TY - THES A1 - Fazeli, Gholamreza T1 - Signaling in the induction of genomic damage by endogenous compounds T1 - Signalwege bei der Induktion von Genomschäden durch endogene Substanzen N2 - Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated in cells and are involved in physiological processes including signal transduction but also their damaging effects on biological molecules have been well described. A number of reports in the literature implicate excessive oxidative stress and/or inadequate antioxidant defense in the pathogenesis of cancer, atherosclerosis, chronic and age related disorders. Several studies have indicated that activation of the renin-angiotensin-aldosterone-system can lead to the formation of ROS. Epidemiological studies have revealed higher renal cell cancer incidences and also higher cancer mortalities in hypertensive individuals. Recently, our group has shown that perfusion of the isolated mouse kidney with Ang II or treatment of several cell lines with Ang II leads to formation of DNA damage and oxidative base modifications. Here, we tried to scrutinize the pathway involved in genotoxicity of Ang II. We confirmed the genotoxicity of Ang II in two kidney cell lines of human origin. Ang II treatment led to the production of superoxide anions which we could hinder when we used the membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic TEMPOL. One of the enzymes which is activated in the cells after Ang II treatment and is able to produce ROS is NADPH oxidase. We demonstrated the activation of NADPH oxidase in response to Ang II by upregulation of its p47 subunit using RT-PCR. Also, pPhosphorylation of p47 subunit of NADPH oxidase after Ang II treatment was enhanced. Using two inhibitors we showed that NADPH oxidase inhibition completely prevents DNA damage by Ang II treatment. To differentiate between Nox2 and Nox4 isoforms of NADPH oxidase subunits in the genotoxicity of Ang II, we performed siRNA inhibition and found a role only for Nox4, while Nox2 was not involved. Next, we investigated PKC as a potential activator of NADPH oxidase. We showed that PKC becomes phosphorylated after Ang II treatment and also that inhibition of PKC hinders Ang II from damaging the cells. Our results from using several inhibitors of different parts of the pathway revealed that PKC activation in this pathway is dependent on the action of PLC on membrane phospholipids and production of IP3. IP3 binds to its receptor at endoplasmic reticulum (ER), opening a channel which allows calcium efflux into the cytoplasm. In this manner, both ER calcium stores and extracellular calcium cooperate so that Ang II can exert its genotoxic effect. PLC is activated by AT1R stimulation. We could also show that the genotoxicity of Ang II is mediated via AT1R signaling using the AT1R antagonist candesartan. In conclusion, here we have shown that Ang II is able to damage genomic damage in cell lines of kidney origin. The observed damage is associated with production of ROS. A decrease in Ang II-induced DNA damage was observed after inhibition of G-proteins, PLC, PKC and NADPH oxidase and interfering with intra- as well as extracellular calcium signaling. This leads to the following preliminary model of signaling in Ang II-induced DNA damage: binding of Ang II to the AT1 receptor activates PLC via stimulation of G-proteins, resulting in the activation of PKC in a calcium dependent manner which in turn, activates NADPH oxidase. NADPH oxidase with involvement of its Nox4 subunit then produces reactive oxygen species which cause DNA damage. Dopamine content and metabolism in the peripheral lymphocytes of PD patients are influenced by L-Dopa administration. The PD patients receiving a high dose of L-Dopa show a significantly higher content of dopamine in their lymphocytes compared to PD patients who received a low dose of L-Dopa or the healthy control. Central to many of the processes involved in oxidative stress and oxidative damage in PD are the actions of monoamine oxidase (MAO), the enzyme which is responsible for the enzymatic oxidation of dopamine which leadsing to production of H2O2 as a by-product. We investigated whether dopamine oxidation can cause genotoxicity in lymphocytes of PD patents who were under high dose L-Dopa therapy and afterward questioned the occurrence of DNA damage after dopamine treatment in vitro and tried to reveal the mechanism by which dopamine exerts its genotoxic effect. The frequency of micronuclei in peripheral blood lymphocytes of the PD patients was not elevated compared to healthy age-matched individuals, although the formation of micronuclei revealed a positive correlation with the daily dose of L-Dopa administration in patients who received L-Dopa therapy together with dopamine receptor agonists. In vitro, we describe an induction of genomic damage detected as micronucleus formation by low micromolar concentrations in cell lines with of different tissue origins. The genotoxic effect of dopamine was reduced by addition of the