TY - THES A1 - Kellert, Marco T1 - Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivität und Gentoxizität von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur T1 - Metabolism of furan in rats and mice and tests for the reactivity and genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial in vitro and in cell culture. N2 - Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss. N2 - Furan has been found in a number of heated food items and is carcinogenic in the liver of rats and mice. Estimates of human exposure on the basis of concentrations measured in food are not reliable because of the volatility of furan. A biomarker approach was therefore indicated. Metabolism of furan includes the formation of an unsaturated dialdehyde, cis-2-butene-1,4-dial. In view of the multifunctional electrophilic reactivity of cis-2-butene-1,4-dial, adduct formation with protein and DNA may explain some of the toxic effects. DNA-adduction is a direct genotoxic effect. The major question was weather a direct genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial could be prevented by the reaction with protein structures. If so, the genotoxic and mutagenic effects are likely to show a threshold dose, reducing the cancer risk for low exposure levels. We searched for metabolites excreted in the urine of male Fischer 344 rats treated by oral gavage with 40 mg furan per kg body weight. A control group received the vehicle oil only. Urine collected over two 24-hour periods both before and after treatment was analyzed by a column-switching LC-MS/MS method. Data were acquired by a full scan survey scan in combination with information dependent acquisition of fragmentation spectra by the use of a linear ion trap. The full scan data was analyzed by principal component analysis (PCA). The first principal component fully separated the samples of treated rats from the controls in the first post-treatment sampling period. Five of the compounds that are responsible for the separation could be identified as the reaction product of cis-2-butene-1,4-dial with either glutathion or lysine (protein). In a second animal study rats and mice were treated with seven different doses of furan in the range from 125 µg to 8 mg per kg body weight. Dose-response and kinetic over 72 h of the seven identified biomarkers was examined by LC-MS/MS in the urine. In the rats all biomarkers showed a dose-dependent increase. In the mice one biomarker lacked of dose dependency. Different excretion profiles were attributed to the formation of either protein adducts or glutathione conjugates. Whereas the protein-derived biomarkers with a lysin moiety showed a slow excretion over more than 72 h, the glutathion-dervived biomarkers were only excreted within the first 24 h. Short-term tests for genotoxicity of furan in mammalian cells are inconclusive, little is known for cis-2-butene-1,4-dial. We investigated cis-2-butene-1,4-dial generated by hydrolysis of 2,5-diacetoxy-2,5-dihydrofuran for genotoxicity and mutagenicity in Salmonella typhimurium (Strain TA104) and in L5178Y mouse lymphoma cells. The Ames Test was negative in the preincubation assay with and without reduction of cytotoxicity by addition of glutathione after preincubation phase. Remarkable cytotoxicity limited the analysis range up to 4.5 µmol/plate. Mutagenicity and genotoxicicty in L5178Y mouse lymphoma cells was evaluated using standard procedures for the comet assay, the micronucleus test, and the mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay. cis-2-butene-1,4-dial was tested at 0, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM. Cytotoxicity was remarkable; cell viability at 50 µM was reduced to <50%. Up to 25 µM, cell viability was >90%, and measures of comet assay and thymidine kinase mutations were increased over control about 1.7 an 2.2-fold, respectively. Compared to methyl methanesulfonate used as positive control, cis-2-butene-1,4-dial was of similar potency for genotoxicity but much more cytotoxic. A potential cross-linking activity of cis-2-butene-1,4-dial was investigated by checking whether gamma radiation-induced DNA migration in the comet assay could be reduced by pretreatment with cis-2-butene-1,4-dial. As opposed to the effect of the positive control glutaraldehyde, cis-2-butene-1,4-dial treatment did not reduce the comets. On the contrary, an increase was observed at ≥100 µM cis-2-butene-1,4-dial, which was attributable to early apoptotic cells. Although cis-2-butene-1,4-dial was found to be a relatively potent genotoxic agent in terms of the concentration necessary to double the background measures, cytotoxicity strongly limited the concentration range that produced interpretable results. This may explain some of the inconclusive results and indicates that nongenotoxic effects must be taken into account in the discussion of modes of toxic and carcinogenic action of furan. KW - Metabolismus KW - Mutagenität KW - Biomarker KW - Furan KW - LC-MS KW - Harn KW - cis-2-Buten-1 KW - 4-dial KW - Gentoxizität KW - furan KW - metabolism KW - biomarker KW - mutagenicity KW - genotoxicity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716 ER - TY - THES A1 - Triebel, Sven T1 - Induktion einer dilatativen Kardiomyopathie am Modell der Lewis-Ratte durch Antikörper gegen die zweite extrazelluläre Domäne des humanen Beta1-adrenergen Rezeptors T1 - Induced antibodies in the Lewis-Rat against the second extracellular loop of the beta1-adrenergic receptor as a cause of dilateted cardiomyopathy N2 - Vor etwas mehr als 20 Jahren wurden erstmals an das Myokard bindende beta1-Rezeptorantikörper im Zusammenhang mit der Chagas-Krankheit beschrieben. Die Arbeiten der beiden folgenden Jahrzehnte konnten zeigen, dass solche beta1-Rezeptorantikörper mit einer Prävalenz von ca. 30 bis 95% (in Abhängigkeit vom verwendeten Nachweisverfahren) v.a. auch bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) nachgewiesen werden können. Insbesondere Antikörper gegen die zweite extrazelluläre Domäne des beta1-adrenergen Rezeptors (beta1-ECII) scheinen dabei in der Lage zu sein, den Rezeptor funktionell zu beeinflussen und zu aktivieren. Beta1-ECII wurde in der Folge als potentes Autoantigen mit T- und B-Zell-Epitopen identifiziert. Erste klinische Untersuchungen an Patienten mit DCM haben gezeigt, dass das Vorhandensein zirkulierender b1-ECII-Antikörper mit einer schlechteren linksventrikulären Funktion, dem Auftreten ventrikulärer Arrhythmien sowie mit einer erhöhten kardiovaskulären Mortalität verbunden ist. Der Verdacht, dass beta1-Antikörper bei der DCM nicht nur ein Epiphänomen, sondern bei einem Teil der betroffenen Patienten auch mögliche Krankheitsursache darstellen könnten, verstärkten dann in jüngster Zeit die Bestrebungen, ein Tiermodell für die Antikörper-induzierte Genese einer Kardio-myopathie zu generieren. So fanden 1997 Matsui et al. im Kaninchenmodell nach Immunisierung mit einem beta1-ECII-homologen Peptid über 12 Monate eine biventrikuläre Dilatation und kompensatorische Hochregulation der beta-Adrenozeptoren im Myokard. Im Gegensatz dazu fanden Iwata et al. wenige Jahre später im gleichen Tiermodell nach 6-monatiger Immunisierung eine linksventrikuläre Hypertrophie bei beta1-ECII-Antikörper-positiven Tieren und eine Downregulation der beta-Rezeptoren. Diese Diskrepanzen ließen das Kaninchenmodell daher als fraglich geeignet erscheinen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurde die Lewis-Ratte zur Generierung eines Kardiomyopathiemodells gewählt, da die beta1-ECII-Sequenz bei Ratte und Mensch 100% homolog ist. Zur Immunisierung verwendeten wir ein Fusionsprotein aus GST und der humanen beta1-ECII-Sequenz. Der Schwerpunkt des Vorhabens lag auf der Charakterisierung der durch die Immunisierung induzierten morphologischen und funktionellen Veränderungen am Herzen der Versuchstiere. Echokardiographisch konnte bei immunisierten Tieren bereits nach 9 Monaten eine linksventrikuläre Erweiterung nachgewiesen werden, die sich nach 12 bzw. 15 Immunisierungsmonaten durch das Auftreten einer progredienten linksventrikulären Dysfunktion (Echokardiographie/Herzkatheteruntersuchung) auch funktionell manifestierte. Makroskopisch-morphometrisch ließ sich an Paraffinschnitten eine Erweiterung des linken Ventrikels bei relativer Abnahme der Wanddicke nachweisen und bestätigte somit histologisch die echokardiographischen Messungen. Die mikroskopische Analyse zeigte eine relative Vergrößerung der Kardiomyozytenkerne ohne signifikante Zellhypertrophie. Durch Radioligandenbindungsversuche konnte zudem in beta1-ECII-immunisierten Tieren eine Downregulation der kardialen beta1-Rezeptoren nachgewiesen werden. Durch die Immunisierung mit beta1-ECII-Antigen konnte der Phänotyp einer DCM somit erstmals in der Ratte induziert werden. Dieser Phänotyp ist vermutlich überwiegend auf die agonist-ähnliche funktionelle Aktivität der durch spezifische Immunisierung induzierten beta1-Rezeptorantikörper zurückzuführen. Das vorgestellte Tiermodell erfüllt dabei einerseits die immunologischen Kriterien des 1. Koch’schen Postulats für den „indirekten“ Nachweis einer Kardiomyopathieinduktion durch Antikörper, die gegen die zweite extrazelluläre Domäne des b1-adrenergen Rezeptors gerichtet sind. Andererseits lieferte es im Anschluss auch die direkte Evidenz für eine kausale Rolle solcher Antikörper bei der Induktion einer Autoimmunkardiomyopathie durch den Transfer induzierter Antikörper auf genetisch identische, herzgesunde Ratten (Nachahmen von Rezeptor-Autoantikörpern). Zukünftig könnte dieses Tiermodell auch dazu dienen, weitere immunologische Faktoren, die an der Entwicklung einer Autoimmunkardiomyopathie durch beta1-Rezeptor-antikörper beteiligt sind, zu untersuchen. Ferner können mit diesem Modell neue therapeutische Ansätze für die Behandlung der Rezeptorantikörper-positiven Kardiomyopathie entwickelt werden, mit dem Ziel einer späteren Anwendung im Tiermodell erprobter Strategien auch bei Antikörper-positiven Patienten. N2 - About 20 years ago antibodies binding to the beta1-adrenergic receptor have been described in Chagas disease. In following decades different authors were able to prove, that these beta-1-adrenergic receptor antibodies are prevalent especially in patients with dilated cardiomyopathy (DCM) in 30 to 95%, depending on the proving method. Especially antibodies directed against the second extracellular loop of the beta-1-receptor (beta1-ECII) seemed to be able to modulate and to activate the receptor. In the past years the second extracellular loop could be identified as a potent (auto-)antigen containing T- and B-cell epitopes. Clinical studies in DCM-patients associated a significant poorer left ventricular function, a higher prevalence of serious ventricular arrhythmias and a higher cardiovascular mortality with the presence of anti-beta1-ECII-antibodies. In the following it was necessary to develop sufficient animal model proving that the presence of these antibodies might not be a side effect and furthermore to prove that these antibodies might causal in developing a DCM. In 1997 Matsui et al. could show a biventricular dilatation and a up-regulation of beta1-receptors in the myocard using rabbits immunised over 12 months with a synthetic peptides corresponding to beta1-ECII. Using the same animal model few years later Iwata et al. recognized a left-ventricular hypertrophy after 6 months of immunisation and a downregulation of beta-receptors. Actually it is not sure, if this animal model might be sufficient to answer question for the causal role of beta1-receptor-antibodies. Therefore, in the present sudy we attempted to create experimental immune-cardiomyopathy in the rat using human beta1-ECII (100% sequence identity human/rat) fused to bacterial GST as an antigen. The main aspect in our study was to characterize the different morphological und functional findings in the rat heart. Compared with the control animals, echocardiographic follow-up revealed significant left ventricular dilatation from the ninth study-month on, which slowly and steadily progressed in the course of the study. The final echocardiographic findings were furthermore supported by left ventricular pressure curves obtained in the left heart catheterization at study end (fifteenth month). The anatomic measurements, performed in hematoxylin an eosin-stained paraffin sections, showed a left ventricular dilatation and a relative increase in left ventricular wall-thickness which furthermore emphasized the echocardiographic results. Histomorphological analysis revealed significantly enlarged polymorphous nuclei, but not a cardiomyocyte-hypertrophy. The radioligand-binding studies showed a down-regulation of the beta1-adrenergic receptor in the cardiomyocyte membrane. We were able to show the first time the phenotype of DCM in the rat by immunization against the second extracellular loop of the beta1-adrenoceptor. It seems conceivable that the generated cardiomyopathic phenotype has to be attributed mainly to the sustained sympathomimetic activity of the produced activating anti-beta1-ECII-antibodies. Our animal model fulfills the first Witebsky postulate for autoimmune disease (indirect evidence) including antibodies against an identified corresponding (auto-)antigen. Furthermore it is the basis for the direct evidence proving a causal role of these beta1-ECII-antibodies in developing a autoimmune cardiomyopathy by transferring induced antibodies on healthy animals of the same strain. In the future this animal model might be used to detect further immunological elements that might be causal to develop a autoimmune cardiomyopathy associated with the evidence of beta1-adrenoceptor-antibodies. Furthermore this animal model might be useful to develop new strategies in the treatment of the beta1-adrenoceptor-positive DCM. KW - Beta-1-Rezeptor KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - zweite extrazelluläre Domäne KW - second extracellular loop Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29580 ER - TY - THES A1 - Schmid, Ursula T1 - Protection against oxidative DNA damage by antioxidants, hormone-receptor blockers and HMG-CoA-reductase inhibitors T1 - Schutz vor oxidativen DNA-Schäden durch Antioxidantien, Hormonrezeptorantagonisten und HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren N2 - In the course of this study, several endogenous compounds and model substances were used to mimic the conditions in patients suffering from hypertension. As endogenous compounds, angiotensin II and aldosterone were chosen. As model substances, 4-nitroquinoline-1-oxide (NQO), hydrogen peroxide and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were selected. Benfotiamine as well as α-tocopherol proved in the course of the experiments to be able to prevent angiotensin II-induced formation of oxidative DNA strand breaks and micronuclei. This could be due to a prior inhibition of the release of reactive oxygen species and is in contrast to results which were achieved using thiamine. Furthermore, experiments in which cells were pre-incubated with benfotiamine followed by incubation with NQO showed that benfotiamine was not able to prevent the induction of oxidative stress. The hypothesis that benfotiamine has, like α-tocopherol, direct antioxidative capacity was fortified by measurements in cell free systems. In brief, a new working mechanism for benfotiamine in addition to the ones already known could be provided. In the second part of the study, angiotensin II was shown to be dose-dependently genotoxic. This effect is mediated via the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) which. Further experiments were extended from in vitro settings to the isolated perfused kidney. Here it could be shown that angiotensin II caused vasoconstriction and DNA strand breaks. Co-perfusion of kidneys with angiotensin II and candesartan prevented vasoconstriction and formation of strand breaks. DNA strand break formation due to mechanical stress or hypoxia could be ruled out after additional experiments with the thromboxane mimetic U 46619. Detailed investigation of the DNA damage in vitro revealed that angiotensin II induces single strand breaks, double strand breaks and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG)-adducts as well as abasic sites. Investigations of the effects of aldosterone-treatment in kidney cells showed an increase of oxidative stress, DNA strand breaks and micronuclei which could be prevented by the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Additional experiments with the non-steroidal mineralocorticoid receptor antagonist (S)-BR-4628 revealed that this substance was also able to prevent oxidative stress and genomic damage and proved to be more potent than eplerenone. In vivo, hyperaldosteronism was imitated in rats by aid of the deoxycorticosteroneacetate (DOCA) salt model. After this treatment, levels of DNA strand breaks and chromosomal aberrations in the kidney could be observed. Furthermore, an increase in the release of ROS could be measured. Treatment of these animals with spironolactone , BR-4628 and enalaprile revealed that all antagonists were effective BR-4628 was the most potent drug. Finally, rosuvastatin was investigated. In HL-60 cells phorbol 12-myristate 13-acetate caused oxidative stress. Rosuvastatin was able to prevent the release of ROS and subsequent oxidative DNA damage when co-incubated with PMA. Furthermore, not only an inhibition of PMA-induced oxidative stress but also inhibition of the unspecific release of ROS induced by hydrogen peroxide was observable. Addition of farnesyl pyrophosphate (FPP), geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), and mevalonate, intermediates of the cholesterol pathway, caused only a marginal increase of oxidative stress in cells treated simultaneously with PMA and rosuvastatin, thus indicating the effect of rosuvastatin to be HMG-CoA-reductase-independent. Investigation of the gene expression of subunits of NAD(P)H oxidase revealed a down-regulation of p67phox following rosuvastatin-treatment. Furthermore, it could be shown that rosuvastatin treatment alone or in combination with PMA increased total glutathione levels probably due to an induction of the gene expression and enzyme activity of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS). N2 - Im Zuge dieser Studie wurden sowohl endogene Substanzen als auch Modellsubstanzen eingesetzt, um die pathologischen Verhältnisse in Patienten, die an Bluthochdruck leiden, zu imitieren. Als endogene Substanzen wurden Angiotensin II und Aldosteron ausgewählt. Als Modellsubstanzen wurden 4-Nitrochinolin-1-oxid (NQO), Wasserstoffperoxid und Phorbol-12-myristat-13-gewählt. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit zwei Vitaminen, nämlich Benfotiamin und α-Tocopherol. Sowohl Benfotiamin als auch α-Tocopherol zeigten im Laufe der Experimente, dass sie in der Lage sind, durch Angiotensin II verursachte DNA-Strangbrüche und chromosomale Aberrationen zu verhindern. Dies ist möglicherweise auf eine ebenfalls beobachtbare vorausgegangene Inhibition der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies zurückzuführen. Zusammenfassend konnte ein neuer Wirkmechanismus für Benfotiamin vorgestellt werden. Im zweiten Teil dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass Angiotensin II eine dosisabhängige Gentoxizität verursacht. Dieser Effekt wird durch den Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 vermittelt. Im weiteren Verlauf der Studie wurden die in vitro Experimente auf das Modell der isolierten perfundierten Mäuseniere ausgeweitet. Hier konnte gezeigt werden, dass Angiotensin II Vasokonstriktion und DNA-Strangbrüche verursacht. Co-Perfusion der Nieren mit Angiotensin II und Candesartan verhinderte hingegen die Vasokonstriktion und die Bildung von DNA-Strangbrüchen. Die Verursachung von Strangbrüchen durch mechanischen Stress oder Hypoxie konnte ausgeschlossen werden. Die Untersuchung der ex vivo beobachteten DNA-Schäden in vitro ließ erkennen, dass Angiotensin II Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche, die Bildung des DNA-Addukts 8-OxodG und abasische Stellen induziert. Ein Reparatur-Comet Assay, parallel durchgeführt mit der Messung des phosphorylierten Histons 2AX (γ-H2AX) über 24 h, zeigte eine vollständige Reparatur der Einzelstrangbrüche, wohingegen die Zahl der Doppelstrangbrüche in diesem Zeitraum sogar zunahm. Untersuchungen der Effekte, die eine Aldosteron-Behandlung auf Nierenzellen hat, zeigten einen Anstieg des oxidativen Stress, der DNA Strangbrüche und der Mikrokerne. Diese Effekte konnten durch Eplerenon verhindert werden. Weitere Experimente mit dem nicht-steroidalen Mineralocorticoid Rezeptor-Antagonisten (S)-BR-4628 zeigten, dass auch diese Substanz oxidativen Stress und DNA Schäden verhindern konnte, im Gegensatz hierzu hatte das (R)-Isomer, das keine Aktivität am Mineralocorticoid Rezeptor zeigt, keine präventiven Effekte. In vivo wurde der Hyperaldosteronismus mit Hilfe des Deoxycorticosteronacetat- (DOCA) Salzmodells nachgeahmt. Unter dieser Behandlung konnten Level an DNA-Strangbrüchen und chromosomalen Aberrationen beobachtet werden. Des Weiteren konnten in den DOCA-Tieren erhöhte Level an oxidativem Stress gemessen werden. Wurden die Versuchstiere zusätzlich zur DOCA-Behandlung mit Spironolacton, BR-4628 und dem Enalapril behandelt, konnte gezeigt werden, dass BR-4628 potenter war als Spironolacton Enalapril. Zuletzt wurde mit Rosuvastatin eine Substanz untersucht, die die antioxidative Abwehr der Zellen aktivieren kann. In der humanen Leukämie-Zelllinie HL-60 verursachte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) oxidativen Stress. Rosuvastatin war in der Lage, die Freisetzung von ROS und daraus resultierende DNA-Strangbrüche bei Co-Inkubation mit PMA zu verhindern. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Rosuvastatin nicht nur PMA-induzierten oxidativen Stress, sondern auch die unspezifische Wasserstoffperoxid-induzierte Freisetzung von ROS verhinderte. Die Untersuchung der Genexpression von Untereinheiten der NAD(P)H Oxidase ergab, dass p67phox nach Rosuvastatin-Behandlung herabreguliert wurde. Behandlung mit Rosuvastatin allein oder zusammen mit PMA konnte außerdem die Glutathion-Spiegel erhöhen. Dies ist vermutlich auf die Induktion der Genexpression und der Enzymaktivität der γ-Glutamylcystein-Synthetase (γ-GCS), des Schrittmacherenzyms des Glutathionsystems, zurückzuführen. KW - Oxidativer Stress KW - Angiotensin II KW - Angiotensin-II-Blocker KW - Aldosteron KW - Aldosteronantagonist KW - Renin-Angiotensin-System KW - Benfotiamin KW - Statin KW - Di KW - DNA-Schaden KW - Mikrokerne KW - Comet Assay KW - DNA damage KW - Micronuclei KW - Comet Assay Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28379 ER - TY - THES A1 - Tiedge, Oliver T1 - Kombinationswirkungen nicht linearer Dosis-Wirkungsbeziehungen T1 - Mixture analysis with nonlinear dose response N2 - Um realistische Risikoabschätzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu können, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung loslöst. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizität einer Kombination in ihrer Stärke vom erwarteten Effekt der normalen Additivität abweicht, wenn die Kurven der Dosis – Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verläufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander ähnlichen oder unabhängigen Wirkmechanismus verfolgen. Für nicht lineare Dosis – Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverläufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen möglichen Bereich der Additivität zwischen ihnen (auch: „Hülle der Additivität“). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, dürfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese Überlegungen wurden überprüft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus – Lymphom – Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis – Wirkungsbeziehungen. Für die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei binären Mixturen miteinander gemischt. Für MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant höher als der vorkalkulierte Effekt der Netto – Wirkung. Für MMS + GEN lag der gemessene Effekt über der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. Für MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis – Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen wäre ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN fälschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN wäre mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen könnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA – Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearität von Dosis – Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend für die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen über tiefere mechanistische Vorgänge hilfreich für eine Vorhersage von ähnlichen oder unabhängigen Wirkprozessen. N2 - Distinction between dose addition and response addition for the analysis of the toxicity of mixtures may allow differentiation of the components regarding similar versus independent mode of action. For nonlinear dose responses for the components, curves of dose addition and response addition differ and embrace an "envelope of additivity." Synergistic or antagonistic interaction may then be postulated only if the mixture effect is outside this surface. This situation was analyzed for the induction of micronuclei in L5178Y mouse lymphoma cells by the two methylating agents methyl methanesulfonate (MMS) and N-methyl-N-nitrosourea (MNU) and the topoisomerase-II inhibitor genistein (GEN). All three chemicals reproducibly generated sublinear (upward convex) dose-response relationships. For the analysis of mixture effects, these genotoxic agents were investigated in the three binary combinations. Statistical testing for dose addition along parallel exponential dose responses was performed by linear regression with interaction based on the logarithm of the number of cells that contain micronuclei. For MMS+MNU, the mixture effect was compatible with dose addition (i.e., significantly larger than calculated for the addition of net responses). For MMS+GEN, the measured effect was larger than for response addition but smaller than for dose addition. For MNU+GEN, the measured effect was below response addition, indicative of true antagonism. In the absence of knowledge on the sublinear dose-response relationships for the individual components, a synergistic effect of MMS on both MNU and GEN would have been postulated erroneously. The observed difference between MMS and MNU when combined with GEN would not have been predicted on the basis of a simplistic interpretation of DNA methylation as the mode of action and may be due to differences in the profile of DNA methylations and/or epigenetic effects. We conclude that knowledge of nonlinearities of the dose-response curves of individual components of a mixture can be crucial to analyze for synergism or antagonism and that an in-depth mechanistic knowledge is useful for a prediction of similarity or independence of action. KW - Kleinkern KW - Kombination KW - Dosis-Wirkungs-Beziehung KW - Synergie KW - Addition KW - Gegensatz KW - Risikoanalyse KW - Genanalyse KW - Genmutation KW - Carcinogen KW - Mikrokern KW - sublinear KW - Mauslymphomzellen KW - genotoxisch KW - alkylating agents KW - genotoxicity KW - cell culture KW - dose response KW - mixture models Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28522 ER - TY - THES A1 - Jonas, René T1 - Arsen-induzierte Zyto- und Gentoxizität sowie deren Modulation T1 - Arsenite-induced cyto- and genotoxicity and their modulation N2 - Arsen ist dafür bekannt, dass es mutagen und kanzerogen wirkt und ein gentoxisches Potential besitzt. Die Mechanismen, durch die diese Effekte ausgeübt werden, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Parameter, die mit der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxiddismutaseaktivität und Hämoxygenase-Genexpression, und Veränderungen des epigenetischen Musters der DNA, z.B. Depletion von S-Adenosylmethionin, in Zusammenhang stehen, durch Arsen beeinflusst werden. In dieser Studie wurde versucht, das gentoxische Potential von Arsen mit Hilfe des Comet Assay, eines Standard-Gentoxizitätstests, zu charakterisieren sowie zu prüfen, ob dieser Test eine geeignete Messmethode für die gentoxische Wirkung von Arsen darstellt. Dies wurde unter Heranziehung verschiedener additiver Messgrößen wie der Vitalität und der Proliferation sowie der parallelen Quantifizierung der Mitose-, C-Mitose-, Mikrokern- und Apoptosefrequenzen der verwendeten murinen L5178Y-Zellen durchgeführt. Des Weiteren wurde der den Arsen-bedingten DNA-Schäden zugrundeliegende Mechanismus genauer beleuchtet. Unter Zuhilfenahme verschiedener Modulatoren wurden durch Arsen induzierter oxidativer Stress und durch Arsen induzierte Veränderung der epigenetischen DNA-Struktur untersucht. Ferner wurde geprüft, inwieweit die Inhibition von oxidativem Stress und Hypomethylierung der DNA zur Verringerung von potenziellen Folgen wie der Entstehung unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen beitragen können, die wiederum eventuell in der Entstehung von Karzinomen resultieren können. Für die Modulation der Freisetzung von ROS wurden als prooxidative Substanz 4-Nitrochinolin-1-Oxid und als Antioxidantien Benfotiamin (Vitamin-B1-Prodrug), N-Acetylcystein (NAC) und α-Tocopherol (Vitamin E) ausgewählt. Das Methylierungs¬muster der DNA sollte durch das hypomethylierende Agens 5-Azacytidin und durch die potenziell hypermethylierenden Verbindungen S-Adenosylmethionin (SAM) und Folat beeinflusst werden. Die Untersuchungen bezüglich des gentoxischen Potentials von Arsen und die Eignung des Comet Assay für dessen Quantifizierung ergaben, dass unter Miteinbeziehung der erwähnten additiven Parameter und der Quantifizierung nach Behandlung mit unterschiedlichen Arsen-Konzentrationen nach unterschiedlich langen Behandlungszeiten die im Comet Assay erzielten Werte als korrekt und zuverlässig angesehen werden können. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen der Freisetzung von ROS und der Veränderung des DNA-Methylierungsmusters mit Hilfe von Modulatoren, dass beide Mechanismen an den Arsen-induzierten Effekten beteiligt sind. Nicht nur konnte mit Hilfe der Modulatoren jeweils die Inhibition der Freisetzung von ROS und der DNA-Hypomethylierung erreicht werden, es konnte zudem gezeigt werden, dass die Substanzen auch die Reduktion der erhöhten Anzahl unnatürlicher Mitosemorphologien und chromosomaler Aberrationen bewirkten. Dieser Zusammenhang konnte in dieser Studie zum ersten Mal aufgezeigt werden und könnte im Hinblick auf die potenzielle Erniedrigung der Krebsinzidenzen durch Supplementierung der Bevölkerung in Gebieten mit Arsen-belastetem Trinkwasser mit den genannten Modulatoren von Bedeutung sein. N2 - Arsenite is known to be mutagenic as well as carcinogenic and is further known to have a genotoxic potency. However, the mechanisms by which these effects are exerted is not yet fully understood. It could be shown, that parameters which are linked to the release of reactive oxygen species e. g. increase activity of superoxide dismutase or increased expression of heme oxygenase or which are linked to changes in the epigenetic pattern of the DNA, like for example depletion of S-adenosylmethionine, are affected by arsenite. In the course of this study, we attempted to characterize the genotoxic potential of sodium arsenite with the aid of the comet assay, a standard genotoxicity test, and to examine, whether this test is a suitable method for the quantification of arsenite-induced genotoxicity. Additionally, parameters like the frequencies of mitoses, C-mitoses, micronuclei and apoptoses were evaluated in murine L5178Y-cells. Furthermore, the mechanism underlying the arsenite-induced DNA-damage was investigated. With the aid of several modulators, arsenite-induced oxidative stress and arsenite-induced epigenetic modifications were examined. In addition we analyzed, to which extent the inhibition of oxidative stress and DNA-hypomethylation can contribute to a decrease in pathologic mitosis morphologies and chromosomal aberrations, which in turn could possibly result in cancer development. For the modulation of the release of reactive oxygen species, the pro-oxidative substance 4-nitroquinoline-1-oxide and the antioxidative substances benfotiamine, N-acetylcysteine and α-tocopherol were chosen. The epigenetic pattern of the DNA was meant to be affected by the hypomethylating agent 5-azacytidine and the hypermethylating agents S-adenosylmethionine and folic acid. The experiments concerning the genotoxicity of arsenite and the suitability of the comet assay to quantify this genotoxic capacity revealed, that if the parameters mentioned above and different concentrations of arsenite and different incubation times were taken into consideration, the results gained with the aid of the comet assay can be considered as correct and reliable. Furthermore, the investigation of the release of reactive oxygen species and modifications of the DNA methylation patters with the aid of modulators showed, that both mechanisms are involved in the effects induced by sodium arsenite. The modulators were able to inhibit the release of reactive oxygen species and hypomethylation of the DNA respectively. In addition a decrease in the frequencies of pathologic mitosis morphologies and chromosomal aberrations could be shown. This connection could be shown for the first time in the course of this study and could be of relevance with regard to a possible decrease of the incidence of cancer by supplementation of populations with the introduced modulators in areas with drinking water contaminated with arsenite. KW - Oxidativer Stress KW - Methylierung KW - DNS-Reparatur KW - DNS-Schädigung KW - DNS-Strangbruch KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - DNS KW - Arsen KW - oxidative stress KW - methylation KW - dna damage KW - arsenite KW - dna strand break Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28772 ER - TY - THES A1 - Engelhardt, Stefan T1 - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren T1 - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann. KW - Beta-Rezeptor KW - Maus KW - Transgene Tiere KW - Herzinsuffizienz KW - Transgene Mäuse KW - beta-adrenerge Rezeptoren KW - Hypertrophie KW - Fibrose KW - Na/H-Austauscher KW - Herzinsuffizienz KW - transgenic mice KW - cardiac hypertrophy KW - fibrosis KW - Na/H-exchanger KW - heart failure Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950 ER - TY - THES A1 - Brede, Marc T1 - Kardiovaskuläre Phänotypisierung von Angiotensin II AT2-Rezeptor- und adrenergen Rezeptor-"Knockout"-Mäusen T1 - Cardiovascular characterization of Angiotensin II AT2-receptor- and adrenergic receptor-knockout-mice N2 - Die Deletion des AT2-Rezeptors (AT2-KO) führt zu erhöhter Blutdruckempfindlichkeit und vaskulärer Hypertrophie durch Aktivitätszunahhme der P70S6-Kinase. Die Vasodilatation von Blutgefäßen wird maßgeblich durch beta1-adrenerge Rezeptoren vermittelt. Die Deletion von alpha2-adrenergen Rezeptoren (alpha2-KO) führt zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz nach Aortenstenose. Der Mortalitätanstieg ist mit erhöhten Plasmanoradrenalin-Spiegeln (a2A-KO), bzw. Plasmaadrenalin-Spiegeln (a2C-KO) assoziiert. N2 - The deletion of AT2-receptors causes increased blood-pressure sensitivity and vascular hypertrophy by increased P70S6-Kinase activity. Vasodilation is mainly mediated by beta1-adrenoceptors. The deletion of alpha2-adrenoceptors leads to heart failure after aortic banding. The increased mortality is associated with elevated plasma levels of norepinephrine (a2A-KO) or epinephrine (a2C-KO). KW - transgen KW - Maus KW - Angiotensin KW - Rezeptor KW - adrenerg KW - Katecholamine KW - Blutgefäß KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - Nebenniere KW - Angiotensin KW - receptor KW - adrenergic KW - catecholamines KW - vessel KW - hypertrophy KW - heart failure KW - adrenal gland Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179726 ER - TY - THES A1 - Melichar, Volker O. T1 - Einfluß der Atherosklerose auf den NO:cGMP Signalweg am Modell des cholesteringefütterten Kaninchen T1 - Alterations of NO:cGMP -Signalling in Atherosclerosis in Cholesterol-fed Rabbits N2 - Atherosklerose ist Volkskrankheit und Todesursache Nummer Eins in den sogenannten entwickelten Ländern. Ursachen für die meisten Folgeerkrankungen sind Minderperfusion und Gefäßverschluß, verursacht durch Ablagerungen und Verdickung der Gefäßwand und durch einen pathologisch erhöhten Gefäßtonus. Mehrere zelluläre Signalwege, die im Gesunden eine Vasodilatation hervorrufen können, sind in atherosklerotischen Gefäßen gestört, so auch der NO:cGMP-Signalweg. Der Einfluß der Atherosklerose auf den NO-abhängigen Teil des Signalwegs, also NO-Produktion und -Abbau, sowie Diffusion von NO zu den glatten Muskelzellen, ist seit längerem bekannt. In dieser Studie zeigen wir, daß im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auch der NO-unabhängige Teil des Signalwegs in erheblichen Maße gestört ist. Die Expression und Aktivität der Enzyme lösliche Guanylatzyklase (sGC) und cGMP-abhängige Proteinkinase-I ist vor allem in der neugebildeten Neointima reduziert. P-VASP, ein Indikator der Aktivität des gesamten NO:cGMP-Signalwegs, ist in eindrucksvoller Weise reduziert. Die Enzyme des NO-unabhängigen Teils des NO:cGMP-Signalwegs werden in zunehmenden Maße pharmakologisch beeinflußbar. Die Ergebnisse dieser Studie stellen somit eine wichtige Grundlage für neue Therapieansätze der Atherosklerose dar. N2 - Atherosclerosis is number one cause of death in the so-called developed countries. The cause of most complications of atherosclerosis is malperfusion and blood vessel occlusion, caused by plaque-formation and vessel wall thickening as well as a pathologically increased vessel tone. Several cellular signalling cascades, capable of causing vasodilatation in the healthy vessel, are known to be impaired, amongst others the NO:cGMP signalling pathway. The influence of atherosclerosis upon the NO-dependent part of this pathway, i.e. NO-synthesis and -scavenging, as well as diffusion of NO to the smooth muscle cells, has been has been intensively studied. In the present study we show, that in more progressed stages of the disease also the NO-independent part of the signalling pathway is highly impaired. Expression and activity of the enzymes soluble guanlylate cyclase (sGC) and cGMP-dependent protein kinase-I is reduced, especially in the newly formed neointima. P-VASP, a marker-protein of the activity of the entire NO:cGMP signalling pathway, is dramatically reduced. Nowadays it is possible to influence also the enzymes of the NO-independent part of the NO:cGMP signalling pathway pharmacologically. Therefore the results of this study are an important basis for new therapeutic approaches of atherosclerotic disease. KW - Atherosklerose KW - No:cGMP-Signalweg KW - Stickstoffmonoxid KW - sGC KW - VASP KW - Atherosclerosis KW - No:cGMP-Signalling KW - nitric oxide KW - sGC KW - VASP Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3833 ER - TY - THES A1 - Bossle, Franz T1 - Zur Pharmakologie von meta-Iodbenzylguanidin T1 - Pharmakology of meta-iodbenzylguanidine N2 - Obwohl radioaktiv markiertes meta-Iodbenzylguanidin (MIBG) häufig in der Diagnose und bei der Behandlung von Neuroblastomen in der Klink Verwendung findet, ist bis heute sehr wenig über seine Pharmakologie bekannt. In der Literatur finden sich öfters Andeutungen, die aber nicht belegt wurden. So fehlten Untersuchungen über indirekt-sympathomimetische Wirkungen von MIBG. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir am isoliert perfundierten Kaninchenherzen die Wirkung von MIBG im Vergleich zum Prototyp eines indirekten Sympathomimetikums (Tyramin). Dabei zeigte sich, daß MIBG zwar etwas potenter aber nicht so effektiv wie Tyramin war. Dies zeigte sich sowohl beim Paramter Herzfrequenz als auch beim Parameter Noradrenalin-Freisetzung. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Zeitverlauf, daß die Wirkung von MIBG wesentlich länger anhielt als die von Tyramin. Der Unterschied zwischen MIBG und Tyramin bezüglich der Effektivität als indirekte Sympathomimetika konnte mit unterschiedlichen Wirkstärken beider Substanzen als Hemmstoff des vesikulären Monoamin-Transporters erklärt werden. Tyramin und MIBG wurden in Versuchen mit Neuroblastomzellen mit gleicher Geschwindigkeit durch Uptake1 aufgenommen, Tyramin war aber ein wesentlich potenterer Hemmstoff des vesikulären Monoamin-Transporters als MIBG. Da aber MIBG im Gegensatz zu Tyramin kein Substrat der neuronalen Monoaminoxidase ist, hielt seine Wirkung auch deutlich länger an als die von Tyramin. Die indirekt sympathomimetische Wirkung von MIBG wurde anschließend auch in-vivo untersucht. Dort zeigte sich auch, daß MIBG trotz im Vergleich zu klinischen Anwendungen hoher Dosen wesentlich schwächer indirekt-sympathomimetisch wirkt als Tyramin. In diesen Versuchen wurde auch beobachtet, daß die indirekt-sympathomimetische Wirkung auf die Herzfrequenz durch eine Gegenregulation des Nervensystems (nämlich den Barorezeptor-Reflex) maskiert wurde. Obwohl MIBG in der Literatur von Anfang an als adrenerger Neuronenblocker bezeichnet wurde, fand sich in der Literatur kein direkter Beweis für diese Behauptung. Mit Hilfe eines in-vitro Modells konnte in der vorliegenden Arbeit der Beweis erbracht werden, daß MIBG ein adrenerger Neuronenblocker ist. Dazu benutzten wir als Parameter die durch elektrische Stimulation induzierte Freisetzung von Noradrenalin im spontan schlagenden, perfundierten Kaninchenherzen. Die stimulationsbedingte Abgabe von Noradrenalin ins Perfusat wurde durch MIBG zeit- und konzentrationsabhängig blockiert. Da viele adrenerge Neuronenblocker das Enzym Monoaminoxidase (MAO) hemmen, wurde in-vitro untersucht, ob MIBG die beiden Iso-Enzyme MAO-A und MAO-B hemmt. Es konnte gezeigt werden, daß MIBG die MAO kompetitiv hemmt und zwar bevorzugt die Isoform MAO-A. Diese MAO-Hemmung wurde auch in-vivo in den Versuchen mit narkotisierten Kaninchen beobachtet. MIBG verminderte nämlich dosisabhängig die Konzentration des desaminierten Noradrenalin-Metaboliten DOPEG im Blutplasma der Tiere. Die Beobachtung, daß für die Hemmung der MAO-A im perfundierten Herzen eine IC50 von 17 nM, im Gewebehomogenat von Herzen dagegen eine IC50 von 18 µM gefunden wurde, spricht dafür, daß MIBG als Substrat von Uptake1 im Axoplasma der sympathischen Neurone des Herzens um den Faktor 1000 angereichert wird. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit einige offene Fragen zur Pharmakologie von MIBG im Bereich des sympathomimetischen Nervensystems beantwortet werden, die auch für den klinischen Einsatz von MIBG wichtig sein könnten. N2 - Although radioiodinated MIBG is widley used clinicaly to diagnose and treat neural crest tumours, there is only paucity of published data on the pharmacology of MIBG. In the literature, there are frequently allusions which were not verified. For example, nothing is known about the indirect sympathomimetic effects of MIBG. This prompted us to compare the sympathomimetic effects of MIBG and tyramine (the prototype of indirectly acting amines) in spontaneously beating, isolated, perfused rabbit hearts. We were able to show, that MIBG was in fact more potent, but much less effectiv, than tyramine. Increases in heart rate and noradrenaline overflow were both indicators for that. On the other hand, the duration of the effects of MIBG was much longer than that of the effects of tyramine. The difference between MIBG and tyramine with respect to the efficacy as indirectly acting sympathomimetic amines can be explained with different potencies to inhibit the vesicular monoamine transporter. For tyramin and MIBG we found in human neuoblastoma cells the same rate of neuronal uptake. On the other hand, as far as the inhibition of the vesicular monoamine transporter is concerned, tyramine was eight times more potent then MIBG. In addition, MIBG is contrary to tyramine, not a substrate of monoamine oxidase. Therefor, the duration of MIBG action was much more longer than that of tyramine. In experiments carried out in anaesthetized rabbits, we examined the indirect sympathomimetic effects of MIBG in vivo. Although the dose of MIBG used in these experiments was relativly high compared to doses used in clinical settings, MIBG was much less effectiv than tyramine as indirectly acting sympathomemetic amine. The effect of MIBG on heart rate was masked by reflex counter-regulation (baroreceptor reflex). Hence, MIBG caused a dose-dependent increase in blood pressure and a dose-dependent decrease in heart rate. Although MIBG was labelled from the beginning as adrenergic neurone blocking agent in the literature, we found no direct evidence for this suggestion in the literature. In our study we were able to show, that MIBG behaves as an adrenergic neurone blocking agent. We used the spillover of noradrenaline induced by electrical stimulation as a parameter in sponantously beating, isolated rabbit hearts. The stimulation-induced spillover of noradrenaline was inhibited by MIBG in a time- and concentration-dependent manner. Because many adrenergic neurone blocking agents inhibit the enzym monoamine oxidase (MAO), we examined in vitro, whether MIBG inhibits both iso-enzyms MAO-A and MAO-B. We were able to show, that the inhibition of MAO by MIBG is competitiv in nature and preferentially involves inhibition of MAO-A. This inhibition of MAO was also shown in the in-vivo experiments carried out in anaesthetized rabbits. In these experiments, MIBG reduced the concentration of the MAO metabolite of noradrenaline, DOPEG, in plasma in a dose dependent manner. In addition, MIBG was found to be 1000 times more potent in inhibiting MAO-A in the intact heart (IC50 17 nM) than in inhibiting MAO-A in heart homogenats (IC50 18 µM). From this difference in potency it can concluded that there is a 1000-fold accumulation of MIBG within the axoplasm of noradrenergic neurones. In this paper a number of questions about the pharmacology of MIBG concerning the sympathomimetic nervouse system were answered. This may be of importance in the clinical use of MIBG. KW - MIBG KW - Pharmakologie KW - Adrenerger Neuronenblocker KW - chromaffine Granulas KW - Herzfrequenz KW - Kaninchen KW - MAO-Hemmer KW - Monoaminoxidase KW - meta-Iodbenzylguanidin KW - Noradrenalin KW - Adrenergic neurone blocking agent KW - chromaffin granulas KW - heart rate KW - mao-inhibiters KW - monoamine oxidase KW - meta-iodobenzylguanidine KW - noradrenaline Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3717 ER - TY - THES A1 - Nerlich, Kai T1 - Untersuchung des genetischen Schadens in peripheren Lymphozyten von Dialysepatienten mittels Mikrokerntest und Comet-Assay T1 - Analysis of genomic damage in peripheral lymphocytes of dialysis patients using the micronucleus- and comet-assay N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich im Gegensatz zu bisherigen Studien (überwiegend im Rahmen von Querschnittsstudien) v.a. prospektiv mit der Untersuchung der Auswirkung verschiedener Faktoren (1. Prädialysephase, 2. Wechsel von der Hämodialyse zu HDF-Behandlung, 3. Einfluß einer Angiotensin IIAntagonistentherapie sowie (durch einmalige Erhebung) „Langzeit“-HDF-Behandlung)auf den relativen genetischen Schaden, ermittelt durch den Comet-Assay und den Mikrokern-Test in peripheren Lymphozyten bei Dialysepatienten bzw. Prädialysepatienten. N2 - In end-stage renal failure cancer incidence is enhanced. We are analysing the DNA damage in peripheral lymphocytes of (pre-)dialysis patients using two biomarkers: micronuclei frequency and single cell gel electrophoresis (comet assay)to evaluate the most beneficial therapy. KW - genetischer Schadens KW - periphere Lymphozyten KW - Dialysepatienten KW - Mikrokerntest KW - Comet-Assay KW - genomic damage KW - peripheral lymphocytes KW - dialysis patients KW - micronucleus- assay KW - comet-assay Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9726 ER - TY - THES A1 - Gregor, Caroline T1 - Genomische Instabilität bei der humanen Ovarialtumorzellinie BG-1 durch hormonelle Proliferationsstimulierung T1 - Genomic instability after hormonal stimulation of cell proliferation in human ovarian cancer cells. N2 - Ergebnisse vieler epidemiologischer Studien über die Risikoabschätzungen von Tumoren hormonabhängiger Gewebe legen einen deutlichen Zusammenhang zwischen den Hormonen und dem Auftreten dieser Tumoren nahe. Dabei wird der zellproliferationssteigernde Effekt der Hormone im Rahmen des Mehrstufenkonzeptes der Kanzerogenese meist als Promotionsfaktor beschrieben. In der vorliegenden Arbeit soll gezeigt werden, dass die hormonelle Induktion einer erhöhten Zellteilungsrate auch primär zu einer genetischen Instabilität beiträgt, mit dem Ziel einen weiteren Mechanismus in der Pathogenese hormonabhängiger Tumoren aufzuklären. Die östrogenrezeptorpositive Ovarialtumorzellinie BG-1 und die rezeptornegativen UCI-107 Zellen wurden mit 17-ß Östradiol behandelt und anschließend mit Hilfe des Mikrokerntests auf chromosomale Schäden untersucht. Die Bestimmung der Mikrokernrate bei den östrogensensitiven BG-1 Zellen zeigte, dass mit steigender Proliferationsinduktion auch die Mikrokernfrequenz konzentrationsabhängig erhöht war. Bei der Behandlung der BG-1 Zellen mit 17-ß Östradiol in Kombination mit dem spezifischen Östrogenrezeptorantagonisten 4- Hydroxytamoxifen wurde die östradiolinduzierte rezeptorabhängige Proliferationsstimulation durch Hydroxytamoxifen gehemmt. Parallel dazu sank auch die Mikrokernrate. Bei vergleichbaren Versuchen mit der östrogeninsensitiven UCI-107 Zellinie, bei der keine Effekte auf die Proliferation bei Behandlung der Zellen mit 17-ß Östradiol alleine sowie in Kombination mit 4- Hydroxytamoxifen detektiert werden konnte, wurde auch keine Mikrokerninduktion beobachtet. Eine erhöhte Mikrokernfrequenz konnte wiederum ausschließlich in den östradiolstimulierten BG-1 Zellen festgestellt werden, als durch den Einsatz des Zytokineseinhibitors Cytochalasin B die Auswertung der Mikrokerne auf jene Zellen normiert wurde, die genau eine Zellteilung durchgeführt hatten. Die Ergebnisse machten deutlich, dass die östradiolstimulierten Zellen auf Grund der beschleunigten Proliferation eine „andere Art von Zellteilung“ durchführen. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde der Einfluss der Östradiolstimulierung auf den Zellzyklus untersucht. Mittels eines FACScans konnten die prozentualen Zellzyklusphasenanteile (G1/ G0-, S- und G2/ M- Phase) der BG-1 Zellen zu verschiedenen Zeiten des Wachstums bestimmt werden. Zum Beispiel war der Anteil an Zellen der östradiolstimulierten Zellpopulation in der G2/ M Phase durchgehend um 6-8 % geringer gegenüber dem Anteil an Zellen, die mit Lösungsmittel behandelt wurden. Möglicherweise ist dies ein Erklärungsansatz für das vermehrte Auftreten von Mikrokernen bei Östradiolstimulierung, da bekannt ist, dass es in der G2/ M-Phase einen wichtigen Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus zur Detektion und Reparatur chromosomaler Schäden gibt. Bei Berechnung der Zellzyklusphasenzeiten ergab sich ebenso in der G2/M Phase eine deutlich verkürzte Verweildauer der östradiol-behandelten BG-1 Zellen. Zusammengefaßt leitet sich die Hypothese ab: „Die Zellen werden auf Grund der hormonellen Proliferationsstimulierung durch den Zellzyklus „gejagt“, demzufolge werden wichtige „Checkpoints“ im Zellzyklus überlaufen, wodurch eine genetische Instabilität entstehen.kann“. N2 - Estrogen-related cancers are often associated with the hormone's tumor promoting activity. Recently, estradiol has also been demonstrated to induce gene mutations in the physiological concentration range. Mitotic disturbances are found at higher concentrations. In the present study we demonstrate data suggesting an additional mechanism for the induction of genetic damage, i.e. chromosomal breakage. The estrogen receptor-positive (BG-1) human ovarian cancer cell line was investigated for micronucleus formation after treatment with estradiol in the picomolar concentration range. The dose-dependent increase in cell proliferation correlated with an increased genomic damage as detected by the formation of micronuclei. Addition of the specific estradiol-receptor antagonist hydroxytamoxifen suppressed both estradiol-induced cell proliferation as well as formation of micronuclei in BG-1 cells Increased numbers of micronuclei were also seen after normalization of the data to the number of cell divisions by additional treatment of the cells with cytochalasin B. In control experiments with the estrogen insensitive ovarial cancer cells UCI-107 neither cell proliferation nor micronucleus formation was found. Furthermore, analysis of the cell cycle revealed decreased cell numbers in G(2)/M phase after treatment with picomolar concentrations. We hypothesize that hormone-specific forcing of responsive cells through cell cycle leads to an override of checkpoints operating under homeostatic control of the cell cycle, resulting in genomic instability. KW - Genomische Instabilität KW - Mikrokerne KW - BG-1 Zellen KW - Östrogene KW - Zellzykluskontrolle KW - Genetic instability KW - micronuclei KW - BG-1 cells KW - estrogens KW - control of the cell cycle Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8072 ER - TY - THES A1 - Philipp, Melanie T1 - Die Rolle von alpha2-adrenergen Rezeptoren während der Embryonalentwicklung der Maus T1 - The role of alpha2-adrenergic receptors during murine development N2 - Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, gehören zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute über alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten Mäusen, sogenannten „Knock-Out“-Mäusen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient für alpha2A und alpha2B, für alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. Während alpha2AB-KO-Mäuse ungefähr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-Mäuse teilweise und alpha2ABC-KO-Mäuse sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalität der alpha2ABC-KO-Mäuse auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalität in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begründet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit für dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS für alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, nämlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dottersäcken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, während andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden können, nicht beeinträchtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dottersäcken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dottersäcken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus über eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen. N2 - alpha2-Receptors belong to the familiy of adrenergic receptors within the superfamily of G-protein coupled receptors. They are involved in the regulation of many physiological processes. Most of the known functions have been investigated using mice deficient in alpha2-receptors. To date, single knockout mouse lines exist for each subtype of alpha2-receptors and also the alpha2AC-knockout. In this study the remaining double knockouts and the triple-knockout were generated by crossing the existing knockout mice. While mice deficient for the alpha2A- and the alpha2B-receptor were born with the expected Mendelian ratio, embryonic lethality occurred in the alpha2BC-knockout mice, and this was complete in mice lacking all three alpha2-receptors. Morphological examinations revealed that alpha2ABC-mice die around midgestation because of a defect in vascularisation in the extra-embryonic organs placenta and yolk sac. These are the organs which support the embryo with nutrients and oxygen and are therefore essential for embryonic development. RT-PCR-experiments detected mRNA for all three subtypes of alpha2-receptors on day E10.5 of embryonic development in embryo, placenta and yolk sac. Autoradiography and radioligand binding studies showed that most of the alpha2-receptors are expressed in the embryonic part of the placenta, in particular in giant cells and the underlying spongiotrophoblast layer. The alpha2B-receptor is the main subtype in these tissues. Immunohistochemistry of stimulated placenta slices demonstrated alpha2-receptor mediated phosphorylation of the MAP-kinase ERK1/2, which was also observed in cultivated yolk sacs of WT-mice. In freshly prepared tissue of alpha2ABC-knockout embryos ERK1/2-phosphorylation was dramatically decreased, while other signaling pathways of alpha2-receptors were unaffected. Experiments using cell culture and cultivated yolk sacs of WT-mice revealed a physiologically relevant interaction between alpha2B-receptors and PDGFbeta-receptors, a receptor tyrosine kinase. The mechanism of this interaction was illucidated in co-culture experiments of alpha2B-receptor transfected cells and alpha2 ABC-knockout yolk sacs as a G-protein coupled receptor initiated transactivation of receptor tyrosine kinases. In this study it was demonstrated that in mice alpha2-receptors are responsible for the vascularisation of placenta and yolk sac by transactivation of ERK1/2, and that they are, therefore, necessary for proper embryonic development. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Alpha-2-Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - MAP-Kinase KW - alpha2-adrenerge Rezeptoren KW - Plazenta KW - MAP-Kinase KW - Gefäßentwicklung KW - alpha2-adrenergic receptors KW - placenta KW - Map-kinase KW - vasculogenesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5186 ER - TY - THES A1 - Rauchschwalbe, Sonja T1 - Korrelation des Polymorphismus der Uridindiphosphat-Glukuronyltransferase Isoform 1A1 mit der Glukuronidierung von Bilirubin und Paracetamol und der klinischen Diagnose des Gilbert Syndroms T1 - Correlation of the polymorphism of the Uridin-diphosphat-glucuronosyltransferase Isoform 1A1 with the Glukuronidation of Bilirubin and Acetaminophen and the clinical Diagnoses of Gilbert´s Syndrome N2 - In einer Population von 304 Männern und Frauen konnte die Frequenz der TA-Duplikation im Promotor der Uridin-Diphosphat-Glukuronyltransferase Isoform 1A1 bestimmt werden. Sie beträgt 0,39 in der Gruppe der Männer und 0,30 in der Gruppe der Frauen, in der Gesamtgruppe kommt das Allel mit einer relativen Häufigkeit von 0,35 vor. Es wurde gezeigt, daß die Höhe der Bilirubinspiegel und die Diagnose "Gilbert Syndrom" nach definierten klinisch-chemischen Kriterien gut mit dem Genotyp korreliert. Dabei lagen die mittleren Bilirubinwerte der Frauen deutlich unter denen der Männer. Die Festlegung neuer Referenzbereiche für Bilirubin von <18µmol/l für Männer und <15µmol/l für Frauen wurde daraus abgeleitet. Ein Unterschied in der Glukuronidierungskapazität von Paracetamol zwischen Probanden mit homozygot wildtypischer, homozygot mutierter und heterozygoter Allelkombination konnte nicht nachgewiesen werden. Deshalb scheint die UGT1A1 nicht das für Para-cet-amol verantwortliche Isoenzym zu sein. Die Bestimmung des Genotyps des UGT1A1 Promotors kann zur Vorhersage zukünf-tiger oder Erklärung vorliegender erhöhter Bilirubinspiegel herangezogen werden. Dies kann in der Klinik zur routinemäßigen Diagnostik des Gilbert Syndroms eingesetzt werden. Für die klinische Forschung bietet die Genotypisierung der UGT1A1 eine Möglichkeit, zwischen dem genetischen Polymorphismus oder einer Reaktion auf die Prüfmedikation als möglichen Ursachen eine Erhöhung der Bilirubinwerte eines Probanden zu unterscheiden. Zur Phäno-typisierung dieses Stoffwechselweges ist Paracetamol nicht geeignet. Personen mit Gilbert Syndrom unterliegen bei der Einnahme von Paracetamol vermutlich keinem erhöhten Risiko toxischer Nebenwirkungen. N2 - Elevated fluctuating levels of bilirubin are a common problem in clinical studies. Differentiation between a drug-related adverse event and the symptom for Gilbert's Syndrome (GS), an idiopathic unconjugated hyperbilirubinemia, is more or less impracticable since GS is an exclusion diagnosis. The aim of this investigation was to evaluate the correlation of the unspecific elevated bilirubin levels and occurrence of GS with a described polymorphism in the Uridine-diphosphat-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) in a predominately Caucasian population. 304 volunteers (152 male, 152 female) were genotyped for the UGT1A1 promoter polymorphism by PCR amplification and polyacrylamide gel electrophoresis. Serum bilirubin levels and liver enzymes were determined and GS was diagnosed according to clinico-chemical criteria. 23/13 subjects were homozygote variant, 73/66 heterozygote and 56/72 wildtype (male/female, respectively). 23 male and 3 female volunteers fulfilled the clinical criteria for GS (15.1 respectively 2.0 %). Men exhibited higher serum bilirubin levels than women with a mean (sd) of 14.37 (8.92) µmol/l compared to 10.17 (5.37) µmol/l, respectively (p<0.001). The homozygote mutant promoter length correlated well with the serum bilirubin levels and with the clinical diagnosis of GS (each p<0.001). Genotyping of the UGT1A1 promoter polymorphism is a cheap and unequivocal method to predict elevated and fluctuating bilirubin levels. For this purpose it is better suited than the clinical diagnosis which is based on exclusion. The genotyping of UGT1A1 promoter polymorphism can help to improve safety and the reliable assessment of adverse events in clinical studies. Our data additionally support the demand to refine the bilirubin reference values. KW - Bilirubin KW - Glukuronidierung KW - UGT1A1 KW - Gilbert Syndrom KW - Paracetamol KW - Bilirubin KW - Glucuronidation KW - UGT1A1 KW - Gilbert´s Syndrome KW - Acetaminophen Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4644 ER - TY - THES A1 - Brede, Anja T1 - Über die Beteiligung EGF-Rezeptor-vermittelter Signaltransduktionswege an den tumorpromovierenden Effekten von 2-Acetylaminofluoren, 2-Nitrosofluoren und Phenobarbital in HepG2-Zellen T1 - Tumour promoting effects of 2-acetylaminofluorene, 2-nitrosofluorene and phenobarbitale in HepG2 cells by EGF-receptor signal transduction pathways N2 - In dieser Arbeit wurden die tumorpromovierenden Effekte von 2-Acetylaminofluoren (2-AAF), 2-Nitrosofluoren (2-NOF) und Phenobarbital (PB) auf die Expression des EGF-Rezeptors (EGF-R), der Proteinkinase C (PKC), der Protoonkogene c-FOS und c-JUN in HepG2 Zellen bestimmt. Nur PB hemmte die Expression des EGF-R, wohingegen die PKC, c-FOS und c-JUN nicht beeinflusst wurden. 2-AAF, 2-NOF und PB wirkten konzentrationsabhängig zytotoxisch und antiproliferativ auf HepG2-Zellen. Die PKC scheint an diesem Effekt beteiligt zu sein. Die Bindungsaktivität der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkappa B wurde durch 2-NOF und Phenobarbital erhöht, wohingegen der Effekt von 2-AAF nicht endeutig zu klären war. N2 - This thesis evaluateted the tumour-promoting effects of 2-acetylaminofluorene (2-AAF), 2-nitrososfluorene (2-NOF)and phenobarbitale (PB)on the expression of the EGF-receptor, proteinkinase C (PKC) and the protoonkogenes c-FOS and C-JUN using HepG2 cells. Only PB inhibited the expression of the EGF-receptor whereas PKC, c-FOS and c-JUN were not influenced. 2-AAF, 2-NOF and PB showed cytotoxic and antiproliferative effects in a concentration dependant manner. The proteinkinase C was mainly responsible for these effects. The binding activity of the transcription factors AP1 and NFkappa B was enhanced by 2-NOF and phenobarbital. It was not possible to clarify the effect of 2-AAF on the binding activity of AP1 and NFkappaB. KW - EGF-Rezeptor KW - AAF KW - NOF KW - Phenobarbital KW - Tumorpromotion KW - EGF-receptor KW - AAF KW - NOF KW - phenobarbitale KW - tumourpromotion Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4024 ER - TY - THES A1 - Wück, Daniela Maria T1 - Kombination von Paclitaxel und Bestrahlung T1 - Combination of paclitaxel and irradiation N2 - Paclitaxel wird als antineoplastisches Agenz hauptsächlich gegen Ovarial- und Brusttumore eingesetzt. Seine Wirkung beruht auf einer Störung der mikrotubulären Dynamik und Struktur des Zytoskeletts, die einen Arrest der Zelle in der G2- und Mitosephase des Zellzykluses bewirkt. Da Zellen, die in der G2/M-Phase des Zellzykluses arretiert sind, eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung aufweisen, könnte Paclitaxel als Strahlensensibilisierer in einer Kombinationstherapie mit Bestrahlung Vorteile in der Tumortherapie haben. In dieser Arbeit wurden daher die gentoxischer Effekte einer Einzelbehandlung und einer Kombinationsbehandlung von Paclitaxel und Strahlung untersucht. Da eine Tumortherapie stark von der Art des Tumors abhängt, wurden verschiedene Tumorzellinien untersucht. Als gentoxischen Endpunkt wurde die Induktion von Mikrokernen in vitro gewählt. Der in vitro Mikrokerntest ist ein valider und empfindlicher Test, der sensitiv gegenüber Spindelgiften wie Paclitaxel und chromosomenbrechende Agentien, wie ionisiernder Strahlung ist. In der Maus Lymphom Zellinie L5178Y, den Lungenfibroblasten V79, den humanen Cervixkarzinomzellen HeLa und in den humanen Brustkrebszellen MCF-7 konnte keine Radiosensibilisierung durch Paclitaxel detektiert werden. Die Anzahl der induzierten Mikrokerne lag immer im Bereich der theoretischen Addition der Einzelbehandlung mit Paclitaxel und Bestrahlung. In der humanen Lungenkarzinomzellinie A549, die als fünfte Zellreihe untersucht wurde, konnte für eine Kombination von 2,5 nM Paclitaxel und 2 Gy Bestrahlung ein synergistischer Effekt gefunden werden (30 %ige Erhöhung der Mikrokernrate bei Kombinationsbehandlung verglichen mit der Summe der Einzelbehandlungen). Dieser Effekt konnte in Wiederholungsexperimenten, in denen höhere Dosen an Paclitaxel verwendet wurden jedoch nicht reproduziert werden. Insgesamt konnten damit die Ergebnisse des in vitro Mikrokerntestes in fünf verschiedenen Zellinien keine eindeutige Radiosensibilisierung von Paclitaxel zeigen. In Folgestudien sollten daher verschiedene Konzentrationen und Behandlunsdauern von Paclitaxel sowie andere Endpunkte untersucht werden, um eine abschließende Beurteilung, ob Paclitaxel als zelltypabhängiger Radiosensibilisierer fungieren könnte, zu erlauben. N2 - Paclitaxel is used as a neoplastic drug for the treatment of ovarian and breast cancer. The mechanism of action of paclitaxel is the impairment of microtubules formation leading to cell cycle arrest in the G2 and M phase. Cells that are arrested in G2/M phase of the cell cycle are sensitive for radiation and paclitaxel could therefore be used as a radiosensibilizer in tumor therapy. This thesis investigated therefore the genotoxic effects of paclitaxel in a single treatment as well as in combination with irradiation. Since tumor therapy is highly dependent on the tissue, several tissue-specific cell line were analyzed. The induction of micronuclei in vitro was chosen as genotoxic endpoint. The in vitro micronucleus test is a valid and sensitive assay suitable for the detection of spindle poisons like paclitaxel and chromosome damaging toxicants like irradiation. Nevertheless, no radiosensibilisation of paclitaxel was detectable in the mouse lymphoma cell line L5178Y, the lung fibroblasts V79, the human cervix carcinoma cells HeLa or the human breast carcinoma cell line MCF-7. The amount of micronuclei induced by the combination treatment paclitaxel and irradiation was always within the range of the calculated sum of the single treatments by paclitaxel and irradiation, respectively. However, a combination of 2.5 nM paclitaxel and 2 Gy irradiation induced a synergistic effect in the human lung carcinoma cell line A549 (number of induced micronuclei by the combination treatment was 30 % higher compared to the calculated sum of the single treatments). This result could not be reproduced in subsequent experiments using higher doses of paclitaxel in A549 cells. In conclusion, no unequivocal radiosensibilisation by paclitaxel was detectable by the in vitro micronucleus test in five different cell lines. It is suggested that in follow-up studies different treatment schemes of paclitaxel and also various genotoxic endpoints should be investigated, to elucidate the potential of paclitaxel as a cell-type specific radiosensibilizer. KW - Paclitaxel KW - Bestrahlung KW - Mikrokerntest KW - Radiosensibilisierung KW - Synergismus KW - nicht additive Effekte KW - paclitaxel KW - irradiation KW - micronucleus test KW - radiosensibilisation KW - synergism KW - non-additive effects Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3356 ER - TY - THES A1 - Rother, Tobias T1 - Die Plasmamembran-Kalzium-ATPase im Myokard T1 - The plasma membrane calcium ATPase in the myocardium N2 - Die Plasmamembran Kalzium-ATPase (PMCA) ist ein in den meisten eukaryontischen Zellen exprimiertes Enzym. Sie katalysiert den Transport von Kalziumionen aus der Zelle und besitzt gegenüber Kalzium eine hohe Affinität jedoch geringe Transportkapazität. Trotz der guten biochemischen Charakterisierung der Pumpe ist ihre Funktion in Zellen wie Kardiomyozyten, die zusätzlich über andere Kalzium-Transportsysteme wie den Natrium/Kalzium-Austauscher verfügen, weiterhin unklar. Erste Ergebnisse aus dem eigenen Labor an PMCA-überexprimierenden L6-Myoblasten zeigten einen Einfluss des Enzyms auf deren Wachstum und Differenzierung. Um diese Erkenntnisse auf den Herzmuskel zu übertragen war im Vorfeld ein transgenes Rattenmodel generiert worden, welches die hPMCA4CI unter einem myokardspezifischen Promotor überexprimierte. Dieses Modell stand für die vorliegende Arbeit zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung. Untersucht wurde zunächst das Wachstumsverhalten von Primärkulturen neonataler Kardiomyozyten unter Stimulation mit fetalem Kälberserum, Noradrenalin und dem Platelet Derived Growth Factor BB, jeweils im Vergleich zwischen transgenen und Wildtyp-Kardiomyozyten. Dabei zeigte sich ein beschleunigtes Wachstum der PMCA-überexprimierenden Zellen. In einem zweiten Ansatz wurden Untersuchungen angestellt, um die subzelluläre Lokalisation der PMCA innerhalb der Herzmuskelzelle aufzudecken. Dabei wurden im Speziellen die Caveolae als Ort der möglichen Lokalisation untersucht, kleine, ca. 50-100 nm große Einstülpungen der Plasmamembran, mit charakteristischer Lipid- und Proteinzusammensetzung, darunter auch viele Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle. Insgesamt konnte mit den Methoden der Detergenzextraktion, Doppelimmunfluoreszenz, Präparation Caveolae-reicher Membranen und Immunpräzipitation gezeigt werden, dass die PMCA zu einem großen Teil in Caveolae lokalisiert ist. Zusätzlich konnte in der Immunpräzipitation eine Interaktion der PMCA mit dem Caveolae-assoziierten Zytoskelettprotein Dystrophin dargestellt werden. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die PMCA über eine Steuerung der lokalen Kalziumkonzentration im Bereich der Caveolae modulierend in wachstumsregulierende Signaltransduktionswege von Kardiomyozyten eingreifen kann. N2 - The plasma membrane calcium ATPase (PMCA) is an enzyme expressed in most eucariotic cells. It catalyses the transport of calcium ions out of the cell and has a high calcium affinity but only a low transportation capacity. Despite the good biochemical characterization of the pump, its function remains unclear in cells like cardiomyocytes that have other calcium transporting systems like the sodium-calcium-exchanger. First results from the own laboratory examining PMCA overexpressing L6-myoblasts showed an influence of the enzyme on cellular growth and differentiation. To transfer these results to the heart muscle, a transgene rat model, overexpressing the hPMCA4CI under the control of a myocardium specific promoter, had been generated in advance. This model was now available for further characterization. First the growth pattern of primary cultures of neonatal cardiomyocytes was studied under stimulation with fetal calf serum, norepinephrine and the platelet derives growth factor BB in comparison of transgene and wildtype cardiomyocytes. These experiments showed an accelerated growth of the PMCA-overexpressing cells. Additionally to these experiments further tests were done to unravel the PMCA’s subcellular localization within the cardiomyocyte. The caveolae were especially examined as places of the potential localization, small invaginations of the plama membrane, about 50-100 nm in diameter, with a characteristic lipid and protein pattern, among them many receptors and signal transduction molecules. With the methods of detergent extraction, double immunofluorescence staining, preparation of caveolae-rich membranes and immunoprecipitation it was shown, that a high percentage of the PMCA is localized in caveolae. In addition to that an interaction of the PMCA with the caveolae associated cytoskeletal protein dystrophin could be shown. In conclusion these results indicate, that the PMCA can modulate growth regulating signal transduction pathways of cardiomyocytes by controlling the local caveolar calcium concentration. KW - Plasmamembran-Kalzium-ATPase KW - PMCA KW - Kalzium KW - Myocard KW - Caveolae KW - Wachstum KW - transgene Ratten KW - plasma membrane calcium ATPase KW - PMCA KW - calcium KW - myocardium KW - caveolae KW - growth KW - transgene rats Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-916 ER - TY - THES A1 - Boullay, Felix T1 - Quantifizierung von DNA-Schäden peripherer Lymphozyten bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz T1 - Increased genomic damage in lymphocytes of Patients with chronical renal failure and after long-term maintenance hemodialysis therapy N2 - Schon vor mehr als zwei Jahrzehnten wurde eine erhöhte Tumorentstehungsrate bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung unter Dialysebehandlung festgestellt. Eine der wahrscheinlichsten Erklärungen für dieses Phänomen ist die klinische Manifestation eines Immundefektes innerhalb dieses Patientenkollektives. Lymphozyten von Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen ohne Dialyse und Dialysepatienten mit einer Behandlungsdauer von mehr als 120 Monaten verfügen nachweislich über eine reduzierte DNA-Reparaturfähigkeit. Zusätzlich weisen sie eine erhöhte Rate von Mikrokernen auf, was für verstärkte gentoxische Einflüsse im Patientenblut spricht. In dieser Arbeit wurde mittels Comet Assay, einem sensiblen Testverfahren zur Quantifizierung von DNA-Schäden auf Einzellzellniveau, aus verschiedenen Gruppen von chronisch Nierenkranken die Zellkern-DNA von peripheren Lymphozyten auf Schäden untersucht. Neben Patienten mit leicht bis stark erhöhten Kreatininspiegeln wurden auch Kollektive mit Hämodialyse und Hämodiafiltrationsbehandlung auf DNA-Schäden untersucht und miteinander verglichen. In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in der Gruppe der chronisch Nierenkranken ohne Dialysebehandlung offensichtlich ein Zusammenhang zwischen Höhe des Kreatininspiegels und einer durch den Comet Assay feststellbaren DNA-Schädigung besteht: im Kollektiv der Hämodialysepatienten ist mit der Dauer der Behandlung ein Anstieg des Schadens zu verzeichnen. Bei Patienten mit Hämodiafiltrationsbehandlung hingegen war kein Anstieg der DNA-Schäden mit der Länge der Behandlung feststellbar. Bei gleicher Behandlungsdauer bestehen zwischen Hämodialyse- und Hämodiafiltrationsgruppe nur unwesentliche Schadensdifferenzen. Dies war nicht vorhersehbar, da besonders Patienten mit stärkeren gesundheitlichen Einschränkungen in den Vorzug der Hämodiafiltration gelangen. Insgesamt zeigten jedoch alle untersuchten Gruppen einen signifikanten Anstieg der DNA-Schädigung gegenüber den Kontrollen. Da der Comet Assay derzeit noch mit methodischen und patientenbedingten Ergebniss-Schwankungen behaftet ist, muss jede Interpretation mit Zurückhaltung erfolgen. Insbesondere muss anhand eines Zusammenhanges hinsichtlich Gentoxizität und vorliegender Erkrankung untersucht und kritisch hinterfragt werden, ob ein früherer Beginn der Dialyse-Behandlung für den Patienten von Vorteil sein könnte. Inwieweit eine Umstellung von Hämodialyse auf Hämodiafiltration die Schäden der lymphozytären Zellkern DNA und somit eventuell auch die Tumorentstehungsraten beeinflusst, ist durch weitere Forschungen auf diesem Gebiet zu klären. N2 - In endstage renal failure a striking rise of cancer incidence has been reported. In its pathogenesis numerous factors including decreased DNA repair may be involved. In the current study the spontaneous genomic damage in peripheral lymphocytes was evaluated by single gel electrophoresis (Comet Assay) in non diabetic patients with moderate to severe renal insufficiency ( n=23, serum creatinine 3,9–9,8 mg/dl ) as well as in non diabetic patients on maintenance hemodialysis therapy (MHD, n=26, duration 8 to 320 months ). In the aged matched control group of 21 healthy subjects DNA damage averaged 10,54 +/- 0,8 %. A marked rise was observed in patients with renal impairment, mean value 14,7 +/- 3,4 %, with an obvious relationship to severity of renal disease. In the 10 patients with creatinine level higher than 6 mg/dl mean DNA damage increased to 17,7 +/- 3,0 %. During MHD therapy DNA damage averaged 16,7 +/- 4,3 %. Its severity was clearly related to the duration of treatment : While over the first 4 years the levels were even lower than those in pre-endstage renal disease, but still significantly higher than the controls, a continuous rise of DNA damage occured in the following years with highest values after more than 10 years. These data are in line with investigations of micronuclei and DNA repair in similar patient groups Summarising, our data show that DNA damage is enhanced in patients with chronic renal insufficiency with a direct relationship to severity of diseases. During MHD therapy a partial improvement is observed within the first 4 years with a subsequent aggravation in the following decade. Higher levels of genomic damage in advanced chronic renal failure and MHD patients may result from decreased DNA repair previously shown and may contribute to the increased cancer incidence in these patients. KW - DNA-Schaden KW - Dialyse KW - Niereninsuffizienz KW - Comet Assay KW - Lymphozyten KW - DNA-Damage KW - Comet Assay KW - Chronical renal failure KW - Dialysis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6722 ER - TY - THES A1 - Vietinghoff, Sibylle von T1 - Das Ecdysonsystem zur induzierbaren Genexpression in Herzen von transgenen Mäusen T1 - The ecdysone systeme for inducible gene expression in the heart of transgenic mice N2 - Zusammenfassung Systeme zur induzierbaren Transgenexpression sind wichtige Werkzeuge, um die Funktion einzelner Gene in vitro und in vivo zu untersuchen. Sie bestehen aus drei Grundkomponenten, einem zu regulierenden Zielgen, einem "Schalter" und einem Liganden, der diesen Schalter bedient. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen am Ecdysonsystem durchgeführt, das als Schalter den Insektensteroidhormonrezeptor für das Verpuppungshormon Ecdyson verwendet. Zunächst wurde ein neuer Rezeptor mit der Ligandenbindedomäne des Ecdysonrezeptors (EcR) des Seidenspinners Bombyx mori konstruiert, dessen Eigenschaften in der Zellkultur mit einem DrosophilaEcR-Konstrukt, das für mammalische Expression optimiert ist, verglichen wurden. Mit dem BombyxEcR konnte die Transgenexpression durch den nichtsteroidalen Liganden Tebufenozid gesteuert werden, was beim DrosophilaEcR nicht möglich war. Damit ist man in diesem Expressionssystem nicht wie beim DrosophilaEcR auf teure steroidale Liganden wie Ponasteron angewiesen. Außerdem mußte beim BombyxEcR der Heterodimerisierungspartner RXR nicht kotransfiziert werden. In Bezug auf erreichbaren Induktionsfaktor und Kinetik der Genexpression zeigten sich für die beiden Systeme vergleichbare Ergebnisse. Weiterhin wurden durch Pronukleusinjektion transgene Mäuse erzeugt, die den BombyxEcR unter einem herzspezifischen Promotor (aMHC) exprimieren. Als Zielgen wurde die b2a-Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals eingebracht, die mit dem neuen Schaltsystem herzspezifisch gesteuert werden sollte. Die Bioverfügbarkeit des Agonisten Tebufenozid nach intraperitonealer Injektion wurde in einem in-vitro Assay in HEK293-Zellen überprüft. Es ergaben sich hinreichende Wirkstoffspiegel im Serum der Mäuse, um das Reportergen zu induzieren. Auch wenn bei der transgenen Maus nach der Induktion mit Tebufenozid kein immunologischer Nachweis erhöhter Expression der b2a-Untereinheit gelang,konnte doch in Herzkatheteruntersuchungen eine veränderte Herzfunktion nachgewiesen werden. Bei transgenen Mäusen führte die intraperitoneale Applikation von Tebufenozid für bis zu sieben Tage zu einem signifikanten Anstieg des systolischen Blutdrucks und der maximalen linksventrikulären Kontraktionsgeschwindigkeit, der bei nicht-transgenen Kontrolltieren nicht beobachtet wurde. Diese Befunde deuten erstmals in vivo darauf hin, daß die b2a–Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals am Herzen eine positiv inotrope Wirkung vermitteln kann. Systeme zur induzierbaren Genexpression müssen weiterentwickelt werden, um die Ideale der präzisen Steuerung ohne Nebenwirkungen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für eine in weiterer Zukunft liegende Verwendung in der Gentherapie zu erreichen. N2 - English Summary Systems for inducible transgene expression are important tools to study the function of single genes in vitro and in vivo. They consist of three compounds, a regulated target gene, the gene for the "switch" and a ligand to operate this switch. This work describes experiments on the ecdysone system, which uses the insect steroid hormone receptor for the molting hormone Ecdysone. First, a new receptor with the ligand binding domain of the Ecdysone receptor (EcR) of the silkmoth Bombyx mori was constructed and compared in cell culture to a DrosophilaEcR optimised for use in mammal expression. The BombyxEcR could regulate transgene expression with the nonsteroidal ligand Tebufenozide in contrast to the DrosophilaEcR. So the investigator becomes independent of expensive steroidal ligands like Ponasterone. Additionally, it was not necessary to cotransfect RXR, the partner for heterodimerisation, with the BombyxEcR. Concerning induction factor and kinetics of gene expression, there was no signifikant difference between the two systems. Second, transgenic mice that expressed the BombyxEcR under the cardiac specific promotor aMHC were generated by pronucleus injection. The target gene that was ment to be regulated in a cardiac specific manner was the b2a-subunit of the L-type Calcium channel. The bioavailability of the agonist Tebufenozide after intraperitoneal injection was studied in a bioassay with HEK293-cells. It showed sufficient serum concentrations of the agonist to induce the reporter gene. Although it was not possible to prove an overexpression of the b2a-subunit after Tebufenozide treatment immunologically, cardiac catheterisations showed an altered cardiac function. In transgenic mice, intraperitoneal application of Tebufenozide for seven days or less led to a significant increase of systolic blood pressure and maximal left ventricular contractiliy. No effect was observed in non-transgenic control animals. This results indicate for the first time in vivo , that the b2a–subunit of the L-type calcium channel can have a positive ionotropic effect on the heart. Systems for inducible transgene expression will further have to be modified to reach the ideals of precise regulation without side effects for basic research as well as for use in gene therapy in a much more distant future. KW - Ecdyson KW - Bombyx mori KW - induzierbares Transgen KW - Herz KW - Calciumkanal KW - ecdysone KW - bombyx mori KW - inducible transgene KW - heart KW - calcium channel Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7101 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Dana T1 - Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizität T1 - Novel Biomarker of Nephrotoxicity N2 - Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten‐ und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in präklinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika‐induzierter Organtoxizität, jedoch ist eine frühe Detektion von Nierenschäden schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivität und Spezifität, da sie Fremdstoff‐induzierte Toxizität meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeinträchtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverlässigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierenschädigungen früher als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen‐basierender und Urinbiomarker (Kim‐1, Clusterin, Lipocalin‐2, Timp‐1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe‐, Urin‐ und Serumproben von männlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen für Nephrotoxizität (Aristolochiasäure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT‐PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen‐ und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Veränderungen korrelieren. Sie konnten meist früher oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erhöhte Expression und Exkretion von Kim‐1 zeigte sich in allen Studien als eine der frühesten Antworten auf Schädigung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erhöhte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer veränderten Gen‐ und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterstützen die Verwendung von Clusterin als nicht‐invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin‐2 sehr früh nach Schädigung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch für einen Nierenschaden. Dennoch könnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin‐2 als frühe Antwort auf eine Entzündung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Ergänzung der routinemäßigen Testung auf Toxizität darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis‐ und zeitabhängiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2“ im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umständen auch vom Mechanismus der Toxizität von Verbindungen abhängen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur frühzeitigen Erkennung von proximalen Nierenschäden sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll für die Identifizierung von Nierenschädigungen in präklinischen Studien. N2 - The discovery and development of new drugs is very costly and time‐consuming and the rate of drug failure due to late‐breaking findings in preclinical toxicity studies is high. The kidney is a major target of xenobiotic induced organ toxicity but early detection of renal damage or minor effects on renal function is challenging due to the functional reserve of the kidney. Current clinical pathology parameters of nephrotoxicity such as blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine are relatively insensitive and non specific, revealing kidney damage not until 70‐80 % of the renal epithelial mass has been lost. There is a clear need for the identification and validation of more sensitive and reliable biomarkers, which are indicators of minimal kidney damage rather than impaired kidney function. Recently a range of novel gene‐based and urinary kidney biomarker (Kim‐1, clusterin, lipocalin‐2 and Timp‐1) was identified from literature and various colloraborative projects. The aim of this work was to investigate the performance of these markers compared to traditional endpoints, such as clinical chemistry and histopathology in tissue, urine and serum samples collected from studies, in which male Wistar rats were treated either with model compounds of nephrotoxicity (aristolochic acid and gentamicin) or drug candidates (PredTox) using qRT‐PCR, immunohistochemistry and ELISA. In summary, effects on marker gene and protein expression generally correlated well with the renal histopathology alterations and were frequently detected at earlier time‐points or lower doses than the traditional clinical parameters BUN and serum creatinine. Overexpression and enhanced urinary excretion of Kim‐1 was one of the earliest responses to proximal tubule damage and might be seen as the most sensitive marker of nephrotoxicity. Furthermore, urinary Clusterin was increased before changes in gene and protein expression or even histopathological alterations were evident, confirming urinary clusterin as a sensitive, non‐invasive marker for renal injury. Although changes in urinary lipocalin‐2 occurred very early after proximal tubule damage, lipocalin‐2 may not specific for kidney injury. However, its rapid response to inflammation and tissue damage in general may reinforce its use in routine toxicity testing. A dose‐ and time‐dependent increase in most of the novel urinary biomarkers was evident using the “WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2”. Due to the the variable sensitivity of a single biomarker, a combination of many different biomarkers to detect kidney injury appears to be useful. Concerning of the easy sampling and measurement, the additional determination of potential urinary biomarkers of nephrotoxcity next to the traditional clinical chemistry parameters and histopathological changes is helpful to identify kidney damage at early time‐points. KW - Biomarker KW - Nephrotoxizität KW - Niere KW - biomarker KW - nephrotoxicity KW - kidney Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562 ER - TY - THES A1 - Sumski, Anna Magdalena T1 - Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen T1 - Adenosine receptors in cervical, uterine and breast cancer cells N2 - Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen Körperzellen exprimiert und übernehmen dort vielfältige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und – je nach Subtyp – mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. In dieser Arbeit wurden Gebärmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und mögliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antikörper bis heute nicht verfügbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gewählt. In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-tät besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu können. Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis. Im durchgeführten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen änderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen stärkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. Freies extrazelluläres Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin können diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unverändert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, lässt aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren könnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, könnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tatsächlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. Mög-licherweise würden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen. Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollständig zu verstehen und möglicherweise für die Krebstherapie nutzbar zu machen. N2 - In this thesis, cell lines from cervical, endometrial and triple-negative breast cancer were investigated for expression and putative functions of adenosine receptors. Due to the lack of specific antibodies, a pharmacological approach using subtype-specific agonists and antagonists was taken. Radio ligand binding assays showed that adenosine receptors of the A1 subtype are expressed by SiHa cervical cancer and by HCC1806 breast cancer cells. Receptors of the A1 and A2A subtype are expressed by the endometrial cancer cell lines Ishikawa and HEC-1-A. A3 adenosine receptors could not be detected in any of the 5 investigated cell lines and the presence of receptors of the A2B subtype cannot be assessed with the available ligands. However, while the majority of the cell lines expressed adenosine receptors, a significant effect of adenosine receptor stimulation on adenylylcyclase activity was only detected in HEC-1-A cells. In crystal violet assays, high concentrations (100 µM) of adenosine showed a proapoptotic effect in Ishikawa- and HEC-1-A cells. The proliferation rate as measured by BrdU uptake was not affected by adenosine. The metabolically more stable adenosine receptor agonist NECA (in combination with ADA) had, in contrast, a stronger impact on the rate of apoptosis in the respective cell lines. Moreover, NECA also reduced BrdU uptake. Using various chemotherapeutics and death ligands, no synergy was observed between stimulation of adenosine receptors and further death stimuli. Free extracellular adenosine can also be generated from ATP when cells express the ectonucleotidases CD39 and CD73. Due to the immunosuppressive effect of adenosine, these enzymes can inhibit T cell and NK cell responses in the tumor microenvironment. Flow cytometry, however, showed that expression of CD39 and/or CD73 remained unaltered after stimulation of adenosine receptors. Thus, further investigations will be required to reveal the functional role of adenosine receptor expression on the investigated tumor cell lines. KW - Adenosinrezeptor KW - Rezeptor KW - Adenosin KW - Gebärmutterhalskrebs KW - Brustkrebs KW - Liganden KW - Adenylatcyclaseassay KW - FACS KW - Bindungsassay KW - BrdU Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332 ER - TY - THES A1 - Fazeli, Gholamreza T1 - Signaling in the induction of genomic damage by endogenous compounds T1 - Signalwege bei der Induktion von Genomschäden durch endogene Substanzen N2 - Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated in cells and are involved in physiological processes including signal transduction but also their damaging effects on biological molecules have been well described. A number of reports in the literature implicate excessive oxidative stress and/or inadequate antioxidant defense in the pathogenesis of cancer, atherosclerosis, chronic and age related disorders. Several studies have indicated that activation of the renin-angiotensin-aldosterone-system can lead to the formation of ROS. Epidemiological studies have revealed higher renal cell cancer incidences and also higher cancer mortalities in hypertensive individuals. Recently, our group has shown that perfusion of the isolated mouse kidney with Ang II or treatment of several cell lines with Ang II leads to formation of DNA damage and oxidative base modifications. Here, we tried to scrutinize the pathway involved in genotoxicity of Ang II. We confirmed the genotoxicity of Ang II in two kidney cell lines of human origin. Ang II treatment led to the production of superoxide anions which we could hinder when we used the membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic TEMPOL. One of the enzymes which is activated in the cells after Ang II treatment and is able to produce ROS is NADPH oxidase. We demonstrated the activation of NADPH oxidase in response to Ang II by upregulation of its p47 subunit using RT-PCR. Also, pPhosphorylation of p47 subunit of NADPH oxidase after Ang II treatment was enhanced. Using two inhibitors we showed that NADPH oxidase inhibition completely prevents DNA damage by Ang II treatment. To differentiate between Nox2 and Nox4 isoforms of NADPH oxidase subunits in the genotoxicity of Ang II, we performed siRNA inhibition and found a role only for Nox4, while Nox2 was not involved. Next, we investigated PKC as a potential activator of NADPH oxidase. We showed that PKC becomes phosphorylated after Ang II treatment and also that inhibition of PKC hinders Ang II from damaging the cells. Our results from using several inhibitors of different parts of the pathway revealed that PKC activation in this pathway is dependent on the action of PLC on membrane phospholipids and production of IP3. IP3 binds to its receptor at endoplasmic reticulum (ER), opening a channel which allows calcium efflux into the cytoplasm. In this manner, both ER calcium stores and extracellular calcium cooperate so that Ang II can exert its genotoxic effect. PLC is activated by AT1R stimulation. We could also show that the genotoxicity of Ang II is mediated via AT1R signaling using the AT1R antagonist candesartan. In conclusion, here we have shown that Ang II is able to damage genomic damage in cell lines of kidney origin. The observed damage is associated with production of ROS. A decrease in Ang II-induced DNA damage was observed after inhibition of G-proteins, PLC, PKC and NADPH oxidase and interfering with intra- as well as extracellular calcium signaling. This leads to the following preliminary model of signaling in Ang II-induced DNA damage: binding of Ang II to the AT1 receptor activates PLC via stimulation of G-proteins, resulting in the activation of PKC in a calcium dependent manner which in turn, activates NADPH oxidase. NADPH oxidase with involvement of its Nox4 subunit then produces reactive oxygen species which cause DNA damage. Dopamine content and metabolism in the peripheral lymphocytes of PD patients are influenced by L-Dopa administration. The PD patients receiving a high dose of L-Dopa show a significantly higher content of dopamine in their lymphocytes compared to PD patients who received a low dose of L-Dopa or the healthy control. Central to many of the processes involved in oxidative stress and oxidative damage in PD are the actions of monoamine oxidase (MAO), the enzyme which is responsible for the enzymatic oxidation of dopamine which leadsing to production of H2O2 as a by-product. We investigated whether dopamine oxidation can cause genotoxicity in lymphocytes of PD patents who were under high dose L-Dopa therapy and afterward questioned the occurrence of DNA damage after dopamine treatment in vitro and tried to reveal the mechanism by which dopamine exerts its genotoxic effect. The frequency of micronuclei in peripheral blood lymphocytes of the PD patients was not elevated compared to healthy age-matched individuals, although the formation of micronuclei revealed a positive correlation with the daily dose of L-Dopa administration in patients who received L-Dopa therapy together with dopamine receptor agonists. In vitro, we describe an induction of genomic damage detected as micronucleus formation by low micromolar concentrations in cell lines with of different tissue origins. The genotoxic effect of dopamine was reduced by addition of the antioxidants TEMPOL and dimethylthiourea which proved the involvement of ROS production in dopamine-induced DNA damage. To determine whether oxidation of dopamine by MAO is relevant in its genotoxicity, we inhibited MAO with two inhibitors, trans-2-phenylcyclopropylamine hydrochloride (PCPA) and Ro 16-6491 which both reduced the formation of micronuclei in PC-12 cells. We also studied the role of the dopamine transporter (DAT) and dopamine type 2 receptor (D2R) signaling in the genotoxicity of dopamine. Inhibitors of the DAT, GBR-12909 and nomifensine, hindered dopamine-induced genotoxicity. These results were confirmed by treatment of MDCK and MDCK-DAT cells, the latter containing the human DAT gene, with dopamine. Only MDCK-DAT cells showed elevated chromosomal damage and dopamine uptake. Although stimulation of D2R with quinpirole in the absence of dopamine did not induce genotoxicity in PC-12 cells, interference with D2R signaling using D2R antagonist and inhibition of G-proteins, phosphoinositide 3 kinase and extracellular signal-regulated kinases reduced dopamine-induced genotoxicity and affected the ability of DAT to take up dopamine. Furthermore, the D2R antagonist sulpiride inhibited the dopamine-induced migration of DAT from cytosol to cell membrane. Overall, the neurotransmitter dopamine causes DNA damage and oxidative stress in vitro. There are also indications that high dose L-Dopa therapy might lead to oxidative stress. Dopamine exerts its genotoxicity in vitro upon transport into the cells and oxidization oxidation by MAO. Transport of dopamine by DAT has the central role in this process. D2R signaling is involved in the genotoxicity of dopamine by affecting activation and cell surface expression of DAT and hence modulating dopamine uptake. We provided evidences for receptor-mediated genotoxicity of two compounds with different mechanism of actions. The involvement of these receptors in many human complications urges more investigations to reveal whether abnormalities in the endogenous compounds-mediated signaling can play a role in the initiation of new conditions like carcinogenesis. N2 - Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden kontinuierlich in Zellen generiert und sind an physiologischen Prozessen wie der Signaltransduktion beteiligt. Aber auch ihre schädigenden Auswirkungen auf biologische Moleküle sind seit langem bekannt. Eine Reihe von Literaturberichten sieht einen Zusammenhang zwischen übermäßigem oxidativen Stress oder einer unzureichenden antioxidativen Verteidigung und Krebs, Atherosklerose und chronischen bzw. altersbedingten Erkrankungen. Mehrere Studien haben belegt, dass die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems zur Bildung von ROS führen kann. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Nierenkarzinom-Inzidenzen und -Mortalitäten bei Hypertonikern erhöht sind. Vor kurzem konnte unsere Gruppe zeigen, dass die Perfusion von isolierten Maäusen-Nieren und dieoder Behandlung mehrerer Zelllinien mit Angiotensin II (Ang II) zur Bildung von DNA-Schäden und oxidativen Basenmodifikationen führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Signalwege der Genotoxizität von Ang II zu bestimmen. Wir bestätigten dDie Genotoxiziät von Ang II in zwei Nieren-Zelllinien humaner Herkunft konnte bestätigt werden. Wir zeigten, dass Ang II-Behandlung zur Produktion von Superoxid-Anionen führt, die durch das membrangängige Superoxid-Dismutase-Mimetikum TEMPOL verhindert werden kann. Eines der Enzyme, das in den Zellen nach Ang II-Behandlung aktiviert wird und ROS produzieren kann, ist die NADPH-Oxidase. Die mittels RT-PCR gemessene Hochregulierung von p47 beweist die Aktivierung der NADPH-Oxidase nach Ang II-Behandlung. Auch die Phosphorylierung von p47 nach Ang II-Behandlung wurde gesteigert. Mittels zweier Inhibitoren zeigten wir, dass NADPH-Oxidase-Hemmung DNA-Schäden durch Ang II-Behandlung vollständig verhindert. Wir versuchten, die Rolle der Nox2- und Nox4-Isoformen der NADPH-Oxidase-Untereinheiten bei der Genotoxizität von Ang II zu differenzieren. Hemmung mittels siRNA bestätigte nur eine Beteiligung der Nox4. Anschließend überprüften wir die Rolle der PKC als potentiellem Aktivator der NADPH-Oxidase. Wir zeigten, dass die PKC nach Ang II-Behandlung PKC phosphoryliert wird und durch die Hemmung der PKC Ang II-induzierten Schäden verhindert werdenird. Die Verwendung mehrerer Inhibitoren der verschiedenen Teile des Signalweges zeigte, dass die PKC-Aktivierung von der Reaktion der PLC mit Membranphospholipiden und der Produktion von IP3 und DAG abhängig ist. IP3 bindet an seinen Rezeptor am Endoplasmatischen Retikulum (ER)., dDie in der Folge auftretende Öffnung eines Kanals ermöglicht einen Calcium-Ausstrom in das Cytoplasma. Auf diese Weise sind sowohl ER-Calcium als auch extrazelluläres Calcium an der Ang II-induzierten genotoxische Wirkung beteiligt. PLC wird durch AT1R-Stimulation aktiviert. Wir konnten mit Hilfe des AT1R-Antagonisten Candesartan auch zeigen, dass die Genotoxizität von Ang II über AT1R-Signaltransduktion vermittelt wird. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Ang II genomische Schäden in humanen Nieren-Zelllinien verursacht. Die Schäden sind mit der Produktion von ROS verbunden. Eine Reduktion der Ang II-induzierten DNA-Schäden wurde nach Hemmung vonder G-Proteinen, der PLC, PKC und NADPH-Oxidase und Beeinflussung intra- sowie extrazellulärer Calium-Signalgebung gezeigt. Dies führt zu folgendem vorläufigen Modell der Signaltransduktion der von Ang II-induzierten DNA-Schäden: Die Bindung von Ang II an den AT1-Rezeptor aktiviert die PLC durch Stimulationerung der G-Proteine und die PKC in Calcium-abhängiger Weise, dies wiederum aktiviert die NADPH-Oxidase. Die NADPH Oxidase unter Beteiligung ihrerseiner Nox4-Untereinheit erzeugt dann reaktive Sauerstoffspezies, die DNA-Schäden verursachen. Dopamingehalt und -stoffwechsel in peripheren Lymphozyten von Parkinson-Patienten werden durch L-Dopa-Gabe beeinflusst. Die Patienten, die eine hohe Dosis L-Dopa erhalten, zeigen einen signifikant höheren Gehalt an Dopamin in den Lymphozyten im Vergleich zu Patienten, die eine niedrige Dosis L-Dopa erhalten oder der gesunden Kontrollgruppe. Im Mittelpunkt vieler Prozesse bei der Entstehung von oxidativem Stress und oxidativer Schäden bei Parkinson-Patienten steht die Monoaminoxidase (MAO), die für die enzymatische Oxidation von Dopamin und in der Folge für die Entstehung von H2O2 verantwortlich ist. Wir untersuchten, ob die Oxidation von Dopamin genotoxische Wirkung in Lymphozyten von Parkinson-Patienten mit hochdosierter L-Dopa-Therapie induzieren kann. Danach überprüftenfragten wir, ob die Behandlung mit Dopamin in vitro DNA-Schäden induzieren kann und versuchten aufzuzeigen, durch welchen Mechanismus Dopamin seine genotoxische Wirkung entfaltet. Die Häufigkeit von Mikrokernen in peripheren Lymphozyten der Parkinson-Patienten war nicht erhöht im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe, allerdings zeigte die Mikrokernfrequenz eine positive Korrelation mit der täglichen L-Dopa-Dosis bei Patienten, die eine L-Dopa-Therapie zusammen mit einem Dopamin-Rezeptor-Agonisten erhielten. In vitro beobachteten wir bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen eine Induktion des genomischen Schadens in Zelllinien, die aus verschiedenen Geweben stammten. Die genotoxische Wirkung von Dopamin wurde durch Zugabe der Antioxidantien TEMPOL und DMTU reduziert, wodurch die Beteiligung von ROS gezeigt werden konnte. Um festzustellen, ob die Oxidation von Dopamin durch MAO für die Genotoxizität relevant ist, hemmten wir MAO mit zwei Inhibitoren, trans-2-Phenylcyclopropylamin-Hydrochlorid (PCPA) und Ro 16-6491, die beide die Bildung von Mikrokernen in PC-12-Zellen reduzieren konnten. Wir untersuchten auch die Rolle des Dopamin-Transporters (DAT) und Dopamin-Typ-2-Rezeptor (D2R)-assoziierter Signalwege in der Genotoxizität von Dopamin. Die Inhibitoren des DAT, GBR-12909 und Nomifensin verhinderten die Dopamin-induzierte Genotoxizität. Diese Ergebnisse wurden durch Behandlung von MDCK- und MDCK-DAT- Zellen (die das humane DAT-Gen besitzen) mit Dopamin bestätigt. Nur MDCK-DAT-Zellen zeigten erhöhte chromosomale Schäden und Dopaminaufnahme. Obwohl die Stimulation mit dem D2R-Rezeptor-Agonisten Quinpirol in Abwesenheit von Dopamin keine Genotoxizität in PC-12-Zellen induzierte, reduzierten sowohl ein D2R-Antagonist, wie auch Inhibitoren des in der Signalkaskade involvierten G-Proteins, der Phosphoinositol-3-Kinase und der extrazellulären signalregulierten Kinasen die Aufnahme von Dopamin mittels DAT und die Dopamin-vermittelte Genotoxizität. Der D2R-Antagonist Sulpirid hemmte die Dopamin-induzierte Migration von DAT aus dem Cytosol zur Zellmembran. Insgesamt verursacht der Neurotransmitter Dopamin DNA-Schäden und oxidativen Stress in vitro. Es gibt Hinweise, dass eine hochdosierte L-Dopa-Therapie zu oxidativem Stress führt. In vitro führt Dopamin zu Genotoxizität durch den Transport in die Zellen und Oxidation durch MAO. Der Transport von Dopamin durch DAT spielt eine zentrale Rolle in diesem Prozess. Die D2R-Signalwege sind an der Genotoxizität von Dopamin durch Auswirkung auf die Aktivierung und Membranexpression von DAT und damit der Dopaminaufnahme beteiligt. KW - Angiotensin II KW - Mutagenität KW - DNS-Schädigung KW - DNA-Schaden KW - Genotoxizität KW - genotoxicity KW - DNA damage Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55634 ER - TY - JOUR A1 - Marinovich, M. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Covalent binding of aflatoxin B\(_1\) to liver DNA in rats pretreated with ethanol JF - Experientia N2 - Male Fischer F-344 rats were given ethanol in the drinking water and/or by single oral administration. Following this, the animals received p.o. 100 ng/kg of the hepatocarcinogen eHJaflatoxin BI (AFBI)' 24 h later, the level of DNA-bound AFBI was determined in the liver and was found not to be affected by any type of ethanol pretreatment. A cocarcinogenic effect of ethanol in the liver is therefore unlikely to be due to an effect on the metabolic activation and inactivation processes governing the formation of DNA-binding AFBI metabolites. KW - Toxikologie KW - Carcinogenesis KW - DNA KW - covalent binding KW - aflatoxin KW - ethanol Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55237 VL - 41 IS - 10 SP - 1338 EP - 1340 ER - TY - THES A1 - Vidal, Marie T1 - b-adrenergic receptors and Erk1/2-mediated cardiac hypertrophy T1 - b-adrenerge Rezeptoren und Erk1/2-vermittelte Herzhypertrophie N2 - Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus für kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso führt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten Mäusen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings führt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellulär-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 führt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche für die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in Mäusen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung führt. Darüberhinaus führte die Überexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden können, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im Mäusen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-wöchige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikuläre Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tatsächlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. Während die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, führt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer möglicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen. N2 - b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Herzhypertrophie KW - MAP-Kinase KW - adrenerge Rezeptoren KW - Herzhypertrophie KW - Erk1/2 KW - adrenergic receptors KW - cardiac hypertrophy KW - Erk1/2 Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83671 ER - TY - JOUR A1 - Jesaitis, A. J. A1 - Klotz, Karl-Norbert T1 - Cytoskeletal regulation of chemotactic receptors: Molecular complexation of N-formyl peptide receptors with G proteins and actin N2 - Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process. It involves direct interaction of receptors with heterotrimeric G-proteins and may be under thc control of cytoskeletal clemcnts. Evidencc exists suggesting that thc cytoskeleton and/or the membrane ske1eton determines the distribution of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling FPR accessibility to different protcins in functionally distinct membrane domains. In desensitized cells, FPR are restricted to domains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inacccssible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. We are investigating the molecular basis for the interaction of FPR with the membrane skeleton, and our results suggest that FPR, and possibly other receptors, may directly bind to cytoskeletal proteins such as actin. KW - Immunologie KW - chemotaxis KW - formyl peptides KW - receptors KW - actin KW - G proteins KW - cytoskeleton KW - membrane skeleton Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79673 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. T1 - Dosis-Wirkungs-Beziehungen in der chemischen Kanzerogenese T1 - Dose-response relations in chemical carcinogenesis N2 - Ich habe versucht darzulegen, daß mechanistische Überlegungen zur Extrapolation der Dosis-WirkungsBeziehung herangezogen werden können. Ein nichtlinearer Verlauf ist nicht nur bei den epigenetischen Kanzerogenen wahrscheinlich, sondern auch bei den DNA-bindenden. Echte Schwellen sind aber nur in solchen Fällen zu erwarten, wo kein endogenes Korrelat besteht. Immerhin können auch steile Nichtlinearitäten zu einer drastischen Risikoreduktion führen, so daß die Anstrengungen dahin gehen sollten, die Steigung und den Bereich des überproportionalen Abfalls experimentell zu zeigen. In einer heterogenen Population kann die 0 0- sis-Wirkungs-Kurve zusätzliche "Wellen" bekommen und wird dadurch grundsätzlich flacher. Im Extremfall ergibt sich eine lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung unabhängig vom Wirkmechanismus des Kanzerogens. Diese Proportionalität zwischen tiefster Dosis und Effekt wird bei genotoxischen Kanzerogenen aus mechanistischen Gründen schon für eine homogene Population postuliert, doch kann dies in einer heterogenen Population auch bei epigenetischen Kanzerogenen in Frage kommen. KW - Toxikologie Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80046 ER - TY - CHAP A1 - Sagelsdorff, P. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Sensitivity of DNA and nucleotides to oxidation by permanganate and hydrogen peroxide N2 - no abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80062 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. T1 - Quantitative evaluation of DNA-binding data in vivo for low-dose extrapolations N2 - no abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80079 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. T1 - Structural characteristics of compounds that can be activated to chemically reactive metabolites: use for a prediction of a carcinogenic potential N2 - Many mutagens and carcinogens act via covalent interaction of metabolic intermediates with DNA in the target cell. This report groups those structural elements which are often found to form the basis for a metabolism to such chemically reactive metabolites. ~mpounds which are chemically reactive per se and which do not require metabolic activation form group 1. Group 2 compri~es of olefins and aromatic hydrocarbons where the oxidation via an epoxide can be responsible for the generation of reactive species. Aromatic amines, hydrazines, and nitrosamirres form group 3 requiring an oxidation of a nitrogen atom or of a carbon atom in alpha position to a nitrosated amine. Group 4 compounds are halogenated hydrocarbons which can either give rise to radicals or can form an ·olefin (group 2) upon dehydrohalogenation. Group 5 compounds depend upon some preceding enzymatic activity either not available in the target cell or acting on positions in the molecule which are not directly involved in the subsequent formation of electrophilic atoms. Examples for each group are taken from the "List of Chemieals and Irrdustrial Processes Associated with Cancer in Humans" as compiled by the International Agency for the Research on Cancer, and it is shown that 91% of the organic carcinogens would have been detected on the basis of structural elements characteristic for group 1-5. As opposed to this very high sensitivity, the specificity ( the true negative fraction) of using this approach as a short-term test for carcinogenicity is shown to be bad because detoxification pathways have so far not been taken into account. These competing processes are so complex, however, that either only very extensive knowledge about pharmacokinetics, stability, and reactivity will be required or that in vivo systems have to be used to predict, on a quantitative basis, the darnage expected on the DNA. DNA-binding experiments in vivo are presented with benzene and toluene to demonstrate one possible way for an experimental assessment and it is shown that the detoxification reaction at the methyl group available only in toluene gives rise to a reduction by at least a factor of forty for the binding to rat liver DNA. This quantitative approach available with DNA-binding tests in vivo, also allows evaluation as to whether reactive metabolites and their DNA binding are always the most important single activities contributing to the overall carcinogenicity of a chemical. With the example of the livertumor inducing hexachlorocyclohexane isomers it is shown that situations will be found where reactive metabolites are formed and DNA binding in vivo is measurable but where this activity cannot be the decisive mode of carcinogenic action. It is concluded that the lack of structural elements known to become potentially reactive does not guarantee the lack of a carcinogenic potential. KW - Toxikologie KW - Structureactivity relationship KW - Reactive intermediates KW - Metabolic activation KW - DNA Binding KW - Covalent binding index KW - Carcinogens KW - Benzene Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80105 ER - TY - THES A1 - Emami-Nemini, Alexander Darius T1 - Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins T1 - Steuerung differenzieller Signalgebung des Parathormon Rezeptors durch Adapterproteine N2 - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR. N2 - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) reguliert eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, was sie bedeutend für die Pharmakotherapie macht. Eingebettet in die Zytoplasmamembran sind GPCRs das Zentrum von Signalkomplexen, die eine Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen ermöglichen. Der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor (PTHR) aktiviert Adenylyl-Zyklasen-, Phospholipasen Cβ- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-abhängige Signalwege, wodurch endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-ähnlichen Peptides (PTHrP) vermittelt werden. Dies ermöglicht die Regulation der Calcium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Knochenentwicklung. Paradoxerweise kann PTH sowohl katabole als auch anabole Effekte auf den Knochenstoffwechsel induzieren. Den anabolen Effekt von PTH nutzt man erfolgreich in der Therapie der schweren Osteoporose. Ob ein anaboler oder kataboler Knochenmetabolismus überwiegt, wird durch zeitliche und Zelltyp-spezifische Faktoren bestimmt. Dem zugrunde liegt vermutlich unter anderem eine differenzielle Anordnung verschiedener Adapterproteine innerhalb der Signalkomplexe, die zur differenziellen Aktivierung von Signalwegen führen und so eine Steuerung bestimmter physiologischer Effekte ermöglichen. Die molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unklar, weshalb großes Interesse besteht, ein besseres Verständnis über die PTHR-assoziierten Adapterproteine zu entwickeln. Zur Identifizierung neuer Adapterproteine, die PTHR-Signalwege beeinflussen, wurde in dieser Arbeit ein auf dem Proteom-basierender Screening-Ansatz entwickelt. Dieser führte zur Entdeckung einer Interaktion von intrazellulären Domänen des PTHR mit vav2, einem Guanin-Nukleotid Austauschfaktor (GEF) für kleine GTPasen, der die Zytoskelett-Reorganisation steuert. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass vav2 über kompetitive Interaktionen mit G Protein αq Untereinheiten PTH-vermittelte Phospholipase Cβ (PLCβ)-abhängige Signalwege beeinflusst. Umgekehrt wurde gezeigt, dass PTH die Phosphorylierung und damit die GEF Aktivität von vav2 reguliert. Diese Befunde können Aufschluss über molekulare Mechanismen geben, die den Wirkungen von PTH auf den Knochenstoffwechsel durch PLC-Signalwege, Zellmigration und Zytoskelett-Reorganisation zugrunde liegen. Neben dem Verständnis über molekulare Prozesse der intrazellulären Signalgebung ist die Suche nach Liganden eine herausfordernde Grundvoraussetzung für die aktuelle Arzneistoffentwicklung. Liganden-Bindungs-Experimente stellen dafür elementare Techniken dar. Zur Substitution kostenintensiver und potentiell gesundheitsschädlicher Radioliganden-Bindungen, wurden in dieser Arbeit Fluoreszenz-basierte Liganden-Bindungs-Experimente für den PTHR entwickelt. Basierend auf Zeit-aufgelöster Fluoreszenz wurden mehrere Varianten dieser Experimente etabliert, um die Arzneistoffentwicklung am PTHR zu unterstützen. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Parathormon KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Parathormon KW - vav2 KW - Guanin Nukleotid Austauschfaktor KW - G protein coupled receptor KW - parathyroid hormone KW - vav2 KW - guanine nucleotide exchange factor KW - Guaninnucleotid-Austauschfaktoren Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369 ER - TY - JOUR A1 - Caviezel, M. A1 - Aeschbach, A. P. A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, C. T1 - Reduction of covalent binding of aflatoxin B1 to rabbit liver DNA after immunization against this carcinogen N2 - The covalent binding of [3H]aflatoxin B1 (AF) to liver DNA was determined, 6 h after oral administration to male rabbits. A Covalent Binding Index, CBI (flmol AF/mol DNA-P)/(mmol AF/kg b. w.) = 8,500 was found. Pretreatment of rabbits with AF coupled to bovine serum albumin in Freund's adjuvant led to the production of AF-directed antibodies. Administration of [3H]AF to such immunized rabbits resulted in a CJH of only 2,500, i.e., the iiDJ{.lUnization provided a protection by a factor of more than 3. Although this is encouraging evidence for the potential of active immunization against genotoxic carcinogens, a nurober of pointswill have to be clarified, such as the time course for the DNA binding and the question of a possible shift to other target cells. KW - Krebs KW - DNA KW - Aflatoxin KW - Cancer prevention KW - Carcinogen KW - Covalent binding KW - DNA KW - Immunization Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80116 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, C. T1 - In vivo covalent binding of chemicals to DNA as a short-term test for carcinogenicity N2 - The determination of a covalent binding of radioactive chemieals to DNA in intact mammalian organisms is proposedas a short-term test for carcinogenicity. The effectiveness of covalent binding to rat liver DNA correlates well with the hepatocarcinogenicity known from long-term bioassays. The binding indices range over more than five orders of rriagnitude between the strongest hepatocarcinogen aflatoxin B 1 and the limit of detection of a binding with 100 f-LCi 14C-labelled chemical. The order of magnitude of binding is therefore a surprisingly good quantitative measure for carcinogenicity. The pattern of DNA binding sites is important especially for small alkylating agents where the determination of total binding might indicate a higher carcinogenic potency than is actually observed. KW - DNA KW - DNA-Binding KW - Carcinogen KW - Short-term Carcinogenicity Test KW - Aflatoxin KW - Toluene KW - Tritiated Water Y1 - 1979 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80127 ER - TY - THES A1 - Müller, Markus T1 - Effekte kardioprotektiver Zyklopeptide auf Funktion und Morphometrie des Herzens im Rattenmodell der dilatativen Immunkardiomyopathie T1 - Effects of cardioprotective cyclopeptides on cardiac function and morphometry in the rat model of dilated immune cardiomyopathy N2 - Kardiomyopathien sind Erkrankungen des Herzmuskels, die mit einer kardialen Funktionsstörung einhergehen. Formen, die ohne erkennbare Ursache zu einer progredienten Dilatation und Reduktion der Kontraktilität des linken Ventrikels führen, werden als idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) bezeichnet. Sie ist der Hauptgrund für schwere Herzinsuffizienz und die damit assoziierten Einschränkungen der Lebensqualität bei jungen Erwachsenen. Neben der beeinträchtigten kardialen Funktion weisen diese Patienten oftmals auch Veränderungen im Bereich der humoralen und zellulären Immunität auf. Ein Teil der Patienten entwickelt Autoantikörper, die sich gegen den kardialen β1-adrenergen Rezeptor richten und ihn ähnlich wie der natürliche Ligand Adrenalin aktivieren. Hieraus resultiert eine chronische Überstimulation des Rezeptors, die über eine initiale Hypertrophie dann zu einer eingeschränkten Pumpfunktion führt. Nachdem sich die Therapie der Antikörper-vermittelten Immunkardiomyopathie bisher auf die Behandlung der Herzinsuffizienz und die Kontrolle der Herz-insuffizienzsymptome beschränkt, könnten β1-ECII-homologe Peptide als Antikörper-Fänger bei Antikörper-positiven Patienten nun einen kausalen Therapieansatz darstellen. In diesem Zusammenhang wurden ein aus 25 Aminosäuren bestehendes zyklisches Peptid, eine aus 18 Aminosäuren bestehende Zyklopeptid-Mutante und ihre jeweiligen linearen Äquivalente im Rattenmodell auf Antikörper-neutralisierende Effekte und potentielle therapeutische Wirksamkeit getestet. Das Rattenmodell ist hierfür besonders geeignet, da die Aminosäuresequenz der funktionell wichtigen zweiten extrazellulären Domäne des β1-adrenergen Rezeptors (β1-ECII) bei Mensch und Ratte absolut identisch ist. Auf immunologischer Ebene konnte der Titer der krankheitsinduzierenden β1-ECII-Antikörper bereits nach der ersten Applikation zyklischer Peptide relevant gesenkt werden und nahm im weiteren Verlauf der Behandlung kontinuierlich ab. Nach Zyklopeptidgabe kam es am Herzen zu einer Reduktion des linksventrikulären Durchmessers und zu einer fast vollständigen Normalisierung der anatomischen Proportionen. Auf die Morphologie der Myozyten selbst und auch den Kollagengehalt des Gewebes hatte die Zyklopeptidtherapie keinen wesentlichen Einfluss. Die funktionellen Eigenschaften des Herzens ließen sich durch die Neutralisation stimulatorischer β1-ECII-Antikörper mittels intravenöser Zyklopeptidapplikation deutlich verbessern: Die Verkürzungsfraktion des linken Ventrikels und der Herzindex als Parameter für die kardiale Leistungsfähigkeit konnten durch die Behandlung wieder weitgehend normalisiert werden. Diese im Tiermodell erzielten Ergebnisse lassen einen therapeutischen Effekt der Zyklopeptide vermuten. Der Ansatz einer spezifisch gegen Antikörper gerichteten Therapie zur Behandlung von Patienten mit β1-Antikörper-positiver Herzinsuffizienz erscheint daher vielversprechend. N2 - Cardiomyopathies are disorders of the heart with particular morphological and physiological characteristics. Cardiomyopathies with unknown origin resulting in progressive left ventricular dilatation and reduced cardiac contractility are named idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). It is the most common cause of heart failure with its associated severe limiting symptoms in young adults. Besides the compromised cardiac function, those patients frequently also exhibit alterations in the humoral and cellular immunity. Some of them develop autoantibodies targeting and activating the cardiac β1-adrenergic receptor similar to its natural ligand epinephrine with a subsequent chronic overstimulation and a decline in left ventricular contractile function. Since the therapy of antibody mediated immune cardiomyopathy has been restricted to the treatment of the heart failure and its concomitant symptoms β1-ECII homologous peptides may constitute a new approach by neutralizing harmful antibodies. Therefore, a 25 amino acid cyclic peptide, a 18 amino acid cyclic peptide mutant, and their linear equivalents were tested for antibody scavenging and potential therapeutic effects in the rat. The rat model was chosen because the amino acid sequence of the functionally important second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (β1-ECII) is completely homologous between human and rat. In contrast to linear peptides, cyclic peptides significantly reduced the β1-ECII antibody titer despite continuous immunization with the disease inducing antigen. Cyclopeptides also achieved a nearly complete restitution of the left ventricular proportions without a significant change in cardiomyocyte morphology or collagen content. In addition, important cardiac parameters such as fractional shortening and cardiac index were clearly improved. The results obtained suggest a therapeutic effect of the applied cyclopeptides. Thus, epitope mimicking cyclic antibody scavengers may open up new perspectives in the treatment of β1-antibody positive heart failure in humans. KW - Dilatative Kardiomyopathie KW - Immunkardiomyopathie KW - Autoimmunerkrankung KW - Peptidtherapie KW - Zyklopeptid Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101935 ER - TY - JOUR A1 - Kannen, Vinicius A1 - Hintzsche, Henning A1 - Zanette, Dalila L. A1 - Silva Jr., Wilson A. A1 - Garcia, Sergio B. A1 - Waaga-Gasser, Anna Maria A1 - Stopper, Helga T1 - Antiproliferative Effects of Fluoxetine on Colon Cancer Cells and in a Colonic Carcinogen Mouse Model N2 - The antidepressant fluoxetine has been under discussion because of its potential influence on cancer risk. It was found to inhibit the development of carcinogen-induced preneoplastic lesions in colon tissue, but the mechanisms of action are not well understood. Therefore, we investigated anti-proliferative effects, and used HT29 colon tumor cells in vitro, as well as C57BL/6 mice exposed to intra-rectal treatment with the carcinogen N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) as models. Fluoxetine increased the percentage of HT29 cells in the G0/G1 phase of cell-cycle, and the expression of p27 protein. This was not related to an induction of apoptosis, reactive oxygen species or DNA damage. In vivo, fluoxetine reduced the development of MNNG-induced dysplasia and vascularization-related dysplasia in colon tissue, which was analyzed by histopathological techniques. An anti-proliferative potential of fluoxetine was observed in epithelial and stromal areas. It was accompanied by a reduction of VEGF expression and of the number of cells with angiogenic potential, such as CD133, CD34, and CD31-positive cell clusters. Taken together, our findings suggest that fluoxetine treatment targets steps of early colon carcinogenesis. This confirms its protective potential, explaining at least partially the lower colon cancer risk under antidepressant therapy. KW - Medizin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75879 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Tobias T1 - Biotransformation of trans‐1‐chloro‐3,3,3‐trifluoropropene and 2,3,3,3‐tetrafluoropropene T1 - Biotransformation von trans‐1‐Chlor‐3,3,3‐trifluorpropen und 2,3,3,3‐Tetrafluorpropen N2 - The novel refrigerant 2,3,3,3‐tetrafluoropropene (HFO‐1234yf) as well as the novel foam blowing and precision cleaning agent trans‐1‐chloro‐3,3,3‐trifluoropropene (trans‐HCFO‐1233zd) are both chlorofluorocarbon replacements with low GWPs and a short atmospheric life time. Whereas the hydrofluoroolefin HFO‐1234yf has no negative effect on stratospheric ozone due to the lack of chlorine in its structure, the hydrochlorofluoroolefine trans‐HCFO‐1233zd exhibits a very low potential for ozone depletion (ODP). This is approximately 100 times lower than the ozone depletion potential of precursor compounds such as 1,1,2‐trichloro‐1,2,2‐trifluoroethane (CFC‐113). Principle aims of this thesis were to investigate the unknown metabolism of the new solvent trans‐HCFO‐1233zd and to further investigate a possible biotransformation based toxicity of HFO‐1234yf observed in rabbits. Therefore study specimens of different in vitro and in vivo studies with trans‐HCFO‐1233zd and HFO‐1234yf were analyzed for metabolites using 19FNMR spectroscopy, LC‐MS/MS spectrometry and GC/MS spectrometry. Metabolites were identified by comparison with purchased or synthesized standard substances. Excretion kinetics of the predominant metabolites were determined by LC‐MS/MS quantification,inorganic fluoride was determined by potentiometry. Moreover cytochrome P‐450 2E1 and 3A4 liver enzyme activities were measured in a multi‐exposure study with HFO‐1234yf. ... N2 - Das neue Kühlmittel 2,3,3,3‐Tetrafluoropropen (HFO‐1234yf) und das neue Treib‐ und Reinigungsmittel trans‐1‐Chlor‐3,3,3‐trifluorpropen (trans‐HCFO‐1233zd) sind Chlorfluorkohlenstoff‐Ersatzstoffe mit sehr geringem Treibhauspotenzial und kurzer atmosphärischer Lebensdauer. Während HFO‐1234yf keinerlei negative Auswirkungen auf den Abbau der Ozonschicht hat, schädigt trans‐HCFO‐1233zd diese aufgrund eines Chloratoms in seiner Struktur. Durch die erhöhte Abbaurate von trans‐HCFO‐1233zd in niedrigeren Luftschichten, wird im Vergleich zu seinen Vorgängersubstanzen (z.B. 1,1,2‐Trichlor‐1,2,2‐trifluorethan, CFC‐113) jedoch ein weitaus geringerer Ozonabbau in der Stratosphäre gewährleistet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Metabolismus von HFO‐1234yf und trans‐HCFO‐1233zd in In‐vitro‐ und In‐vivo‐Versuchen charakterisiert. Hierfür wurde das gewonnene Probenmaterial mittels 19F‐NMR‐Spektroskopie, LC‐MS/MS‐Spektrometrie und GC/MSSpektrometrie auf Fluor‐Metabolite untersucht und diese durch Vergleichsmessungen mit Standardsubstanzen identifiziert. Die Quantifizierung der Hauptmetabolite und des anorganischen Fluorids in Urin und Plasma erfolgte mittels LC‐MS/MS‐Analyse bzw. mittels Potentiometrie. In einer Mehrfachexpositionsstudie mit HFO‐1234yf wurde zudem die Aktivität der Cytochrom‐P450‐Enzyme 3A4 und 2E1 in gewonnenem Leber‐ und Herzgewebe ermittelt. ... KW - Propenderivate KW - Chlorfluorkohlenstoffe KW - Ersatzstoff KW - FCKW-Ersatzstoffe KW - Biotransformation KW - In vitro KW - In vivo KW - Biotransformation KW - CFC replacements KW - halo olefines Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78579 ER - TY - THES A1 - Saxena, Ambrish T1 - Role of the novel protein tyrosine phosphatase AUM for cell adhesion T1 - Die Rolle des neuen Proteins "Tyrosin phosphatase" AUM für Zell-Adhäsion N2 - Cell adhesion and migration are essential for development and homeostasis. Adhesion to the extracellular matrix occurs at specialized plasma membrane domains where transmembrane adhesion receptors, signaling proteins such as kinases and phosphatases, and a large number of adaptor proteins interact with the cytoskeleton in a tightly regulated and synchronized fashion. Whereas altered cell adhesion and migration are known to be important in cardiovascular disease and malignant tumors, the target proteins and molecular interactions that regulate these complex processes still remain incompletely understood. Whereas numerous kinases are known to regulate cell adhesion dynamics, information about the involved protein phosphatases is still very limited. A newly emerging phosphatase family contains the unconventional active site sequence DXDX(T/V) and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases. Our laboratory has recently discovered AUM, a novel phosphatase that belongs to this poorly characterized enzyme family. Initial findings pointed toward a potential involvement of AUM in the regulation of cell adhesion to the extracellular matrix. The objective of the present study was to study the potential role of AUM in cell adhesion. We could show that cells stably depleted of AUM are characterized by accelerated adhesion on immobilized fibronectin. To confirm these findings, we used an siRNA-based approach for the acute depletion of AUM and observed a similar phenomenon. Rescue experiments were performed with stably AUM-depleted cells to ensure that the above mentioned effects are indeed AUM specific. We observed that the re-addition of AUM normalizes cellular adhesion kinetics on fibronectin. These results clearly show that AUM exerts important functions in cell-matrix adhesion. To investigate the molecular basis of these effects, we have characterized integrin expression patterns using flow cytometry. Interestingly, fibronectin-stimulated AUM-depleted cells are characterized by an increase in the cell surface expression of conformationally active 1-integrins. Consistent with the important role of 1-integrins in the regulation of RhoA activity, we also observed a specific increase in RhoA-GTP, but not Rac1-GTP-levels during cell adhesion to fibronectin. Consistent with these findings and with the important role of RhoA for focal adhesion maturation, AUM depleted cells showed more elongated and more centripetally oriented focal adhesions as compared to control cells when spread on fibronectin. Taken together, this study has revealed an important role of AUM for cell-matrix adhesion. Our findings strongly suggest that AUM functions as a negative regulator of 1-integrins and RhoA-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion. N2 - Die Adhäsion und Migration von Zellen auf extrazellulären Matrixmolekülen ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen. Die Adhäsion an extrazellulärer Matrix findet über spezialisierte Plasmamembran-Domänen statt, an denen transmembranäre Adhäsionsrezeptoren, Signalproteine wie Kinasen und Phosphatasen und eine große Anzahl von Adapterproteinen auf eng regulierte und synchronisierte Weise mit dem Zytoskelett interagieren. Während feststeht, dass Veränderungen der Zelladhäsion und Migration eine wichtige Rolle zum Beispiel bei kardiovaskulären Erkrankungen und bei metastasierenden Tumoren spielen, sind die Schlüsselmoleküle und Protein-Protein-Interaktionen, welche diese Prozesse regulieren immer noch unvollständig verstanden. Obwohl von zahlreichen Kinasen bekannt ist, dass sie die Zelladhäsions-Dynamik regulieren, existieren kaum Informationen über an diesen Prozessen beteiligte Phosphatasen. Seit Kurzem wird einer noch wenig charakterisierten Phosphatase-Familie mit der unkonventionellen Aminosäuresequenz DXDX(T/V) im aktiven Zentrum des Enzyms vermehrt Beachtung geschenkt. Diese Phosphatasen gehören zur Haloazid-Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen. Unserem Labor ist es kürzlich gelungen, eine neue Phosphatase aus dieser Enzymfamilie zu identifizieren. Erste Befunde aus unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, dass AUM möglicherweise an der Regulation der Zelladhäsion an extrazelluläre Matrixmoleküle beteiligt sein könnte. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die mögliche Rolle von AUM bei der Zelladhäsion genauer zu untersuchen. Es gelang uns zu zeigen, dass stabil AUM-shRNA exprimierende Zellen durch eine beschleunigte Adhäsion auf immobilisiertem Fibronektin gekennzeichnet sind. Um diese Befunde zu erhärten, wurde endogenes AUM mittels transienter Expression von siRNAs akut depletiert. Auch unter diesen Bedingungen konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der endogenen AUM-Proteinexpression die Zelladhäsion auf Fibronektin beschleunigt. Weiterhin wurden rescue-Experimente mit stabil AUM-depletierten Zellen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die oben genannten Effekte spezifisch sind. Dabei wurde beobachtet, dass die Re-Expression von AUM die zelluläre Adhäsionskinetik auf Fibronektin normalisiert. Diese Ergebnisse belegen eindeutig, dass AUM wichtige Funktionen bei der Zell-Matrix-Adhäsion erfüllt. Um die molekulare Grundlage dieser Effekte zu untersuchen, haben wir zunächst das zelluläre Integrin-Expressionsmuster mittels Durchflußzytometrie charakterisiert. Interessanterweise konnte nachgewiesen werden, dass Fibronektin-stimulierte, AUM-depletierte Zellen vermehrt 1-Integrine in ihrer aktiven Konformation auf der Zelloberfläche exprimieren. Übereinstimmend mit der wichtigen Rolle von 1-Integrinen für die Regulation der RhoA-Aktivität konnten wir auch eine spezifische Zunahme der RhoA-GTP, nicht aber der Rac1-GTP-Spiegel während der Zelladhäsion auf Fibronektin beobachten. Konsistent mit diesen Ergebnissen und der bekannten Rolle von RhoA für die Reifung fokaler Adhäsionen, zeigten AUM-depletierte Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen vermehrt elongierte und zentripetal orientierte fokale Adhäsionen. Zusammengenommen ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine wichtige Rolle von AUM bei der Zell-Matrix-Adhäsion aufzudecken. Unsere Befunde legen nahe, dass AUM im Rahmen der Zell-Adhäsion als ein negativer Regulator von 1-Integrinen und der RhoA-abhängigen Zytoskelett-Dynamik fungiert. KW - Proteintyrosinphosphatase KW - Zelladhäsion KW - Tyrosin phosphatase KW - Zell-Adhäsion KW - AUM KW - tyrosine phosphatase KW - AUM KW - cell adhesion Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65503 ER - TY - THES A1 - Schlipp [verh.: Wölfel], Angela T1 - Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with Förster resonance energy transfer microscopy T1 - Charakterisierung von anti-beta1-Adrenozeptor Antikörpern mittels Förster Resonanz Energie Transfer Mikroskopie N2 - Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. N2 - Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Beta-1-Rezeptor KW - Antikörper KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Adrenergic receptor KW - Beta-1-receptor KW - Antibodies KW - Fluorescence-resonance-energy-transfer KW - Dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162 ER - TY - JOUR A1 - Gonzalez-Calero, G. A1 - Cubero, A. A1 - Klotz, Karl-Norbert T1 - Characterization and photoaffinity labeling of A1 adenosine receptors in coated visicles form bovine brain N2 - The antagonist (3 II ) DPCPX exhi bitcd a Kd of 0. 4 nM at coalcd vcsicles from bovine brain. Agonist compelition for ( 3 11) DPCPX bind in~ revcaled two affini ty slales for gonists. The pholoaffinity probe I25 I -AHPIA specifically labelled a band with a molecular weight of 35 Kd. KW - Pharmakologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86004 ER - TY - THES A1 - Eman, Maher Othman Sholkamy T1 - In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage T1 - In vitro und in vivo Untersuchungen von Insulin-induzierten oxidativen Stress und DNA-Schäden N2 - Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial. N2 - Hyperinsulinämie, ein Zustand mit sehr hohen Blutspiegeln an Insulin, ist mit einer erhöhten Krebsinzidenz verbunden. Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas und das polyzystische Ovarialsyndrom sind die häufigsten Krankheiten, die mit Hyperinsulinämie einhergehen. Da ein erhöhtes Krebsrisiko insbesondere für Krebserkrankungen des Dickdarms und der Niere beobachtet wurde, untersuchten wir erstmals die Induktion von Genomschäden durch Insulin in HT29-Zellen (humane Dickdarmzellen), LLC-PK1-Zellen (Nierenzellen vom Schwein), HK2-Zellen (humane Nierenzellen) und peripheren humanen Lymphozyten. Um die Gentoxizität von Insulin zu bestätigen, wurden auch andere Zellen aus unterschiedlichen Geweben untersucht. Um sicherzustellen, dass die Effekte durch Insulin nicht auf permanente Zelllinien beschränkt sind, wurden außerdem primäre Rattenzellen aus Dickdarm, Niere, Leber und Fettgewebe untersucht. Um die Befunde auf die in-vivo-Situation übertragen zu können, kamen zwei Hyperinsulinämie-Modelle zum Einsatz: mit Insulin infundierte ZDF-Ratten (Zucker Diabetic Fatty Rats) und periphere Lymphozyten von Patienten mit Diabetes Typ 2. Zuerst konnte in humanen Adenokarzinomzellen des Dickdarms (HT29) eine signifikante Erhöhung des DNA-Schadens in Standard-Protokollen des Comet Assays und des Mikrokerntests nach Behandlung mit 5 nM Insulin gezeigt werden. Bei Verlängerung der Behandlungszeit auf 6 Tage wurden signifikante Effekte bereits ab 0,5 nM beobachtet. Insulin erhöhte die zelluläre ROS-Produktion, die als Oxidation der Farbstoffe 2‘,7‘-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (H2DCF-DA) und Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen wurde. Befunde aus dem FPG-modifizierten Comet Assay und das Ergebnis, dass der Radikalfänger Tempol die Zellen schützte stellen die Verbindung zwischen Insulin-verursachtem DNA-Schaden und ROS produktion her. Um die ROS-Quelle nach Stimulation mit Insulin zu untersuchen, wurden Apocynin und VAS2870 als NADPH-Oxidase-Inhibitoren und Rotenon als Inhibitor der Mitochondrien mit Insulin kombiniert. Alle diese Stoffe reduzierten den Genomschaden. Zur Charakterisierung der Signalwege wurde zunächst die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor und an den IGF1-Rezeptor untersucht. Beide Rezeptoren sind an der Signaltransduktion beteiligt. Nach Aktivierung der Rezeptoren wird die PI3K aktiviert, dies führt zur Phosphorylierung von AKT. Dadurch werden zwei Wege zur ROS-Produktion aktiviert, der erste involviert die mitochondriale Atmungskette , der zweite agiert durch Rac1-Aktivierung. Letzteres resultiert in der Aktivierung der NADPH-Oxidase Isoform Nox1. Der Effekt von Insulin auf zelluläres Chromatin konnte in einer weiteren humanen Dickdarmkrebs-Zelllinie und in primären Dickdarmzellen der Ratte in vitro bestätigt werden. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass pathophysiologische Insulin-Blutspiegel DNA-Schäden im Dickdarm verursachen können. Dies könnte zur Induktion oder Progression von Dickdarmkrebs beitragen. Weiterhin verursachte Insulin bei einer Konzentration von 5 nM einen signifikanten Anstieg von DNA-Schäden in vitro. Dies war verbunden mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Bei Anwesenheit von Antioxidantien, von Inhibitoren des Insulin-Rezeptors bzw. des IGF-1-Rezeptors und eines Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-Inhibitors war der Insulin-vermittelte DNA-Schaden reduziert. Phosphorylierung von AKT war erhöht und das Protein P53 akkumulierte. Inhibierung der ROS-Produktion der Mitochondrien bzw. der NADPH-Oxidase reduzierte den Insulin-vermittelten Schaden. In primären Rattenzellen induzierte Insulin ebenfalls Genomschaden. HK2-Zellen wurden zur Untersuchung der mechanistischen Signalwege in der Niere eingesetzt. Die Signalwege entsprechen denen der Dickdarmzellen bis zur Aktivierung der ROS-Produktion in den Mitochondrien. Als Folge der Aktivierung von PI3K wird Nox4 aktiviert. Eine Verbindung zwischen Mitochondrien und Nox4-Aktivierung wird vorgeschlagen. Als in-vivo-Modell wurden gesunde ZDF-Ratten mit Insulin infundiert, um normale bzw. erhöhte Insulin-Blutspiegel bei konstanten Glukose-Blutspiegeln zu erreichen. In den Nieren war der Gehalt an ROS und an P53 in der Gruppe mit erhöhten Insulin-Blutspiegeln im Vergleich zur Kontrolle erhöht. ROS und P53 waren ebenfalls in den diabetischen und adipösen ZDF-Ratten erhöht. Die Behandlung der diabetischen Ratten mit Metformin reduzierte die DNA-Oxidation, die in Form von 8-oxodG bestimmt wurde, und die ROS-Produktion in dieser Gruppe. HL60-Zellen und kultivierte Lymphozyten als Modelle für das hämatopoetische System zeigten eine signifikante Induktion von DNA-Schäden nach Behandlung mit Insulin. Diabetes-Patienten zeigten eine erhöhte Mikrokern-Bildung im Vergleich zu gesunden Probanden. In der vorliegenden Studie konnten wir erstmals zeigen, dass Insulin-induzierter oxidativer Stress zu Genomschaden führt, und dass in unterschiedlichen Geweben ROS aus verschiedenen Quellen stammten. Falls diese Mechanismen auch in Patienten auftreten, könnte Hyperinsulinämie durch ROS-Induktion zu Genomschaden führen und damit zu einem erhöhten Krebsrisiko beitragen. Unter bestimmten Bedingungen könnten Antioxidantien bzw. Inhibitoren der Mitochondrien oder der NADPH-Oxidase protektive Effekte ausüben. KW - Insulin KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - oxidativer Stress KW - DNA Schaden KW - Insulin KW - Insulin KW - Oxidative Stress KW - DNA Damage Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Kirchner, S. A1 - Schiffmann, D. A1 - Poot, M. T1 - Cell cycle disturbance in relation to micronucleus formation induced by the carcinogenic estrogen diethylstilbestrol N2 - In addition to its tumor-promoting activity in honnone-receptive tissue, the carcinogenic estrogen diethylstilbestrol (DES) has been found to induce cell transformation, aneuploidy and micronucleus formation in mammalian cells. The majority of these micronuclei contained whole chromosomes and were fonned during mitosis. Here a possible relationship between a disturbance in cell cycle progression and micronucleus fonnation is investigated by exposing Syrian hamster embryo (SHE) cells to DES. Continuous bromodeoxyuridine labeling followed by bivariate Hoechst 33258/ethidium bromide flow cytometry was employed for analysis of cell cycle transit and related to the time course of micronucleus formation. Treatment of SHE cells with DES resulted in delayed and impaired cell activation (exit from the GO/G 1 phase), impaired S-phase transit and, mainly, G2-phase traverse. Cells forming micronuclei, on the other hand, were predominantly in G2 phase during DES treatment. These results suggest that impairment of Sand G2 transit may involve a process ultimately leading to micronucleus formation. KW - Toxikologie KW - Flow cytometry KW - Micronucleus formation KW - Diethylstilbestrol KW - Hoechst 33258 dye KW - Bromodeoxyuridine labeling KW - continuous Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82250 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Zimmermann, U. A1 - Wecker, E. T1 - High yields of DNA-transfer into mouse L-cells by electropermeabilization N2 - no abstracts available KW - Toxikologie KW - Gene Transfer KW - Electric Field KW - Stable Transformation KW - Neomycin Resistance Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82408 ER - TY - THES A1 - Merkl, Martin T1 - Immunologische Effekte der Therapie mit rezeptor-homologen Peptiden im Rattenmodell der antikörper-induzierten dilatativen Immunkardiomyopathie N2 - Unsere Arbeitsgruppe verfolgt im Rattenmodell der Antikörper-induzierten DiCM einen Antikörper-spezifischen Therapieansatz durch die Gabe eines synthetischen β1-ECII homologen zyklischen „Fänger“-Peptids. Die Applikation dieses Peptids führte zu einer deutlichen Verbesserung wichtiger Herzparameter wie z.B. des Durchmessers des linken Ventrikels (LV) sowie der LV-Verkürzungsfraktion und des kardialen Indexes. Des Weiteren kam es unter der Peptid-Therapie zu einer signifikanten Reduktion des anti-β1-ECII Antikörpertiters trotz kontinuierlich durchgeführter Immunisierungen mit dem die Erkrankung induzierenden Antigen. Es lag daher nahe, dass durch die Peptid-Therapie auch eine Art immunologischer Toleranz induziert wird, der eine Depletion bzw. funktionelle Beeinträchtigung von Zellen des Immunsystems, die an der Produktion von anti-β1-ECII Antikörpern beteiligt sind, zugrunde liegen könnte. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit war es daher Aufgabe, die verschiedenen Zellkomponenten der humoralen und zellulären Immunantwort zu untersuchen, um den immunologischen Effekt der Peptid-Applikation besser zu verstehen. So scheinen in unserem Modell die β1-ECII-spezifischen CD4+T-Zellen durch die Peptid-Therapie nicht beeinflusst zu werden; ebenso konnten unsere Experimente keinen Zyklopeptideffekt auf die langlebigen Plasmazellen nachweisen. Die erzielten Ergebnisse sprechen jedoch dafür, dass die Rückbildung des DiCM Phänotyps und der Abfall des anti-β1-ECII Antikörpertiters trotz kontinuierlicher Immunisierung zum einen auf der direkten Neutralisierung der anti-β1-ECII Antikörper durch die Ring-Peptide (Scavenger-Effekt)und zum anderen auf einer Depletion bzw. funktionellen Beeinträchtigung der β1-ECII-spezifischen Memory B-Zellen beruhen könnte. Der für die Reduktion der Memory B-Zellen letztlich verantwortliche molekulare Mechanismus muss jedoch noch in weiteren Experimenten untersucht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse tragen aber wesentlich zum besseren Verständnis der Wirkungsweise dieses neuartigen Therapiekonzepts zur Behandlung der immuninduzierten Kardiomyopathie bei. N2 - We used a rat model of antibody-induced DiCM to analyze an antibody specific therapeutic approach by the administration of a synthetic β1-ECII homologous cyclic-peptide. The application of this peptide resulted in a significant improvement of important cardiac parameters such as the diameter of the left ventricle (LV), LV fractional shortening and cardiac index. Furthermore, peptide therapy leads to a significant reduction of the anti-β1-ECII antibody titer despite continuous immunization with the disease inducing antigen. We suggested that peptide therapy could induce immunological tolerance by depletion or functional impairment of immune cells that are involved in the production of anti-β1-ECII antibodies. Therefore, the objective of this thesis was to examine the different cellular components of the humoral and cellular immune response in order to understand the immunological effects of peptide application. In our model, β1-ECII-specific CD4+T-cells and long-lived plasma cells are not affected by peptide treatment. However, the regression of the DiCM phenotype and the reduction of the anti-β1-ECII antibody titer, despite continuous immunization, might be due to the direct neutralization of the anti-β1-ECII antibodies by the cyclic peptides (scavenger effect) and a depletion or functional impairment of β1-ECII-specific memory B-cells. The exact molecular mechanism responsible for the reduction of memory B cells remains to be investigated in further experiments. The results obtained in this work help to understand this novel therapeutic approach of immune- induced cardiomyopathy. KW - Peptidtherapie KW - Peptidtherapie KW - Kardiomyopathie KW - Autoimmunerkrankung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85161 ER - TY - JOUR A1 - Janevski, J. A1 - Choh, V. A1 - Stopper, Helga A1 - Schiffmann, D. A1 - De Boni, U. T1 - Diethylstilbestrol alters the morphology and calcium levels of growth cones of PC12 cells in vitro N2 - Diethylstilbestrol (DES) is a synthetic estrogen with carcinogenic properties. DES is known to alter cytoskeletal components, including the organization of actin stress fibres in C6 rat glioma cells. ln a test of the hypothesis that DES disrupts actin Filaments of growth cones in neuron-like cells, DES-induced changes in filopodial lengths were quantified in rat pheochromocytoma (PC12) cells in vitro. DES significantly altered growth cone morphology, with collapse of growth cone filopodia and neurite retraction invariably occurring at a concentration of 10 MikroM. At 5 MikroM DES, transient reductions in total filopodiallengths occurred. At DES concentrations of 0.1 nM and 1 nM, reductions in total filopodiallengths occurred in a fraction of growth cones. Evidence exists which shows that growth cone activity and morphology are intimately linked to Ieveis of intracellular, free calcium and that DES increases such levels. Measurements of free intracellular calcium levels by fluorescence microscopy, at times concurrent with the DES-induced reduction in total filopodial lengths, showed that calcium levels were indeed significantly increased by 10 MirkoM DES. Labelling of filamentaus actin (f-actin) with FITC-phalloidin showed that the f-actin distribution in growth cones exposed to DES could not be differentiated from the distribution found in spontaneously retracting growth cones. Tagether with evidence which showed that growth cone motility was not affected, the results are taken to indicate that DES, rather than acting directly on the cytoskeleton, exerts its effects indirectly, by a calcium-induced destabilization of actin filaments in the growth cone. KW - Calcium KW - Zellskelett KW - Wachstumskonus KW - Diethylstilbestrol KW - Diethylstilbestrol KW - rat pheochromocytoma cells KW - growth cone KW - cytoskeleton KW - calcium Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86858 ER - TY - CHAP A1 - Zimmermann, U. A1 - Stopper, Helga T1 - Electrofusion and electropermeabilization of cells N2 - No abstract available. KW - Elektrofusion KW - Elektroporation KW - Zelle Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73065 ER - TY - JOUR A1 - Zimmermann, U. A1 - Stopper, Helga T1 - Elektrofusion und Elektropermeabilisierung von Zellen N2 - No abstract available. KW - Elektrofusion KW - Elektroporation KW - Zelle Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86865 ER - TY - THES A1 - Pollinger, Thomas T1 - Spatiotemporale Organisation der Interaktion von Gq Protein-Untereinheiten und der Phospholipase Cβ3 T1 - Spatiotemporal patterns of interaction of Gq protein subunits and phospholipase Cβ3 N2 - Die G-Protein vermittelte Aktivierung der Phospholipase Cβ (PLCβ) stellt einen primären Mechanismus dar, um eine Vielzahl von physiologischen Ereignissen zu regulieren, z.B. die Kontraktion glatter Muskelzellen, Sekretion oder die Modulation der synaptischen Transmission. Sowohl Gαq- als auch Gβγ-Untereinheiten sind dafür bekannt mit PLCβ Enzymen zu interagieren und diese zu aktivieren. Über die Dynamik dieser Interaktion und den relative Beitrag der G-Protein Untereinheiten ist jedoch nur wenig bekannt. Unter Verwendung Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)- basierter Methoden in lebenden Zellen, wurde die Kinetik der Rezeptor-induzierten Interaktion zwischen Gβγ und Gαq Untereinheiten, die Interaktion von sowohl der Gαq als auch der Gβγ-Untereinheit mit der PLCβ3 und die Interaktion des regulator of G-Protein signaling 2 (RGS2) mit Gαq-Untereinheiten untersucht. Um die Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion auf die Zellmembran zu beschränken, wurde die Total-Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie angewandt. Zeitlich hoch auflösendes, ratiometrisches FRET-Imaging offenbarte eine deutlich schnellere Dissoziation von Gαq und PLCβ3 nach Entzug purinerger Agonisten verglichen mit der Deaktivierung von Gq Proteinen in der Abwesenheit der PLCβ3. Dieser offensichtliche Unterschied in der Kinetik kann durch die GTPase-aktivierende Eigenschaft der PLCβ3 in lebenden Zellen erklärt werden. Weiterhin zeigte es sich, dass PLCβ3 die Gq Protein Kinetik in einem ähnlich Ausmaß beeinflusst wie RGS2, welches in vitro deutlich effizienter darin ist, die intrinsische GTPase Aktivität der Gαq-Untereinheit zu beschleunigen. Als Antwort auf die Rezeptorstimulation wurde sowohl eine Interaktion von Gαq-Untereinheiten als auch von Gq-abstammende Gβγ-Untereinheiten mit der PLCβ3 beobachtet. Darüber hinaus zeigte sich auch eine Agonist-abhängige Interaktion von Gαq und RGS2. In Abwesenheit einer Rezeptorstimulation konnte kein spezifisches FRET-Signal zwischen Gq Proteinen und der PLCβ3 oder RGS2 detektiert werden. Zusammengefasst ermöglichte das ratiometrische FRET-Imaging in der TIRF Mikroskopie neue Einsichten in die Dynamik und Interaktionsmuster des Gq-Signalwegs. N2 - G protein-mediated activation of phospholipase Cβ (PLCβ) represents a primary mechanism to regulate many physiological events such induce smooth muscle contraction, secretion and modulation of synaptic transmission. Both Gαq- and Gβγ-subunits are known to interact and activate PLCβ enzymes, however little is known about the dynamics of this interactions and the relative contribution of the G protein subunits in intact cells. Using fluorescence resonance energy transfer- (FRET-) based assays in single intact cells we studies kinetics of receptor-induced interactions between Gβγ- and Gαq-subunits, interactions of both Gαq and Gβγ with PLCβ3 as well as interactions of regulator of G proteins signalling 2 (RGS2) with Gαq- and Gβγ-subunits. In order to restrict the protein/protein interaction studies to the cell membrane we applied total internal reflection (TIRF) microscopy. High temporal resolution ratiometric FRET imaging uncovered a markedly faster dissociation of Gαq and PLC upon withdrawal of purinergic agonists compared to the deactivation of Gq proteins in the absence of PLCβ3. This apparent difference in kinetics could be contributed to the GTPase-activating property of PLCβ3 in living cells. Furthermore we found that PLCβ3 modulated Gq protein kinetics to a similar extent compared to RGS2, which in vitro is about 100 fold more efficient in activating Gq-GTPase activity. We observed that both Gαq subunits and Gq-derived Gβγ-subunits interact with PLCβ3 in response to receptor stimulation. In the absence of receptor stimulation we did neither detect any specific FRET signals between Gq protein subunits and PLCβ3 nor did we detect any interactions between RGS2 and Gαq subunits. Finally we could not detect agonist- dependent FRET between RGS2 and Gβγ-subunits. Taken together, ratiometric FRET-imaging under conditions of TIRF allowed new insights into dynamics and interaction patterns within the Gq signalling pathway. KW - TIRF KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Phospholipase C KW - Gq-Protein KW - RGS2 KW - PLCβ3 KW - TIRF KW - FRET KW - Gq-Protein KW - RGS2 KW - PLCβ3 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71884 ER - TY - JOUR A1 - Schupp, Nicole A1 - Ali, Badreldin H. A1 - Beegam, Sumyia A1 - Al-Husseni, Isehaq A1 - Al-Shukaili, Ahmed A1 - Nemmar, Abderrahim A1 - Schierling, Simone A1 - Queisser, Nina T1 - Effect of gum arabic on oxidative stress and inflammation in adenine-induced chronic renal failure in rats JF - PLoS One N2 - Inflammation and oxidative stress are known to be involved in the pathogenesis of chronic kidney disease in humans, and in chronic renal failure (CRF) in rats. The aim of this work was to study the role of inflammation and oxidative stress in adenine-induced CRF and the effect thereon of the purported nephroprotective agent gum arabic (GA). Rats were divided into four groups and treated for 4 weeks as follows: control, adenine in feed (0.75%, w/w), GA in drinking water (15%, w/v) and adenine+GA, as before. Urine, blood and kidneys were collected from the rats at the end of the treatment for analysis of conventional renal function tests (plasma creatinine and urea concentration). In addition, the concentrations of the pro-inflammatory cytokine TNF-a and the oxidative stress markers glutathione and superoxide dismutase, renal apoptosis, superoxide formation and DNA double strand break frequency, detected by immunohistochemistry for c-H2AX, were measured. Adenine significantly increased the concentrations of urea and creatinine in plasma, significantly decreased the creatinine clearance and induced significant increases in the concentration of the measured inflammatory mediators. Further, it caused oxidative stress and DNA damage. Treatment with GA significantly ameliorated these actions. The mechanism of the reported salutary effect of GA in adenine-induced CRF is associated with mitigation of the adenine-induced inflammation and generation of free radicals. KW - adenine KW - blood plasma KW - creatinine KW - inflammation KW - inflammatory diseases KW - Kidneys KW - Oxidative stress KW - Water resources Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-95787 ER - TY - JOUR A1 - Epe, Bernd A1 - Häring, Martin A1 - Ramaiah, Danaboyina A1 - Stopper, Helga A1 - Abou-Elzahab, Mohamed M. A1 - Adam, Waldemar A1 - Saha-Möller, Chantu R. T1 - DNA damage induced by furocoumarin hydroperoxides plus UV (360 nm) N2 - Wben irradiated at 360 nm, furocoumarins with a hydroperoxide group in a side chain effciently give rise to a type of DNA damage that can best be explained by a photoinduced generation of hydroxyl radicals from the excited pbotosensitizers. The observed DNA damage profiles, i.e. the ratios of single-strand breaks, sites of base loss (AP sites) and base modifications sensitive to fonnamidopyrimidine-DNA glycosylase (FPG protein) and endonuclease m, are similar to the DNA damage profile produced by hydroxyl radicals generated by lonizing radiation or by xanthine and xanthine oxidase in the presence of Fe(III)-EDTA. No such damage is observed with the corresponding furocoumarin alcohols or in the absence of near-UV radiation. The damage caused by the photo-excited hydroperoxides is not influenced by superoxide dismutase (SOD) or catalase or by D2O as solvent. The presence of t-butanol, however, reduces both the formation of single-strand breaks and of base odifications sensitive to FPG protein. The cytotoxicity caused by one of the hydroperoxides in L5178Y mome lymphoma cells is found to be dependent on the near-UV irradiation and to be much higher than that of the corresponding alcohol. Therefore the new type of photoinduced damage occurs inside cells. Intercalating photosensitizers with an attached hydroperoxide group might represent a novel and versatile class of DNA damaging agents, e.g. for phototherapy. KW - DNS-Schädigung Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86870 ER - TY - CHAP A1 - Schwinn, Andreas A1 - Rethwilm, Axel A1 - Esers, Stefan A1 - Borisch, Bettina A1 - ter Meulen, Volker T1 - Interaction of HIV-1 and HHV-6 N2 - No abstract available. KW - HIV KW - Herpesviren Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86415 ER - TY - CHAP A1 - Cantoreggi, S. A1 - Gupta, R. C. A1 - Lutz, Werner K. T1 - An improved 32P-postlabelling assay for detection and quantitation of styrene 7,8-oxide-DNA adducts N2 - Using DNA modified with [7-3H]styrene 7,8-oxide (SO) in vitro we have standardized the 32P-postlabelling assay for detecting SO-DNA adducts. Nuclease P 1-enriched adducts were 32P-labelled and purified by high-salt ( 4.0 M ammonium formate, pH 6.1} C1s reverse-phase TLC. After elution from the layer with 2-butoxyethanol:H20 (4:6), adducts were separated by two-dimensional PEI cellulose TLC in non-urea solvents (2.0 M ammonium formate, pH 3.5, and 2.7 M sodium phosphate, pH 5.6). One major, three minor and several trace adducts were detected. The efficiency of the kinase reaction depended on the ATP concentration. Use of standard labelling conditions (['Y· 32P]ATP, <3000 Ci/mmol; <2 Mikromol) resulted in poor ( 4-7%) adduct recovery. An ATP concentration of 40 Mikromol, however, increased the labeJling efficiency by a factor of 5-8 (35-55% based on 3H-SO labelied DNA). The results indicate that the new separation technique is suitable for the relatively polar SO-DNA adducts and that high labelling efficiency can be achieved. KW - Medizin Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86305 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. A1 - Cantoreggi, S. A1 - Velic, I. T1 - DNA binding and stimulation of cell division in the carcinogenicity of styrene 7,8-oxide N2 - [7-3H)Styrene 7,8-oxide was administered by oral gavage to male CD rats at a dose of 1.3 mg/kg. After 4 h, the forestomach was excised, DNA was isolated, purified to constant specific radioactivity and degraded nzymatically to the 3 '-nucleotides. Highperformance liquid chromatography fractions with the normal nucleotides contained most of the radiolabel, but a minute level of adduct label was also detccted. Using the units of the covalent binding index (micromoles adduct per mole DNA nucleotide)/(millimole chemical administered per kilogram body weight), a DNA binding potency of 1.0 was derived. A comparison of the covalent binding indices and carcinogenic potencies of other genotoxic forestarnach carcinogens showed that the tumorigenic activity of styrene oxide is unlikely to be purely genotoxic. Therefore, styrene oxide was compared with 3-tbutylhydroxyanisole (BHA) with respect to stimulation of cell proliferation in the forestomach. Male Fischer 344 rats were treated for four weeks at three dose levels of styrene oxide (0, 137, 275 and 550 mg/kg, three times per week by oral gavage) and BHA (0, 0.5, 1 and 2% in the diet); the highest doses had been reported to result in 84% and 22% carcinomas in the forestomach, respectively. Cell proliferation was assessed by incorporation of bromodeoxyuridine into DNA and immunohistochemical analysis. An increase in the lablling indexwas found in a11 treated animals. In the prefundic region of the forestomach, the labeHing index increased significantly, from 42% (controls) to 54% with styrene oxide and from 41 to 55% with BHA. Rats treated with BHA also had severe hyperplastic lesions in the prefundic region, i.e., at the location of BHA-induced forestomach carcinomas. The number of cells per millimetre of section length was increased up to 19 fold. Hyperplastic lesions were not seen with styrene oxide, despite the higher tumour incidence reported with this compound. We conclude that the carcinogenicity of styrene oxide to the forestomach most probably involves a mechanism in which marginal genotoxicity is combined with promotion by increased cell proliferation. KW - Styrol KW - DNS-Bindung KW - Zellteilung KW - Carcinogenität Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71597 ER - TY - JOUR A1 - Adami, Hans-Olov A1 - Dragsted, Lars A1 - Enig, Bent A1 - Hansen, Jens A1 - Haraldsdóttir, Jóhanna A1 - Hill, Michael J. A1 - Holm, Lars Erik A1 - Knudsen, Ib A1 - Larsen, Jens-Jorgen A1 - Lutz, Werner K. A1 - Osler, Merete A1 - Overvad, Kim A1 - Sabroe, Svend A1 - Sanner, Tore A1 - Strube, Michael A1 - Sorensen, Thorkild I. A. A1 - Thorling, Eivind B. T1 - Report from the working group on diet and cancer. N2 - No abstract available. KW - Krebs KW - Ernährung Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71601 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, Josef T1 - The relative importance of mutagens and carcinogens in the diet. N2 - Known mutagens and carcinogens in the dict were compiled and the risk of cancer was estimated on the basis of average exposure Ievels in Switzerland and carcinogenic potencies from rodent bioassays. The analysis showed that, except for a1cohol, the sum of all known dietary carcinogens could only explain a few percent of the cancer deaths attributed by epidemiologists to dietary factors. The discrepancy was explained by a "carcinogenicity" of excess macronutrients. This hypothesis was based on an evaluation of dietary restriction experiments in rats and mice, where a dramatic reducing effect on spontaneaus tumour formation was seen. From these experiments, a "carcinogenic potency" was deduced for food in excess (TD50 approximately 16 g/kg per day). Ovemutrition in Switzerland was converted into excess food intake and the cancer risk estimated on the basis ofthe TD50 value. The resulting risk of60,000 cases per one million lives wou1d aJlow to explain by overnutrition almost all "diet-related" cancer deaths in humans. KW - Medizin Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86311 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. T1 - Dose-response relationships in chemical carcinogenesis: from DNA adducts to tumor incidence N2 - Mechanistic possibilitles responsible for nonlinear shapes of the dose-response relationship in chemical carcinogenesis are discussed. (i) Induction and saturation of enzymatic activation and detoxification processes and of DNA repair affect the relationship between dose and steady-state DNA adduct Ievel; (ii) The fixation of DNA adducts in the form of mutations is accelerated by stimulation of the cell division, for Jnstance due to regenerative hyperplasia at cytotoxic dose Ievels; (iii) The rate of tumor formation results from a superposition of the rates of the individual steps. It can become exponential with dose if more than one step is accelerated by the DNA damage exerted by the genotoxic carcinogen. The strongly sigmoidal shapes often observed for dose-tumor incidence relationships in animal bioassays supports this analysis. A power of four for the dose in the su~linear part of the curve is the maximum observed (formaldehyde). In contrast to animal experiments, epidemiological data ln humans rarely show a slgnificant deviation from linearity. The discrepancy might be explained by the fact that a I arge nu mber of genes contribute to the overall sensitivity of an individual and to the respective heterogeneity within the human population. Mechanistic nonlinearities are flattened out in the presence of genetic and life-style factors which affect the sensitivity for the development of cancer. For a risk assessment, linear extrapolation from the high-dose lncidence to the spontaneaus rate can therefore be approprlate in a heterogeneous population even if the mechanism of action would result in a nonlinear shape of the dose-response curve in a homogeneaus population. KW - aflatoxin B1 KW - 2-acetylaminofluorene KW - DNA KW - adduct KW - covalent KW - binding KW - carcinogen KW - dose KW - extrapolation KW - individual KW - susceptibility KW - heterogeneous population KW - risk KW - tumour Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71625 ER - TY - CHAP A1 - Shephard, S. E. A1 - Meier, I. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Alkylating potency of nitrosated amino acids and peptides N2 - Tbe alkylating potency of unstable N-nitrosamino acids and N-nitrosopeptides was investigated in vitro using 4-(para-nitrobenzyl)pyridine (NBP) as nucleophile. Of the amino acids, Met and those with an aromatic side chain were the most potent. The relative overall alkylating potency was 23:10:5:4:2:1: for Trp, Met, His, 1)rr, Phe and Gly, respectively. The homo-dipeptides were much more potent than the amino acids, with relative potencies of 400:110:100:8:3:1, for Trp-Trp, l)T-'I)T, Met-Met, Asp-Asp, Phe-Phe and Gly, respectively. In the one-phase reaction system (in which NBP is already present durlog the nitrosation reaction at acidic pH), all amino acids tested showed a second-order reaction for nitrite. In the two-phase system (in which NBP is added only after bringing the nitrosation reaction mixture to neutrality), all amino acids tested except one again showed a second-order reaction for nitrite (Phe, His, Asp and the dipeptide artiticial sweetener aspartame); only Met under these conditions bad a reaction order of one for nitrite. This could mean that nitrosation of the side chain of Metproduces a second N-nitroso product which is relatively stable in acid but reacts with NBP under neutral conditions. In the human stomach, this side-chain nitrosation might become more important than the reactions at the primary amino group, firstly because of the greater stability of the product(s) in acid and secondly because of the tirst-order reaction rate for nitrite. A decrease in nitrite concentration from the millimolar concentrations ofthe in-vitro assay to the micromolar concentrations in the stomach reduces the reaction rate by a factor of 1000 for the side-chain nitrosation, whereas a million-fold reduction will be observed for nitrosation of the amino group. KW - Aminosäuren Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86320 ER - TY - THES A1 - Jarzina, Sebastian Oskar T1 - Assessment of systemic toxicity in vitro using the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept: nephrotoxicity due to receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and inhibition of mtDNA polymerase-ɣ as case studies T1 - Bewertung der systemischen Toxizität in vitro unter Verwendung des Adverse Outcome Pathway (AOP)-Konzepts: Nephrotoxizität infolge rezeptorvermittelter Endozytose und lysosomaler Überlastung sowie Hemmung der mtDNA-Polymerase-ɣ als Fallstudien N2 - The US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP concept was ap-plied in this work to develop AOPs for proximal tubule injuries initiated by Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and Inhibition of mtDNA polymerase-. These AOPs were used as a mechanistic basis for the development of in vitro assays for each key event (KE). To experimentally support the developed in vitro assays, proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) were treated with model compounds. To measure the dis-turbance of lysosomal function in the AOP – Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload, polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide) were used as model compounds. Altered expression of lysosomal associated membrane protein 1/2 (LAMP-1/2) (KE1) and cathepsin D release from lysosomes (KE2) were determined by im-munofluorescence, while cytotoxicity (KE3) was measured using the CellTiter-Glo® cell via-bility assay. Importantly, significant differences in polymyxin uptake and susceptibility be-tween cell lines were observed, underlining the importance of in vitro biokinetics to determine an appropriate in vitro point of departure (PoD) for risk assessment. Compared to the in vivo situation, distinct expression of relevant transporters such as megalin and cubilin on mRNA and protein level in the used cell lines (RPTEC/TERT1 and NRK-52E) could not be con-firmed, making integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolations (QIVIVE) neces-sary. Integration of QIVIVE by project partners of the University of Utrecht showed an im-provement in the modelled biokinetic data for polymyxin B. To assess the first key event, (KE1) Depletion of mitochondrial DNA, in the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, a RT-qPCR method was used to determine the mtDNA copy number in cells treated with mod-el compounds (adefovir, cidofovir, tenofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil fumarate). Mitochondrial toxicity (KE2) was measured by project partners using the high-content imaging technique and MitoTracker® whereas cytotoxicity (KE3) was determined by CellTiter-Glo® cell viability assay. In contrast to the mechanistic hypothesis underlying the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, treatment with model compounds for 24 h resulted in an increase rather than a decrease in mtDNA copy number (KE1). Only minor effects on mitochondrial toxicity (KE2) and cytotoxicity (KE3) were observed. Treatment of RPT-EC/TERT1 cells for 14 days showed only a slight decrease in mtDNA copy number after treatment with adefovir dipivoxil and tenofovir disoproxil fumarate, underscoring some of the limitations of short-term in vitro systems. To obtain a first estimation for risk assessment based on in vitro data, potential points of departure (PoD) for each KE were calculated from the obtained in vitro data. The most common PoDs were calculated such as the effect concentra-tion at which 10 % or 20_% effect was measured (EC10, EC20), the highest no observed effect concentration (NOEC), the lowest observed effect concentration (LOEC), the benchmark 10 % (lower / upper) concentrations (BMC10, BMCL10, BMCU10) and a modelled non-toxic con-centration (NtC). These PoDs were then compared with serum and tissue concentrations de-termined from in vivo studies after treatment with therapeutic / supratherapeutic doses of the respective drugs in order to obtain a first estimate of risk based on in vitro data. In addition, AOPs were used to test whether the quantitative key event relationships between key events allow prediction of downstream effects and effects on the adverse outcome (AO) based on measurements of an early key event. Predictions of cytotoxicity from the mathematical rela-tionships showed good concordance with measured cytotoxicity after treatment with colistin and polymyxin b nonapeptide. The work also revealed uncertainties and limitations of the ap-plied strategy, which have a significant impact on the prediction and on a risk assessment based on in vitro results. N2 - Der Bericht des US National Research Council (NRC) „Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)“, der 2007 veröffentlicht wurde, sieht einen vollständigen Paradigmenwechsel in der Toxizitätsprüfung vor. Ein zentraler Aspekt des Berichts beinhaltet den Übergang von apikal ermittelten Endpunkten für Toxizität in in vivo Studien, zu mehr mechanistisch basierten in vitro Tests. Um den Übergang zu erleichtern und den Paradigmen-wechsel in der Prüfung auf Toxizität zu unterstützen, wird das Adverse Outcome Pathway (AOP) Konzept als pragmatisches Instrument weithin anerkannt. In dieser Arbeit wurde das AOP Konzept angewandt, um neue Ansätze zur Prüfung auf systemische Toxizität zu unter-suchen. Dazu wurden AOPs für proximale Tubulusschäden, die durch lysosomale Überladung und Inhibition der mtDNA Polymerase- initiiert werden, entwickelt. Diese AOPs wurden als mechanistische Grundlage für die Entwicklung von mechanistisch relevanten in vitro Tests für jedes Schlüsselereignis (KE) verwendet. Um die entwickelten in vitro Tests experimentell zu unterstützen, wurden proximale Tubuluszellen aus der Ratte (NRK-52E) und aus dem Men-schen (RPTEC/TERT1) mit Hilfe von Modellsubstanzen behandelt. Zur Messung der Störung der lysosomalen Funktion im AOP – Rezeptor-vermittelte Endozytose und lysosomale Überla-dung wurden Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid) als Modellsubstanzen verwendet. Die gestörte Expression des lysosomal assoziierten Membran-proteins 1/2 (LAMP 1/2) (KE1) und die Cathepsin D Freisetzung (KE2) wurden mittels Im-munofluoreszenztechnik bestimmt und die Zytotoxizität (KE3) mittels CellTiter-Glo® Zellvia-bilitätstest gemessen. Zwischen den Zelllinien wurden signifikante Unterschiede in der Auf-nahme von Polymyxinen und der Empfindlichkeit beobachtet, was die Bedeutung der in vitro Biokinetik zur Definition eines geeigneten Ausgangspunktes für die Risikobewertung unter-streicht. Im Vergleich zur in vivo Situation, konnte eine eindeutige Expression von relevanten Trans-portern wie Megalin und Cubilin auf mRNA und Proteinebene in den verwendeten Zelllinien (RPTEC/TERT1 und NRK-52E) nicht gezeigt werden, was eine zusätzliche Integration von quantitativen in vitro zu in vivo Extrapolationen (QIVIVE) unabdingbar macht. Die Integrati-on von QIVIVE durch Projektpartner der Universität Utrecht zeigte eine Verbesserung der modellierten biokinetischen Werte für Polymyxin B. Zur Bestimmung des ersten Schlüsseler-eignisse, (KE1) Depletion von mitochondrialer DNA, im AOP – Hemmung der mitochondria-len DNA Polymerase-, wurde nach Behandlung mit Modellsubstanzen (Adefovir, Cidofovir, Tenofovir, Adefovirdipivoxil, Tenofovirdisoproxil Fumarat) eine RT-qPCR Methode verwen-det, um die mtDNA Kopienzahl zu bestimmen. Die mitochondriale Toxizität (KE2) wurde mittels eines hochauflösenden Bildgebungsverfahrens und MitoTracker® vom Projektpartner des Fraunhofer Institut in Hamburg gemessen, während die Zytotoxizität (KE3) mittels Cel-lTiter-Glo® Zellviabilitätstest ermittelt wurde. Entgegen der mechanistischen Hypothese des AOPs – Hemmung der mitochondrialen DNA Polymerase-, führte eine 24 h Behandlung mit den Modellsubstanzen eher zu einer Erhöhung als zu einer Verringerung der mtDNA-Kopienzahl (KE1). Auch wurden nur geringe Auswirkungen auf die mitochondriale Toxizität (KE2) und Zytotoxizität (KE3) beobachtet. Die Behandlung von RPTEC/TERT1 Zellen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine leichte Abnahme der mtDNA Kopienzahl nach Be-handlung mit Adefovirdipivoxil und Tenofovirdisoproxil Fumarat, was den Bedarf an zeit-aufgelösten Daten und Einschränkungen von kurzfristigen in vitro Systemen unterstreicht. Um eine erste Einschätzung für die Risikobewertung basierend auf in vitro Daten zu erhalten, wurden aus den erhaltenen in vitro Daten für jedes KE mögliche Ausgangspunkte (Points of Departure (PoD)) berechnet. Dazu wurden gängige in vitro PoDs berechnet, wie die Effekt-konzentration, bei der 10 % bzw. 20 % Effekt gemessen wurden (EC10, EC20), die höchste Konzentration ohne Wirkung (no observed effect Konzentration (NOEC)), die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (lowest observed effect Konzentration (LOEC)), die Benchmark 10 % (unterer / obere) Konzentrationen (BMC10, BMCL10, BMCU10) und eine modellierte nicht-toxische Konzentration (NtC). Diese wurden dann mit Serum- bzw. Ge-webskonzentrationen aus in vivo Studien verglichen, die nach Gabe therapeutischer / suprathe-rapeutischer Dosen gemessen wurden. Zusätzlich wurde überprüft, ob es mit Hilfe von quanti-tativen Beziehungen zwischen Schlüsselereignissen möglich ist, basierend auf der Bestimmung früher Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorherzusagen. Diese Untersuchungen zeig-ten eine gute Korrelation der aus den mathematischen Beziehungen modellierten Daten mit den tatsächlich gemessenen Werten der Zytotoxizität der Modellsubstanzen Colistin und Po-lymyxin B-Nonapeptid. Im Rahmen der Arbeit wurden auch Unsicherheiten und Limitationen der Strategie deutlich, die maßgebliche Auswirkungen auf die Vorhersage und auf die Risiko-bewertung basierend auf in vitro Resultaten haben. KW - Adverse outcome pathway (AOP) KW - Nephrotoxicity KW - In vitro testing KW - QIVIVE KW - Risk Assessment Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-264842 ER - TY - THES A1 - Kaestner, Alexandra Annika Nadine T1 - Charakterisierung pharmakologischer Phosphoglykolatphosphatase-Inhibitoren T1 - Characterization of pharmacological phosphoglycolate phosphatase inhibitors N2 - In dieser Arbeit geht es um die Phosphoglykolatphosphatase (PGP), die als Phosphatase vom Haloazid Dehalogenase-Typ (HAD-Phosphatase) zu der ubiquitär vorkommenden Superfamilie der HAD-Hydrolasen gehört. In der Literatur ist eine in vitro Phosphatase-Aktivität gegenüber 2-Phospho-L-Laktat (2PL), 4-Phospho-D-Erythronat (4PE), Phosphoglykolat (PG) und Glycerol-3-Phosphat (G3P) beschrieben. 2PL und 4PE entstehen in Nebenreaktionen während der Glykolyse und hemmen bei Akkumulation die Glykolyse bzw. den Pentosephosphatweg. PG kann auch in einer Nebenreaktion während der Glykolyse oder im Rahmen der Reparatur von oxidativen DNA-Schäden entstehen. G3P entsteht aus Dihydroxyacetonphosphat und bildet das Kohlenhydratgerüst der Triacylglyceride (TAG). Zelluläre Studien konnten Hinweise auf die Regulierung des epidermalen wachstumsfaktor-(EGF-)induzierten Zytoskelettumbaus durch die PGP liefern und die Untersuchung von Mäusen mit PGP-Inaktivierung zeigte einen Einfluss auf die Zellproliferation und embryonale Entwicklung. Die Regulation der PGP-Expression führte zu Veränderungen im Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel. Die Untersuchung der PGP-Funktionen erfolgte bislang ausschließlich mit genetischen Ansätzen. Aufgrund von möglichen Kompensationsmechanismen und Off-Target-Effekten müssen genetische und pharmakologische Methoden als sich ergänzende Ansätze verstanden werden. Um die Funktionen der PGP besser zu verstehen, fokussiert sich die vorliegende Arbeit auf die gezielte pharmakologische PGP-Inhibition. In Vorarbeiten wurden 41.000 Moleküle gescreent und fünf potentielle Inhibitoren identifiziert. Ziele dieser Arbeit waren zum einen die Implementierung der Inhibitor # 1-Behandlung in der Zellkultur, zum anderen die Charakterisierung der PGP-Hemmung durch Inhibitor # 48 und die Durchführung erster Selektivitätstestungen mit Inhibitor # 48. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Inhibitor # 1 in der Lage ist, die endogene PGP in Zelllysaten der murinen spermatogonialen Zelllinie (GC1) zu hemmen. Unter bestimmten Bedingungen führte die Inhibitor # 1-Behandlung der GC1-Zellen zur Hemmung der PGP. Erste Analysen zellulärer Inhibitoreffekte konnten eine Steigerung der TAG-Konzentration in behandelten GC1-Zellen nachweisen. Die PGP-Hemmung durch Inhibitor # 48 wurde als unkompetitive Inhibition charakterisiert und es zeigten sich keine relevanten Inhibitoreffekte auf die HAD-Phosphatasen Magnesium-abhängige Phosphatase 1 (MDP1), Lysin-Histidin-Pyrophosphat-Phosphatase (LHPP) und Polynukleotidase 5'-Kinase/3'-Phosphatase (PnkP). Dagegen konnte eine Aktivitätssteigerung von Phospho 2 beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit liefert somit erste Erkenntnisse über die Anwendung des PGP-Inhibitors # 1 in der Zellkultur und schafft die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen mit Inhibitor # 48. Weitere Experimente sind notwendig, die die Inhibitorbehandlung in der Zellkultur optimieren und die Selektivität weiter charakterisieren, um mithilfe der Inhibitoren neue Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Rolle der PGP gewinnen zu können. N2 - The present thesis describes the analysis of phosphoglycolate phosphatase (PGP), a haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatase of the ubiquitous superfamily of HAD hydrolases. In vitro and in cells, PGP has been described to dephosphorylate 2-phospho-L-lactate (2PL), 4-phospho-D-erythronate (4PE), phosphoglycolate (PG) and glycerol-3-phosphate (G3P). 