko bei chronischer erhöhter Stressbelastung abzuschätzen.
N2  - Introduction: Methylphenidate (MPH) as first line treatment for patients with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is widely used not only for therapy in children but also in adults. Because there are still safety concerns  for this medication this study investigated if the long term treatment of MPH is harmless regarding to cytogenetic effects. A further aim was to compare the psychosocial stress levels of ADHD patients  to those in control subjects and to investigate if MPH  medication has an influence on  self-perceived stress levels in ADHD. The third aim of this study was to explore  if psychosocial stress   leads to cytogenetic damage.
Materials and methods: Lymphocytes of 72 subjects (42 ADHD and 28 healthy control subjects), matched in age and gender(aged  18-28 years) were isolated from venous blood for micronucleus assay. Main endpoint was the micronucleus frequency in binucleated cells.
Psychosocial stress exposure of the last three month was measured by Trier Inventory for Chronic Stress (TICS). Additionally saliva samples were collected for cortisol measurement.

Results: An influence of MPH  intake on cytogenetic markers could not be found. ADHD patients showed significantly higher stress levels in comparison to control subjects. 
Patients taking MPH for more than one year displayed significantly lower chronic psychosocial stress levels than patients taking it less than one year or not-treated patients. 
Stress exposure of ADHD  patients and control subjects showed no correlations to cytogenetic endpoints. A small subgroup of ADHD patients with comorbid depression showed significantly higher micronuclei frequencies and  reported greater increased chronic stress.
Views:  We conclude that MPH in weight - and symptom - adjusted dose can be safely used also for long term treatment regarding to cancer risk.
Further studies are necessary to estimate cancer risk for increased chronic stress exposure.
KW  - ADHS
KW  - psychosozialer Stress
KW  - psychosocial stress
KW  - adult ADHD
KW  - micronucleus test
KW  - chronischer Stress
KW  - chronical stress
KW  - Mikrokernfrequenzanalyse
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139387
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kahlert, Katrin
T1  - Der Einfluss von RKIP auf die Progression von Herzinsuffizienz
T1  - RKIP protects from pressure overload induced heart failure
N2  - GRK2 vermittelt über die Phosphorylierung und Inaktivierung kardialer β1-Rezeptoren eine verminderte kardiale Kontraktilität. RKIP als GRK2-Inhibitor spielt eine Rolle in der GPCR-Signalgebung. Die Überexpression des Proteins führt zu einer verbesserten Herzfunktion. Dieser Effekt wird möglicherweise über die GRK2-Inhibition vermittelt und eröffnet die Diskussion über weitere durch RKIP vermittelte protektive Effekte im Herzen.
In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die kardiale RKIP-Expression in Mäusen und humanem Herzgewebe bei Herzinsuffizienz gesteigert ist. Zudem beschrieb ich den protektiven Effekt einer gesteigerten Expression von RKIP in murinen Herzen im Hinblick auf die Ausprägung typischer struktureller und morphologischer Zeichen von Herzinsuffizienz.
Echokardiographische Untersuchungen zeigten, dass RKIP die Herzfunktion positiv beeinflusst. RKIP-tg-Mäuse wiesen eine gesteigerte Verkürzungsfraktion und einen dauerhaft hyperkontraktilen Phänotyp auf. Trotz fehlenden Einflusses auf die kardiale Hypertrophie bewirkte die chronische linksventrikuläre Druckbelastung durch TAC in RKIP-tg-Mäusen eine geringere kardiale Dilatation und den Erhalt einer stärkeren Kontraktilität als in Wildtyp-Mäusen. 
Die Ligation der Aorta transversa bewirkte bei Wildtyp-Mäusen zudem strukturelle und molekulare Veränderungen, die typisch für einen herzinsuffizienten Phänotyp sind. Der Anteil fibrotischen Gewebes und die Apoptose im Herzen nahmen zu. Strukturelle Veränderungen des Herzgewebes sind ein Korrelat für ein herzinsuffizientes Herz. RKIP-tg-Mäuse zeigten diese Veränderungen in einem deutlich geringeren Ausmaß und weisen auf eine protektive Wirkung einer kardialen RKIP-Überexpression hin. Interessanterweise war die mRNA-Expression der Fibrosemarker CTGF und TGFß nach chronischer linksventrikulärer Druckbelastung sowohl bei Wildtyp-Mäusen als auch bei RKIP-transgenen Mäusen erhöht. Die Ursache für das Fehlen eines signifikanten Unterschiedes könnte sein, dass diese Marker nicht spezifisch für die kardiale Fibrosierung sind, sondern deren Expression auch mit der kardialen Hypertrophie zusammenhängt.
Eine weitere Beobachtung war der Anstieg der mRNA-Expression der Herzinsuffizienz-Marker BNP und ANF nach chronischer Druckbelastung in Wildtyp- und RKIP-tg-Mäusen. Die Ergebnisse bestätigten, dass BNP spezifischer für die durch chronische linksventrikuläre Druckerhöhung verursachte Herzinsuffizienz zu sein scheint.
Ich beobachtete eine gesteigerte RKIP-Expression bei Herzinsuffizienz und kardialer Hypertrophie. Herzbiopsien herzinsuffizienter und an Aortenstenose erkrankter Patienten wiesen im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte RKIP-Proteinexpression auf. Auch C57BL/6J-Mäuse wiesen nach chronischer linksventrikulärer Druckbelastung eine gesteigerte kardiale RKIP-Expression im Vergleich zu Kontrollen auf. Die Hochregulation der RKIP-Expression könnte als protektiver feedback-Mechanismus interpretiert werden. 
Resultat dieser Arbeit ist, dass RKIP eine protektive Wirkung bei der Progression von durch chronische linksventrikuläre Druckbelastung induzierte Herzinsuffizienz hat, am ehesten durch seine Funktion als GRK2-Inhibitor und seine Rolle bei der GPCR-Signalgebung.
N2  - Failing hearts are unable to adequately supply the body with blood and oxygen. Common therapeutic strategies interfere with cardiac remodelling, reduce cardiac pre- and afterload or aim at direct improvement of cardiac contractility. Cardiac contractility is mainly controlled by 1-adrenergic receptors. Resensitization of -adrenergic receptors by inhibition of G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2) is discussed as a potential strategy to treat heart failure. Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is as a physiological inhibitor of GRK2 and it increases contractility of neonatal cardiomyocytes. In this study its effects on cardiac function in pressure overload induced heart failure and determined the expression patterns of RKIP in failing hearts of humans and mice was assessed. Transverse aortic contriction (TAC) was performed on 7-week-old C57/BL6 mice to induce heart failure by pressure overload of left ventricles. 
After three weeks of TAC, echocardiography showed distinct signs of decreased cardiac function in wild-type mice. Fractional shortening was reduced and left ventricular diameters were increased. 
Histological analyses revealed increased interstitial fibrosis, caspase- and TUNEL-assays indicated myocyte apoptosis. 
Western blot analysis and real-time PCR showed significant upregulation of RKIP expression in failing hearts compared to non-banded control hearts. Interestingly, this upregulation of RKIP protein expression was also detected in failing human hearts and in samples of patients with aortic valve stenosis but not in healthy control samples.
To assess the effects of RKIP overexpression on heart failure, heart function and structure of RKIP transgenic mice and wild-type mice 3 weeks after TAC was analysed. 
While left ventricular hypertrophy was increased to similar extents in wild-type and RKIP trangenic mice, RKIP mice did neither develop dilatation of the left ventricle nor a decrease in fractional shortening. The mRNA-expression of the fibrosis markers CTGF and TGFwas upregulated in banded wild-type mice and in banded RKIP transgenic mice after 3 weeks of TAC indicating its correlation not only for fibrosis but possibly also for hypertrophy.
The mRNA-expression of the heart failure markers BNP and ANF was upregulated in banded wild-type mice and in banded RKIP transgenic mice after 3 weeks of TAC. The results confirm that BNP is more specific for heart failure than ANF. 
Taken together, cardiac overexpression of RKIP prevented left ventricular dilatation and loss of contractile function in a mouse model of pressure overload induced heart failure. Therefore, increased RKIP expression may be an interesting target to prevent detrimental effects from increased left ventricular pressure.
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Raf kinase inhibitor protein
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139191
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zimnol, Anna
T1  - Relevance of angiotensin II type 1a receptor and NADPH oxidase for the formation of angiotensin II-mediated DNA damage
T1  - Relevanz des Angiotensin II Typ 1a-Rezeptors und der NADPH-Oxidase für die Entstehung Angiotensin II-vermittelter DNA-Schäden
N2  - Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck sowie den Elektrolyt- und Wasserhaushalt. Das aktive Peptid, Angiotensin II (AngII), führt dabei zur Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen zu Bluthochdruck. Hypertensive Patienten haben ein erhöhtes Risiko an Krebs zu erkranken, vor allem an Nierenkrebs. Wir konnten bereits in vivo zeigen, dass AngII in der Lage ist, den Blutdruck zu steigern und dosisabhängig zu DNA-Schäden über den Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) führt. Ein stimuliertes RAAS kann ferner über die Aktivierung der NADPH-Oxidase, einer Hauptquelle der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, zu oxidativem Stress führen. Zielsetzung dieser Arbeit war es zum einen, mit Hilfe von AT1a-Rezeptor-defizienten Mäusen in vivo zu prüfen, ob die Bildung von ROS, sowie die Bildung von DNA-Schäden in der Niere und im Herzen unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Zum anderen sollte, ebenfalls in vivo, untersucht werden, ob eine oder beide von zwei untersuchten Isoformen der NADPH-Oxidase (Nox) für die Auslösung oxidativen Stresses in der Niere verantwortlich ist. 