antioxidants TEMPOL and dimethylthiourea which proved the involvement of ROS production in dopamine-induced DNA damage. To determine whether oxidation of dopamine by MAO is relevant in its genotoxicity, we inhibited MAO with two inhibitors, trans-2-phenylcyclopropylamine hydrochloride (PCPA) and Ro 16-6491 which both reduced the formation of micronuclei in PC-12 cells. We also studied the role of the dopamine transporter (DAT) and dopamine type 2 receptor (D2R) signaling in the genotoxicity of dopamine. Inhibitors of the DAT, GBR-12909 and nomifensine, hindered dopamine-induced genotoxicity. These results were confirmed by treatment of MDCK and MDCK-DAT cells, the latter containing the human DAT gene, with dopamine. Only MDCK-DAT cells showed elevated chromosomal damage and dopamine uptake. Although stimulation of D2R with quinpirole in the absence of dopamine did not induce genotoxicity in PC-12 cells, interference with D2R signaling using D2R antagonist and inhibition of G-proteins, phosphoinositide 3 kinase and extracellular signal-regulated kinases reduced dopamine-induced genotoxicity and affected the ability of DAT to take up dopamine. Furthermore, the D2R antagonist sulpiride inhibited the dopamine-induced migration of DAT from cytosol to cell membrane. Overall, the neurotransmitter dopamine causes DNA damage and oxidative stress in vitro. There are also indications that high dose L-Dopa therapy might lead to oxidative stress. Dopamine exerts its genotoxicity in vitro upon transport into the cells and oxidization oxidation by MAO. Transport of dopamine by DAT has the central role in this process. D2R signaling is involved in the genotoxicity of dopamine by affecting activation and cell surface expression of DAT and hence modulating dopamine uptake. We provided evidences for receptor-mediated genotoxicity of two compounds with different mechanism of actions. The involvement of these receptors in many human complications urges more investigations to reveal whether abnormalities in the endogenous compounds-mediated signaling can play a role in the initiation of new conditions like carcinogenesis. N2 - Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden kontinuierlich in Zellen generiert und sind an physiologischen Prozessen wie der Signaltransduktion beteiligt. Aber auch ihre schädigenden Auswirkungen auf biologische Moleküle sind seit langem bekannt. Eine Reihe von Literaturberichten sieht einen Zusammenhang zwischen übermäßigem oxidativen Stress oder einer unzureichenden antioxidativen Verteidigung und Krebs, Atherosklerose und chronischen bzw. altersbedingten Erkrankungen. Mehrere Studien haben belegt, dass die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems zur Bildung von ROS führen kann. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Nierenkarzinom-Inzidenzen und -Mortalitäten bei Hypertonikern erhöht sind. Vor kurzem konnte unsere Gruppe zeigen, dass die Perfusion von isolierten Maäusen-Nieren und dieoder Behandlung mehrerer Zelllinien mit Angiotensin II (Ang II) zur Bildung von DNA-Schäden und oxidativen Basenmodifikationen führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Signalwege der Genotoxizität von Ang II zu bestimmen. Wir bestätigten dDie Genotoxiziät von Ang II in zwei Nieren-Zelllinien humaner Herkunft konnte bestätigt werden. Wir zeigten, dass Ang II-Behandlung zur Produktion von Superoxid-Anionen führt, die durch das membrangängige Superoxid-Dismutase-Mimetikum TEMPOL verhindert werden kann. Eines der Enzyme, das in den Zellen nach Ang II-Behandlung aktiviert wird und ROS produzieren kann, ist die NADPH-Oxidase. Die mittels RT-PCR gemessene Hochregulierung von p47 beweist die Aktivierung der NADPH-Oxidase nach Ang II-Behandlung. Auch die Phosphorylierung von p47 nach Ang II-Behandlung wurde gesteigert. Mittels zweier Inhibitoren zeigten wir, dass NADPH-Oxidase-Hemmung DNA-Schäden durch Ang II-Behandlung vollständig verhindert. Wir versuchten, die Rolle der Nox2- und Nox4-Isoformen der NADPH-Oxidase-Untereinheiten bei der Genotoxizität von Ang II zu differenzieren. Hemmung mittels siRNA bestätigte nur eine Beteiligung der Nox4. Anschließend überprüften wir die Rolle der PKC als potentiellem Aktivator der NADPH-Oxidase. Wir zeigten, dass die PKC nach Ang II-Behandlung PKC phosphoryliert wird und durch die Hemmung der PKC Ang II-induzierten Schäden verhindert werdenird. Die Verwendung mehrerer Inhibitoren der verschiedenen Teile des Signalweges zeigte, dass die PKC-Aktivierung von der Reaktion der PLC mit Membranphospholipiden und der Produktion von IP3 und DAG abhängig ist. IP3 bindet an seinen Rezeptor am Endoplasmatischen Retikulum (ER)., dDie in der Folge auftretende Öffnung eines Kanals ermöglicht einen Calcium-Ausstrom in das Cytoplasma. Auf diese Weise sind sowohl ER-Calcium als auch extrazelluläres Calcium an der Ang II-induzierten genotoxische Wirkung beteiligt. PLC wird durch AT1R-Stimulation aktiviert. Wir konnten mit Hilfe des AT1R-Antagonisten Candesartan auch zeigen, dass die Genotoxizität von Ang II über AT1R-Signaltransduktion vermittelt wird. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Ang II genomische Schäden in humanen Nieren-Zelllinien verursacht. Die Schäden sind mit der Produktion von ROS verbunden. Eine Reduktion der Ang II-induzierten DNA-Schäden wurde nach Hemmung vonder G-Proteinen, der PLC, PKC und NADPH-Oxidase und Beeinflussung intra- sowie extrazellulärer Calium-Signalgebung gezeigt. Dies führt zu folgendem vorläufigen Modell der Signaltransduktion der von Ang II-induzierten DNA-Schäden: Die Bindung von Ang II an den AT1-Rezeptor aktiviert die PLC durch Stimulationerung der G-Proteine und die PKC in Calcium-abhängiger Weise, dies wiederum aktiviert die NADPH-Oxidase. Die NADPH Oxidase unter Beteiligung ihrerseiner Nox4-Untereinheit erzeugt dann reaktive Sauerstoffspezies, die DNA-Schäden verursachen. Dopamingehalt und -stoffwechsel in peripheren Lymphozyten von Parkinson-Patienten werden durch L-Dopa-Gabe beeinflusst. Die Patienten, die eine hohe Dosis L-Dopa erhalten, zeigen einen signifikant höheren Gehalt an Dopamin in den Lymphozyten im Vergleich zu Patienten, die eine niedrige Dosis L-Dopa erhalten oder der gesunden Kontrollgruppe. Im Mittelpunkt vieler Prozesse bei der Entstehung von oxidativem Stress und oxidativer Schäden bei Parkinson-Patienten steht die Monoaminoxidase (MAO), die für die enzymatische Oxidation von Dopamin und in der Folge für die Entstehung von H2O2 verantwortlich ist. Wir untersuchten, ob die Oxidation von Dopamin genotoxische Wirkung in Lymphozyten von Parkinson-Patienten mit hochdosierter L-Dopa-Therapie induzieren kann. Danach überprüftenfragten wir, ob die Behandlung mit Dopamin in vitro DNA-Schäden induzieren kann und versuchten aufzuzeigen, durch welchen Mechanismus Dopamin seine genotoxische Wirkung entfaltet. Die Häufigkeit von Mikrokernen in peripheren Lymphozyten der Parkinson-Patienten war nicht erhöht im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe, allerdings zeigte die Mikrokernfrequenz eine positive Korrelation mit der täglichen L-Dopa-Dosis bei Patienten, die eine L-Dopa-Therapie zusammen mit einem Dopamin-Rezeptor-Agonisten erhielten. In vitro beobachteten wir bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen eine Induktion des genomischen Schadens in Zelllinien, die aus verschiedenen Geweben stammten. Die genotoxische Wirkung von Dopamin wurde durch Zugabe der Antioxidantien TEMPOL und DMTU reduziert, wodurch die Beteiligung von ROS gezeigt werden konnte. Um festzustellen, ob die Oxidation von Dopamin durch MAO für die Genotoxizität relevant ist, hemmten wir MAO mit zwei Inhibitoren, trans-2-Phenylcyclopropylamin-Hydrochlorid (PCPA) und Ro 16-6491, die beide die Bildung von Mikrokernen in PC-12-Zellen reduzieren konnten. Wir untersuchten auch die Rolle des Dopamin-Transporters (DAT) und Dopamin-Typ-2-Rezeptor (D2R)-assoziierter Signalwege in der Genotoxizität von Dopamin. Die Inhibitoren des DAT, GBR-12909 und Nomifensin verhinderten die Dopamin-induzierte Genotoxizität. Diese Ergebnisse wurden durch Behandlung von MDCK- und MDCK-DAT- Zellen (die das humane DAT-Gen besitzen) mit Dopamin bestätigt. Nur MDCK-DAT-Zellen zeigten erhöhte chromosomale Schäden und Dopaminaufnahme. Obwohl die Stimulation mit dem D2R-Rezeptor-Agonisten Quinpirol in Abwesenheit von Dopamin keine Genotoxizität in PC-12-Zellen induzierte, reduzierten sowohl ein D2R-Antagonist, wie auch Inhibitoren des in der Signalkaskade involvierten G-Proteins, der Phosphoinositol-3-Kinase und der extrazellulären signalregulierten Kinasen die Aufnahme von Dopamin mittels DAT und die Dopamin-vermittelte Genotoxizität. Der D2R-Antagonist Sulpirid hemmte die Dopamin-induzierte Migration von DAT aus dem Cytosol zur Zellmembran. Insgesamt verursacht der Neurotransmitter Dopamin DNA-Schäden und oxidativen Stress in vitro. Es gibt Hinweise, dass eine hochdosierte L-Dopa-Therapie zu oxidativem Stress führt. In vitro führt Dopamin zu Genotoxizität durch den Transport in die Zellen und Oxidation durch MAO. Der Transport von Dopamin durch DAT spielt eine zentrale Rolle in diesem Prozess. Die D2R-Signalwege sind an der Genotoxizität von Dopamin durch Auswirkung auf die Aktivierung und Membranexpression von DAT und damit der Dopaminaufnahme beteiligt. KW - Angiotensin II KW - Mutagenität KW - DNS-Schädigung KW - DNA-Schaden KW - Genotoxizität KW - genotoxicity KW - DNA damage Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55634 ER - TY - JOUR A1 - Marinovich, M. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Covalent binding of aflatoxin B\(_1\) to liver DNA in rats pretreated with ethanol JF - Experientia N2 - Male Fischer F-344 rats were given ethanol in the drinking water and/or by single oral administration. Following this, the animals received p.o. 100 ng/kg of the hepatocarcinogen eHJaflatoxin BI (AFBI)' 24 h later, the level of DNA-bound AFBI was determined in the liver and was found not to be affected by any type of ethanol pretreatment. A cocarcinogenic effect of ethanol in the liver is therefore unlikely to be due to an effect on the metabolic activation and inactivation processes governing the formation of DNA-binding AFBI metabolites. KW - Toxikologie KW - Carcinogenesis KW - DNA KW - covalent binding KW - aflatoxin KW - ethanol Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55237 VL - 41 IS - 10 SP - 1338 EP - 1340 ER - TY - THES A1 - Vidal, Marie T1 - b-adrenergic receptors and Erk1/2-mediated cardiac hypertrophy T1 - b-adrenerge Rezeptoren und Erk1/2-vermittelte Herzhypertrophie N2 - Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus für kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso führt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten Mäusen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings führt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellulär-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 führt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche für die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in Mäusen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung führt. Darüberhinaus führte die Überexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden können, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im Mäusen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-wöchige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikuläre Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tatsächlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. Während die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, führt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer möglicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen. N2 - b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Herzhypertrophie KW - MAP-Kinase KW - adrenerge Rezeptoren KW - Herzhypertrophie KW - Erk1/2 KW - adrenergic receptors KW - cardiac hypertrophy KW - Erk1/2 Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83671 ER - TY - JOUR A1 - Jesaitis, A. J. A1 - Klotz, Karl-Norbert T1 - Cytoskeletal regulation of chemotactic receptors: Molecular complexation of N-formyl peptide receptors with G proteins and actin N2 - Signal transduction via receptors for N-formylmethionyl peptide chemoattractants (FPR) on human neutrophils is a highly regulated process. It involves direct interaction of receptors with heterotrimeric G-proteins and may be under thc control of cytoskeletal clemcnts. Evidencc exists suggesting that thc cytoskeleton and/or the membrane ske1eton determines the distribution of FPR in the plane of the plasma membrane, thus controlling FPR accessibility to different protcins in functionally distinct membrane domains. In desensitized cells, FPR are restricted to domains which are depleted of G proteins but enriched in cytoskeletal proteins such as actin and fodrin. Thus, the G protein signal transduction partners of FPR become inacccssible to the agonist-occupied receptor, preventing cell activation. We are investigating the molecular basis for the interaction of FPR with the membrane skeleton, and our results suggest that FPR, and possibly other receptors, may directly bind to cytoskeletal proteins such as actin. KW - Immunologie KW - chemotaxis KW - formyl peptides KW - receptors KW - actin KW - G proteins KW - cytoskeleton KW - membrane skeleton Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79673 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. T1 - Dosis-Wirkungs-Beziehungen in der chemischen Kanzerogenese T1 - Dose-response relations in chemical carcinogenesis N2 - Ich habe versucht darzulegen, daß mechanistische Überlegungen zur Extrapolation der Dosis-WirkungsBeziehung herangezogen werden können. Ein nichtlinearer Verlauf ist nicht nur bei den epigenetischen Kanzerogenen wahrscheinlich, sondern auch bei den DNA-bindenden. Echte Schwellen sind aber nur in solchen Fällen zu erwarten, wo kein endogenes Korrelat besteht. Immerhin können auch steile Nichtlinearitäten zu einer drastischen Risikoreduktion führen, so daß die Anstrengungen dahin gehen sollten, die Steigung und den Bereich des überproportionalen Abfalls experimentell zu zeigen. In einer heterogenen Population kann die 0 0- sis-Wirkungs-Kurve zusätzliche "Wellen" bekommen und wird dadurch grundsätzlich flacher. Im Extremfall ergibt sich eine lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung unabhängig vom Wirkmechanismus des Kanzerogens. Diese Proportionalität zwischen tiefster Dosis und Effekt wird bei genotoxischen Kanzerogenen aus mechanistischen Gründen schon für eine homogene Population postuliert, doch kann dies in einer heterogenen Population auch bei epigenetischen Kanzerogenen in Frage kommen. KW - Toxikologie Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80046 ER - TY - CHAP A1 - Sagelsdorff, P. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Sensitivity of DNA and nucleotides to oxidation by permanganate and hydrogen peroxide N2 - no abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80062 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. T1 - Quantitative evaluation of DNA-binding data in vivo for low-dose extrapolations N2 - no abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80079 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. T1 - Structural characteristics of compounds that can be activated to chemically reactive metabolites: use for a prediction of a carcinogenic potential N2 - Many mutagens and carcinogens act via covalent interaction of metabolic intermediates with DNA in the target cell. This report groups those structural elements which are often found to form the basis for a metabolism to such chemically reactive metabolites. ~mpounds which are chemically reactive per se and which do not require metabolic activation form group 1. Group 2 compri~es of olefins and aromatic hydrocarbons where the oxidation via an epoxide can be responsible for the generation of reactive species. Aromatic amines, hydrazines, and nitrosamirres form group 3 requiring an oxidation of a nitrogen atom or of a carbon atom in alpha position to a nitrosated amine. Group 4 compounds are halogenated hydrocarbons which can either give rise to radicals or can form an ·olefin (group 2) upon dehydrohalogenation. Group 5 compounds depend upon some preceding enzymatic activity either not available in the target cell or acting on positions in the molecule which are not directly involved in the subsequent formation of electrophilic atoms. Examples for each group are taken from the "List of Chemieals and Irrdustrial Processes Associated with Cancer in Humans" as compiled by the International Agency for the Research on Cancer, and it is shown that 91% of the organic carcinogens would have been detected on the basis of structural elements characteristic for group 1-5. As opposed to this very high sensitivity, the specificity ( the true negative fraction) of using this approach as a short-term test for carcinogenicity is shown to be bad because detoxification pathways have so far not been taken into account. These competing processes are so complex, however, that either only very extensive knowledge about pharmacokinetics, stability, and reactivity will be required or that in vivo systems have to be used to predict, on a quantitative basis, the darnage expected on the DNA. DNA-binding experiments in vivo are presented with benzene and toluene to demonstrate one possible way for an experimental assessment and it is shown that the detoxification reaction at the methyl group available only in toluene gives rise to a reduction by at least a factor of forty for the binding to rat liver DNA. This quantitative approach available with DNA-binding tests in vivo, also allows evaluation as to whether reactive metabolites and their DNA binding are always the most important single activities contributing to the overall carcinogenicity of a chemical. With the example of the livertumor inducing hexachlorocyclohexane isomers it is shown that situations will be found where reactive metabolites are formed and DNA binding in vivo is measurable but where this activity cannot be the decisive mode of carcinogenic action. It is concluded that the lack of structural elements known to become potentially reactive does not guarantee the lack of a carcinogenic potential. KW - Toxikologie KW - Structureactivity relationship KW - Reactive intermediates KW - Metabolic activation KW - DNA Binding KW - Covalent binding index KW - Carcinogens KW - Benzene Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80105 ER - TY - THES A1 - Emami-Nemini, Alexander Darius T1 - Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins T1 - Steuerung differenzieller Signalgebung des Parathormon Rezeptors durch Adapterproteine N2 - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR. N2 - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) reguliert eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, was sie bedeutend für die Pharmakotherapie macht. Eingebettet in die Zytoplasmamembran sind GPCRs das Zentrum von Signalkomplexen, die eine Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen ermöglichen. Der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor (PTHR) aktiviert Adenylyl-Zyklasen-, Phospholipasen Cβ- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-abhängige Signalwege, wodurch endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-ähnlichen Peptides (PTHrP) vermittelt werden. Dies ermöglicht die Regulation der Calcium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Knochenentwicklung. Paradoxerweise kann PTH sowohl katabole als auch anabole Effekte auf den Knochenstoffwechsel induzieren. Den anabolen Effekt von PTH nutzt man erfolgreich in der Therapie der schweren Osteoporose. Ob ein anaboler oder kataboler Knochenmetabolismus überwiegt, wird durch zeitliche und Zelltyp-spezifische Faktoren bestimmt. Dem zugrunde liegt vermutlich unter anderem eine differenzielle Anordnung verschiedener Adapterproteine innerhalb der Signalkomplexe, die zur differenziellen Aktivierung von Signalwegen führen und so eine Steuerung bestimmter physiologischer Effekte ermöglichen. Die molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unklar, weshalb großes Interesse besteht, ein besseres Verständnis über die PTHR-assoziierten Adapterproteine zu entwickeln. Zur Identifizierung neuer Adapterproteine, die PTHR-Signalwege beeinflussen, wurde in dieser Arbeit ein auf dem Proteom-basierender Screening-Ansatz entwickelt. Dieser führte zur Entdeckung einer Interaktion von intrazellulären Domänen des PTHR mit vav2, einem Guanin-Nukleotid Austauschfaktor (GEF) für kleine GTPasen, der die Zytoskelett-Reorganisation steuert. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass vav2 über kompetitive Interaktionen mit G Protein αq Untereinheiten PTH-vermittelte Phospholipase Cβ (PLCβ)-abhängige Signalwege beeinflusst. Umgekehrt wurde gezeigt, dass PTH die Phosphorylierung und damit die GEF Aktivität von vav2 reguliert. Diese Befunde können Aufschluss über molekulare Mechanismen geben, die den Wirkungen von PTH auf den Knochenstoffwechsel durch PLC-Signalwege, Zellmigration und Zytoskelett-Reorganisation zugrunde liegen. Neben dem Verständnis über molekulare Prozesse der intrazellulären Signalgebung ist die Suche nach Liganden eine herausfordernde Grundvoraussetzung für die aktuelle Arzneistoffentwicklung. Liganden-Bindungs-Experimente stellen dafür elementare Techniken dar. Zur Substitution kostenintensiver und potentiell gesundheitsschädlicher Radioliganden-Bindungen, wurden in dieser Arbeit Fluoreszenz-basierte Liganden-Bindungs-Experimente für den PTHR entwickelt. Basierend auf Zeit-aufgelöster Fluoreszenz wurden mehrere Varianten dieser Experimente etabliert, um die Arzneistoffentwicklung am PTHR zu unterstützen. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Parathormon KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Parathormon KW - vav2 KW - Guanin Nukleotid Austauschfaktor KW - G protein coupled receptor KW - parathyroid hormone KW - vav2 KW - guanine nucleotide exchange factor KW - Guaninnucleotid-Austauschfaktoren Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369 ER - TY - JOUR A1 - Caviezel, M. A1 - Aeschbach, A. P. A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, C. T1 - Reduction of covalent binding of aflatoxin B1 to rabbit liver DNA after immunization against this carcinogen N2 - The covalent binding of [3H]aflatoxin B1 (AF) to liver DNA was determined, 6 h after oral administration to male rabbits. A Covalent Binding Index, CBI (flmol AF/mol DNA-P)/(mmol AF/kg b. w.) = 8,500 was found. Pretreatment of rabbits with AF coupled to bovine serum albumin in Freund's adjuvant led to the production of AF-directed antibodies. Administration of [3H]AF to such immunized rabbits resulted in a CJH of only 2,500, i.e., the iiDJ{.lUnization provided a protection by a factor of more than 3. Although this is encouraging evidence for the potential of active immunization against genotoxic carcinogens, a nurober of pointswill have to be clarified, such as the time course for the DNA binding and the question of a possible shift to other target cells. KW - Krebs KW - DNA KW - Aflatoxin KW - Cancer prevention KW - Carcinogen KW - Covalent binding KW - DNA KW - Immunization Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80116 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, C. T1 - In vivo covalent binding of chemicals to DNA as a short-term test for carcinogenicity N2 - The determination of a covalent binding of radioactive chemieals to DNA in intact mammalian organisms is proposedas a short-term test for carcinogenicity. The effectiveness of covalent binding to rat liver DNA correlates well with the hepatocarcinogenicity known from long-term bioassays. The binding indices range over more than five orders of rriagnitude between the strongest hepatocarcinogen aflatoxin B 1 and the limit of detection of a binding with 100 f-LCi 14C-labelled chemical. The order of magnitude of binding is therefore a surprisingly good quantitative measure for carcinogenicity. The pattern of DNA binding sites is important especially for small alkylating agents where the determination of total binding might indicate a higher carcinogenic potency than is actually observed. KW - DNA KW - DNA-Binding KW - Carcinogen KW - Short-term Carcinogenicity Test KW - Aflatoxin KW - Toluene KW - Tritiated Water Y1 - 1979 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80127 ER - TY - THES A1 - Müller, Markus T1 - Effekte kardioprotektiver Zyklopeptide auf Funktion und Morphometrie des Herzens im Rattenmodell der dilatativen Immunkardiomyopathie T1 - Effects of cardioprotective cyclopeptides on cardiac function and morphometry in the rat model of dilated immune cardiomyopathy N2 - Kardiomyopathien sind Erkrankungen des Herzmuskels, die mit einer kardialen Funktionsstörung einhergehen. Formen, die ohne erkennbare Ursache zu einer progredienten Dilatation und Reduktion der Kontraktilität des linken Ventrikels führen, werden als idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) bezeichnet. Sie ist der Hauptgrund