2PL and 4PE are formed in side reactions by two core glycolytic enzymes and, when they accumulate, inhibit glycolysis or the pentose phosphate pathway, respectively. PG may also be formed in a side reaction during glycolysis or during the repair of oxidative DNA damage. G3P can be generated by glycerol kinase-mediated phosphorylation of glycerol, or by reduction of dihydroxyacetone phosphate. G3P forms the activated backbone of triglycerides. Cellular studies provided evidence for the regulation of epidermal growth factor (EGF) induced cytoskeletal remodeling by PGP, and examination of mice with PGP inactivation revealed its effect on cell proliferation and embryonic development. The experimental deletion or overexpression of PGP in cells, mice and rats resulted in changes in carbohydrate and lipid metabolism. To date, the study of PGP functions has been conducted exclusively using genetic approaches, and no pharmacological PGP inhibitors have been described so far. The goal of this thesis was to characterize small molecule PGP inhibitors that have previously been identified in the group by high throughput screening. Specifically, the aim of this work was to implement inhibitor # 1 treatment in cell culture and to characterize PGP inhibition by inhibitor # 48 as well as to perform initial selectivity assays with inhibitor # 48. Inhibitor # 1 is able to inhibit endogenous PGP in cell lysates of the murine spermatogonial cell line (GC1). Under certain conditions, inhibitor # 1 treatment of GC1 cells resulted in inhibition of PGP. Preliminary analyses of cellular inhibitory effects demonstrated an increase in TG levels in treated GC1 cells. Inhibitor # 48 was characterized as an uncompetitive PGP-inhibitor. No relevant inhibitor effects on the HAD phosphatases magnesium-dependent phosphatase-1 (MDP1), phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and polynucleotidase 5´-kinase/3´-phosphatase (PnkP) could be detected. In contrast, an increase in the activity of Phospho 2 was observed. The present work thus provides first insights into the application of the PGP inhibitor # 1 in cell culture and lays the foundation for subsequent studies with inhibitor # 48. Further experiments are needed to improve inhibitor treatment in cell culture and to further characterize selectivity in order to gain new insights into the physiological and pathophysiological role of PGP by using the inhibitors. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Inhibitor KW - Phosphatase KW - phosphoglycolatephosphatase KW - inhibitor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272394 ER - TY - THES A1 - Schuster, Paul Xaver T1 - Biotransformation of trans-1,1,1,3-tetrafluoropropene, 2,3,3,3-tetrafluoropropene and 1,2,3,3,3-pentafluoropropene T1 - Biotransformation von trans-1,1,1,3-Tetrafluorpropen, 2,3,3,3-Tetrafluorpropen und 1,2,3,3,3-Pentafluorpropen N2 - trans-1,1,1,3-Tetrafluoropropene (HFO-1234ze) and 2,3,3,3-tetrafluoropropene (HFO-1234yf) are non-ozone-depleting fluorocarbon replacements with low global warming potentials and short atmospheric lifetimes. They are developed as foam blowing agent and refrigerant, respectively. Investigations on biotransformation in different test species and in vitro systems are required to assess possible health risks of human exposure and needed for commercial development. The biotransformation of HFO-1234ze and HFO-1234yf was therefore investigated after inhalation exposure. Male Sprague-Dawley rats were exposed to air containing 2 000; 10,000; or 50,000 ppm (n=5/concentration) HFO-1234ze or HFO-1234yf. Male B6C3F1 mice were only exposed to 50,000 ppm HFO-1234ze or HFO-1234yf. Due to lethality observed in a developmental study with rabbits after exposure to high concentrations of HFO-1234yf, the metabolic fate of the compound was tested by whole body inhalation exposure of female New Zealand White rabbits to air containing 2 000; 10,000; or 50,000 ppm (n=3/concentration) HFO-1234yf. All inhalation exposures were conducted for 6 h in a dynamic exposure chamber. After the end of the exposures, animals were individually housed in metabolic cages and urines were collected at 6 or 12 h intervals for 48 h (rats and mice) or 60 h (rabbits). For metabolite identification, urine samples were analyzed by 1H-coupled and 1H-decoupled 19F-NMR and by LC/MS-MS or GC/MS. Metabolites were identified by 19F-NMR chemical shifts, signal multiplicity, 1H-19F coupling constants and by comparison with synthetic reference compounds. Biotransformation of HFO-1234ze in rats exposed to 50,000 ppm yielded S-(3,3,3-trifluoro-trans-propenyl)mercaptolactic acid as the predominant metabolite which accounted for 66% of all integrated 19F-NMR signals in urines. No 19F-NMR signals were found in spectra of rat urine samples collected after inhalation exposure to 2 000 or 10,000 ppm HFO-1234ze likely due to insufficient sensitivity. S-(3,3,3-Trifluoro-trans-propenyl)-L-cysteine, N-acetyl-S-(3,3,3-trifluoro-trans-propenyl)-L-cysteine, 3,3,3-trifluoropropionic acid and 3,3,3-trifluorolactic acid were also present as metabolites in urine samples of rats and mice at the 50,000 ppm level. A presumed amino acid conjugate of 3,3,3-trifluoropropionic acid was the major metabolite of HFO-1234ze in urine samples of mice exposed to 50,000 ppm and related to 18% of total integrated 19F-NMR signals. Quantitation of three metabolites in urines of rats and mice was performed, using LC/MS-MS or GC/MS. The quantified amounts of the metabolites excreted with urine in both mice and rats, suggest only a low extent (<<1% of dose received) of biotransformation of HFO-1234ze and 95% of all metabolites were excreted within 18 h after the end of the exposures (t1/2 approx. 6 h). Due to its low boiling point of −22 °C, most of the inhaled HFO-1234ze is expected to be readily exhaled. Moreover, steric and electronic factors may decrease the reactivity of the parent compound with soft nucleophiles such as glutathione. The obtained results suggest that HFO-1234ze is subjected to an addition-elimination reaction with glutathione and to a cytochrome P450-mediated epoxidation at low rates. The extent of a direct addition reaction of HFO-1234ze with glutathione is negligible, compared to that of the observed addition-elimination reaction. The results of in vivo testing of HFO-1234ze could not be supported by in vitro investigations, since HFO-1234ze was not metabolized in incubations with either liver microsomes or subcellular fractions from rat and human. Regarding the structures delineated in the biotransformation scheme of HFO-1234ze, 1,1,1,3-tetrafluoroepoxypropane and 3,3,3-trifluoropropionic acid are toxic intermediates which, however, are not supposed to display toxicity in the species after exposure to HFO-1234ze, due to the low extent of formation and an efficient detoxification of the epoxide by hydrolysis and glutathione conjugation. The findings of biotransformation of HFO-1234ze in rats and mice correlate with the absence of adverse effects in the toxicity testings and indicate their innocuousness to a human exposure. Biotransformation of HFO-1234yf yielded N-acetyl-S-(3,3,3-trifluoro-2-hydroxypropanyl)-L-cysteine as predominat metabolite which accounted for approx. 44, 90 and 32% (50,000 ppm) of total 19F-NMR signal intensities in urine samples from rabbits, rats and mice, respectively. S-(3,3,3-Trifluoro-2-hydroxypropanyl)mercaptolactic acid and the sulfoxides of mercapturic acid and mercaptolactic acid S-conjugate were identified as minor metabolites of HFO-1234yf in urine samples from rabbits, rats and mice, whereas trifluoroacetic acid, 3,3,3-trifluorolactic acid and 3,3,3-trifluoro-1-hydroxyacetone were present as minor metabolites only in urine samples from rats and mice. The absence of these metabolites in rabbit urine samples... N2 - trans-1,1,1,3-Tetrafluorpropen (HFO-1234ze) und 2,3,3,3-Tetrafluorpropen (HFO-1234yf) sind FKW-Ersatzstoffe, die eine kurze atmosphärische Lebensdauer besitzen und weder die Ozonschicht beeinträchtigen noch wesentlich zur globalen Erwärmung beitragen. Sie werden derzeit als Treibmittel für Schäume beziehungsweise als Kühlmittel entwickelt. Untersuchungen der Biotransformation in verschiedenen Tierspezies und in in vitro Systemen tragen zur Risikobewertung einer Humanexposition bei und werden für die kommerzielle Entwicklung benötigt. In dieser Arbeit wurde die Biotransformation von HFO-1234ze und HFO-1234yf nach inhalativer Exposition untersucht. Männliche Sprague-Dawley Ratten wurden Luftkonzentrationen von 2.000, 10.000 und 50.000 ppm (n=5/Konzentration) ausgesetzt. Männliche B6C3F1 Mäuse wurden dagegen nur einer Konzentration von 50.000 ppm ausgesetzt. Aufgrund von Todesfällen in einer Entwicklungstoxizitätsstudie mit Kaninchen wurde in dieser Arbeit auch die Biotransformation von HFO-1234yf in weiblichen Kaninchen mit Konzentrationen von 2.000, 10.000 und 50.000 ppm untersucht. Alle Inhalationen dauerten 6 Stunden und fanden in einem dynamisch durchströmten Expositionssystem statt. Nach Ende der Inhalationen wurden die Versuchstiere individuell in Stoffwechselkäfigen untergebracht und ihre Urine in 6 bzw. 12 h Intervallen gesammelt (insgesamt 48 h bei Ratten und Mäusen bzw. 60 h bei Kaninchen). Zur Identifizierung der Metabolite von HFO-1234ze und HFO-1234yf in den Urinen wurden 1H-ge- und entkoppelte 19F-NMR-Spektren aufgezeichnet und massenspektrometrische Untersuchungen mittels LC/MS-MS oder GC/MS durchgeführt. Die Metaboliten wurden anhand ihrer 19F-NMR-Charakteristika (Chemische Verschiebung, Signalmultiplizität und 1H-19F Kopplungskonstante) und durch Vergleich mit ihren synthetischen Referenzverbindungen identifiziert. In Ratten, die einer Konzentration von 50.000 ppm HFO-1234ze ausgesetzt worden waren, konnte S-(3,3,3-Trifluor-trans-propenyl)merkaptolaktat als Hauptmetabolit nachgewiesen werden. Er machte 66% aller integrierten 19F-NMR-Signale aus. In 19F-NMR-Spektren von Rattenurinen der 2.000 und 10.000 ppm Expositionen konnten dagegen keine Signale detektiert werden, wahrscheinlich wegen unzureichender Empfindlichkeit der 19F-NMR-Messungen. Als Nebenprodukte von HFO-1234ze in Ratten- und Mäuseurinen wurden S-(3,3,3-Trifluor-trans-propenyl)-L-cystein, N-Acetyl-S-(3,3,3-trifluor-trans-propenyl)-L-cystein, 3,3,3-Trifluorpropion-säure und 3,3,3-Trifluorlaktat nachgewiesen. In Mäuseurinen war der Hauptmetabolit von HFO-1234ze ein vermutetes Aminosäurekonjugat von 3,3,3-Trifluorpropion-säure, auf das 18% aller integrierten 19F-NMR Signalintensitäten entfielen. In den Urinen von Ratten und Mäusen wurden 3 Metabolite mittels LC/MS-MS oder GC/MS quantifiziert. Die ermittelten Mengen weisen auf eine sehr niedrige Biotransformationsrate von HFO-1234ze hin (<<1% der verabreichten Dosis). 95% aller Metabolite wurden innerhalb von 18 h nach Ende der Inhalationen ausgeschieden (t1/2 ca. 6 h). Aufgrund des niedrigen Siedepunkts von −22°C wird ein Großteil des aufgenommen Gases möglicherweise rasch wieder exhaliert, und sterische sowie elektronische Faktoren könnten die Reaktivität der Ausgangsverbindung mit schwachen Nukleophilen wie Glutathion senken. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass HFO-1234ze in geringem Ausmaß durch Additions-Eliminations Reaktion mit Glutathion und einer CYP450-vermittelten Epoxidierung biotransformiert wird. Das Ausmaß einer direkten Additions Reaktion von HFO-1234ze mit Glutathion ist verglichen mit der vorherrschenden Additions-Eliminations Reaktion vernachlässigbar. Da kein Umsatz von HFO-1234ze in Inkubationen mit Rettenlebermikrosomen oder subzellulären Fraktionen von Human- und Rattenleber stattfand, konnten die in vivo Ergebnisse dieser Arbeit nicht mit in vitro Untersuchungen verglichen werden. Im Biotransformationsschema von HFO-1234ze sind 1,1,1,3-Tetrafluorepoxypropan und 3,3,3-Trifluorpropionsäure toxische Intermediate, die jedoch aufgrund der geringen gebildeten Mengen und einer effektiven Entgiftung des Epoxids durch Glutathionkonjugation keine toxischen Effekte in den verwendeten Tierspezies auslösten. Die Ergebnisse der Untersuchung der Biotransformation von HFO-1234ze in Ratten und Mäusen korrelieren mit der Abwesenheit nachteiliger Effekte in den Toxizitätsstudien und lassen eine Humanexposition gegenüber HFO-1234ze als unbedenklich erscheinen. Bei der Biotransformation von HFO-1234yf entstand N-Acetyl-S-(3,3,3-trifluor-2-hydroxypropanyl)-L-cystein... KW - Biotransformation KW - fluorocarbons KW - trans-1 KW - 1 KW - 1 KW - 3 KW - tetrafluoropropene KW - 2 KW - 3 KW - 3 KW - 3-tetrafluoropropene KW - 1 KW - 2 KW - 3 KW - 3 KW - 3-pentafluoropropene KW - metabolites KW - Merkaptursäure KW - Merkaptolaktat KW - Glutathion S-Konjugat KW - Toxizität KW - Inhalation KW - mercapturic acid KW - mercaptolactic acid KW - glutathion S-conjugate KW - toxicity KW - inhalation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43716 ER - TY - JOUR A1 - Jeanclos, Elisabeth A1 - Schlötzer, Jan A1 - Hadamek, Kerstin A1 - Yuan-Chen, Natalia A1 - Alwahsh, Mohammad A1 - Hollmann, Robert A1 - Fratz, Stefanie A1 - Yesilyurt-Gerhards, Dilan A1 - Frankenbach, Tina A1 - Engelmann, Daria A1 - Keller, Angelika A1 - Kaestner, Alexandra A1 - Schmitz, Werner A1 - Neuenschwander, Martin A1 - Hergenröder, Roland A1 - Sotriffer, Christoph A1 - von Kries, Jens Peter A1 - Schindelin, Hermann A1 - Gohla, Antje T1 - Glycolytic flux control by drugging phosphoglycolate phosphatase JF - Nature Communications N2 - Targeting the intrinsic metabolism of immune or tumor cells is a therapeutic strategy in autoimmunity, chronic inflammation or cancer. Metabolite repair enzymes may represent an alternative target class for selective metabolic inhibition, but pharmacological tools to test this concept are needed. Here, we demonstrate that phosphoglycolate phosphatase (PGP), a prototypical metabolite repair enzyme in glycolysis, is a pharmacologically actionable target. Using a combination of small molecule screening, protein crystallography, molecular dynamics simulations and NMR metabolomics, we discover and analyze a compound (CP1) that inhibits PGP with high selectivity and submicromolar potency. CP1 locks the phosphatase in a catalytically inactive conformation, dampens glycolytic flux, and phenocopies effects of cellular PGP-deficiency. This study provides key insights into effective and precise PGP targeting, at the same time validating an allosteric approach to control glycolysis that could advance discoveries of innovative therapeutic candidates. KW - phosphoglycolate phosphatase KW - glycolytic flux control KW - intrinsic metabolism Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300928 VL - 13 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Lotz, Arietta Lucia T1 - Eine in-vitro-Untersuchung des Einflusses von Angiotensin II und Sulforaphan auf die Modulation des oxidativen Stresses anhand der NFκB- und Nrf 2-Aktivität in LLC-PK1 Zellen T1 - The influence of angiotensin II and sulforaphane on the modulation of oxidative stress in vitro based on NFκB and Nrf 2 activity in LLC-PK 1 cells N2 - Ausgangspunkt der Arbeit ist die klinische Beobachtung, dass Patienten mit arteriellem Hypertonus vermehrt Nierenerkrankungen entwickeln. Dabei zeigten sich in der Subgruppenanalyse vor allem erhöhte Inzidenzen der Niereninsuffizienz und der Nierenzellkarzinome. Als möglicher Pathomechanismus steht das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS-System) im Vordergrund. Dabei wird postuliert, dass erhöhte Angiotensin II-Spiegel zu einem Missverhältnis zwischen den Oxidations- und Reduktionspartnern in der Zelle führen, wodurch sich das oxidative Potential der Zelle ändert, und es vermehrt zur Bildung von Radikalen (ROS) kommt, die meist ungepaarte Elektronen in der Valenzschale oder instabile Verbindungen enthalten, wodurch sie besonders reaktionsfreudig mit Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und auch der DNA interagieren. In der Folge kommt es zu DNA-Veränderungen in Form von Doppel- oder Einzelstrangbrüchen, DNA-Protein-Crosslinks, Basenmodifikationen und Basenverlusten, wodurch sich ein hohes mutagenes Potential ergibt. Dieser Ansatz zur Pathophysiologie bestätigte sich auch an den hier verwendeten porkinen Nierenzellmodell. Dabei zeigte sich nicht nur eine Veränderung der genomischen Stabilität nach Exposition gegenüber erhöhten Angiotensin II-Spiegeln, sondern auch eine Veränderung der DNA in Abhängigkeit von der Expositionsdauer der Zellen. Als nächster Schritt konnte die Modulation der Transkriptionsfaktoren Nrf 2 und NF-κB durch die Behandlung mit Angiotensin II und Sulforaphan nachgewiesen werden. Bei der Behandlung mit Sulforaphan ließ sich eine Nrf 2-Induktion nachweisen mit vermehrter Expression von antioxidativen und detoxifizierender Enzyme. Weiterhin zeigte sich im Rahmen der Behandlung erniedrigte NF-κB-Level. Bei der Modulation durch Angiotensin II stellte sich zunächst ein signifikant erniedrigtes Level an Nrf 2 in den Zellen dar, das im Verlauf von 24 Stunden anstieg und konsekutiv ließ sich eine maximale Proteinexpression zwischen 24 und 48 Stunden messen. Weiterhin wiesen die Zellen, die mit Angiotensin II behandelt wurden, erhöhte NF-κB Mengen/Zelle auf. Zudem zeigte sich der Einfluss erhöhter Glucosekonzentrationen auf eine progrediente genomischen Instabilität, die Veränderung der Transkriptionsfaktoren mit erhöhter Nrf 2-Induktion und mit Deregulation des Transkriptionsfaktors NF-κB wurde durch die Behandlung mit Sulforaphan nachgewiesen. Aufgrund dieser Rolle in der Tumorgenese sind mittlerweile einige Bestandteile des NF-κB- und des Nrf 2-Signalweges und auch Nrf 2-Aktivatoren wie Sulforaphan wichtige Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Medikamente und Therapieoptionen. Besonders zeigt sich hierbei die Wichtigkeit bei Diabetes induzierten kardiovaskulären Folgeschäden mit frühzeitiger medikamentöser Behandlung. N2 - The starting point of this work is the clinical observation that patients with arterial hypertension develop more renal diseases. The subgroup analysis showed an increased incidence of renal insufficiency and renal cell carcinoma. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS system) has been implicated as a possible pathomechanism. It is postulated that increased angiotensin II levels lead to a mismatch between the oxidation and reduction partners in the cell, which alters the oxidative potential of the cell and results in increased formation of radicals (ROS), most of which contain unpaired electrons in the valence shell or unstable compounds, making them particularly reactive with proteins, lipids, carbohydrates, and DNA. As a result, DNA changes occur in the form of double or single strand breaks, DNA-protein crosslinks, base modifications, and base losses, resulting in a high mutagenic potential. This approach to pathophysiology was also confirmed in the porky kidney cell model. This showed not only a change in genomic stability after exposure to elevated angiotensin II levels, but also a change in DNA depending on the duration of exposure of the cells. Next, modulation of the Nrf 2 and NF-κB transcription factors by angiotensin II and sulforaphane treatment was demonstrated. Treatment with sulforaphane showed Nrf 2 induction with increased expression of antioxidant and detoxifying enzymes. Furthermore, treatment revealed decreased NF-κB levels. When modulated by angiotensin II, cells initially showed a significantly reduced level of Nrf 2, which increased over the course of 24 hours. In addition, cells treated with angiotensin II demonstrated increased NF-κB levels. Moreover, the influence of increased glucose concentrations on progressive genomic instability, the alteration of transcription factors with increased Nrf 2 induction and with deregulation of the transcription factor NF-κB was demonstrated by treatment with sulforaphane. Because of this role in tumorigenesis, some components of the NF-κB and Nrf 2 signaling pathways, as well as Nrf 2 activators such as sulforaphane, are now important targets for the development of new drugs and therapeutic options. The importance of this is particularly evident in diabetes-induced cardiovascular complications with early drug treatment. KW - Oxidativer Stress KW - Angiotensin II KW - Sulforaphan KW - Nrf 2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310573 ER - TY - THES A1 - Schott, Lea Marie T1 - In vitro Untersuchung zur Genotoxizität ausgewählter Pyrrolizidinalkaloide T1 - Assessment of in vitro genotoxicity of selected pyrrolizidine alkaloids N2 - Pyrrolizidinalkaloide (PA) sind sekundäre Pflanzenstoffe, welche über Nahrungsmittel in den menschlichen Organismus gelangen können. Zahlreiche Studien belegen, dass PA in der Leber verstoffwechselt und dabei in aktive genotoxische Metabolite umgewandelt werden. Diese verursachen vor allem in der Leber zelluläre Schäden, was sich klinisch in Form einer hepatischen venösen okklusiven Leberkrankheit, aber auch in der Entstehung von Tumoren zeigt. Die vorliegende Arbeit testet das genotoxische Potential der drei PA Lasiocarpin, Senecionin und Seneciphyllin anhand der Leberzelllinie Huh6 mit Hilfe des Mikrokerntests. Darüber hinaus wird die Wirkung von Lasiocarpin auf den intrazellulären Glutathion-Gehalt, die Superoxidproduktion und das mitochondriale Membranpotential analysiert. Zudem werden sowohl der eventuell negative Einfluss einer Glutathion Depletion, als auch die möglicherweise schützenden Effekte des pflanzlichen Antioxidans Delphinidin in Bezug auf die Genotoxizität von Lasiocarpin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass alle drei ausgewählten PA einen signifikanten Anstieg der Mikrokernfrequenz bewirken.Unsere Messungen zeigten für Lasiocarpin eine dezente Reduktion des Glutathion Gehalts. Dagegen führte eine Glutathion-Depletion in den Huh6 Zellen zu keiner Steigerung der Genotoxizität von Lasiocarpin. In Kombination mit dem Antioxidans Delphinidin zeigte sich für Lasiocarpin eine signifikante Reduktion der Mikrokernfrequenz. Abschließend ist anzumerken, dass in Zukunft vor allem die Wechselwirkung der PA untereinander und mit anderen (Pflanzen-)bestandteilen für eine verbesserte Risikoabschätzung der PA-Exposition untersucht werden sollte. N2 - Pyrrolizidine alkaloids (PA) are secondary plant metabolites that can enter the human organism via food. Numerous studies showed that PA are metabolized in the liver and converted into active genotoxic metabolites. This causes cellular damage, particularly in the liver, which is clinically manifested in the "veno-occlusive-disease". It can also induce the development of tumors. This dissertation investigates the genotoxic potential of the three PA lasiocarpine, senecionine and seneciphylline in the liver cell line Huh6 using the micronucleus test. Furthermore, the effect of lasiocarpine on intracellular glutathione content, superoxide production and mitochondrial membrane potential are analyzed. In addition, the possible negative influence of glutathione depletion as well as the possible protective effects of the plant antioxidant delphinidin on the genotoxicity of lasiocarpine are investigated. It could be shown that all three selected PA cause a significant increase of the micronucleus frequency. Our measurements showed a small reduction of the glutathione content by treatment with lasiocarpine. In contrast, glutathione depletion in Huh6 cells did not lead to an increase in genotoxicity of lasiocarpine. In combination with the antioxidant delphinidin, micronucleus induction by lasiocarpine was reduced. In conclusion, it should be noted, that in the future, the interaction of different PA with each other, but also with other (plant-)components, should be investigated for an improved risk assessment of PA exposure. KW - Pyrrolizidinalkaloide KW - Lasiocarpin KW - Senecionin KW - Seneciphyllin KW - Huh6 KW - Genotoxizität KW - lasiocarpine KW - senecionine KW - seneciphylline KW - huh6 KW - genotoxicity Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241716 ER - TY - JOUR A1 - Schönegge, Anne-Marie A1 - Gallion, Jonathan A1 - Picard, Louis-Philippe A1 - Wilkins, Angela D. A1 - Le Gouill, Christian A1 - Audet, Martin A1 - Stallaert, Wayne A1 - Lohse, Martin J. A1 - Kimmel, Marek A1 - Lichtarge, Olivier A1 - Bouvier, Michel T1 - Evolutionary action and structural basis of the allosteric switch controlling β\(_2\)AR functional selectivity JF - Nature Communications N2 - Functional selectivity of G-protein-coupled receptors is believed to originate from ligand-specific conformations that activate only subsets of signaling effectors. In this study, to identify molecular motifs playing important roles in transducing ligand binding into distinct signaling responses, we combined in silico evolutionary lineage analysis and structure-guided site-directed mutagenesis with large-scale functional signaling characterization and non-negative matrix factorization clustering of signaling profiles. Clustering based on the signaling profiles of 28 variants of the β\(_2\)-adrenergic receptor reveals three clearly distinct phenotypical clusters, showing selective impairments of either the Gi or βarrestin/endocytosis pathways with no effect on Gs activation. Robustness of the results is confirmed using simulation-based error propagation. The structural changes resulting from functionally biasing mutations centered around the DRY, NPxxY, and PIF motifs, selectively linking these micro-switches to unique signaling profiles. Our data identify different receptor regions that are important for the stabilization of distinct conformations underlying functional selectivity. KW - toxicology KW - functional clustering KW - molecular modelling KW - protein design KW - receptor pharmacology Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172268 VL - 8 ER - TY - JOUR A1 - Werner, Rudolf A1 - Wakabayashi, Hiroshi A1 - Bauer, Jochen A1 - Schütz, Claudia A1 - Zechmeister, Christina A1 - Hayakawa, Nobuyuki A1 - Javadi, Mehrbod S. A1 - Lapa, Constantin A1 - Jahns, Roland A1 - Ergün, Süleyman A1 - Jahns, Valerie A1 - Higuchi, Takahiro T1 - Longitudinal \(^{18}\)F-FDG PET imaging in a Rat Model of Autoimmune Myocarditis JF - European Heart Journal Cardiovascular Imaging N2 - Aims: Although mortality rate is very high, diagnosis of acute myocarditis remains challenging with conventional tests. We aimed to elucidate the potential role of longitudinal 2-Deoxy-2-\(^{18}\)F-fluoro-D-glucose (\(^{18}\)F-FDG) positron emission tomography (PET) inflammation monitoring in a rat model of experimental autoimmune myocarditis. Methods and results: Autoimmune myocarditis was induced in Lewis rats by immunizing with porcine cardiac myosin emulsified in complete Freund’s adjuvant. Time course of disease was assessed by longitudinal \(^{18}\)F-FDG PET imaging. A correlative analysis between in- and ex vivo \(^{18}\)F-FDG signalling and macrophage infiltration using CD68 staining was conducted. Finally, immunohistochemistry analysis of the cell-adhesion markers CD34 and CD44 was performed at different disease stages determined by longitudinal \(^{18}\)F-FDG PET imaging. After immunization, myocarditis rats revealed a temporal increase in 18F-FDG uptake (peaked at week 3), which was followed by a rapid decline thereafter. Localization of CD68 positive cells was well correlated with in vivo \(^{18}\)F-FDG PET signalling (R\(^2\) = 0.92) as well as with ex vivo 18F-FDG autoradiography (R\(^2\) = 0.9, P < 0.001, respectively). CD44 positivity was primarily observed at tissue samples obtained at acute phase (i.e. at peak 18F-FDG uptake), while CD34-positive staining areas were predominantly identified in samples harvested at both sub-acute and chronic phases (i.e. at \(^{18}\)F-FDG decrease). Conclusion: \(^{18}\)F-FDG PET imaging can provide non-invasive serial monitoring of cardiac inflammation in a rat model of acute myocarditis. KW - positron emission tomography KW - Myokarditis KW - myocarditis KW - inflammation KW - 18F-FDG KW - PET KW - personalized treatment Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165601 SN - 2047-2404 ER - TY - JOUR A1 - Breitenbach, Tim A1 - Lorenz, Kristina A1 - Dandekar, Thomas T1 - How to steer and control ERK and the ERK signaling cascade exemplified by looking at cardiac insufficiency JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Mathematical optimization framework allows the identification of certain nodes within a signaling network. In this work, we analyzed the complex extracellular-signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) cascade in cardiomyocytes using the framework to find efficient adjustment screws for this cascade that is important for cardiomyocyte survival and maladaptive heart muscle growth. We modeled optimal pharmacological intervention points that are beneficial for the heart, but avoid the occurrence of a maladaptive ERK1/2 modification, the autophosphorylation of ERK at threonine 188 (ERK\(^{Thr188}\) phosphorylation), which causes cardiac hypertrophy. For this purpose, a network of a cardiomyocyte that was fitted to experimental data was equipped with external stimuli that model the pharmacological intervention points. Specifically, two situations were considered. In the first one, the cardiomyocyte was driven to a desired expression level with different treatment strategies. These strategies were quantified with respect to beneficial effects and maleficent side effects and then which one is the best treatment strategy was evaluated. In the second situation, it was shown how to model constitutively activated pathways and how to identify drug targets to obtain a desired activity level that is associated with a healthy state and in contrast to the maleficent expression pattern caused by the constitutively activated pathway. An implementation of the algorithms used for the calculations is also presented in this paper, which simplifies the application of the presented framework for drug targeting, optimal drug combinations and the systematic and automatic search for pharmacological intervention points. The codes were designed such that they can be combined with any mathematical model given by ordinary differential equations. KW - optimal pharmacological modulation KW - efficient intervention points KW - ERK signaling KW - optimal treatment strategies KW - optimal drug targeting KW - optimal drug combination Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285164 SN - 1422-0067 VL - 20 IS - 9 ER - TY - JOUR A1 - Schihada, Hannes A1 - Vandenabeele, Sylvie A1 - Zabel, Ulrike A1 - Frank, Monika A1 - Lohse, Martin J. A1 - Maiellaro, Isabella T1 - A universal bioluminescence resonance energy transfer sensor design enables high-sensitivity screening of GPCR activation dynamics JF - Communications Biology N2 - G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most important classes of drug targets. The discovery of new GCPR therapeutics would greatly benefit from the development of a generalizable high-throughput assay to directly monitor their activation or de-activation. Here we screened a variety of labels inserted into the third intracellular loop and the C-terminus of the alpha(2 Lambda)-adrenergic receptor and used fluorescence (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET) to monitor ligand-binding and activation dynamics. We then developed a universal intramolecular BRET receptor sensor design to quantify efficacy and potency of GPCR ligands in intact cells and real time. We demonstrate the transferability of the sensor design by cloning beta(2)-adrenergic and PTH1-receptor BRET sensors and monitored their efficacy and potency. For all biosensors, the Z factors were well above 0.5 showing the suitability of such design for microtiter plate assays. This technology will aid the identification of novel types of GPCR ligands. KW - Fluorescence resonance energy transfer KW - G protein-coupled receptors KW - High-throughput screening Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-228592 VL - 1 IS - 105 ER - TY - JOUR A1 - Ilin, Alexander A1 - Kulmanov, Murat A1 - Nersesyan, Armen A1 - Stopper, Helga T1 - Genotoxic activity of the new pharmaceutical FS-1 in Salmonella/microsome test and mouse lymphoma L5178Y cells JF - Journal of BUON N2 - Purpose: The purpose of this study was to determine possible genotoxic effects of a new very promising antibacterial/ antiviral drug FS-1. Methods: The drug was tested in TA98, TA100, TA102, TA 1535 and TA1537 strains of Salmonella (Ames test) with and without metabolic activation, and also in mouse lymphoma L5178Y cells by means of micronucleus and comet assays. In microbes the drug was tested at concentrations up to 500 \(\mu\)g/plate and in mouse lymphoma cells up to 2,000 \(\mu\)g/ml. Results: In both test-systems in all experiments completely negative results were obtained although FS-1 was tested at maximum tolerated doses. Conclusions: The drug is not genotoxic. This is advantageous because many antibacterial/antiviral drugs possess such activity. KW - mutagenicity KW - antibacterial/antiviral drug KW - comet assay KW - mouse lymphoma L5178Y KW - Salmonella/microsome assay KW - micronucleus test Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143769 VL - 20 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Mally, Angela A1 - Jarzina, Sebastian T1 - Mapping adverse outcome pathways for kidney injury as a basis for the development of mechanism-based animal-sparing approaches to assessment of nephrotoxicity JF - Frontiers in Toxicology N2 - In line with recent OECD activities on the use of AOPs in developing Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATAs), it is expected that systematic mapping of AOPs leading to systemic toxicity may provide a mechanistic framework for the development and implementation of mechanism-based in vitro endpoints. These may form part of an integrated testing strategy to reduce the need for repeated dose toxicity studies. Focusing on kidney and in particular the proximal tubule epithelium as a key target site of chemical-induced injury, the overall aim of this work is to contribute to building a network of AOPs leading to nephrotoxicity. Current mechanistic understanding of kidney injury initiated by 1) inhibition of mitochondrial DNA polymerase γ (mtDNA Polγ), 2) receptor mediated endocytosis and lysosomal overload, and 3) covalent protein binding, which all present fairly well established, common mechanisms by which certain chemicals or drugs may cause nephrotoxicity, is presented and systematically captured in a formal description of AOPs in line with the OECD AOP development programme and in accordance with the harmonized terminology provided by the Collaborative Adverse Outcome Pathway Wiki. The relative level of confidence in the established AOPs is assessed based on evolved Bradford-Hill weight of evidence considerations of biological plausibility, essentiality and empirical support (temporal and dose-response concordance). KW - adverse outcome pathway KW - nephrotoxicity KW - protein alkylation KW - lysosomal disruption KW - mitochondrial DNA polymerase γ Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284405 SN - 2673-3080 VL - 4 ER - TY - THES A1 - Reiser, Pia T1 - Das Adverse Outcome Pathway (AOP) – Konzept als Grundlage für die Entwicklung mechanistischer tierversuchsfreier Ansätze: Eine Fallstudie über Nephrotoxizität initiiert durch rezeptorvermittelte Endozytose und lysosomalen Overload T1 - The Adverse Outcome Pathway (AOP) concept as a framework for the development of mechanistic non-animal approaches: a case study of nephrotoxicity initiated by receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload N2 - Zur Verbesserung der Prüfung und Risikobewertung der zunehmenden Menge von Chemikalien und Arzneimitteln, gilt es neue Alternativen in Form von in vitro Prüfmethoden mit mechanistisch relevanten Endpunkten zu finden. Einen solchen Rahmen bietet das konzeptionelle Konstrukt des Adverse Outcome Pathway (AOP)- Konzepts. Es erzeugt auf der Basis bestehenden Wissens einen mechanistischen und kausalen Zusammenhang mit Hilfe von mehreren Schlüsselereignissen (Key Event [KE]) zwischen einem initierenden molekularen Ereignis (Molecular Initiating Event [MIE]) und einem adversen Effekt (Adverse Outcome [AO]) auf biologischer Ebene. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der AOP „Rezeptorvermittelte Endozytose und lysosomaler Overload führen zu Nephrotoxizität“ am Zellkulturmodell proximaler Nierentubuluszellen weiterentwickelt. Es wurden in vitro Assays für die Zelllinien RPTEC/TERT1 (Mensch) und NRK-52 E (Ratte) für jedes KE etabliert. In dem AOP wird die Initiierung der Schädigung des Nierengewebes durch rezeptorvermittelte Endozytose der Substanzen (MIE) mit folgendem lysosomalem Overload (KE 1) und der lysosomalen Membranruptur (KE 2) beschrieben. Es kommt zur Zellschädigung (KE 3) und endet mit einem Schaden auf Organebene (AO). Für KE 1 erfolgte die Visualisierung des lysosomal-assoziierten Membranproteins (lysosomal-associated Membranprotein [LAMP]) und in KE 2 die Darstellung der Protease Cathepsin D (CTSD) mittels Immunfluoreszenz. Für KE 3 wurden spezifische Toxizitätsdaten der Testsubstanzen mit dem CellTiter-Glo® Lumineszenz-Zellviabilitätstest generiert. Gewählte Stressoren für den AOP war die Gruppe der Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid), das Aminoglykosid Gentamicin, das Glykopeptid Vancomycin sowie Cadmiumchlorid. In Zusammenschau der Ergebnisse der drei KEs war die Rangfolge der Auswirkungen der drei Polymyxin-Derivate über alle KEs konsistent. Polymyxin B erwies sich als aktivste Substanz, während Polymyxin B Nonapeptid die geringsten Auswirkungen zeigte. Als Ausblick in weiterführenden Analysen der Arbeitsgruppe konnten bei Cadmiumchlorid trotz einer signifikanten Zytotoxizität (KE 3) nur geringe Auswirkungen in der LAMPExpression (KE 1) aufgezeigt werden. Des Weiteren erfolgte die Erstellung von Response-Response-Analysen, um mittels vorgeschalteter Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorhersagen zu können. Projektpartner der Universität Utrecht entwickelten darüber hinaus eine quantitative in vitro in vivo Extrapolation (QIVIVE) mittels eines physiologisch basierten pharmakokinetischen (PBPK) Modells. N2 - To improve testing and risk assessment of the increasing amount of chemicals and drugs, new alternatives of in vitro testing methods with mechanistically relevant endpoints need to be found. The conceptual construct of the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept provides such a framework. It generates a mechanistic and causal relationship based on existing knowledge using multiple key events (KE) between an initiating molecular event (MIE) and an adverse outcome (AO) at a biological level. In this work, the AOP "Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload lead to nephrotoxicity" was further developed using a cell culture model of proximal renal tubular cells. In vitro assays were established for the RPTEC/TERT1 (human) and NRK-52E (rat) cell lines for each KE. In the AOP, initiation of renal tissue damage by receptor-mediated endocytosis of substances (MIE) with subsequent lysosomal overload (KE 1) and lysosomal membrane rupture (KE 2) is described. Cell damage occurs (KE 3) and ends with organ damage (AO). For KE 1, visualization of lysosomal-associated membrane protein (LAMP), and for KE 2, visualization of protease cathepsin D (CTSD) was used by immunofluorescence. For KE 3, specific test substance toxicity data were generated using the CellTiter-Glo® luminescence cell viability assay. Selected stressors for the AOP were polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide), the aminoglycoside gentamicin, the glycopeptide vancomycin, and cadmium chloride. All results of the three KEs combined, the ranking of the effects of the three polymyxin derivatives was consistent across all KEs. Polymyxin B proved to be the most active compound, while polymyxin B nonapeptide showed the lowest effects. In further analyses of the working group, only minor effects in LAMP expression (KE 1) could be shown with cadmium chloride despite a significant cytotoxicity (KE 3). Furthermore, response-response analyses were performed to predict upstream effects by downstream key events. Project partners from Utrecht University also developed a quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) using a physiologically based pharmacokinetic (PBPK) model. KW - Nephrotoxizität KW - Lysosom KW - Endozytose KW - Adverse Outcome Pathway KW - rezeptorvermittelte Endozytose KW - lysosomaler Overload KW - tierversuchsfrei Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-318046 ER - TY - JOUR A1 - Paisdzior, Sarah A1 - Dimitriou, Ioanna Maria A1 - Schöpe, Paul Curtis A1 - Annibale, Paolo A1 - Scheerer, Patrick A1 - Krude, Heiko A1 - Lohse, Martin J. A1 - Biebermann, Heike A1 - Kühnen, Peter T1 - Differential signaling profiles of MC4R mutations with three different ligands JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - The melanocortin 4 receptor (MC4R) is a key player in hypothalamic weight regulation and energy expenditure as part of the leptin–melanocortin pathway. Mutations in this G protein coupled receptor (GPCR) are the most common cause for monogenetic obesity, which appears to be mediated by changes in the anorectic action of MC4R via G\(_S\)-dependent cyclic adenosine-monophosphate (cAMP) signaling as well as other signaling pathways. To study potential bias in the effects of MC4R mutations between the different signaling pathways, we investigated three major MC4R mutations: a G\(_S\) loss-of-function (S127L) and a G\(_S\) gain-of-function mutant (H158R), as well as the most common European single nucleotide polymorphism (V103I). We tested signaling of all four major G protein families plus extracellular regulated kinase (ERK) phosphorylation and β-arrestin2 recruitment, using the two endogenous agonists, α- and β-melanocyte stimulating hormone (MSH), along with a synthetic peptide agonist (NDP-α-MSH). The S127L mutation led to a full loss-of-function in all investigated pathways, whereas V103I and H158R were clearly biased towards the G\(_{q/11}\) pathway when challenged with the endogenous ligands. These results show that MC4R mutations can cause vastly different changes in the various MC4R signaling pathways and highlight the importance of a comprehensive characterization of receptor mutations. KW - Melanocortin 4 receptor (MC4R) KW - Melanocyte stimulating hormones MSH KW - G protein coupled receptor (GPCR) KW - biased signaling Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285108 SN - 1422-0067 VL - 21 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Maurer, Wiebke A1 - Hartmann, Nico A1 - Argyriou, Loukas A1 - Sossalla, Samuel A1 - Streckfuss-Bömeke, Katrin T1 - Generation of homozygous Na\(_{v}\)1.8 knock-out iPSC lines by CRISPR Cas9 genome editing to investigate a potential new antiarrhythmic strategy JF - Stem Cell Research N2 - The sodium channel Na\(_{v}\)1.8, encoded by SCN10A, is reported to contribute to arrhythmogenesis by inducing the late I\(_{Na}\) and thereby enhanced persistent Na\(^{+}\) current. However, its exact electrophysiological role in cardiomyocytes remains unclear. Here, we generated induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a homozygous SCN10A knock-out from a healthy iPSC line by CRISPR Cas9 genome editing. The edited iPSCs maintained full pluripotency, genomic integrity, and spontaneous in vitro differentiation capacity. The iPSCs are able to differentiate into iPSC-cardiomyocytes, hence making it possible to investigate the role of Na\(_{v}\)1.8 in the heart. KW - arrhythmogenesis KW - cardiomyocytes KW - induced pluripotent stem cells Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300936 VL - 60 ER - TY - THES A1 - Eppli, Nenad T1 - Untersuchung des Einflusses der ERK1/2-Autophosphorylierung an Threonin 188 auf Mausherzen mittels transgener Mäuse mit ubiquitärer Überexpression von ERK2\(^{T188D}\) T1 - Study on the effects of autophosphorylation of ERK1/2 at threonine 188 on murine hearts by means of transgenic mice ubiquitiously overexpressing ERK2\(^{T188D}\) N2 - Die ERK2Thr188-Autophosphoylierung stellt einen regulatorischen Signalweg dar, der infolge einer hypertrophen Stimulation die kardiale Hypertrophie begünstigt. Eine Hemmung dieser Phosphorylierung in Kardiomyozyten verhindert die Ausbildung der kardialen Hypertrophie ohne Beeinflussung der kardioprotektiven Funktionen von ERK1/2. Demgegenüber führt die dauerhafte Simulation zu einem gain-of-function-Phänotypen mit ausgeprägter Hypertophie, Fibrose und einer reduzierten Herzfunktion. In dieser Arbeit wurde die dauerhafte Simulation ERK2Thr188-Phosphorylierung (T188D) in einem Mausmodell mit ubiquitärer Expression dieser Mutation untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich nach Stimulation durch TAC in diesen Tieren ein etwas stärkerer hypertropher Phänotyp mit vergrößerten Kardiomyozyten, gesteigerter interstitieller Fibrosierung und reduzierter Herzfunktion ausbildet als in Mäusen mit kardiomyozyten-spezifischer Überexpression diese Mutante. In Fibroblasten- und VSMC-Zelllinien wurde eine gesteigerte Proliferation der T188D-überexprimierenden Zellen im Vergleich zu Kontrollen festgestellt. Somit scheint die ERK2Thr188-Phosphorylierung auch in kardialen Nicht-Myozyten einen maladaptiven Einfluss auf das Herz auszuüben. N2 - Autophosphorylation of ERK2 on threonine 188 is a regulatory signaling pathway facilitating cardiac hypertrophy due to a hypertrophic stimulation. The formation of cardiac hypertrophy can be impaired by inhibition of the phosphorylation without interfering with the cardioprotective functions of ERK1/2. In contrast, permanent stimulation of ERK2Thr188 phosphorylation leads to a gain-of-function phenotype with distinct hypertrophy fibrosis and a reduced cardiac function. Here, we examined a murine model with ubiquitous overexpression of ERK2Thr188 phosphorylation (T188D). We point out that mice showed an increased hypertrophic phenotype with augmented cardiomyocytes, enhanced interstitial fibrosis and reduced cardiac function in response to TAC compared to mice with overexpression of this mutant limited to cardiomyocytes. Fibroblasts and vascular smooth muscle cells overexpressing T188D showed an enhanced proliferation compared to controls. Taken together, the phosphorylation of ERK2 on threonine 188 exerts a maladaptive influence on non-myocytes in the heart as well. KW - Herzhypertrophie KW - cardiac hypertrophy KW - ERK1/2-Autophosphorylierung KW - autophosphorylation of ERK1/2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216558 ER - TY - THES A1 - Zink, Christoph T1 - Biochemische und strukturbiologische Charakterisierung der Inhibition der Pyridoxal 5´-Phosphat Phosphatase durch 7,8-Dihydroxyflavon T1 - Biochemical and structural characterization of pyridoxal 5´-phosphate phosphatase inhibitor 7,8-dihydroxyflavone N2 - Die Pyridoxal-5‘-Phosphat Phosphatase (PDXP), auch bekannt als Chronophin (CIN), ist eine HAD-Phosphatase, die beim Menschen ubiquitär exprimiert wird und eine entscheidende Rolle im zellulären Vitamin-B6-Metabolismus einnimmt. PDXP ist in der Lage Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), die co-enzymatisch aktive Form von Vitamin B6, zu dephosphorylieren. In-vivo Studien mit Mäusen zeigten, dass die Abwesenheit von PDXP mit verbesserten kognitiven Leistungen und einem verringerten Wachstum von Hirntumoren assoziiert ist. Dies begründet die gezielte Suche nach einem pharmakologischen Inhibitor für PDXP. Ein Hochdurchsatz-Screen legte nahe, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) hierfür ein potenzieller Kandidat ist. Zahlreiche Studien beschreiben bereits vielfältige positive neurologische Effekte nach in-vivo Administration von 7,8-DHF, allerdings bleibt der genaue Wirkmechanismus umstritten und wird bis dato nicht mit PDXP in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit ist es, die Inhibition von PDXP durch 7,8-DHF näher zu charakterisieren und damit einen Beitrag zur Beantwortung der Frage zu leisten, ob PDXP an den 7,8-DHF-induzierten Effekten beteiligt ist. Hierzu wurde der Effekt von 7,8-DHF auf die enzymatische Aktivität von rekombinant hergestelltem, gereinigtem PDXP in in-vitro Phosphatase-Assays charakterisiert. Um die Selektivität von 7,8-DHF gegenüber PDXP zu untersuchen, wurden fünf weitere HAD-Phosphatasen getestet. Unter den analysierten Phosphatasen zeigte einzig die dem PDXP nah verwandte Phosphoglykolat Phosphatase (PGP) eine geringer ausgeprägte Sensitivität gegen 7,8-DHF. Ein Vergleich von 7,8-DHF mit sechs strukturell verwandten, hydroxylierten Flavonen zeigte, dass 7,8-DHF unter den getesteten Substanzen die höchste Potenz und Effektivität aufwies. Außerdem wurde eine Co-Kristallisation von PDXP mit 7,8-DHF durchgeführt, deren Struktur bis zu einer Auflösung von 2,0 Å verfeinert werden konnte. Die in der Kristallstruktur identifizierte Bindungsstelle von 7,8-DHF an PDXP wurde mittels verschiedener, neu generierter PDXP-Mutanten enzymkinetisch bestätigt. Zusammenfassend zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse, dass 7,8-DHF ein direkter, selektiver und vorwiegend kompetitiver Inhibitor der PDXP-Aktivität ist, mit einer IC50 im submikromolaren Bereich. Die Ergebnisse dieser in-vitro Untersuchungen motivieren zu weiterer Forschung bezüglich der 7,8-DHF-vermittelten Inhibition der PDXP-Aktivität in Zellen, um die Frage beantworten zu können, ob PDXP auch in-vivo ein relevantes Target für 7,8-DHF darstellt. N2 - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase (PDXP, also known as chronophin, CIN), is a ubiquitously expressed HAD-phosphatase. PDXP is known to dephosphorylate pyridoxal-5'-phosphate (PLP), the biologically active form of vitamin B6 that is one of the most versatile cofactors found in nature. In-vivo studies revealed improved cognition and impaired glial tumor growth with mice absent of PDXP, and caused the search for a pharmacological inhibitor of PDXP. The result of a high-throughput screen suggested that 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) is a suitable candidate for this. Interestingly, numerous scientific studies highlighted diverse positive neurological effects after administration of 7,8-DHF to mice, however, the precise mode of action remains disputed, and at this date is unrelated to PDXP. The aim of this work is to characterize the inhibition of PDXP by 7,8-DHF. This approach is a first step to determine whether 7,8-DHF may indeed exert some of its neurological effects via PDXP inhibition. For this purpose, the effect of 7,8-DHF on the enzymatic activity of recombinantly expressed and purified PDXP was characterized in in-vitro phosphatase assays. To investigate the selectivity of 7,8-DHF on PDXP, five additional HAD phosphatases were tested. Among the phosphatases analyzed, only the phosphoglycolate phosphatase (PGP), closely related to PDXP, showed a less pronounced sensitivity to 7,8-DHF. A comparison of 7,8-DHF with six structurally related, hydroxylated flavones showed that 7,8-DHF had the highest potency and effectiveness among the substances tested. In addition, a co-crystallization of PDXP with 7,8-DHF was carried out. The resulting co-crystal structure could be resolved and refined to a resolution of 2.0 Å. The binding site of the ligand to the enzyme identified in the crystal structure was confirmed via activity-based assays using various newly generated PDXP mutants. In summary, the results described here show that 7,8-DHF is a direct, selective, and predominantly competitive inhibitor of PDXP activity with an IC50 in the submicromolar range. The results of these in-vitro studies motivate further research into the 7,8-DHF-mediated inhibition of PDXP activity in cells to be able to answer the question of whether PDXP is also a relevant target for 7,8-DHF in-vivo. KW - Pyridoxalphosphat KW - Pyridoxalphosphat Phosphatase KW - PDXP KW - 7,8-Dihydroxyflavon KW - 7,8-dihydroxyflavone KW - Chronophin KW - Pyridoxal phosphate phosphatase Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251511 ER - TY - JOUR A1 - Nwogha, Jeremiah S. A1 - Abtew, Wosene G. A1 - Raveendran, Muthurajan A1 - Oselebe, Happiness O. A1 - Obidiegwu, Jude E. A1 - Chilaka, Cynthia A. A1 - Amirtham, Damodarasamy D. T1 - Role of non-structural sugar metabolism in regulating tuber dormancy in white yam (Dioscorea rotundata) JF - Agriculture N2 - Changes in sugar composition occur continuously in plant tissues at different developmental stages. Tuber dormancy induction, stability, and breaking are very critical developmental transitions in yam crop production. Prolonged tuber dormancy after physiological maturity has constituted a great challenge in yam genetic improvement and productivity. In the present study, biochemical profiling of non-structural sugar in yam tubers during dormancy was performed to determine the role of non-structural sugar in yam tuber dormancy regulation. Two genotypes of the white yam species, one local genotype (Obiaoturugo) and one improved genotype (TDr1100873), were used for this study. Tubers were sampled at 42, 56, 87, 101, 115, and 143 days after physiological maturity (DAPM). Obiaoturugo exhibited a short dormant phenotype and sprouted at 101-DAPM, whereas TDr1100873 exhibited a long dormant phenotype and sprouted at 143-DAPM. Significant metabolic changes were observed in non-structural sugar parameters, dry matter, and moisture content in Obiaoturugo from 56-DAPM, whereas in TDr1100873, significant metabolic changes were observed from 101-DAPM. It was observed that the onset of these metabolic changes occurred at a point when the tubers of both genotypes exhibited a dry matter content of 60%, indicating that a dry matter content of 60% might be a critical threshold for white yam tuber sprouting. Non-reducing sugars increased by 9–10-fold during sprouting in both genotypes, which indicates their key role in tuber dormancy regulation in white yam. This result implicates that some key sugar metabolites can be targeted for dormancy manipulation of the yam crop. KW - sugars KW - metabolism KW - yam KW - tuber KW - genotypes KW - dormancy KW - regulation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-304486 SN - 2077-0472 VL - 13 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Hadi, Naji Said Aboud A1 - Bankoglu, Ezgi Eyluel A1 - Stopper, Helga T1 - Genotoxicity of pyrrolizidine alkaloids in metabolically inactive human cervical cancer HeLa cells co-cultured with human hepatoma HepG2 cells JF - Archives of Toxicology N2 - Pyrrolizidine alkaloids (PAs) are secondary plant metabolites, which can be found as contaminant in various foods and herbal products. Several PAs can cause hepatotoxicity and liver cancer via damaging hepatic sinusoidal endothelial cells (HSECs) after hepatic metabolization. HSECs themselves do not express the required metabolic enzymes for activation of PAs. Here we applied a co-culture model to mimic the in vivo hepatic environment and to study PA-induced effects on not metabolically active neighbour cells. In this co-culture model, bioactivation of PA was enabled by metabolically capable human hepatoma cells HepG2, which excrete the toxic and mutagenic pyrrole metabolites. The human cervical epithelial HeLa cells tagged with H2B-GFP were utilized as non-metabolically active neighbours because they can be identified easily based on their green fluorescence in the co-culture. The PAs europine, riddelliine and lasiocarpine induced micronuclei in HepG2 cells, and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Metabolic inhibition of cytochrome P450 enzymes with ketoconazole abrogated micronucleus formation. The efflux transporter inhibitors verapamil and benzbromarone reduced micronucleus formation in the co-culture model. Furthermore, mitotic disturbances as an additional genotoxic mechanism of action were observed in HepG2 cells and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Overall, we were able to show that PAs were activated by HepG2 cells and the metabolites induced genomic damage in co-cultured HeLa cells. KW - co-culture KW - micronuclei KW - mitotic disturbance KW - cytochrome P450s KW - membrane transporters KW - pyrrolizidine alkaloids Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-324708 VL - 97 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Bittner, Nataly A1 - Boon, Andy A1 - Delbanco, Evert H. A1 - Walter, Christof A1 - Mally, Angela T1 - Assessment of aromatic amides in printed food contact materials: analysis of potential cleavage to primary aromatic amines during simulated passage through the gastrointestinal tract JF - Archives of Toxicology N2 - Recent analyses conducted by German official food control reported detection of the aromatic amides N-(2,4-dimethylphenyl)acetamide (NDPA), N-acetoacetyl-m-xylidine (NAAX) and 3-hydroxy-2-naphthanilide (Naphthol AS) in cold water extracts from certain food contact materials made from paper or cardboard, including paper straws, paper napkins, and cupcake liners. Because aromatic amides may be cleaved to potentially genotoxic primary amines upon oral intake, these findings raise concern that transfer of NDPA, NAAX and Naphthol AS from food contact materials into food may present a risk to human health. The aim of the present work was to assess the stability of NDPA, NAAX and Naphthol AS and potential cleavage to 2,4-dimethylaniline (2,4-DMA) and aniline during simulated passage through the gastrointestinal tract using static in vitro digestion models. Using the digestion model established by the National Institute for Public Health and the Environment (RIVM, Bilthoven, NL) and a protocol recommended by the European Food Safety Authority, potential hydrolysis of the aromatic amides to the respective aromatic amines was assessed by LC–MS/MS following incubation of the aromatic amides with digestive fluid simulants. Time-dependent hydrolysis of NDPA and NAAX resulting in formation of the primary aromatic amine 2,4-DMA was consistently observed in both models. The highest rate of cleavage of NDPA and NAAX was recorded following 4 h incubation with 0.07 M HCl as gastric-juice simulant, and amounted to 0.21% and 0.053%, respectively. Incubation of Naphthol AS with digestive fluid simulants did not give rise to an increase in the concentration of aniline above the background that resulted from the presence of aniline as an impurity of the test compound. Considering the lack of evidence for aniline formation from Naphthol AS and the extremely low rate of hydrolysis of the amide bonds of NDPA and NAAX during simulated passage through the gastrointestinal tract that gives rise to only very minor amounts of the potentially mutagenic and/or carcinogenic aromatic amine 2,4-DMA, risk assessment based on assumption of 100% cleavage to the primary aromatic amines would appear to overestimate health risks related to the presence of aromatic amides in food contact materials. KW - aromatic amides KW - primary aromatic amine KW - food contact materials KW - simulated digestion Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-324697 VL - 96 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Naseem, Muhammad A1 - Othman, Eman M. A1 - Fathy, Moustafa A1 - Iqbal, Jibran A1 - Howari, Fares M. A1 - AlRemeithi, Fatima A. A1 - Kodandaraman, Geema A1 - Stopper, Helga A1 - Bencurova, Elena A1 - Vlachakis, Dimitrios A1 - Dandekar, Thomas T1 - Integrated structural and functional analysis of the protective effects of kinetin against oxidative stress in mammalian cellular systems JF - Scientific Reports N2 - Metabolism and signaling of cytokinins was first established in plants, followed by cytokinin discoveries in all kingdoms of life. However, understanding of their role in mammalian cells is still scarce. Kinetin is a cytokinin that mitigates the effects of oxidative stress in mammalian cells. The effective concentrations of exogenously applied kinetin in invoking various cellular responses are not well standardized. Likewise, the metabolism of kinetin and its cellular targets within the mammalian cells are still not well studied. Applying vitality tests as well as comet assays under normal and hyper-oxidative states, our analysis suggests that kinetin concentrations of 500 nM and above cause cytotoxicity as well as genotoxicity in various cell types. However, concentrations below 100 nM do not cause any toxicity, rather in this range kinetin counteracts oxidative burst and cytotoxicity. We focus here on these effects. To get insights into the cellular targets of kinetin mediating these pro-survival functions and protective effects we applied structural and computational approaches on two previously testified targets for these effects. Our analysis deciphers vital residues in adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and adenosine receptor (A2A-R) that facilitate the binding of kinetin to these two important human cellular proteins. We finally discuss how the therapeutic potential of kinetin against oxidative stress helps in various pathophysiological conditions. KW - cytokinins KW - 6-benzylaminopurine Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231317 VL - 10 ER - TY - JOUR A1 - Maiellaro, Isabella A1 - Lohse, Martin J. A1 - Kitte, Robert J. A1 - Calebiro, Davide T1 - cAMP Signals in Drosophila Motor Neurons Are Confined to Single Synaptic Boutons JF - Cell Reports N2 - The second messenger cyclic AMP (cAMP) plays an important role in synaptic plasticity. Although there is evidence for local control of synaptic transmission and plasticity, it is less clear whether a similar spatial confinement of cAMP signaling exists. Here, we suggest a possible biophysical basis for the site-specific regulation of synaptic plasticity by cAMP, a highly diffusible small molecule that transforms the physiology of synapses in a local and specific manner. By exploiting the octopaminergic system of Drosophila, which mediates structural synaptic plasticity via a cAMP-dependent pathway, we demonstrate the existence of local cAMP signaling compartments of micrometer dimensions within single motor neurons. In addition, we provide evidence that heterogeneous octopamine receptor localization, coupled with local differences in phosphodiesterase activity, underlies the observed differences in cAMP signaling in the axon, cell body, and boutons. KW - cAMP KW - synaptic plasticity KW - PDE KW - octopamine KW - FRET KW - active zone KW - dunce KW - GPCR Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162324 VL - 17 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Weigand, Isabel A1 - Ronchi, Cristina L. A1 - Vanselow, Jens T. A1 - Bathon, Kerstin A1 - Lenz, Kerstin A1 - Herterich, Sabine A1 - Schlosser, Andreas A1 - Kroiss, Matthias A1 - Fassnacht, Martin A1 - Calebiro, Davide A1 - Sbiera, Silviu T1 - PKA Cα subunit mutation triggers caspase-dependent RIIβ subunit degradation via Ser\(^{114}\) phosphorylation JF - Science Advances N2 - Mutations in the PRKACA gene are the most frequent cause of cortisol-producing adrenocortical adenomas leading to Cushing’s syndrome. PRKACA encodes for the catalytic subunit α of protein kinase A (PKA). We already showed that PRKACA mutations lead to impairment of regulatory (R) subunit binding. Furthermore, PRKACA mutations are associated with reduced RIIβ protein levels; however, the mechanisms leading to reduced RIIβ levels are presently unknown. Here, we investigate the effects of the most frequent PRKACA mutation, L206R, on regulatory subunit stability. We find that Ser\(^{114}\) phosphorylation of RIIβ is required for its degradation, mediated by caspase 16. Last, we show that the resulting reduction in RIIβ protein levels leads to increased cortisol secretion in adrenocortical cells. These findings reveal the molecular mechanisms and pathophysiological relevance of the R subunit degradation caused by PRKACA mutations, adding another dimension to the deregulation of PKA signaling caused by PRKACA mutations in adrenal Cushing’s syndrome. KW - mutation triggers KW - phosphorylation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270445 VL - 7 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Awad, Eman A1 - Othman, Eman M. A1 - Stopper, Helga T1 - Effects of resveratrol, lovastatin and the mTOR-inhibitor RAD-001 on insulin-induced genomic damage in vitro JF - Molecules N2 - Diabetes mellitus (DM) is one of the major current health problems due to lifestyle changes. Before diagnosis and in the early years of disease, insulin blood levels are elevated. However, insulin generates low levels of reactive oxygen species (ROS) which are integral to the regulation of a variety of intracellular signaling pathways, but excess levels of insulin may also lead to DNA oxidation and DNA damage. Three pharmaceutical compounds, resveratrol, lovastatin and the mTOR-inhibitor RAD-001, were investigated due to their known beneficial effects. They showed protective properties against genotoxic damage and significantly reduced ROS after in vitro treatment of cultured cells with insulin. Therefore, the selected pharmaceuticals may be attractive candidates to be considered for support of DM therapy. KW - genomic damage KW - insulin KW - resveratrol KW - lovastatin KW - mTOR-inhibitor RAD-001 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159260 VL - 22 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Lohse, Christian A1 - Bock, Andreas A1 - Maiellaro, Isabella A1 - Hannawacker, Annette A1 - Schad, Lothar R. A1 - Lohse, Martin J. A1 - Bauer, Wolfgang R. T1 - Experimental and mathematical analysis of cAMP nanodomains JF - PLoS ONE N2 - In their role as second messengers, cyclic nucleotides such as cAMP have a variety of intracellular effects. These complex tasks demand a highly organized orchestration of spatially and temporally confined cAMP action which should be best achieved by compartmentalization of the latter. A great body of evidence suggests that cAMP compartments may be established and maintained by cAMP degrading enzymes, e.g. phosphodiesterases (PDEs). However, the molecular and biophysical details of how PDEs can orchestrate cAMP gradients are entirely unclear. In this paper, using fusion proteins of cAMP FRET-sensors and PDEs in living cells, we provide direct experimental evidence that the cAMP concentration in the vicinity of an individual PDE molecule is below the detection limit of our FRET sensors (<100nM). This cAMP gradient persists in crude cytosol preparations. We developed mathematical models based on diffusion-reaction equations which describe the creation of nanocompartments around a single PDE molecule and more complex spatial PDE arrangements. The analytically solvable equations derived here explicitly determine how the capability of a single PDE, or PDE complexes, to create a nanocompartment depend on the cAMP degradation rate, the diffusive mobility of cAMP, and geometrical and topological parameters. We apply these generic models to our experimental data and determine the diffusive mobility and degradation rate of cAMP. The results obtained for these parameters differ by far from data in literature for free soluble cAMP interacting with PDE. Hence, restricted cAMP diffusion in the vincinity of PDE is necessary to create cAMP nanocompartments in cells. KW - fluorescence resonance energy transfer KW - yellow fluorescent protein KW - radii KW - adenylyl cyclase signaling cascade KW - cell fusion KW - cytosol KW - isoproterenol KW - absorption KW - cyclic nucleotides such as cyclic adenosine monophosphate Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170972 VL - 12 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Schupp, Nicole A1 - Stopper, Helga A1 - Heidland, August T1 - DNA Damage in Chronic Kidney Disease: Evaluation of Clinical Biomarkers JF - Oxidative Medicine and Cellular Longevity N2 - Patients with chronic kidney disease (CKD) exhibit an increased cancer risk compared to a healthy control population. To be able to estimate the cancer risk of the patients and to assess the impact of interventional therapies thereon, it is of particular interest to measure the patients’ burden of genomic damage. Chromosomal abnormalities, reduced DNA repair, and DNA lesions were found indeed in cells of patients with CKD. Biomarkers for DNA damage measurable in easily accessible cells like peripheral blood lymphocytes are chromosomal aberrations, structural DNA lesions, and oxidatively modified DNA bases. In this review the most common methods quantifying the three parameters mentioned above, the cytokinesis-block micronucleus assay, the comet assay, and the quantification of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, are evaluated concerning the feasibility of the analysis and regarding the marker’s potential to predict clinical outcomes. KW - chronic kidney disease KW - cancer risk KW - DNA damage KW - biomarkers Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166569 VL - 2016 IS - 3592042 ER - TY - JOUR A1 - Fathy, Moustafa A1 - Fawzy, Michael Atef A1 - Hintzsche, Henning A1 - Nikaido, Toshio A1 - Dandekar, Thomas A1 - Othman, Eman M. T1 - Eugenol exerts apoptotic effect and modulates the sensitivity of HeLa cells to cisplatin and radiation JF - Molecules N2 - Eugenol is a phytochemical present in different plant products, e.g., clove oil. Traditionally, it is used against a number of different disorders and it was suggested to have anticancer activity. In this study, the activity of eugenol was evaluated in a human cervical cancer (HeLa) cell line and cell proliferation was examined after treatment with various concentrations of eugenol and different treatment durations. Cytotoxicity was tested using lactate dehydrogenase (LDH) enzyme leakage. In order to assess eugenol’s potential to act synergistically with chemotherapy and radiotherapy, cell survival was calculated after eugenol treatment in combination with cisplatin and X-rays. To elucidate its mechanism of action, caspase-3 activity was analyzed and the expression of various genes and proteins was checked by RT-PCR and western blot analyses. Eugenol clearly decreased the proliferation rate and increased LDH release in a concentration- and time-dependent manner. It showed synergistic effects with cisplatin and X-rays. Eugenol increased caspase-3 activity and the expression of Bax, cytochrome c (Cyt-c), caspase-3, and caspase-9 and decreased the expression of B-cell lymphoma (Bcl)-2, cyclooxygenase-2 (Cox-2), and interleukin-1 beta (IL-1β) indicating that eugenol mainly induced cell death by apoptosis. In conclusion, eugenol showed antiproliferative and cytotoxic effects via apoptosis and also synergism with cisplatin and ionizing radiation in the human cervical cancer cell line. KW - eugenol KW - HeLa cells KW - cisplatin KW - radiation KW - apoptosis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193227 SN - 1420-3049 VL - 24 IS - 21 ER - TY - JOUR A1 - Wölfel, Angela A1 - Sättele, Mathias A1 - Zechmeister, Christina A1 - Nikolaev, Viacheslov O. A1 - Lohse, Martin J. A1 - Boege, Fritz A1 - Jahns, Roland A1 - Boivin-Jahns, Valérie T1 - Unmasking features of the auto-epitope essential for β\(_1\)-adrenoceptor activation by autoantibodies in chronic heart failure JF - ESC Heart Failure N2 - Aims Chronic heart failure (CHF) can be caused by autoantibodies stimulating the heart via binding to first and/or second extracellular loops of cardiac β1-adrenoceptors. Allosteric receptor activation depends on conformational features of the autoantibody binding site. Elucidating these features will pave the way for the development of specific diagnostics and therapeutics. Our aim was (i) to fine-map the conformational epitope within the second extracellular loop of the human β\(_1\)-adrenoceptor (β1ECII) that is targeted by stimulating β\(_1\)-receptor (auto)antibodies and (ii) to generate competitive cyclopeptide inhibitors of allosteric receptor activation, which faithfully conserve the conformational auto-epitope. Methods and results Non-conserved amino acids within the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop (compared with the amino acids constituting the ECII loop of the β\(_2\)-adrenoceptor) were one by one replaced with alanine; potential intra-loop disulfide bridges were probed by cysteine–serine exchanges. Effects on antibody binding and allosteric receptor activation were assessed (i) by (auto)antibody neutralization using cyclopeptides mimicking β1ECII ± the above replacements, and (ii) by (auto)antibody stimulation of human β\(_1\)-adrenoceptors bearing corresponding point mutations. With the use of stimulating β\(_1\)-receptor (auto)antibodies raised in mice, rats, or rabbits and isolated from exemplary dilated cardiomyopathy patients, our series of experiments unmasked two features of the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop essential for (auto)antibody binding and allosteric receptor activation: (i) the NDPK\(^{211–214}\) motif and (ii) the intra-loop disulfide bond C\(^{209}\)↔C\(^{215}\). Of note, aberrant intra-loop disulfide bond C\(^{209}\)↔C\(^{216}\) almost fully disrupted the functional auto-epitope in cyclopeptides. Conclusions The conformational auto-epitope targeted by cardio-pathogenic β\(_1\)-receptor autoantibodies is faithfully conserved in cyclopeptide homologues of the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop bearing the NDPK\(^{211–214}\) motif and the C\(^{209}\)↔C\(^{215}\) bridge while lacking cysteine C216. Such molecules provide promising tools for novel diagnostic and therapeutic approaches in β\(_1\)-autoantibodypositive CHF. KW - antibody/autoantibody KW - β1-adrenoceptor/β1-adrenergic receptor KW - chronic heart failure KW - conformational auto-epitope KW - cyclic peptides/cyclopeptides KW - cyclopeptide therapy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235974 VL - 7 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Scholz, Nicole A1 - Guan, Chonglin A1 - Nieberler, Matthias A1 - Grotmeyer, Alexander A1 - Maiellaro, Isabella A1 - Gao, Shiqiang A1 - Beck, Sebastian A1 - Pawlak, Matthias A1 - Sauer, Markus A1 - Asan, Esther A1 - Rothemund, Sven A1 - Winkler, Jana A1 - Prömel, Simone A1 - Nagel, Georg A1 - Langenhan, Tobias A1 - Kittel, Robert J T1 - Mechano-dependent signaling by Latrophilin/CIRL quenches cAMP in proprioceptive neurons JF - eLife N2 - Adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs), a large molecule family with over 30 members in humans, operate in organ development, brain function and govern immunological responses. Correspondingly, this receptor family is linked to a multitude of diverse human diseases. aGPCRs have been suggested to possess mechanosensory properties, though their mechanism of action is fully unknown. Here we show that the Drosophila aGPCR Latrophilin/dCIRL acts in mechanosensory neurons by modulating ionotropic receptor currents, the initiating step of cellular mechanosensation. This process depends on the length of the extended ectodomain and the tethered agonist of the receptor, but not on its autoproteolysis, a characteristic biochemical feature of the aGPCR family. Intracellularly, dCIRL quenches cAMP levels upon mechanical activation thereby specifically increasing the mechanosensitivity of neurons. These results provide direct evidence that the aGPCR dCIRL acts as a molecular sensor and signal transducer that detects and converts mechanical stimuli into a metabotropic response. KW - Latrophilin KW - adhesion GPCR KW - dCIRL KW - sensory physiology KW - metabotropic signalling KW - mechanotransduction Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170520 VL - 6 IS - e28360 ER - TY - JOUR A1 - Gmach, Philipp A1 - Bathe-Peters, Marc A1 - Telugu, Narasimha A1 - Miller, Duncan C. A1 - Annibale, Paolo T1 - Fluorescence spectroscopy of low-level endogenous β-adrenergic receptor expression at the plasma membrane of differentiating human iPSC-derived cardiomyocytes JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - The potential of human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to be differentiated into cardiomyocytes (CMs) mimicking adult CMs functional morphology, marker genes and signaling characteristics has been investigated since over a decade. The evolution of the membrane localization of CM-specific G protein-coupled receptors throughout differentiation has received, however, only limited attention to date. We employ here advanced fluorescent spectroscopy, namely linescan Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), to observe how the plasma membrane abundance of the β\(_1\)- and β\(_2\)-adrenergic receptors (β\(_{1/2}\)-ARs), labelled using a bright and photostable fluorescent antagonist, evolves during the long-term monolayer culture of hiPSC-derived CMs. We compare it to the kinetics of observed mRNA levels in wildtype (WT) hiPSCs and in two CRISPR/Cas9 knock-in clones. We conduct these observations against the backdrop of our recent report of cell-to-cell expression variability, as well as of the subcellular localization heterogeneity of β-ARs in adult CMs. KW - GPCR KW - β-adrenergic receptors KW - hiPSC-CM KW - cardiomyocyte KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - FCS KW - fluorescence KW - CRISPR/Cas9 KW - differentiation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288277 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 18 ER - TY - JOUR A1 - Schanbacher, Constanze A1 - Hermanns, Heike M. A1 - Lorenz, Kristina A1 - Wajant, Harald A1 - Lang, Isabell T1 - Complement 1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs): structure, receptors and signaling JF - Biomedicines N2 - Adiponectin and the other 15 members of the complement 1q (C1q)/tumor necrosis factor (TNF)-related protein (CTRP) family are secreted proteins composed of an N-terminal variable domain followed by a stalk region and a characteristic C-terminal trimerizing globular C1q (gC1q) domain originally identified in the subunits of the complement protein C1q. We performed a basic PubMed literature search for articles mentioning the various CTRPs or their receptors in the abstract or title. In this narrative review, we briefly summarize the biology of CTRPs and focus then on the structure, receptors and major signaling pathways of CTRPs. Analyses of CTRP knockout mice and CTRP transgenic mice gave overwhelming evidence for the relevance of the anti-inflammatory and insulin-sensitizing effects of CTRPs in autoimmune diseases, obesity, atherosclerosis and cardiac dysfunction. CTRPs form homo- and heterotypic trimers and oligomers which can have different activities. The receptors of some CTRPs are unknown and some receptors are redundantly targeted by several CTRPs. The way in which CTRPs activate their receptors to trigger downstream signaling pathways is largely unknown. CTRPs and their receptors are considered as promising therapeutic targets but their translational usage is still hampered by the limited knowledge of CTRP redundancy and CTRP signal transduction. KW - adiponectin KW - AMPK KW - C1q/TNF related protein (CTRP) KW - inflammation KW - metabolism Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-304136 SN - 2227-9059 VL - 11 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Janz, Anna A1 - Walz, Katharina A1 - Cirnu, Alexandra A1 - Surjanto, Jessica A1 - Urlaub, Daniela A1 - Leskien, Miriam A1 - Kohlhaas, Michael A1 - Nickel, Alexander A1 - Brand, Theresa A1 - Nose, Naoko A1 - Wörsdörfer, Philipp A1 - Wagner, Nicole A1 - Higuchi, Takahiro A1 - Maack, Christoph A1 - Dudek, Jan A1 - Lorenz, Kristina A1 - Klopocki, Eva A1 - Ergün, Süleyman A1 - Duff, Henry J. A1 - Gerull, Brenda T1 - Mutations in DNAJC19 cause altered mitochondrial structure and increased mitochondrial respiration in human iPSC-derived cardiomyocytes JF - Molecular Metabolism N2 - Highlights • Loss of DNAJC19's DnaJ domain disrupts cardiac mitochondrial structure, leading to abnormal cristae formation in iPSC-CMs. • Impaired mitochondrial structures lead to an increased mitochondrial respiration, ROS and an elevated membrane potential. • Mutant iPSC-CMs show sarcomere dysfunction and a trend to more arrhythmias, resembling DCMA-associated cardiomyopathy. Background Dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA) is an autosomal recessive disorder arising from truncating mutations in DNAJC19, which encodes an inner mitochondrial membrane protein. Clinical features include an early onset, often life-threatening, cardiomyopathy associated with other metabolic features. Here, we aim to understand the metabolic and pathophysiological mechanisms of mutant DNAJC19 for the development of cardiomyopathy. Methods We generated induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) of two affected siblings with DCMA and a gene-edited truncation variant (tv) of DNAJC19 which all lack the conserved DnaJ interaction domain. The mutant iPSC-CMs and their respective control cells were subjected to various analyses, including assessments of morphology, metabolic function, and physiological consequences such as Ca\(^{2+}\) kinetics, contractility, and arrhythmic potential. Validation of respiration analysis was done in a gene-edited HeLa cell line (DNAJC19tv\(_{HeLa}\)). Results Structural analyses revealed mitochondrial fragmentation and abnormal cristae formation associated with an overall reduced mitochondrial protein expression in mutant iPSC-CMs. Morphological alterations were associated with higher oxygen consumption rates (OCRs) in all three mutant iPSC-CMs, indicating higher electron transport chain activity to meet cellular ATP demands. Additionally, increased extracellular acidification rates suggested an increase in overall metabolic flux, while radioactive tracer uptake studies revealed decreased fatty acid uptake and utilization of glucose. Mutant iPSC-CMs also showed increased reactive oxygen species (ROS) and an elevated mitochondrial membrane potential. Increased mitochondrial respiration with pyruvate and malate as substrates was observed in mutant DNAJC19tv HeLa cells in addition to an upregulation of respiratory chain complexes, while cellular ATP-levels remain the same. Moreover, mitochondrial alterations were associated with increased beating frequencies, elevated diastolic Ca\(^{2+}\) concentrations, reduced sarcomere shortening and an increased beat-to-beat rate variability in mutant cell lines in response to β-adrenergic stimulation. Conclusions Loss of the DnaJ domain disturbs cardiac mitochondrial structure with abnormal cristae formation and leads to mitochondrial dysfunction, suggesting that DNAJC19 plays an essential role in mitochondrial morphogenesis and biogenesis. Moreover, increased mitochondrial respiration, altered substrate utilization, increased ROS production and abnormal Ca\(^{2+}\) kinetics provide insights into the pathogenesis of DCMA-related cardiomyopathy. KW - cell biology KW - molecular biology KW - dilated cardiomyopathy with ataxia KW - genetics KW - metabolism KW - mitochondria KW - OXPHOS KW - ROS KW - contractility Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350393 SN - 2212-8778 VL - 79 ER - TY - JOUR A1 - Guth, Sabine A1 - Hüser, Stephanie A1 - Roth, Angelika A1 - Degen, Gisela A1 - Diel, Patrick A1 - Edlund, Karolina A1 - Eisenbrand, Gerhard A1 - Engel, Karl-Heinz A1 - Epe, Bernd A1 - Grune, Tilman A1 - Heinz, Volker A1 - Henle, Thomas A1 - Humpf, Hans-Ulrich A1 - Jäger, Henry A1 - Joost, Hans-Georg A1 - Kulling, Sabine E. A1 - Lampen, Alfonso A1 - Mally, Angela A1 - Marchan, Rosemarie A1 - Marko, Doris A1 - Mühle, Eva A1 - Nitsche, Michael A. A1 - Röhrdanz, Elke A1 - Stadler, Richard A1 - van Thriel, Christoph A1 - Vieths, Stefan A1 - Vogel, Rudi F. A1 - Wascher, Edmund A1 - Watzl, Carsten A1 - Nöthlings, Ute A1 - Hengstler, Jan G. T1 - Contribution to the ongoing discussion on fluoride toxicity JF - Archives of Toxicology N2 - Since the addition of fluoride to drinking water in the 1940s, there have been frequent and sometimes heated discussions regarding its benefits and risks. In a recently published review, we addressed the question if current exposure levels in Europe represent a risk to human health. This review was discussed in an editorial asking why we did not calculate benchmark doses (BMD) of fluoride neurotoxicity for humans. Here, we address the question, why it is problematic to calculate BMDs based on the currently available data. Briefly, the conclusions of the available studies are not homogeneous, reporting negative as well as positive results; moreover, the positive studies lack control of confounding factors such as the influence of well-known neurotoxicants. We also discuss the limitations of several further epidemiological studies that did not meet the inclusion criteria of our review. Finally, it is important to not only focus on epidemiological studies. Rather, risk analysis should consider all available data, including epidemiological, animal, as well as in vitro studies. Despite remaining uncertainties, the totality of evidence does not support the notion that fluoride should be considered a human developmental neurotoxicant at current exposure levels in European countries. KW - pharmacology/toxicology KW - occupational medicine/industrial medicine KW - environmental health KW - biomedicine, general Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-307161 SN - 0340-5761 SN - 1432-0738 VL - 95 IS - 7 ER - TY - JOUR A1 - Barile, Frank A. A1 - Berry, Colin A1 - Blaauboer, Bas A1 - Boobis, Alan A1 - Bolt, Herrmann M. A1 - Borgert, Christopher A1 - Dekant, Wolfgang A1 - Dietrich, Daniel A1 - Domingo, Jose L. A1 - Galli, Corrado L. A1 - Gori, Gio Batta A1 - Greim, Helmut A1 - Hengstler, Jan G. A1 - Heslop-Harrison, Pat A1 - Kacew, Sam A1 - Marquardt, Hans A1 - Mally, Angela A1 - Pelkonen, Olavi A1 - Savolainen, Kai A1 - Testai, Emanuela A1 - Tsatsakis, Aristides A1 - Vermeulen, Nico P. T1 - The EU chemicals strategy for sustainability: in support of the BfR position JF - Archives of Toxicology N2 - The EU chemicals strategy for sustainability (CSS) asserts that both human health and the environment are presently threatened and that further regulation is necessary. In a recent Guest Editorial, members of the German competent authority for risk assessment, the BfR, raised concerns about the scientific justification for this strategy. The complexity and interdependence of the networks of regulation of chemical substances have ensured that public health and wellbeing in the EU have continuously improved. A continuous process of improvement in consumer protection is clearly desirable but any initiative directed towards this objective must be based on scientific knowledge. It must not confound risk with other factors in determining policy. This conclusion is fully supported in the present Commentary including the request to improve both, data collection and the time-consuming and bureaucratic procedures that delay the publication of regulations. KW - pharmacology/toxicology KW - occupational medicine/industrial medicine KW - environmental health KW - biomedicine, general Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-307154 SN - 0340-5761 SN - 1432-0738 VL - 95 IS - 9 ER - TY - JOUR A1 - Rebs, Sabine A1 - Streckfuss-Bömeke, Katrin T1 - How can we use stem cell-derived cardiomyocytes to understand the involvement of energetic metabolism in alterations of cardiac function? JF - Frontiers in Molecular Medicine N2 - Mutations in the mitochondrial-DNA or mitochondria related nuclear-encoded-DNA lead to various multisystemic disorders collectively termed mitochondrial diseases. One in three cases of mitochondrial disease affects the heart muscle, which is called mitochondrial cardiomyopathy (MCM) and is associated with hypertrophic, dilated, and noncompact cardiomyopathy. The heart is an organ with high energy demand, and mitochondria occupy 30%–40% of its cardiomyocyte-cell volume. Mitochondrial dysfunction leads to energy depletion and has detrimental effects on cardiac performance. However, disease development and progression in the context of mitochondrial and nuclear DNA mutations, remains incompletely understood. The system of induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes (CM) is an excellent platform to study MCM since the unique genetic identity to their donors enables a robust recapitulation of the predicted phenotypes in a dish on a patient-specific level. Here, we focus on recent insights into MCM studied by patient-specific iPSC-CM and further discuss research gaps and advances in metabolic maturation of iPSC-CM, which is crucial for the study of mitochondrial dysfunction and to develop novel therapeutic strategies. KW - mitochondrial cardiomyopathy KW - iPSC-cardiomyocytes KW - maturation strategies KW - Barth syndrome KW - Friedreich’s ataxia KW - lysosomal storage disorders Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327344 VL - 3 ER - TY - INPR A1 - Brenner, Marian A1 - Zink, Christoph A1 - Witzinger, Linda A1 - Keller, Angelika A1 - Hadamek, Kerstin A1 - Bothe, Sebastian A1 - Neuenschwander, Martin A1 - Villmann, Carmen A1 - von Kries, Jens Peter A1 - Schindelin, Hermann A1 - Jeanclos, Elisabeth A1 - Gohla, Antje T1 - 7,8-Dihydroxyflavone is a direct inhibitor of pyridoxal phosphatase T2 - eLife N2 - Vitamin B6 deficiency has been linked to cognitive impairment in human brain disorders for decades. Still, the molecular mechanisms linking vitamin B6 to these pathologies remain poorly understood, and whether vitamin B6 supplementation improves cognition is unclear as well. Pyridoxal phosphatase (PDXP), an enzyme that controls levels of pyridoxal 5’-phosphate (PLP), the co-enzymatically active form of vitamin B6, may represent an alternative therapeutic entry point into vitamin B6-associated pathologies. However, pharmacological PDXP inhibitors to test this concept are lacking. We now identify a PDXP and age-dependent decline of PLP levels in the murine hippocampus that provides a rationale for the development of PDXP inhibitors. Using a combination of small molecule screening, protein crystallography and biolayer interferometry, we discover and analyze 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) as a direct and potent PDXP inhibitor. 7,8-DHF binds and reversibly inhibits PDXP with low micromolar affinity and sub-micromolar potency. In mouse hippocampal neurons, 7,8-DHF increases PLP in a PDXP-dependent manner. These findings validate PDXP as a druggable target. Of note, 7,8-DHF is a well-studied molecule in brain disorder models, although its mechanism of action is actively debated. Our discovery of 7,8-DHF as a PDXP inhibitor offers novel mechanistic insights into the controversy surrounding 7,8-DHF-mediated effects in the brain. KW - 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) KW - pyridoxal phosphatase (PDXP) KW - vitamin B6 KW - PDXP inhibitors Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350446 ER - TY - JOUR A1 - Djelić, Ninoslav A1 - Borozan, Sunčica A1 - Dimitrijević-Srećković, Vesna A1 - Pajović, Nevena A1 - Mirilović, Milorad A1 - Stopper, Helga A1 - Stanimirović, Zoran T1 - Oxidative stress and DNA damage in peripheral blood mononuclear cells from normal, obese, prediabetic and diabetic persons exposed to thyroid hormone in vitro JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Diabetes, a chronic group of medical disorders characterized byhyperglycemia, has become a global pandemic. Some hormones may influence the course and outcome of diabetes, especially if they potentiate the formation of reactive oxygen species (ROS). There is a close relationship between thyroid disorders and diabetes. The main objective of this investigation was to find out whether peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are more prone to DNA damage by triiodothyronine (T\(_3\)) (0.1, 1 and 10 μM) at various stages of progression through diabetes (obese, prediabetics, and type 2 diabetes mellitus—T2DM persons). In addition, some biochemical parameters of oxidative stress (catalase-CAT, thiobarbituric acid reactive substances—TBARS) and lactate dehydrogenase (LDH) were evaluated. PBMCs from prediabetic and diabetic patients exhibited increased sensitivity for T\(_3\) regarding elevated level of DNA damage, inhibition of catalase, and increase of TBARS and LDH. PBMCs from obese patients reacted in the same manner, except for DNA damage. The results of this study should contribute to a better understanding of the role of thyroid hormones in the progression of T2DM. KW - diabetes KW - oxidative stress KW - DNA damage KW - lymphocytes KW - thyroid hormone Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285988 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 16 ER - TY - THES A1 - Horn, Daniela T1 - Kardiotoxizität von CTRPs und das Vorkommen der CTRP-Rezeptoren in Kardiomyozyten T1 - Cardiotoxicity of CTRPs and the presence of CTRP receptors in cardiomyocytes N2 - Die C1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs) sind eine Ligandenfamilie aus sezernierten Plasmaproteinen, welche sich in ihrem Grundbauplan ähneln. Daten aus der Literatur deuten darauf hin, dass sie zum Teil positive Effekte auf den Stoffwechsel und das Herz-Kreislaufsystem besitzen und somit eine mögliche therapeutische Zielstruktur darstellen. Während für manche CTRPs bereits Rezeptoren identifiziert werden konnten, ist für andere immer noch nicht geklärt, an welche Rezeptoren sie binden oder über welche sie diese Wirkungen erzielen. Um die CTRPs zukünftig therapeutisch nutzen zu können, muss die Wirkung der CTRPs auf verschiedene Zellen weiter analysiert werden. Dafür wurden in dieser Arbeit Zellen, auf die Expression bereits bekannter CTRP-Rezeptoren hin, untersucht. Des Weiteren wurden die durch CTRP2, CTRP3, CTRP4, CTRP9A, CTRP10, CTRP11, CTRP13 und CTRP14 induzierten Änderungen in der ATP- und Laktatproduktion als Surrogatparameter für Kardiotoxizität in den Kardiomyozytenzelllinien H9c2 und AC16 getestet, um potenziell kardiotoxische Wirkungen frühzeitig erkennen zu können. Es konnte gezeigt werden, dass die CTRPs sicher für Kardiomyozyten zu sein scheinen, was eine wichtige Grundlage für die therapeutische Nutzbarkeit darstellt. N2 - C1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs) are a ligand family of secreted plasma proteins that are similar in their basic structure. Literature on the subject indicate that some of them have positive effects on the metabolism and the cardiovascular system and therefore represent a potential therapeutic target structure. While some receptors have already been identified for some CTRPs, for others it is still not clear which receptors they bind to or through which they achieve these effects. In order to be able to use the CTRPs therapeutically in the future, the effect of the CTRPs on different cells must be further analyzed. For that cells were examined in this study for the expression of already known CTRP receptors. Furthermore, CTRP2, CTRP3, CTRP4, CTRP9A, CTRP10, CTRP11, CTRP13 and CTRP14 were tested in the cardiomyocyte cell lines H9c2 and AC16 with respect to their effect on production of ATP and lactate as surrogate parameters for cardiotoxicity in order to be able to recognize potentially cardiotoxic effects at an early stage. It was shown that the CTRPs appear to be safe for cardiomyocytes, which is an important basis for therapeutic utility. KW - Herzmuskelzelle KW - Zelllinie KW - CTRP KW - C1q/tumor necrosis factor-related proteins KW - Kardiomyozyten Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349029 ER - TY - JOUR A1 - Eberl, Hanna A1 - Rebs, Sabine A1 - Hoppe, Stefanie A1 - Sedaghat-Hamedani, Farbod A1 - Kayvanpour, Elham A1 - Meder, Benjamin A1 - Streckfuss-Bömeke, Katrin T1 - Generation of an RBM20-mutation-associated left-ventricular non-compaction cardiomyopathy iPSC line (UMGi255-A) into a DCM genetic background to investigate monogenetic cardiomyopathies JF - Stem Cell Research N2 - RBM20 mutations account for 3 % of genetic cardiomypathies and manifest with high penetrance and arrhythmogenic effects. Numerous mutations in the conserved RS domain have been described as causing dilated cardiomyopathy (DCM), whereas a particular mutation (p.R634L) drives development of a different cardiac phenotype: left-ventricular non-compaction cardiomyopathy. We generated a mutation-induced pluripotent stem cell (iPSC) line in which the RBM20-LVNC mutation p.R634L was introduced into a DCM patient line with rescued RBM20-p.R634W mutation. These DCM-634L-iPSC can be differentiated into functional cardiomyocytes to test whether this RBM20 mutation induces development of the LVNC phenotype within the genetic context of a DCM patient. KW - cell biology KW - developmental biology KW - general medicine KW - RBM20 mutations KW - DCM genetic background KW - monogenetic cardiomyopathies Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350565 SN - 1873-5061 VL - 74 ER - TY - JOUR A1 - Bankoglu, Ezgi Eyluel A1 - Stipp, Franzisca A1 - Gerber, Johanna A1 - Seyfried, Florian A1 - Heidland, August A1 - Bahner, Udo A1 - Stopper, Helga T1 - Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay JF - Archives of Toxicology N2 - The comet assay is a commonly used method to determine DNA damage and repair activity in many types of samples. In recent years, the use of the comet assay in human biomonitoring became highly attractive due to its various modified versions, which may be useful to determine individual susceptibility in blood samples. However, in human biomonitoring studies, working with large sample numbers that are acquired over an extended time period requires some additional considerations. One of the most important issues is the storage of samples and its effect on the outcome of the comet assay. Another important question is the suitability of different blood preparations. In this study, we analysed the effect of cryopreservation on DNA damage and repair activity in human blood samples. In addition, we investigated the suitability of different blood preparations. The alkaline and FPG as well as two different types of repair comet assay and an in vitro hydrogen peroxide challenge were applied. Our results confirmed that cryopreserved blood preparations are suitable for investigating DNA damage in the alkaline and FPG comet assay in whole blood, buffy coat and PBMCs. Ex vivo hydrogen peroxide challenge yielded its optimal effect in isolated PBMCs. The utilised repair comet assay with either UVC or hydrogen peroxide-induced lesions and an aphidicolin block worked well in fresh PBMCs. Cryopreserved PBMCs could not be used immediately after thawing. However, a 16-h recovery with or without mitotic stimulation enabled the application of the repair comet assay, albeit only in a surviving cell fraction. KW - human biomonitoring KW - DNA damage KW - DNA repair KW - comet assay KW - blood samples Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-265326 VL - 95 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Christian, Gentzsch A1 - Seier, Kerstin A1 - Drakopoulos, Antonios A1 - Jobin, Marie-Lise A1 - Lanoiselée, Yann A1 - Koszegi, Zsombor A1 - Maurel, Damien A1 - Sounier, Rémy A1 - Hübner, Harald A1 - Gmeiner, Peter A1 - Granier, Sébastien A1 - Calebiro, Davide A1 - Decker, Michael T1 - Selective and Wash‐Resistant Fluorescent Dihydrocodeinone Derivatives Allow Single‐Molecule Imaging of μ‐Opioid Receptor Dimerization JF - Angewandte Chemie International Edition N2 - μ‐Opioid receptors (μ‐ORs) play a critical role in the modulation of pain and mediate the effects of the most powerful analgesic drugs. Despite extensive efforts, it remains insufficiently understood how μ‐ORs produce specific effects in living cells. We developed new fluorescent ligands based on the μ‐OR antagonist E‐p‐nitrocinnamoylamino‐dihydrocodeinone (CACO), that display high affinity, long residence time and pronounced selectivity. Using these ligands, we achieved single‐molecule imaging of μ‐ORs on the surface of living cells at physiological expression levels. Our results reveal a high heterogeneity in the diffusion of μ‐ORs, with a relevant immobile fraction. Using a pair of fluorescent ligands of different color, we provide evidence that μ‐ORs interact with each other to form short‐lived homodimers on the plasma membrane. This approach provides a new strategy to investigate μ‐OR pharmacology at single‐molecule level. KW - single-molecule microscopy KW - fluorescent probes KW - G-protein coupled receptor KW - homodimerization KW - opioid ligands Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212398 VL - 59 IS - 15 ER - TY - JOUR A1 - Godbole, Amod A1 - Lyga, Sandra A1 - Lohse, Martin J. A1 - Calebiro, Davide T1 - Internalized TSH receptors en route to the TGN induce local G\(_{S}\)-protein signaling and gene transcription JF - Nature Communications N2 - A new paradigm of G-protein-coupled receptor (GPCR) signaling at intracellular sites has recently emerged, but the underlying mechanisms and functional consequences are insufficiently understood. Here, we show that upon internalization in thyroid cells, endogenous TSH receptors traffic retrogradely to the trans-Golgi network (TGN) and activate endogenous Gs-proteins in the retromer-coated compartment that brings them to the TGN. Receptor internalization is associated with a late cAMP/protein kinase A (PKA) response at the Golgi/TGN. Blocking receptor internalization, inhibiting PKA II/interfering with its Golgi/TGN localization, silencing retromer or disrupting Golgi/TGN organization all impair efficient TSH-dependent cAMP response element binding protein (CREB) phosphorylation. These results suggest that retrograde trafficking to the TGN induces local G\(_{S}\)-protein activation and cAMP/PKA signaling at a critical position near the nucleus, which appears required for efficient CREB phosphorylation and gene transcription. This provides a new mechanism to explain the functional consequences of GPCR signaling at intracellular sites and reveals a critical role for the TGN in GPCR signaling. KW - G protein-coupled receptors KW - fluorescence imaging KW - hormone receptors KW - trans-Golgi network Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170375 VL - 8 IS - 443 ER - TY - JOUR A1 - Maurer, Jana A1 - Hupp, Sabrina A1 - Bischoff, Carolin A1 - Foertsch, Christina A1 - Mitchell, Timothy J. A1 - Chakraborty, Trinad A1 - Iliev, Asparouh I. T1 - Distinct neurotoxicity profile of listeriolysin O from \(Listeria\) \(monocytogenes\) JF - Toxins N2 - Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs) are protein toxins that originate from Gram-positive bacteria and contribute substantially to their pathogenicity. CDCs bind membrane cholesterol and build prepores and lytic pores. Some effects of the toxins are observed in non-lytic concentrations. Two pathogens, \(Streptococcus\) \(pneumoniae\) and \(Listeria\) \(monocytogenes\), cause fatal bacterial meningitis, and both produce toxins of the CDC family—pneumolysin and listeriolysin O, respectively. It has been demonstrated that pneumolysin produces dendritic varicosities (dendrite swellings) and dendritic spine collapse in the mouse neocortex, followed by synaptic loss and astrocyte cell shape remodeling without elevated cell death. We utilized primary glial cultures and acute mouse brain slices to examine the neuropathological effects of listeriolysin O and to compare it to pneumolysin with identical hemolytic activity. In cultures, listeriolysin O permeabilized cells slower than pneumolysin did but still initiated non-lytic astrocytic cell shape changes, just as pneumolysin did. In an acute brain slice culture system, listeriolysin O produced dendritic varicosities in an NMDA-dependent manner but failed to cause dendritic spine collapse and cortical astrocyte reorganization. Thus, listeriolysin O demonstrated slower cell permeabilization and milder glial cell remodeling ability than did pneumolysin and lacked dendritic spine collapse capacity but exhibited equivalent dendritic pathology. KW - medicine KW - listeriolysin O KW - meningitis KW - acute slices KW - variocosities KW - dendritic spines Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172130 VL - 9 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Cirkel, Nanett Christin T1 - Beeinflussung des oxidativen Stress-Status in einem Rattenmodell: Effekt von Selenmangel auf Niere und Leber T1 - Influenceability of Oxidative Stress for a Rat Model: Effect of Selenium Deficiency on Kidney and Liver N2 - Das Spurenelement Selen und Vitamin E reduzieren reaktive Sauerstoff Spezies (ROS). Bei Mangel dieser wichtigen Stoffe erhöht sich die Konzentration an ROS und der oxidative Stress steigt. Unter erhöhten ROS entstehen vermehrt DNA-Schäden und Lipidperoxidationen. Das ROS Wasserstoffperoxid wird zu Wasser über das Enzym Gluthationperxoidase reduziert. Dessen Aktivität steigert Selen um den Faktor 100-1.000. Das Aktivitätsmaximum des Enzyms liegt bei einer täglichen Selenaufnahme von 60-80 Mikrogramm/Tag. Dadurch wird die Menge an ROS reduziert und der oxidative Stress in der Zelle nimmt ab. Vitamin E fungiert als Radikalfänger. Sein Derivat alpha- Tocopherol besitzt die höchste antioxidative Wirkung und kann Lipidperoxidationen unterbrechen. Die vorliegende Arbeit untersucht Auswirkungen von oxidativem Stress, den ein Mangel von Selen und Vitamin E in der Nahrung bei 6 Monate und 12 Monate alten Tieren auf Leber und Niere verursacht. Der Nachweis von oxidativem Stress erfolgte über sogenannte Hitzeschockproteine HSP70 und Hämoxygenase 1. HSP 70 wird auch unter physiologischen Bedingungen exprimiert. Es wirkt als Chaperon und ist u.a. für die korrekte Faltung und Stabilisierung von Proteinen zuständig. Die Versuche zeigten, dass im Alter in der Niere die HSP70 Konzentration ansteigt und die Zelle unter vermehrtem oxidativen Stress leidet. Entsprechende Literaturergebnisse wurden bestätigt. Die Hämoxygenase 1 (HO-1) ist ein Schlüsselenzym, das vermehrt bei oxidativem Stress gebildet wird. Hoch reaktionsfreudige und freie Blutbestandteile katalysiert die Hämoxygenase. Einen Abfall der HO- 1 Konzentration zeigten Untersuchungen von Leber und Niere bei Selen, - Vitamin E Mangel und höherem Lebensalter. Gründe für die verminderte Expression sind noch wenig erforscht. Die vermehrte Anreicherung von Superoxidanionradikalen wurde in den Geweben von Leber und Niere über Dihydroethidium (DHE) Färbung nachgewiesen. Die Hypothese wurde bestätigt, dass bei Selen, -Vitamin E Mangelnahrung und höherem Alter vermehrter oxidativer Stress entsteht. Selenmangel begünstigt die Entstehung verschiedener Krankheiten, z.B. Krebs, koronale Herzerkrankung und vor allem die Keshan-Krankheit, die den Herzmuskel befällt. Selen nimmt positiven Einfluss auf Körperfunktionen: Fertilität, embryonalen Entwicklung und Entwicklung eines Neugeborenen. Einige Fragen bleiben ungeklärt: Welche physiologischen Entwicklungsprozesse fördert Selen? Nimmt Selen eine wichtige Funktion bei der Befruchtung der Eizelle ein? Wie beeinflusst Selen die Entwicklung des Gehirns? Dem Spurenelement Selen kommen offensichtlich neben seiner Bedeutung zur Minderung des oxidativen Stresses noch weitere wichtige Funktionen zu, die bisher wenig untersucht wurden. N2 - The trace element Selenium and vitamin E reduce reactive oxygen species (ROS). Under increased ROS concentration occur augmented DNA damage and lipid peroxidation. Selenium and vitamin E deficiency in nutrition of rats of 6 and 12 months causes oxidative stress in kidney and liver. Oxidative stress has been proved by heat shock protein HSP70 and Heme Oxygenase-1 (HO-1). By higher age HSP70 concentration in kidney rises and the cells suffer from increased oxidative stress. Selenium and vitamin E deficiency as well as higher age cause a decrease in concentration of HO-1 in liver and kidney, which is increasingly synthesized by oxidative stress. KW - Oxidativer Stress KW - Selenmangel KW - Vitamin E Mangel Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163631 ER - TY - THES A1 - Soliman, Alexander T1 - Einfluss des Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und den DNS-Schaden in adipösen Patient*innen nach bariatrischer Chirurgie T1 - Influence of bariatric surgery induced weight loss on oxidative stress and DNA damage in obese patients N2 - Adipositas ist eine Erkrankung, die durch ein erhöhtes Krebsrisiko neben zahlreichen anderen Komorbiditäten mit weitreichenden Folgen für die Gesundheit adipöser Patient*innen einhergeht. In der Pathogenese der adipositas-assoziierten Krebsarten sind dabei ein erhöhter oxidativer Stress sowie die damit einhergehende Schädigung der DNS maßgeblich beteiligt. Im Umkehrschluss wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss eines durch bariatrische Chirurgie induzierten Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und DNS-Schaden in adipösen Patient*innen anhand von Blutproben präoperativ sowie 6 und 12 Monate postoperativ untersucht. In einer Subpopulation der Patient*innen konnte eine tendenzielle Verringerung des DNS-Schadens anhand des Comet-Assays in peripheren Lymphozyten beobachtet werden. Im Hinblick auf den oxidativen Stress wurde im Plasma die Eisenreduktionsfähigkeit als Maß für die antioxidative Kapazität sowie Malondialdehyd als Surrogatmarker für das Ausmaß an Lipidperoxidation bestimmt. Weiterhin wurde in Erythrozyten das Gesamtglutathion und das oxidierte Glutathion bestimmt. Die oxidativen Stressparameter zeigten insgesamt nach einer initialen Zunahme im oxidativen Stress 6 Monate postoperativ eine rückläufige Tendenz im oxidativen Stress am Studienende. Somit geben die Beobachtungen dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, dass adipöse Patient*innen durch einen bariatrisch induzierten Gewichtsverlust von einer Verringerung des Krebsrisikos profitieren könnten. N2 - Obesity is a disease that is linked with a higher risk of cancer among other comorbidities of obese patients. Especially oxidative stress and DNA damage have been shown to play a major role in the pathogenesis of obesity associated cancers. Therefore the aim of this study was to examine the effect of a massive weight loss induced by bariatric surgery on oxidative stress and DNA damage in whole blood samples of obese patients at 6 and 12 month after bariatric surgery. In a subpopulation of the study population a tending decrease in DNA damage in peripheral lymphocytes could be observed. Concerning oxidative stress parameters, determination of ferric-reducing antioxidative power and malondialdehyde levels as a marker for lipidperoxidation were carried out on plasma samples. Furthermore total and oxidised glutathione levels were determined in erythrocytes of patients. In synopsis oxidative stress parameters indicated an initial increase in oxidative stress 6 month after bariatric surgery and a decreasing trend at the end of the study. These findings give hope that obese patients may benefit from a reduced cancer risk through bariatric surgery induced weight loss. KW - Magenchirurgie KW - Adipositas KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - DNS-Schaden KW - bariatrische Chirurgie KW - DNA damage KW - bariatric surgery KW - oxidative stress Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-278354 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht; die ursprüngliche Veröffentlichung war am: 09.03.2022 ER - TY - JOUR A1 - Bauer, Benedikt A1 - Mally, Angela A1 - Liedtke, Daniel T1 - Zebrafish embryos and larvae as alternative animal models for toxicity testing JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Prerequisite to any biological laboratory assay employing living animals is consideration about its necessity, feasibility, ethics and the potential harm caused during an experiment. The imperative of these thoughts has led to the formulation of the 3R-principle, which today is a pivotal scientific standard of animal experimentation worldwide. The rising amount of laboratory investigations utilizing living animals throughout the last decades, either for regulatory concerns or for basic science, demands the development of alternative methods in accordance with 3R to help reduce experiments in mammals. This demand has resulted in investigation of additional vertebrate species displaying favourable biological properties. One prominent species among these is the zebrafish (Danio rerio), as these small laboratory ray-finned fish are well established in science today and feature outstanding biological characteristics. In this review, we highlight the advantages and general prerequisites of zebrafish embryos and larvae before free-feeding stages for toxicological testing, with a particular focus on cardio-, neuro, hepato- and nephrotoxicity. Furthermore, we discuss toxicokinetics, current advances in utilizing zebrafish for organ toxicity testing and highlight how advanced laboratory methods (such as automation, advanced imaging and genetic techniques) can refine future toxicological studies in this species. KW - danio rerio KW - alternative methods KW - organ toxicity KW - 3R KW - transgenic animals Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284225 SN - 1422-0067 VL - 22 IS - 24 ER -