Zunächst wurden für den Versuch zur Überprüfung der Abhängigkeit AngII-induzierter DNA-Schäden vom Blutdruck männliche C57BL/6-Mäuse und AT1a-Knockout (KO)-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentrationen von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Zusätzlich wurde eine Gruppe von AngII-behandelten Wildtyp (WT)-Mäusen mit dem AT1-Rezeptor-Blocker Candesartan (Cand) behandelt. Während des Versuchszeitraumes fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an den wachen Mäusen statt. In WT-Mäusen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in Niere und im Herzen. Außerdem traten in dieser Gruppe DNA-Schäden in Form von Einzel- und Doppelstrangbrüchen auf. All diese Reaktionen auf AngII konnten jedoch durch gleichzeitige Behandlung mit Cand verhindert werden. AT1a-KO-Mäuse hatten, verglichen mit WT-Kontrollmäusen, einen signifikant niedrigeren Blutdruck und normale Albumin-Level im Urin. In AT1a-KO-Mäusen, die mit AngII behandelt wurden, konnte kein Anstieg des systolischen Blutdrucks sowie kein Einfluss auf die Nierenfunktion gefunden werden. Jedoch führte AngII in dieser Gruppe zu einer Steigerung von ROS in der Niere und im Herzen. Zusätzlich wurden genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen signifikant in dieser Gruppe induziert. Auch wenn AT1a-KO-Tiere, unabhängig von einer AngII-Infusion, keine eingeschränkte Nierenfunktion zeigten, so wiesen sie erhebliche histopathologische Schäden im Hinblick auf die Glomeruli und das Tubulussystem auf. Diese Art von Schäden deuten auf eine besondere Bedeutung des AT1aR im Hinblick auf die embryonale Entwicklung der Niere hin. Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse dieses Experiments eindeutig, dass eine AngII-induzierte ROS-Produktion und die Induktion von DNA-Schäden unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Da in der AngII-behandelten AT1a-KO-Gruppe eine signifikant höhere Expression des AT1b-Rezeptors zu finden war und die Blockade von beiden Rezeptorsubtypen mit Cand zu einer Verhinderung der schädlichen Effekte durch AngII führte, scheint der AT1bR im Falle einer AT1aR-Defizienz für die Entstehung der Schäden zuständig zu sein. 
Ziel des zweiten Experimentes war es, den Beitrag der Nox2 und Nox4 zum oxidativen DNA-Schaden in vivo zu untersuchen. Hierfür wurden männliche C57BL/6-Mäuse und Nox2- oder Nox4-defiziente Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentration von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Im WT-Stamm und in beiden Nox-defizienten Stämmen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in der Niere. Außerdem waren in allen AngII-behandelten Gruppen genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen, erhöht. Auch in Abwesenheit von AngII wiesen Nox2- und Nox4-defiziente Mäuse mehr Doppelstrangbrüche im Vergleich zu WT-Kontrollmäusen auf. Interessanterweise kompensieren allerdings weder Nox2 noch Nox4 das Fehlen der jeweils anderen Isoform auf RNA-Basis. Aufgrund dieser Ergebnisse schließen wir, dass bislang keine Isoform alleine für die Generierung von oxidativen DNA-Schäden in der Niere verantwortlich gemacht werden kann und dass eine Beteiligung einer weiteren Nox-Isoform sehr wahrscheinlich ist. Möglicherweise könnten aber auch andere ROS-generierende Enzyme, wie Xanthinoxidase oder Stickoxidsynthase involviert sein. Da genomische Schäden in Nieren von Nox2- und Nox4-defizienten Mäusen in Abwesenheit von AngII gegenüber den Schäden in WT-Kontrollmäusen erhöht waren, könnten die beiden Isoformen auch eine schützende Funktion im Bereich von Nierenkrankheiten übernehmen. Da dies aber bislang nur für Nox4 beschrieben ist, ist es wahrscheinlicher, dass das Fehlen von einer der beiden Isoformen eher einen Einfluss auf die Embryonalentwicklung hat. Um dies jedoch abschließend zu klären wäre es sinnvoll mit induzierbaren Knockout-Modellen zu arbeiten, bei denen mögliche entwicklungsbedingte Effekte minimiert werden können.
N2  - The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) regulates blood pressure, electrolyte metabolism and water balance. The reactive peptide, Angiotensin II (AngII), of the RAAS causes vasoconstriction and, in higher concentrations, increased blood pressure. Hypertensive patients have an increased risk to develop cancer, especially kidney cancer. We have shown in vivo, that AngII is capable to cause an elevation of blood pressure, as well as DNA damage dose-dependently via the AngII type 1 receptor (AT1R). A stimulated RAAS can further lead to oxidative stress by activating NADPH oxidases which are major enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS) in the cell. On the one hand the aim of this work was to examine in vivo with the help of AT1aR-deficient mice whether the formation of ROS and DNA damage in the kidney and the heart occur independently of an increased blood pressure. On the other hand we wanted to investigate whether one or both of the two examined isoforms of the NADPH oxidase (Nox) is responsible for the triggering of oxidative stress in the kidney. 
For the purpose of the first experiment which examined the dependency of AngII-induced DNA damage on blood pressure, male C57BL/6-mice and AT1a-knockout (KO)-mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg x min during 28 days. Additionally, wild-type (WT) mice were treated with the AT1R antagonist candesartan (cand). Over the whole time period, frequent non-invasive blood pressure measurements were taken. In WT mice, AngII induced hypertension, an elevated urinary albumin level and formation of ROS in kidney and heart. Furthermore, genomic damage, in form of single- and double strand breaks, was augmented in this group. All these responses to AngII could be attenuated by concurrent administration of candesartan. AT1a-deficient mice had lower basal systolic pressures than WT mice and comparable urinary albumin levels. In AT1a-deficient mice treated with AngII, systolic pressure was not increased, and no effect on renal function could be detected. However, AngII led to an increase of ROS in kidney and heart in this group. In addition, genomic damage, especially in form of double strand breaks was significantly induced. Although AT1a-KO-mice, independent of an AngII-infusion, showed no renal impairment they had significant histopathological changes in glomeruli and tubules. This points to a special importance of AT1aR with regard to the embryonic development of the kidney. In summary our results clearly demonstrate that AngII-induced ROS production and DNA damage is independent of blood pressure. Since we found a significantly higher expression of the AT1bR in the AngII-treated AT1aR-KO-group and since blocking of both subtypes with cand resulted in a complete prevention of adverse AngII effects, the receptor responsible for the mediation of these effects seems to be AT1bR. 
The aim of the second experiment was to examine the contribution of Nox2 and Nox4 to oxidative DNA damage in vivo. Therefore male C57BL/6-mice and Nox2- or Nox4-deficient mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg × min during 28 days. In WT and in both strains of Nox-deficient mice, AngII induced hypertension, elevated urinary albumin levels and formation of ROS in the kidney. Furthermore, genomic damage, especially in form of double strand breaks were augmented in all of the AngII-treated groups. Also in the absence of AngII, Nox2- and Nox4-deficient mice exhibited a higher background of double strand breaks. Interestingly neither Nox2 nor Nox4 do not compensate for the deficiency of the other isoform on mRNA level. Due to these results we conclude that there is no isoform so far which is solely responsible for the generation of ROS in the kidney under AngII-treatment. Potentially there might also be a contribution of other enzymes like xanthine oxidase or nitric oxide synthase to the formation of ROS. Since genomic damage in kidneys of Nox2- and Nox4-deficient mice in the absence of AngII was higher as compared to the damages in WT control mice it might be that both isoforms could have a protective role in renal disease. But, since this is so far only described for Nox4 it is likely that the absence of one of the two isoforms rather has an influence on the embryonic development. To finally clarify this hypothesis it would be suggestive to work with inducible knockout mouse models where possible developmental effects can be minimized.
KW  - Angiotensin II
KW  - NADPH-Oxidase
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Angiotensin II
KW  - NADPH oxidase
KW  - angiotensin II type 1a receptor
KW  - DNA damage
KW  - oxidative stress
KW  - Angiotensin II Typ 1a-Rezeptor
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137469
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Federico, Stephanie
A1  - Redenti, Sara
A1  - Sturlese, Mattia
A1  - Ciancetta, Antonella
A1  - Kachler, Sonja
A1  - Klotz, Karl-Norbert
A1  - Cacciari, Barbara
A1  - Moro, Stefano
A1  - Spalluto, Giampiero
T1  - The Influence of the 1-(3-Trifluoromethyl-Benzyl)-1H-Pyrazole-4-yl Moiety on the Adenosine Receptors Affinity Profile of Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]Triazolo[1,5-c]Pyrimidine Derivatives
JF  - PLoS One
N2  - A new series of pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidine (PTP) derivatives has been developed in order to explore their affinity and selectivity profile at the four adenosine receptor subtypes. In particular, the PTP scaffold was conjugated at the C2 position with the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole, a group believed to confer potency and selectivity toward the human (h) A\(_{2B}\) adenosine receptor (AR) to the xanthine ligand 8-(1-(3-(trifluoromethyl) benzyl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,3-dimethyl-1H-purine-2,6(3H, 7H)-dione (CVT 6975). Interestingly, the synthesized compounds turned out to be inactive at the hA\(_{2B}\) AR but they displayed affinity at the hA\(_3\) AR in the nanomolar range. The best compound of the series (6) shows both high affinity (hA\(_3\) AR K\(_i\) = 11 nM) and selectivity (A\(_1\)/A\(_3\) and A\(_{2A}\)/A\(_3\) > 9090; A\(_{2B}\)/A\(_3\) > 909) at the hA\(_3\) AR. To better rationalize these results, a molecular docking study on the four AR subtypes was performed for all the synthesized compounds. In addition, CTV 6975 and two close analogues have been subjected to the same molecular docking protocol to investigate the role of the 1-(3-trifluoromethyl-benzyl)-1H-pyrazole on the binding at the four ARs.
KW  - drug
KW  - human A(3)
KW  - protein-coupled receptors
KW  - classification
KW  - subtypes
KW  - potent
KW  - antagonists
KW  - mast cells
KW  - targets
KW  - A(2B) receptors
KW  - international union
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137133
VL  - 10
IS  - 12
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hupp, Sabrina
A1  - Förtsch, Christina
A1  - Wippel, Carolin
A1  - Ma, Jiangtao
A1  - Mitchell, Timothy J.
A1  - Iliev, Asparouh I.
T1  - Direct Transmembrane Interaction between Actin and the Pore-Competent, Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin
JF  - Journal of Molecular Biology
N2  - The eukaryotic actin cytoskeleton is an evolutionarily well-established pathogen target, as a large number of bacterial factors disturb its dynamics to alter the function of the host cells. These pathogenic factors modulate or mimic actin effector proteins or they modify actin directly, leading to an imbalance of the precisely regulated actin turnover. Here, we show that the pore-forming, cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin (PLY), a major neurotoxin of Streptococcus pneumoniae, has the capacity to bind actin directly and to enhance actin polymerisation in vitro. In cells, the toxin co-localised with F-actin shortly after exposure, and this direct interaction was verified by Förster resonance energy transfer. PLY was capable of exerting its effect on actin through the lipid bilayer of giant unilamellar vesicles, but only when its pore competence was preserved. The dissociation constant of G-actin binding to PLY in a biochemical environment was 170–190 nM, which is indicative of a high-affinity interaction, comparable to the affinity of other intracellular actin-binding factors. Our results demonstrate the first example of a direct interaction of a pore-forming toxin with cytoskeletal components, suggesting that the cross talk between pore-forming cytolysins and cells is more complex than previously thought.
KW  - pore-forming toxin
KW  - cholesterol-dependent cytolysin
KW  - actin
KW  - membrane
KW  - pneumolysin
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132297
VL  - 425
IS  - 3
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Klotz, Barbara
A1  - Mentrup, Birgit
A1  - Regensburger, Martina
A1  - Zeck, Sabine
A1  - Schneidereit, Jutta
A1  - Schupp, Nicole
A1  - Linden, Christian
A1  - Merz, Cornelia
A1  - Ebert, Regina
A1  - Jakob, Franz
T1  - 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Treatment Delays Cellular Aging in Human Mesenchymal Stem Cells while Maintaining Their Multipotent Capacity
JF  - PLoS ONE
N2  - 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) was reported to induce premature organismal aging in fibroblast growth factor-23 (Fgf23) and klotho deficient mice, which is of main interest as 1,25D3 supplementation of its precursor cholecalciferol is used in basic osteoporosis treatment. We wanted to know if 1,25D3 is able to modulate aging processes on a cellular level in human mesenchymal stem cells (hMSC). Effects of 100 nM 1,25D3 on hMSC were analyzed by cell proliferation and apoptosis assay, beta-galactosidase staining, VDR and surface marker immunocytochemistry, RT-PCR of 1,25D3-responsive, quiescence-and replicative senescence-associated genes. 1,25D3 treatment significantly inhibited hMSC proliferation and apoptosis after 72 h and delayed the development of replicative senescence in long-term cultures according to beta-galactosidase staining and P16 expression. Cell morphology changed from a fibroblast like appearance to broad and rounded shapes. Long term treatment did not induce lineage commitment in terms of osteogenic pathways but maintained their clonogenic capacity, their surface marker characteristics (expression of CD73, CD90, CD105) and their multipotency to develop towards the chondrogenic, adipogenic and osteogenic pathways. In conclusion, 1,25D3 delays replicative senescence in primary hMSC while the pro-aging effects seen in mouse models might mainly be due to elevated systemic phosphate levels, which propagate organismal aging.
KW  - perspectives
KW  - bone marrow
KW  - mutant mice
KW  - oxidative stress
KW  - transcription factors
KW  - vitamin-D-receptor
KW  - differentiation
KW  - tissue
KW  - 2',7'-dichlorofluorescin
KW  - homeostasis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133392
VL  - 7
IS  - 1
ER  - 
TY  - THES
A1  - Leyh, Annekathrin
T1  - In vitro Untersuchungen zur Genotoxizität von Insulin
T1  - In vitro studies on genotoxicity of insulin
N2  - Insulin ist ein essentielles Hormon im menschlichen Körper, welches für die Senkung der Blutglukosekonzentration, die Bildung von Energiespeichern und das Zellwachstum verantwortlich ist. Eine mit der Fehlregulation der Insulinproduktion einhergehenden Krankheit ist der Diabetes mellitus. Für diese Arbeit spielt der Typ 2 dieser Erkrankung eine wichtige Rolle. Es entwickelt sich bei Patienten mit diesem Typ des Diabetes mellitus langsam eine Insulinresistenz, die zunächst durch eine kompensatorische Überproduktion von Insulin charakterisiert ist. Dieser Zustand der Hyperinsulinämie kann Jahre bis Jahrzehnte andauern, ehe es zu einem Versagen der ß-Zellen des Pankreas und somit zu einer Hypoinsulinämie kommt. In dieser Arbeit war es Ziel herauszufinden, ob diese lange Zeit herrschende Hyperinsulinämie einen Einfluss auf die menschliche DNA hat. Die Genotoxizität von hohen Insulinkonzentrationen wurde in Hep-G2 Zellen, HT29 Zellen, sowie primären humanen peripheren Lymphozyten mithilfe des Comet Assays und des Mikrokerntests nachgewiesen. Oxidativer Stress bzw. dessen Reduzierung durch Antioxidantien und Inhibitoren wurde in HT29 Zellen mithilfe der DHE-Färbung detektiert. Diese Arbeit belegt dass sich Insulin schädigend auf das menschliche Genom in vitro auswirken kann. Eine besondere Relevanz haben die durchgeführten Experimente mit primären menschlichen Lymphozyten. Denn bei ihnen handelt es sich um Zellen, die im Gegensatz zu der auch genutzten humanen Leberkarzinomzelllinie Hep-G2 und der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 nicht transformiert sind. Eine weitere wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass schon pathophysiologisch vorliegende Insulinkonzentrationen in der Lage sind Genomschädigungen in vitro zu induzieren. HT29 Zellen zeigten bei Kurzzeitbehandlung mit nur 1nM Insulin eine signifikante Erhöhung der DNA-Schädigung. Bei Langzeitexposition von 6 Tagen konnten schon 0,5nM signifikante DNA-Schäden hervorrufen. Diese durch Insulin hervorgerufenen Schäden könnten, falls sie so auch in vivo entstehen, bei Versagen von Reparaturmechanismen zur Entstehung von Mutationen und sich daraus entwickelnden Karzinomen beitragen. Aus diesem Grund war ein weiteres Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob bestimmte Antioxidantien oder Inhibitoren in der Lage sind die Insulin-induzierten Genomschädigungen zu verringern. Hierfür wurde Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 und Wortmannin genutzt. Tatsächlich sind diese Substanzen in der Lage die durch Insulin hervorgerufene Schädigung zu reduzieren. Die positiven Ergebnisse dieser Arbeit könnten einen ersten Hinweis auf eine mögliche pharmakologische Intervention bei Hyperinsulinämie mit dem Ziel der Senkung des erhöhten Krebsrisikos geben. Eine wichtige Erkenntnis aus den Ergebnissen meiner Arbeit ist, dass die Reduzierung des oxidativen Stresses eine Reduzierung der Genomschädigung bewirkt. Die genutzten Substanzen Apocynin, Tempol, VAS2870 und Rotenone bewirkten in HT29 Zellen eine signifikante Reduzierung des durch Insulin ausgelösten oxidativen Stresses. Um aber genauere Aussagen über Möglichkeiten der Therapie bei Hyperinsulinämie zu treffen, sollten Folgestudien auch in vivo folgen, welche die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte bestätigen.
N2  - Insulin is an essential hormone in the human body, which is responsible for the reduction of blood glucose concentration, the formation of energy holding compounds, and cell growth. A disease associated with the dysregulation of insulin production is diabetes mellitus. For this work, the type 2 of the disease plays an important role. Patients with this type of diabetes mellitus gradually develop an insulin resistance, which is initially characterized by a compensatory overproduction of insulin. This state of hyperinsulinemia may last years or even decades, before it comes to a break-down of the beta cells of the pancreas, and hence to a hypoinsulinemia. The target of this study was to evaluate, whether these long term lasting hyperinsulinemia has an impact on human DNA. The genotoxicity of high insulin concentrations was detected in HepG2 cells, HT29 cells as well as primary human peripheral lymphocytes, using the comet assay and the micronucleus test. Oxidative stress and it´s reduction by antioxidants and inhibitors was detected in HT29 cells using the DHE staining. This work shows that insulin may damage the human genome in vitro. A special relevance show experiments carried out with primary human lymphocytes. Because these are not transformed like the human liver carcinoma cell line HepG2, and the human colon carcinoma cell line HT29, also studied. Another significant finding of this study is, that even pathophysiologically present insulin concentrations are capable to damage the genome in vitro. HT29 cells showed a significant increase in DNA damage when short-term treated with only 1nM insulin. After long-term exposure of 6 days already 0.5nM were capable to significantly damage DNA. This induced insulin damage could, if also occurring in vivo, contribute to the development of mutations and carcinomas, if mechanisms of repairs are failing. A further aim of this study was therefore to check whether certain antioxidants or inhibitors would be capable of reducing insulin-induced genome damages. For this Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 and Wortmannin were used. In fact, these substances are capable to reduce the damage caused by insulin. The positive results of this work could be a first indication of a possible pharmacological intervention against hyperinsulinemia with the aim of lowering stringent cancer risk. An important conclusion of the results of my work is that reduction of oxidative stress results in a reduction of genome damage. The substances used, Apocynin, Tempol, VAS2870 and Rotenone, caused a significant reduction of insulin-induced oxidative stress, in HT29 cells. In order to make more detailed statements about possibilities of hyperinsulinemia therapy, follow-up studies in vivo are required which would back-up the findings of this study.
KW  - Insulin
KW  - Genotoxizität
KW  - Hyperinsulinämie
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131986
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Vandenberg, Laura N.
A1  - Chahoud, Ibrahim
A1  - Heindel, Jerrold J.
A1  - Padmanabhan, Vasantha
A1  - Paumgartten, Francisco J. R.
A1  - Schönfelder, Gilbert
T1  - Urinary, Circulating, and Tissue Biomonitoring Studies Indicate Widespread Exposure to Bisphenol A
T1  - Estudos de biomonitoração do sistema urinário, circulatório e tecidos indicam grande exposição ao Bisfenol A
JF  - Ciência & Saúde Coletiva
N2  - Bisphenol A (BPA) is one of the highest-volume chemicals produced worldwide, and human exposure to BPA is thought to be ubiquitous. Thus, there are concerns that the amount of BPA to which humans are exposed may cause adverse health effects. We examined many possibilities for why biomonitoring and toxicokinetic studies could come to seemingly conflicting conclusions. More than 80 published human biomonitoring studies that measured BPA concentrations in human tissues, urine, blood, and other fluids, along with two toxicokinetic studies of human BPA metabolism were examined. Unconjugated BPA was routinely detected in blood (in the nanograms per milliliter range), and conjugated BPA was routinely detected in the vast majority of urine samples (also in the nanograms per milliliter range). In stark contrast, toxicokinetic studies proposed that humans are not internally exposed to BPA. Available data from biomonitoring studies clearly indicate that the general population is exposed to BPA and is at risk from internal exposure to unconjugated BPA. The two toxicokinetic studies that suggested human BPA exposure is negligible have significant deficiencies, are directly contradicted by hypothesis-driven studies, and are therefore not reliable for risk assessment purposes.
N2  - Bisfenol A (BPA) é um dos produtos químicos mais produzido em todo o mundo, e a exposição humana a ele é considerada onipresente. Assim, há preocupações de que a quantidade de BPA para o qual os seres humanos estão expostos podem causar efeitos adversos à saúde. Nós examinamos muitas possibilidades sobre o porquê estudos de biomonitorização e toxicocinética podem chegar a conclusões aparentemente conflitantes. Mais de 80 estudos publicados de biomonitorização humana que mediram a concentração de BPA em tecidos humanos, urina, sangue e outros fluidos, juntamente com dois estudos de toxicocinética do metabolismo humano BPA foram examinados. BPA não conjugado foi detectado no sangue (nonanogramas por mililitro gama), e BPA conjugado foi detectado na grande maioria das amostras de urina. Em contraste, estudos de toxico-cinética propuseram que os seres humanos não são internamente expostos ao BPA. Dados disponíveis de estudos de biomonitorização indicam que a população em geral está exposta ao BPA e em risco de exposição interna ao BPA não conjugado. Os dois estudos de toxicocinética, que sugeriram a exposição humana ao BPA é insignificante, têm deficiências significativas e estão diretamente refutados por outros estudos e, portanto não são confiáveis para fins de avaliação de risco.
KW  - human
KW  - performance liquid-chromatography
KW  - toxicocinética
KW  - serum
KW  - fluorescence detection
KW  - disrupting chemicals
KW  - endocrine disruptor
KW  - human exposure
KW  - PBPK/PBTK model
KW  - pregnancy
KW  - risk assessment
KW  - toxicokinetics
KW  - solid-phase extraction
KW  - tandem mass-spectrometry
KW  - HPLC-MS/MS method
KW  - environmental phenols
KW  - estrogen receptor
KW  - adipose tissue
KW  - disruptor endócrino
KW  - exposição humana
KW  - modelo PBPK/PBTK
KW  - gravidez
KW  - avaliação de risco
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134332
VL  - 17
IS  - 2
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Wippel, Carolin
A1  - Maurer, Jana
A1  - Fortsch, Christina
A1  - Hupp, Sabrina
A1  - Bohl, Alexandra
A1  - Ma, Jiangtao
A1  - Mitchell, Timothy J.
A1  - Bunkowski, Stephanie
A1  - Brück, Wolfgang
A1  - Nau, Roland
A1  - Iliev, Asparouh I.
T1  - Bacterial Cytolysin during Meningitis Disrupts the Regulation of Glutamate in the Brain, Leading to Synaptic Damage
JF  - PLoS Pathogens
N2  - Abstract
Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) meningitis is a common bacterial infection of the brain. The cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin represents a key factor, determining the neuropathogenic potential of the pneumococci. Here, we demonstrate selective synaptic loss within the superficial layers of the frontal neocortex of post-mortem brain samples from individuals with pneumococcal meningitis. A similar effect was observed in mice with pneumococcal meningitis only when the bacteria expressed the pore-forming cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin. Exposure of acute mouse brain slices to only pore-competent pneumolysin at disease-relevant, non-lytic concentrations caused permanent dendritic swelling, dendritic spine elimination and synaptic loss. The NMDA glutamate receptor antagonists MK801 and D-AP5 reduced this pathology. Pneumolysin increased glutamate levels within the mouse brain slices. In mouse astrocytes, pneumolysin initiated the release of glutamate in a calcium-dependent manner. We propose that pneumolysin plays a significant synapto- and dendritotoxic role in pneumococcal meningitis by initiating glutamate release from astrocytes, leading to subsequent glutamate-dependent synaptic damage. We outline for the first time the occurrence of synaptic pathology in pneumococcal meningitis and demonstrate that a bacterial cytolysin can dysregulate the control of glutamate in the brain, inducing excitotoxic damage.

Author Summary
Bacterial meningitis is one of the most devastating brain diseases. Among the bacteria that cause meningitis, Streptococcus pneumoniae is the most common. Meningitis predominantly affects children, especially in the Third World, and most of them do not survive. Those that do survive often suffer permanent brain damage and hearing problems. The exact morphological substrates of brain damage in Streptococcus pneumoniae meningitis remain largely unknown. In our experiments, we found that the brain cortex of patients with meningitis demonstrated a loss of synapses (the contact points among neurons, responsible for the processes of learning and memory), and we identified the major pneumococcal neurotoxin pneumolysin as a sufficient cause of this loss. The effect was not direct but was mediated by the brain neurotransmitter glutamate, which was released upon toxin binding by one of the non-neuronal cell types of the brain – the astrocytes. Pneumolysin initiated calcium influx in astrocytes and subsequent glutamate release. Glutamate damaged the synapses via NMDA-receptors – a mechanism similar to the damage occurring in brain ischemia. Thus, we show that synaptic loss is present in pneumococcal meningitis, and we identify the toxic bacterial protein pneumolysin as the major factor in this process. These findings alter our understanding of bacterial meningitis and establish new therapeutic strategies for this fatal disease.
KW  - synapses
KW  - brain damage
KW  - astrocytes
KW  - neuronal dendrites
KW  - meningitis
KW  - glutamate
KW  - bacterial meningitis
KW  - neocortex
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130462
VL  - 9
IS  - 6
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Capra, Valérie
A1  - Busnelli, Marta
A1  - Perenna, Alessandro
A1  - Ambrosio, Manuela
A1  - Accomazzo, Maria Rosa
A1  - Galés, Celine
A1  - Chini, Bice
A1  - Rovati, G. Enrico
T1  - Full and Partial Agonists of Thromboxane Prostanoid Receptor Unveil Fine Tuning of Receptor Superactive Conformation and G Protein Activation
JF  - PLoS ONE
N2  - The intrahelical salt bridge between \(E/D^{3.49}\) and \(R^{3.50}\) within the E/DRY motif on helix 3 (H3) and the interhelical hydrogen bonding between the E/DRY and residues on H6 are thought to be critical in stabilizing the class A G protein-coupled receptors in their inactive state. Removal of these interactions is expected to generate constitutively active receptors. This study examines how neutralization of \(E^{3.49/6.30}\) in the thromboxane prostanoid (TP) receptor alters ligand binding, basal, and agonist-induced activity and investigates the molecular mechanisms of G protein activation. We demonstrate here that a panel of full and partial agonists showed an increase in affinity and potency for E129V and E240V mutants. Yet, even augmenting the sensitivity to detect constitutive activity (CA) with overexpression of the receptor or the G protein revealed resistance to an increase in basal activity, while retaining fully the ability to cause agonist-induced signaling. However, direct G protein activation measured through bioluminescence resonance energy transfer (BRET) indicates that these mutants more efficiently communicate and/or activate their cognate G proteins. These results suggest the existence of additional constrains governing the shift of TP receptor to its active state, together with an increase propensity of these mutants to agonist-induced signaling, corroborating their definition as superactive mutants. The particular nature of the TP receptor as somehow "resistant" to CA should be examined in the context of its pathophysiological role in the cardiovascular system. Evolutionary forces may have favored regulation mechanisms leading to low basal activity and selected against more highly active phenotypes.
KW  - coupled receptor
KW  - ligand binding
KW  - intracellular loop
KW  - molecular dynamics
KW  - Beta(1)-adrenergic receptor
KW  - ionic look
KW  - Beta(2)-adrenergic receptor
KW  - crystal structure
KW  - constitutive activity
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131013
VL  - 8
IS  - 3
ER  - 
TY  - THES
A1  - Knaus, Anne Elizabeth
T1  - Pharmacological target proteins of alpha2-agonists in alpha2ABC-deficient mice
T1  - Pharmakologische Zielproteine von alpha2-Agonisten bei alpha2ABC-Rezeptor-defizienten Mäusen
N2  - Clonidine is an agonist at alpha2-adrenergic receptors that mediate a wide variety of the physiological responses to epinephrine and norepinephrine, such as inhibition of neurotransmitter release as well as sedation and analgesia. As with other therapeutically used alpha2-agonists such as moxonidine and rilmenidine, clonidine possesses an imidazoline structure and is believed to lower blood pressure not only via central and peripheral alpha2-receptors, but perhaps even more so by acting on central “imidazoline I1 receptors” in the brain stem. The molecular structure of these hypothetical “imidazoline I1 receptors” has not yet been identified. In order to test whether ligands with an imidazoline structure elicit pharmacological effects via alpha2-adrenergic receptors or via “imidazoline receptors”, mice were generated with a targeted deletion of all three alpha2-adrenergic receptor subtypes (alpha2ABC-KO). These alpha2ABC-KO mice were an ideal model in which to examine the pharmacological effects of the centrally acting antihypertensives clonidine, moxonidine and rilmenidine in the absence of alpha2-adrenergic receptors. As expected, sedative and analgesic actions of clonidine were completely absent in alpha2ABC-KO mice, confirming the sole role of alpha2-receptors in these properties of clonidine. Clonidine significantly lowered heart rate in anesthetized alpha2ABC-KO and wild-type mice by up to 150 beats/min. A similar bradycardic effect of clonidine was observed in isolated spontaneously beating right atria from alpha2ABC-KO mice. After treatment with the specific If inhibitor ZD 7288, clonidine was no longer able to lower spontaneous beating frequency, suggesting a common site of action. Furthermore, in HEK293 cells stably transfected with HCN2 and HCN4, it could be shown that clonidine inhibits the If current via blockade of pacemaker channels with similar affinity as in isolated alpha2ABC-KO and wild-type atria. This inhibition was demonstrated again in isolated sinoatrial node (SAN) cells from alpha2ABC-KO mice and was identical in potency and efficacy to clonidine inhibition observed in isolated wild-type SAN cells, confirming that inhibition of atrial HCN channels constitutes the alpha2-independent bradycardic action of clonidine. Direct inhibition of cardiac HCN pacemaker channels contributes to the bradycardic effects of clonidine in gene-targeted mice. Thus clonidine-like drugs represent novel structures for future HCN channel inhibitors.
N2  - alpha2-adrenerge Rezeptoren vermitteln die vielfältigen Wirkungen der endogenen Catecholamine Noradrenalin und Adrenalin, darunter auch eine Hemmung der Noradrenalin-Freisetzung sowie Sedierung und Analgesie. Clonidin und die ebenfalls therapeutisch eingesetzten alpha2-Agonisten Moxonidin und Rilmenidin besitzen eine Imidazolin-Teilstrukur. Es wird zur Zeit diskutiert, ob die hypotensive Wirkung dieser Arzneimittel nicht nur auf zentrale und periphere alpha2-Rezeptoren zurückzuführen ist, sondern auch auf sogenannte “I1 Imidazolin-Rezeptoren” in der ventrolateralen Medulla. Bis heute ist die molekulare Struktur dieser hypothetischen Rezeptoren nicht bekannt. Um diese Imidazolin-Hypothese zu überprüfen wurden Mäuse mit einer gezielten Deletion in allen drei alpha2-Rezeptor Genen generiert (alpha2ABC-KO). Dieses Mausmodell eignete sich hervorragend, um die pharmakologische Wirkung von den zentral-wirksamen Antihypertensiva Clonidin, Moxonidin und Rilmenidin in der völligen Abwesenheit von alpha2-Rezeptoren zu untersuchen. Wie erwartet fehlten die sedativen und analgetischen Wirkungen des Clonidins bei alpha2ABC-KO Mäusen, wodurch die alleinige Beteiligung von alpha2-Rezeptoren an diesen Eigenschaften des Clonidins bestätigt wurde. Bei anästhesierten alpha2ABCKO und Wildtyp-Mäusen zeigte Clonidin eine signifikante Senkung der basalen Herzfrequenz in beiden Genotypen von bis zu 150 Schlägen/min. In ähnlicher Weise setzte Clonidin in isolierten, spontan schlagenden rechten Vorhöfen von alpha2ABC-KO die Schlagfrequenz herab. Nach Vorbehandlung der Vorhöfe mit dem spezifischen If Inhibitor ZD 7288 fand keine weitere Senkung der Schlagfrequenz durch Clonidin mehr statt, was auf einen gemeinsamen Wirkort der beiden Substanzen hindeutete. In stabil transfizierten HEK293 Zellen zeigte Clonidin eine Inhibition des If Stromes durch Blockade von HCN2- und HCN4-Kanälen mit ähnlicher Potenz wie in den isolierten Vorhöfen. Ebenfalls in isolierten Sinusknoten (SAN) Zellen von alpha2ABC-KO und Wildtyp-Mäusen inhibierte Clonidin den If Strom mit gleicher Potenz. Diese Befunde bestätigen, dass die Blockade von atrialen HCN-Kanälen den Mechanismus der alpha2-unabhängigen, Clonidin-induzierten Bradykardie darstellt. Die direkte Hemmung von kardialen HCN-Schrittmacher-Kanälen trägt wesentlich zur bradykarden Wirkung von Clonidin bei transgenen Mäusen bei. Clonidin-Derivate bilden somit die Basis für die Entwicklung neuer HCN-Kanal-Inhibitoren.
KW  - alpha2-Rezeptor
KW  - Clonidin
KW  - HCN-Kanal
KW  - alpha2-KO Maus
KW  - I1 Imidazolin Bindungsstelle
KW  - alpha2-receptor
KW  - clonidine
KW  - HCN channel
KW  - alpha2-KO mouse
KW  - I1 imidazoline binding site
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23752
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schober, Tilmann
T1  - Erhöhte Calcium-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente - ein Mechanismus bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen
T1  - Increased myofilament calcium sensitivity - a mechanism in the development of cardiac arrhythmias
N2  - Die vorliegende Studie zeigt erstmals, dass eine erhöhte Ca2+-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente im Tiermodell einen selbstständigen Risikofaktor bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen darstellt. Dies konnte sowohl für chronische Erhöhung der Ca2+-Empfindlichkeit im Rahmen einer Familiären Hypertrophen Kardiomyopathie (FHK) als auch für eine akute Erhöhung mit Hilfe eines Ca2+-Sensitizers gezeigt werden. Die Ergebnisse der Arbeit bieten so eine mögliche Erklärung für plötzlichen Herztod bei bestimmten Patienten mit FHK. Sie schränken weiterhin den Einsatz von Ca2+-Sensitizern ein. Schließlich beleuchten sie einen bisher kaum untersuchten Aspekt in der Arrhythmogenese von Herzinsuffizienz und nach einem Myokard-Infarkt. Auf zellulärer Ebene findet sich ein veränderter Ca2+-Zyklus mit erniedrigten und verlangsamten Transienten. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich eine direkte Konsequenz der erhöhten Bindungsaffinität für Ca2+. Die Myofilamente sind „klebriger“ für Ca2+, während der Systole wird mehr Ca2+ gebunden, während der Diastole hingegen dissoziiert es langsamer. Bei adrenerger Stimulation und schnellen Herzfrequenzen mit entsprechender Verkürzung der Diastole kommt es zu erhöhtem diastolischem [Ca2+]i und zu erhöhten Ca2+-Inhalt des Sarkoplasmatischen Retikulums. Der so veränderte Ca2+-Zyklus führt wahrscheinlich mit Hilfe des Na+/Ca2+-Austauschers zu Veränderungen der Repolarisation des Aktionspotentials. Bei schnellen Herzfrequenzen treten Aktionspotential-Verlängerung, Ca2+-abhängige Nachdepolarisationen und getriggerte Schläge auf. Auf Organ-Ebene findet sich eine verkürzte Refraktärzeit. Damit sind sowohl ein Trigger als auch ein arrhythmogenes Substrat für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien gegeben.
N2  - The present study shows for the first time that increased Ca2+-sensitity of the cardiac myofilaments is an indepent mechanism in the development of cardiac arrhythmias. This could be shown both for chronically increased Ca2+-sensitity in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy (FHC) and for acute drug-induced Ca2+-sensitization. The results provide an explanation for sudden cardiac death in certain patients with FHC. Moreover they limit the use of Ca2+-sensitizers. Furthermore they elucidate new aspects in the arrhythmogenesis of important aquired hearts diseases such as heart failure and myocardial infarction. On the cellular level the Ca2+-cycle is altered, Ca2+-transients show a smaller amplitude and slower rate of decay. These changes are probably a direct consequence of the increased Ca2+-puffering capacity. The myofilaments are “sticky” for Ca2+, durig systole more Ca2+ is bound while the dissociation during diastole is decelerated. With adrenergic stimulation and faster frequencies there is an increased diastolic [Ca2+]i and subsequently an Ca2+-overloading of the Sarcoplasmatic Reticulum. These changes in the Ca2+-cycle cause remodelling of the action potential repolarisation via the Na+-Ca2+-exchanger. At fast frequencies one finds action potential prolongation, Ca2+-dependent afterdepolarisations and triggered activity. On the organ level Ca+-sensitized hearts show a shortened refractory period. Thus there is both trigger and substrate for the observed ventricular arrhytrhmia.
KW  - Herzrhythmusstörung
KW  - Calcium
KW  - Troponin
KW  - Aktionspotenzial
KW  - EAD
KW  - Alternans
KW  - Hypertrophische Herzmuskelkrankheit
KW  - Natrium-Calcium-Austauscher
KW  - Calcium-bindende Proteine
KW  - MAP
KW  - Refraktärzeit
KW  - Elektrokardiogramm
KW  - Frank-Starling-Gesetz
KW  - Sekunde
KW  - Myofilament
KW  - FHK
KW  - plötzlicher Herztod
KW  - Sudden Cardiac Death
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33298
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sevastiadis, Emmanouil
T1  - Mikrokernfrequenz peripherer Lymphozyten bei Dialyse- und Prädialysepatienten sowie bei gesunden Probanden nach in vitro Behandlung mit Methylmethansulfonat
T1  - The micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes of patients on hemodialysis, of patients with advanced renal disease und healthy donors after in vitro treatment with methylmethanesulfonate.
N2  - Nierenerkrankungen und die dazu gehörige Nierenersatztherapien spiegeln im Verlauf der letzten fünfzig Jahren die rasanten Entwicklungen der heutigen hochtechnisierten Medizin wider. Durch die zunehmende Lebenserwartung der Patienten unter langjährigen Blutreinigungsverfahren werden Probleme sichtbar, die vorher nicht zu erwarten waren, insbesondere ist hier die schwerwiegende Problematik der erhöhten Malignominzidenz in dieser Bevölkerungspopulation hervorzuheben. Die Ursachenforschung und die Prävention dieser erhöhten Malignominzidenz wird immer wichtiger. Die Zahl der Betroffenen steigt kontinuierlich. "Moderne" Erkrankungen wie Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie, die zur terminalen Niereninsuffizienz führen, haben die Dimension von Volkserkrankungen erreicht. Die Entstehung von Mikrokernen im Zellplasma neben dem eigentlichen Zellkern steht im dringendem Verdacht, dass sie einen Schritt in der Mutationsinduktion und Kanzerogenese darstellen und/oder diese Entwicklung anzeigen. Die Mikrokernfrequenz wird auch als Marker für eine akzidentelle oder chronische Schädigung des Genmaterials (z.B. nach beruflicher Exposition) genutzt. Auf zellulärer Ebene ist die Mikrokerninduktion auch Zeichen einer herabgesetzten Funktion der DNA-Repairmechanismen. Defekte dieser Mechanismen begünstigen nachgewiesenermaßen die Entstehung von Malignomen aller Art. Ziel der Arbeit war zu zeigen ob die in vivo beobachtete erhöhte Malignominzidenz bei Patienten unter Hämodialyse auch in Mikrokernfrequenzen abgebildet werden kann. Hier wurde die in vitro Behandlung mit einer bekannten kanzerogenen Substanz verwendet, um eine eventuell veränderte zelluläre Antwort in Form von gesteigerter Mikrokernfrequenzen in vitro zu provozieren. Dies wird als indirektes Zeichen der DNA-Repairfähigkeit angesehen. Als Substanz wurde Methylmethansulfonat verwendet. Die dafür modifizierte Methodik mit der Zusatz des kanzerogenen Methylmethansulfonat in Konzentrationen von 10, 20 und 40 µg/ml war ein zusätzlicher Stress für die Zellkulturen. Diese ließ aber in ausreichendem Maße die Vermehrung und Induktion von doppelkernigen Lymphozyten zu, so dass die Registrierung der Mikrokerne glaubhaft und repräsentativ war. Es wurden drei Gruppen von Probanden untersucht: Personen unter Dialyse, Patienten in einem Prädialysestadium und nierengesunde Probanden als Kontrollgruppe. Die Hämodialysepatienten zeigten keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollpatienten. Tendenziell erhöhte Mikrokernraten zeigten die Prädialysepatienten in allen Kategorien. Erwartungsgemäß war bei älteren Personen-Subgruppen eine gesteigterte Rate an in vitro induzierten Mikrokernen nach Erhöhung der kanzerogenen Substanzkonzentration zu finden. Es müssen sicherlich weitere Faktoren identifiziert werden, um den genetischen Schaden durch die verminderte DNA-Repairkapazität in Form von Mikrokernen zuverlässig abbilden zu können. Hier könnten eine Mindestdauer der Dialyse von 10 Jahren sowie ein Kreatininwert von über 5 mg/dl eine entscheidende Rolle spielen.
N2  - End-stage renal disease (ESRD) patients on hemodialysis or renal transplantation patients have an increased incidence of cancer compared with the general human population. Various factors associated with renal failure and its therapeutic treatment may favour malignant transformation and cancer formation. The induction of micronuclei in cytoplasm is used as a marker of chronic or accidental genetic damage and is well established as a standard method for monitoring chromosome damage in human populations. The incidence of micronuclei seems to correlated with DNA repair processes. A reduced DNA repair capacity is associated with enhanced incidence of malignancy. This study investigated the spontaneous micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes of 10 patients on hemodialysis, 10 patients with advanced chronic renal failure (creatine level 3.0 mg/dl- 8.2 mg/dl) and 10 healthy non smoking donors in age- and sex-matched groups with the cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN assay) The micronuclei frequency has also been determinated after treatment of the lymphocytes culture with 10, 20 and 40 µg/ml of methyl methanesulfonate. The cultivation of these lymphocytes has shown reliable and representative results. There was no significant difference regarding the micronuclei frequency between the 3 groups. The group of patients with advanced chronic renal failure and the subgroup of long-term (more than 10 years) hemodialysis patients tended to show increased micronuclei frequencies in all age groups compared with all ESRD patients and the healthy control persons. In conclusion, more studies will have to be conducted in the future in order to identify the factors for an increased incidence of malignancy in those patients.
KW  - Hämodialyse
KW  - Mikrokerne
KW  - Mikrokernfrequenz
KW  - Hämodialyse
KW  - terminale Niereninsuffizienz
KW  - Cytochalasin-B micronucleus assay
KW  - Methymethansulfonat
KW  - micronuclei
KW  - end-stage renal disease
KW  - ESDR
KW  - cytokinesis-block micronucleus assay
KW  - methyl methanesulfonate
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33283
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Banach, Katrin
A1  - Bünemann, Moritz
A1  - Hüser, Jörg
A1  - Pott, Lutz
T1  - Serum contains a potent factor that decreases \(\beta\)-adrenergic receptor-stimulated L-type Ca\(^{2+}\) current in cardiac myocytes
N2  - No abstract available
KW  - Cardiac myocyte ; Beta-Receptor ; Muscarinic receptor ; cAMP ; G-protein ; Serum
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32027
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dorsch, Sandra
T1  - Rezeptor-Rezeptor-Interaktion ß-adrenerger Rezeptoren
T1  - Receptor-Receptor Interaction of ß-adrenergic Receptors
N2  - Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.
N2  - Many membrane receptors exist as disulfide-bond dimers. In these cases dimerization is methodological clearly and easily provable. However, for most G-protein coupled receptors the postulated existence of di- or oligomerization nor their function is definitely demonstrated. Mostly, methods like co-immunoprecipitation and resonance energy transfer techniques like BRET and FRET were used to investigate protein-protein interactions. Despite their high sensitivity these methods have some limits and reveal sometimes distinct results regarding the occurrence of a protein-protein interaction depending on experimental approach and use of different controls. Neither the stability of the interaction nor the fraction of interacting proteins are determinable using resonance energy transfer assays. Furthermore the size of complexes is not or only technically difficult determinable. Therefore in this work a novel independent approach was developed to allow a more detailed investigation of receptor-receptor interactions in living cells. This method based on fluorescence recovery after photobleaching microscopy allows to determine the mobility of proteins. In order to measure homo-interactions between proteins two protein fractions with different mobility have to be distinguishable. Therefore one receptor fraction was extracellularly tagged with YFP and specifically immobilized using polyclonal antibodies against YFP. The other receptor fraction was intracellularly labeled with CFP or Cerulean and therefore not recognized by the extracellular antibodies. In this way using dual-color FRAP potential interactions between immobilized extracellularly-tagged receptors and intracellularly-tagged receptors were detectable due to a change of mobility of the latter. This method was validated using monomeric (CD86) and covalent dimeric (CD28) receptors. A specific immobilization of extracellularly-tagged proteins was achievable only by using polyclonal but not monoclonal antibodies against YFP. Intracellularly tagged proteins were not influenced in their mobility by extracellular antibodies. After immobilization of the extracellularly-labeled CD86 the coexpressed intracellularly-tagged CD86-CFP was still fully mobile. Furthermore the monomeric CD86 showed a relative CFP–YFP expression ratio independent mobility. This result led to the conclusion that extra- and intracellularly labeled CD86 did not interact with each other and exist as a monomer. The mobility of the covalent dimer CD28 however was depending on the relative CFP-YFP expression ratio and was in good agreement with theoretically expected values for a dimer. The application of the dual-color FRAP approach for the investigation of interactions between ß1- and ß2-adrenergic receptors showed differences between both receptor subtypes. ß1-AR exhibited a specific transient interaction, however ß2-AR existed as stable higher order oligomers. The transient interaction between ß1-AR and the stable higher order oligomerization of ß2-AR were not only observed in HEK 293T cells but also in neonatal rat cardiac myocytes and at 37°C. Furthermore the activation state of the respective receptor had no influence on the extent of the interaction. Between ß1- and ß2-AR only a weak and unstable hetero-interaction was observed using the dual-color FRAP approach. In order to control if a direct interaction between the adrenergic receptors is occurring the BRET method was applied. Using BRET a direct interaction between ß2-AR was observed, but it was not possible to distinguish between dimers and higher order oligomers. For ß1-AR a specific energy transfer occurred at higher YFP-Rluc expression ratios. At lower expression ratios the signal was in the unspecific range. Also the investigation of hetero-interactions between ß1- and ß2-AR revealed no clear conclusion about a specific interaction between both receptor subtypes.
KW  - Dimerisierung
KW  - FRAP
KW  - GPCR
KW  - ß-adrenerge Rezeptoren
KW  - BRET
KW  - FRAP
KW  - GPCR
KW  - ß-adrenergic Receptors
KW  - BRET
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39712
ER  - 
TY  - THES
A1  - Humrich, Jan
T1  - G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine
T1  - G protein betagamma regulation by phosducin-like proteins
N2  - Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.
N2  - Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.
KW  - G-Proteine
KW  - Membranrezeptor
KW  - Regulation
KW  - Proteinfaltung
KW  - Phosphorylierung
KW  - Zellkultur
KW  - RNS-Interferenz
KW  - Proteinkinase A
KW  - Protein-Protein-Wechselwirkung
KW  - Proteinkinase CK2
KW  - Immunoblot
KW  - Phosducin
KW  - Phosducin-like Proteine
KW  - CCT
KW  - TCP-1 alpha
KW  - Proteasom
KW  - WD 40 Repeat Proteins
KW  - Inhibition
KW  - Protein Folding
KW  - Protein Interaction
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hommers, Leif
T1  - Modulation der Einwärtsgleichrichrichtung von GIRK-Kanälen durch G-Protein Untereinheiten
T1  - Modulation of the rectification properties of GIRK channels by G Protein subunits
N2  - G-Protein-gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kalium-Kanäle sind durch zwei Eigenschaften gekennzeichnet: (I) Die Leitfähigkeit für K+-Ionen ist positiv des Kalium-Gleichgewichtspotentials reduziert und (II) die Kanal-Aktivität wird durch Bindung von G betagamma-Dimere heterotrimerer Gi/o-Proteine reguliert. In der Literatur wurde die Aktivierung von GIRK-Kanälen als eine Zunahme ihrer Offenwahrscheinlichkeit unabhängig vom Membranpotential beschrieben. Die vorliegenden Untersuchungen zeigten, dass es bei starker Aktivierung des GIRK-Kanals durch G betagamma-Dimere auch zu einer Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung kommt. Im heterologen Expressionssystem konnte bei Rezeptor-Stimulation mit Agonist die Einwärtsgleichrichtung von GIRK-Kanälen abhängig von der Stärke der Koexpression von G betagamma-Dimeren geschwächt werden. Dieser Effekt entstand nicht durch eine Veränderung der Affinität, mit der Polyamine und Mg2+-Ionen den GIRK-Kanal membranpotentialabhängig blockieren. Die Kinetik, mit der Polyamine den GIRK-Kanal blockieren, war nicht verändert; eine Erhöhung der intrazellulären Mg2+-Konzentration um den Faktor 20 konnte eine Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung nicht mindern. Es wurde vermutet, dass eine Änderung der Konformation von Strukturen nahe des Selektivitätsfilters die Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung verursacht. Gestützt wurde diese Vermutung zum einen dadurch, dass Ba2+- und Cs+-Ionen, die von extrazellulärer Seite her den Kanal an Strukturen nahe des Selektivitätsfilters blockieren können, unter schwach einwärtsgleichrichtenden Bedingungen eine geringere Bindungsaffinität hatten und zum anderen dadurch, dass das relative Ausmaß des GIRK-Kanal-Blocks durch Cs+-Ionen mit der Stärke der Einwärtsgleichrichtung korrelierte.
N2  - G Protein-coupled inwardly rectifying potassium channels (GIRK channels) conduct K+ ions at membrane potentials negative of the potassium reversal potential and are activated by binding of G betagamma subunits of heterotrimeric Gi/o proteins. Activation of GIRK channels was described to be a process, which results in an increase in open probabilty independent of the membrane potential. The investigations of this thesis enhance this modell by supoorting evidence, that the degree of rectification becomes weakened upon strong GIRK channel activation. The weakened inward rectification was not associated with a shift in Mg2+ or polyamine binding affinities towards GIRK. It was concluded, that structeres close to the selectivity filter may be involved in the process, as proposed by the finding, that Cs+ and Ba2+ block (which is considered to take place near the selectivity filter) is less efficient in weakly inward rectifying GIRK channels.
KW  - GIRK
KW  - Einwärtsgleichrichtung
KW  - G Protein
KW  - Gi/o
KW  - G beta gamma
KW  - GIRK
KW  - Einwärtsgleichrichtung
KW  - G Protein
KW  - Gi/o
KW  - G beta gamma
KW  - GIRK
KW  - Inward Rectification
KW  - G Protein
KW  - Gi/o
KW  - G beta gamma
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40388
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schickinger, Stefanie
T1  - Funktionsanalyse alpha2-adrenerger Rezeptoren auf molekularer und transgener Ebene
T1  - Analysis of functions of alpha2-adrenergic receptors at molecular and transgenic levels
N2  - alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt.
N2  - alpha2-adrenergic receptors of which three different subtypes were cloned (alpha2A, alpha2B, alpha2C), are part of the family of G-protein coupled receptors and mediate many physiological functions of the transmitters adrenaline and noradrenaline. This study was initiated to determine whether receptor subtypes, their subcellular localization or the status of differentiation of a cell are responsible for the functional diversity of effects of alpha2-adrenergic receptors in vivo. In the first part of this project a transgenic mouse model was characterized, in which alpha2-adrenergic receptors were expressed under control of the dopamine-beta-hydroxylase-promotor in adrenergic neurons selectively. This model was used to test whether a single receptor subtype has identical functions in different neurons of the sympathetic nervous system in vivo. Transgenic alpha2A-adrenergic receptors inhibited the release of noradrenaline from sympathetic nerves in vivo, but not the exocytosis of adrenaline from the adrenal medulla. Therefore the question arose whether the functions of receptors are dependent on cell morphology, the status of differentiation of cells or the subcellular localization of receptors. To address this question, alpha2A-receptors were tagged with variants of the green fluorescent protein and investigated by means of FRET fluorescence microscopy. In PC12 rat pheochromocytoma cells which were stimulated by nerve growth factor to develop neurites, the conformational changes of alpha2A-adrenergic receptors upon agonist activation, however, did not dependent on the status of cellular differentiation or on the subcellular localization of receptors. Only in transiently transfected cells, higher agonist concentrations were necessary for the activation of receptors as determined by FRET microscopy. These findings demonstrate that the cellular context in which receptor subtypes are expressed play an essential role for their function.
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Adrenergisches System
KW  - Alpha-2-Rezeptor
KW  - Transgene Tiere
KW  - Grün fluoreszierendes Protein
KW  - Sympathikus
KW  - Noradrenalin
KW  - Adrenalin
KW  - G-Protein-gekoppelter-Rezeptor
KW  - Dopamin-beta-Hydroxylase Promotor
KW  - Phäochromozytomzellen
KW  - G-protein coupled receptor
KW  - dopamine-beta-hydroxylase-promotor
KW  - pheochromocytoma cells
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31667
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fink, Kristin
T1  - Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms
T1  - Toxine in Nierenerkrankung und Dialyse Therapie : Genotoxisches Potential und Mechanismus
N2  - In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes.
N2  - Patienten, die an terminaler Niereninsuffizienz leiden und mittels Hämodialyse behandelt werden, weisen einen erhöhten Genomschaden auf. Dieser könnte ursächlich für die erhöhte Krebsinzidenz dieser Patientengruppe sein. Eine der möglichen Ursachen für den erhöhten Genomschaden stellt die Akkumulation genotoxischer Substanzen im Blut der Patienten dar. Diese Substanzen können prinzipiell aus zwei unterschiedlichen Quellen stammen. Erstens besteht die Möglichkeit, dass während der Dialyse Substanzen aus den Dialysatoren, dem Blutschlauchsystem oder gar aus verunreinigtem Dialysat in das Blut der Patienten übertreten. Zweitens führt der Verlust der Nierenfunktion zu einer stark verminderten Exkretion harnpflichtiger Substanzen. Diese Substanzen akkumulieren im Blut und bilden, sofern sie ein toxisches Potential besitzen, die Gruppe der so genannten urämischen Toxine. Einige dieser urämischen Toxine sind potentiell auch genotoxisch. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden exemplarische Vertreter der urämischen Toxine auf ihre genotoxische Wirkung hin untersucht (Homocstein, Homocystein-Thiolacton, Leptin, Advanced Glycation End-Products). Außerdem wurde analysiert, ob Substanzen aus Dialysatormembranen oder dem Blutschlauchsystem austreten und in in vitro-Toxizitätstests Effekte zeigen. Der Fokus der Analytik lag hierbei auf dem Nachweis von Bisphenol A, dem Hauptbestandteil verschiedener Kunststoffe die für Dialysatoren und Dialysatormembranen verwendet werden.
KW  - Bisphenol A
KW  - Homocystein
KW  - Extrakorporale Dialyse
KW  - Genomschaden
KW  - Urämische Toxine
KW  - bisphenol a
KW  - homocysteine
KW  - dialysis
KW  - genomic damage
KW  - uremic toxins
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lutz, Werner K.
A1  - Schlatter, C.
T1  - A closed inhalation system for pharmacokinetic and metabolism studies of volatile compounds with small laboratory animals
N2  - In the inhalation system described an animal can be kept in the same atmosphere of a 2-liter desiccator for up to 24 h. The expired carbon dioxide is adsorbed with soda lime and the resulting reduced pressure is balanced by a supply of oxygen also used for the inflow of the chemical to be investigated. Urine and faeces can be collected ~eparately and the system allows a periodical control of the concentration of the chemical by sampling the air with needle and syringe.
KW  - Toxikologie
Y1  - 1978
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80145
ER  - 
TY  - THES
A1  - Baumann, Klaus
T1  - Modulierende Effekte von Kaffee auf die Induktion von Mikrokernen durch mutagene Substanzen in Mauslymphomzellen L5178Y
T1  - Coffee as an effect modifier of mutagenicity in L5178Y mouse lymphoma cells treated with mutages
N2  - Kaffee, die in der westlichen Welt am häufigsten verwendete psychoaktive Substanz, erwies sich im Mikrokern-Testes an Maus-Lymphomzellen L 5178Y als modulierend auf bekannte mutagene Agentien. In dieser Arbeit wurde meist Instantkaffee verwendet, der gegen N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Mitomycin C (MMC), Genistein, und Methylmethansulfonat getestet wurde. Bei MMC und Genistein erwies sich Kaffee als antimutagen. Bei MNNG hatte Kaffee keinen klaren Einfluss auf die Gentoxizität, ebenso blieb die Kaffee-Wirkung bezüglich MMS unklar. Kaffee minderte dosisabhängig das Wachstum und die Überlebensrate von L 5178Y - Zellen. Es wurde die Frage nach den Ursachen der modulierenden Effekte diskutiert. Insbesondere wurde die Hypothese erörtert, dass für die Richtung der Modulation nicht so sehr die Konzentration des Kaffees, sondern die mutagene Potenz der koinkubierten Substanz eine entscheidende Rolle spielen könnte. Ggf. wirkt Kaffee - im Sinne eines "abhärtenden" Effektes - bei schwach mutagenen Substanzen anitmutagen, bei stark mutagenen Substanzen hingegen synergistisch mutagen.
N2  - Coffee, the most commonly used psychoactive substance in the western hemisphere, was regarded as an effect modifier of mutagenicity in L5178Y mouse lymphoma cells treated with mutages. Mainly instant-coffee was tested against N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), mitomycin C (MMC), genistein, und methylmethanesulfonate (MMS). Coffee was antimutagen against mitomycin C (MMC) and genistein. No clearly influence was seen against MNNG or MMS. Dose-dependent Coffee reduces the growing and survival rate of L5178Y mouse lymphoma cells. The reasons for the modifying-effects of coffee were discussed. The hypothesis was found, that the concentration of the coffee ist not so influential in making antimutagene or mutagene effects, rather the mutagen power-factor of the coincubating substances. Coffee could be an “indurating” parameter: Causing antimutage effects in the presence of “gentle” mutagens, causing synergistic mutagen or zytotoxic effects in the presence of “strong” mutagens.
KW  - Kaffee
KW  - induzierte Mutation
KW  - Coffein
KW  - Antimutagen
KW  - Mutagen
KW  - Mauslymphomtest
KW  - Mauslymphomzellen L5178Y
KW  - Mikrokerne
KW  - Effekt-Modifizierung
KW  - Janus-Aktivität
KW  - coffee
KW  - caffeine
KW  - micronuclei
KW  - mouse lymphoma cells
KW  - mutagenicity
KW  - antimutagenicity
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36996
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Bünemann, Moritz
A1  - Pott, Lutz
T1  - Membrane-delimited activation of muscarinic K current by an albumin-associated factor in guinea-pig atrial myocytes
N2  - No abstract available
KW  - cardiac myocyte ; muscarinic K current ; G-protein ; Albumin ; serum
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31300
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rübeling, Karsten
T1  - Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung von Adenosinrezeptoren in humanen Melanomzelllinien
T1  - Identification and pharmacological characterization of adenosine receptors in human melanoma cell lines
N2  - Adenosin steuert seine physiologische Funktionen über die vier G-Protein gekoppelten Adenosinrezeptoren A1, A2A, A2B und A3 und kann enormen Einfluss auf die Zellphysiologie und das Immunsystem haben. Hohe Adenosinkonzentrationen in Tumorgeweben haben das Interesse vieler Forschungsgruppen geweckt und den Nachweis von AR und dessen tumorfördernde sowie -hemmende Wirkung auf diverse Krebszellen nach sich gezogen. Melanome sind für 90% der letal ausgehenden Hautkrebsformen verantwortlich, da bereits kleinste Formen metastasieren können und vielmals eine rein chirurgische Therapie keine Heilung verspricht. Bei ungünstiger Prognose schränken adjuvante und systemische Therapieergänzungen die Lebensqualität erheblich ein. Auf der Suche nach gezielteren und schonenderen Therapieansätzen gilt es, die Rolle des Adenosins im Tumorgeschehen weiter aufzuklären, was den Nachweis und die Charakterisierung von AR und deren rezeptorspezifisch-gekoppelte Effekte voraussetzt. Daher sollten in der hier vorliegenden Arbeit die fünf humanen Melanomzelllinien A375, Brown, MV3, SK MEL23 und MEL2A auf die Expression von AR untersucht werden. 
Zu Beginn wurden die Zellen mit Hilfe von Bindungsexperimenten unter Einsatz radioaktiv markierter Liganden ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]ZM 241385) auf das Vorliegen der vier AR-Subtypen untersucht. A1- und A3-AR wurden nach Bindungsstudien mit [3H]CCPA bzw. [3H]HEMADO ausgeschlossen und nicht weiter untersucht. Durch Bindungsstudien mit [3H]ZM 241385 konnten in den Zellen Brown, MV3, SK-MEL23 und MEL2A geringe Mengen von A2B-Rezeptoren detektiert werden. 
Es folgten funktionelle Untersuchungen zur Stimulation der AC mit den Liganden NECA und CGS 21680 unter besonderem Blick auf die Differenzierung zwischen einer A2A- oder A2B vermittelten Stimulation. Ein NECA vermittelter Anstieg des c[32P]AMP im AC-Versuch bestätigte die Anwesenheit von A2B-Rezeptoren in den Zellen A375, Brown, MV3 und SK-MEL23. Durch CGS 21680 kam es hingegen zu keiner AC-Stimulation, was eine A2A-AR-Beteiligung ausschloss. Zur Bestätigung einer A2B gekoppelten AC-Aktivität wurde zum Abschluss der Versuche die Wirkung von drei selektiven Antagonisten (DPCPX, SCH 58261 und MRE 3008 F20) auf ein NECA induziertes cAMP-Signal überprüft. Mit den drei Antagonisten konnte an den Zelllinien A375, Brown und MV3 die für A2B-AR zu erwartende Wirkung nachgewiesen und damit die Expression von A2B-AR in diesen Zellen bestätigt werden. 
Die gewonnenen Daten können als Ausgangspunkt weiterführender Untersuchungen genutzt werden, um die Rolle von AR in Krebszellen besser zu verstehen. Sie könnten als Grundlage für die Suche nach potenziellen Angriffspunkten für neue Therapieansätze dienen und so einen Beitrag für Fortschritte in der Behandlung von Tumoren leisten.
N2  - Adenosine regulates its physiological function through four G protein-coupled adenosine receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine can have a tremendous impact on cell physiology and the immune system. A high concentration of adenosine in tumour tissue has drawn the interest of many research groups which then led to the detection of AR and its tumour-promoting and tumour-inhibiting effect on various cancer cells. Melanomas are responsible for 90% of all fatal skin cancers since already the smallest types can metastasise and, in many cases, surgical treatment alone will prove insufficient. In case of an unfavourable prognosis, adjuvant and systemic additional therapeutic measures will considerably impair the patient’s quality of life.
In the search for more targeted and gentle therapeutic approaches it is crucial to further investigate the role of adenosine in tumour development which implies the detection and characterisation of AR and their receptor-specific coupled effects. Hence, in this thesis, the five human melanoma cell lines A375, Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A will be tested for the expression of AR.
In the beginning, the cells were tested for the presence of four AR-subtypes with the help of binding experiments employing radioactively marked ligands ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA and
[3H]ZM 241385). A1- and A3-AR were excluded after binding studies with [3H]CCPA and [3H]HEMADO and were not further investigated. Binding studies with [3H]ZM 241385 showed that small amounts of A2B-receptors were detectable in the cell lines Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A.
This was followed by functional analyses regarding the stimulation of the AC with the ligands NECA and CGS 21680. Particular attention was paid to a differentiation between an A2A- or A2B-induced stimulation. A NECA-induced increase of the c[32P]AMP in the AC-test confirmed the presence of A2B-receptors in the cell lines A375, Brown, MV3 and SK-MEL23. CGS 21680, however, did not cause an AC-stimulation, which excluded an A2A-AR-involvement. In order to confirm an A2B-coupled AC-activity, the impact of three selective antagonists (DPCPX, SCH 58261 and MRE 3008-F20) on a NECA-induced cAMP-signal was tested to complete testing. The expected impact for A2B-AR could be proven on the cell lines A375, Brown and MV3 with the three antagonists and thus confirming the expression of A2B-AR in these cells.
The data obtained can be used as a basis for further investigating the role of AR in cancer cells. They could be used in the search forpotential points of application for new therapeutic approaches and thus contribute to making progress in the treatment of tumours.
KW  - Adenosin
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - Adenosine
KW  - Adenosine receptor
KW  - Melanoma
KW  - Melanomzelllinien
KW  - Functional analyses
KW  - Human
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115137
ER  - 
TY  - THES
A1  - Riese, Thorsten
T1  - Analysen zur potentiellen Gentoxizität von Terahertzstrahlung in vitro
T1  - Analyses concerning potential genotoxicity of terahertz radiation in vitro
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurden immortalisierte humane Keratinozyten (HaCaT-Zelllinie) über eine Dauer von 24 Stunden mit Terahertzstrahlung der Frequenz 0,106 THz und einer Leistungsflussdichte von 2 mW/cm² behandelt und anschließend mittels „cytokinesis-block micronucleus cytome assay“ ausgewertet. Ferner wurden Proben der gleichen Zelllinie über einen Zeitraum von 24 Stunden Temperaturen zwischen 37 °C und 42 °C ausgesetzt und zum einen auf Hinweise für Gentoxizität mit Hilfe des Mikrokerntests untersucht und zum anderen mittels Western Blot die Expressionsrate von Hitzeschockproteinen der 70 kDa Familie bestimmt.

Die der Terahertzstrahlung ausgesetzten Zellen zeigten gegenüber den Kontrollen keine signifikanten Veränderungen der Marker für chromosomale Aberrationen oder der Zellteilung. Die der erhöhten Temperatur ausgesetzten Zellen zeigten einen signifikanten Anstieg der Mikrokernraten und weiterer Marker für Gentoxizität sowie eine damit korrelierende Zunahme der synthetisierten Proteinmenge der Hsp70 Proteine im Rahmen der Hitzeschockreaktion.
N2  - In this dissertation HaCaT human keratinocytes were exposed to terahertz radiation (0.106 THz) and to different temperatures from 37 °C to 42 °C for 24 hours. Using the “cytokinesis-block micronucleus cytome assay” the appearance of different markers of genomic damage was analysed and compared to negative controls. Furthermore the heat-induced expression rate of the heat shock protein 70 was determined between 37 °C and 42 °C.

The cells exposed to terahertz radiation showed no statistically significant elevation of genomic damage markers or change of proliferation compared to the controls. The hyperthermia-treated cells showed significantly increased micronucleus frequencies and an elevated heat-shock protein expression for temperatures above 37 °C.
KW  - Terahertzbereich
KW  - Gentoxizität
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - Terahertzstrahlung
KW  - Gentoxizität
KW  - Nichtionisierende Strahlung
KW  - terahertz radiation
KW  - genotoxicity
KW  - non-ionizing radiation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116469
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Agarwal, Shailesh R.
A1  - Yang, Pei-Chi
A1  - Rice, Monica
A1  - Singer, Cherie A.
A1  - Nikolaev, Viacheslav O.
A1  - Lohse, Martin J.
A1  - Clancy, Colleen E.
A1  - Harvey, Robert D.
T1  - Role of Membrane Microdomains in Compartmentation of cAMP Signaling
JF  - PLOS ONE
N2  - Spatially restricting cAMP production to discrete subcellular locations permits selective regulation of specific functional responses. But exactly where and how cAMP signaling is confined is not fully understood. Different receptors and adenylyl cyclase isoforms responsible for cAMP production are not uniformly distributed between lipid raft and non-lipid raft domains of the plasma membrane. We sought to determine the role that these membrane domains play in organizing cAMP responses in HEK293 cells. The freely diffusible FRET-based biosensor Epac2-camps was used to measure global cAMP responses, while versions of the probe targeted to lipid raft (Epac2-MyrPalm) and non-raft (Epac2-CAAX) domains were used to monitor local cAMP production near the plasma membrane. Disruption of lipid rafts by cholesterol depletion selectively altered cAMP responses produced by raft-associated receptors. The results indicate that receptors associated with lipid raft as well as non-lipid raft domains can contribute to global cAMP responses. In addition, basal cAMP activity was found to be significantly higher in non-raft domains. This was supported by the fact that pharmacologic inhibition of adenylyl cyclase activity reduced basal cAMP activity detected by Epac2-CAAX but not Epac2-MyrPalm or Epac2-camps. Responses detected by Epac2-CAAX were also more sensitive to direct stimulation of adenylyl cyclase activity, but less sensitive to inhibition of phosphodiesterase activity. Quantitative modeling was used to demonstrate that differences in adenylyl cyclase and phosphodiesterase activities are necessary but not sufficient to explain compartmentation of cAMP associated with different microdomains of the plasma membrane.
KW  - protein-coupled-receptors
KW  - adenylyl-cyclase isoforms
KW  - adult cardiac myocytes
KW  - plasma membrane
KW  - lipid rafts
KW  - cholesterol depletion
KW  - BETA(2)-adrenergic receptor
KW  - living vells
KW  - cyclic-AMP
KW  - domains
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116673
SN  - 1932-6203
VL  - 9
IS  - 4
ER  -