für schwere Herzinsuffizienz und die damit assoziierten Einschränkungen der Lebensqualität bei jungen Erwachsenen. Neben der beeinträchtigten kardialen Funktion weisen diese Patienten oftmals auch Veränderungen im Bereich der humoralen und zellulären Immunität auf. Ein Teil der Patienten entwickelt Autoantikörper, die sich gegen den kardialen β1-adrenergen Rezeptor richten und ihn ähnlich wie der natürliche Ligand Adrenalin aktivieren. Hieraus resultiert eine chronische Überstimulation des Rezeptors, die über eine initiale Hypertrophie dann zu einer eingeschränkten Pumpfunktion führt. Nachdem sich die Therapie der Antikörper-vermittelten Immunkardiomyopathie bisher auf die Behandlung der Herzinsuffizienz und die Kontrolle der Herz-insuffizienzsymptome beschränkt, könnten β1-ECII-homologe Peptide als Antikörper-Fänger bei Antikörper-positiven Patienten nun einen kausalen Therapieansatz darstellen. In diesem Zusammenhang wurden ein aus 25 Aminosäuren bestehendes zyklisches Peptid, eine aus 18 Aminosäuren bestehende Zyklopeptid-Mutante und ihre jeweiligen linearen Äquivalente im Rattenmodell auf Antikörper-neutralisierende Effekte und potentielle therapeutische Wirksamkeit getestet. Das Rattenmodell ist hierfür besonders geeignet, da die Aminosäuresequenz der funktionell wichtigen zweiten extrazellulären Domäne des β1-adrenergen Rezeptors (β1-ECII) bei Mensch und Ratte absolut identisch ist. Auf immunologischer Ebene konnte der Titer der krankheitsinduzierenden β1-ECII-Antikörper bereits nach der ersten Applikation zyklischer Peptide relevant gesenkt werden und nahm im weiteren Verlauf der Behandlung kontinuierlich ab. Nach Zyklopeptidgabe kam es am Herzen zu einer Reduktion des linksventrikulären Durchmessers und zu einer fast vollständigen Normalisierung der anatomischen Proportionen. Auf die Morphologie der Myozyten selbst und auch den Kollagengehalt des Gewebes hatte die Zyklopeptidtherapie keinen wesentlichen Einfluss. Die funktionellen Eigenschaften des Herzens ließen sich durch die Neutralisation stimulatorischer β1-ECII-Antikörper mittels intravenöser Zyklopeptidapplikation deutlich verbessern: Die Verkürzungsfraktion des linken Ventrikels und der Herzindex als Parameter für die kardiale Leistungsfähigkeit konnten durch die Behandlung wieder weitgehend normalisiert werden. Diese im Tiermodell erzielten Ergebnisse lassen einen therapeutischen Effekt der Zyklopeptide vermuten. Der Ansatz einer spezifisch gegen Antikörper gerichteten Therapie zur Behandlung von Patienten mit β1-Antikörper-positiver Herzinsuffizienz erscheint daher vielversprechend. N2 - Cardiomyopathies are disorders of the heart with particular morphological and physiological characteristics. Cardiomyopathies with unknown origin resulting in progressive left ventricular dilatation and reduced cardiac contractility are named idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). It is the most common cause of heart failure with its associated severe limiting symptoms in young adults. Besides the compromised cardiac function, those patients frequently also exhibit alterations in the humoral and cellular immunity. Some of them develop autoantibodies targeting and activating the cardiac β1-adrenergic receptor similar to its natural ligand epinephrine with a subsequent chronic overstimulation and a decline in left ventricular contractile function. Since the therapy of antibody mediated immune cardiomyopathy has been restricted to the treatment of the heart failure and its concomitant symptoms β1-ECII homologous peptides may constitute a new approach by neutralizing harmful antibodies. Therefore, a 25 amino acid cyclic peptide, a 18 amino acid cyclic peptide mutant, and their linear equivalents were tested for antibody scavenging and potential therapeutic effects in the rat. The rat model was chosen because the amino acid sequence of the functionally important second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (β1-ECII) is completely homologous between human and rat. In contrast to linear peptides, cyclic peptides significantly reduced the β1-ECII antibody titer despite continuous immunization with the disease inducing antigen. Cyclopeptides also achieved a nearly complete restitution of the left ventricular proportions without a significant change in cardiomyocyte morphology or collagen content. In addition, important cardiac parameters such as fractional shortening and cardiac index were clearly improved. The results obtained suggest a therapeutic effect of the applied cyclopeptides. Thus, epitope mimicking cyclic antibody scavengers may open up new perspectives in the treatment of β1-antibody positive heart failure in humans. KW - Dilatative Kardiomyopathie KW - Immunkardiomyopathie KW - Autoimmunerkrankung KW - Peptidtherapie KW - Zyklopeptid Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101935 ER - TY - JOUR A1 - Kannen, Vinicius A1 - Hintzsche, Henning A1 - Zanette, Dalila L. A1 - Silva Jr., Wilson A. A1 - Garcia, Sergio B. A1 - Waaga-Gasser, Anna Maria A1 - Stopper, Helga T1 - Antiproliferative Effects of Fluoxetine on Colon Cancer Cells and in a Colonic Carcinogen Mouse Model N2 - The antidepressant fluoxetine has been under discussion because of its potential influence on cancer risk. It was found to inhibit the development of carcinogen-induced preneoplastic lesions in colon tissue, but the mechanisms of action are not well understood. Therefore, we investigated anti-proliferative effects, and used HT29 colon tumor cells in vitro, as well as C57BL/6 mice exposed to intra-rectal treatment with the carcinogen N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) as models. Fluoxetine increased the percentage of HT29 cells in the G0/G1 phase of cell-cycle, and the expression of p27 protein. This was not related to an induction of apoptosis, reactive oxygen species or DNA damage. In vivo, fluoxetine reduced the development of MNNG-induced dysplasia and vascularization-related dysplasia in colon tissue, which was analyzed by histopathological techniques. An anti-proliferative potential of fluoxetine was observed in epithelial and stromal areas. It was accompanied by a reduction of VEGF expression and of the number of cells with angiogenic potential, such as CD133, CD34, and CD31-positive cell clusters. Taken together, our findings suggest that fluoxetine treatment targets steps of early colon carcinogenesis. This confirms its protective potential, explaining at least partially the lower colon cancer risk under antidepressant therapy. KW - Medizin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75879 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Tobias T1 - Biotransformation of trans‐1‐chloro‐3,3,3‐trifluoropropene and 2,3,3,3‐tetrafluoropropene T1 - Biotransformation von trans‐1‐Chlor‐3,3,3‐trifluorpropen und 2,3,3,3‐Tetrafluorpropen N2 - The novel refrigerant 2,3,3,3‐tetrafluoropropene (HFO‐1234yf) as well as the novel foam blowing and precision cleaning agent trans‐1‐chloro‐3,3,3‐trifluoropropene (trans‐HCFO‐1233zd) are both chlorofluorocarbon replacements with low GWPs and a short atmospheric life time. Whereas the hydrofluoroolefin HFO‐1234yf has no negative effect on stratospheric ozone due to the lack of chlorine in its structure, the hydrochlorofluoroolefine trans‐HCFO‐1233zd exhibits a very low potential for ozone depletion (ODP). This is approximately 100 times lower than the ozone depletion potential of precursor compounds such as 1,1,2‐trichloro‐1,2,2‐trifluoroethane (CFC‐113). Principle aims of this thesis were to investigate the unknown metabolism of the new solvent trans‐HCFO‐1233zd and to further investigate a possible biotransformation based toxicity of HFO‐1234yf observed in rabbits. Therefore study specimens of different in vitro and in vivo studies with trans‐HCFO‐1233zd and HFO‐1234yf were analyzed for metabolites using 19FNMR spectroscopy, LC‐MS/MS spectrometry and GC/MS spectrometry. Metabolites were identified by comparison with purchased or synthesized standard substances. Excretion kinetics of the predominant metabolites were determined by LC‐MS/MS quantification,inorganic fluoride was determined by potentiometry. Moreover cytochrome P‐450 2E1 and 3A4 liver enzyme activities were measured in a multi‐exposure study with HFO‐1234yf. ... N2 - Das neue Kühlmittel 2,3,3,3‐Tetrafluoropropen (HFO‐1234yf) und das neue Treib‐ und Reinigungsmittel trans‐1‐Chlor‐3,3,3‐trifluorpropen (trans‐HCFO‐1233zd) sind Chlorfluorkohlenstoff‐Ersatzstoffe mit sehr geringem Treibhauspotenzial und kurzer atmosphärischer Lebensdauer. Während HFO‐1234yf keinerlei negative Auswirkungen auf den Abbau der Ozonschicht hat, schädigt trans‐HCFO‐1233zd diese aufgrund eines Chloratoms in seiner Struktur. Durch die erhöhte Abbaurate von trans‐HCFO‐1233zd in niedrigeren Luftschichten, wird im Vergleich zu seinen Vorgängersubstanzen (z.B. 1,1,2‐Trichlor‐1,2,2‐trifluorethan, CFC‐113) jedoch ein weitaus geringerer Ozonabbau in der Stratosphäre gewährleistet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Metabolismus von HFO‐1234yf und trans‐HCFO‐1233zd in In‐vitro‐ und In‐vivo‐Versuchen charakterisiert. Hierfür wurde das gewonnene Probenmaterial mittels 19F‐NMR‐Spektroskopie, LC‐MS/MS‐Spektrometrie und GC/MSSpektrometrie auf Fluor‐Metabolite untersucht und diese durch Vergleichsmessungen mit Standardsubstanzen identifiziert. Die Quantifizierung der Hauptmetabolite und des anorganischen Fluorids in Urin und Plasma erfolgte mittels LC‐MS/MS‐Analyse bzw. mittels Potentiometrie. In einer Mehrfachexpositionsstudie mit HFO‐1234yf wurde zudem die Aktivität der Cytochrom‐P450‐Enzyme 3A4 und 2E1 in gewonnenem Leber‐ und Herzgewebe ermittelt. ... KW - Propenderivate KW - Chlorfluorkohlenstoffe KW - Ersatzstoff KW - FCKW-Ersatzstoffe KW - Biotransformation KW - In vitro KW - In vivo KW - Biotransformation KW - CFC replacements KW - halo olefines Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78579 ER - TY - THES A1 - Saxena, Ambrish T1 - Role of the novel protein tyrosine phosphatase AUM for cell adhesion T1 - Die Rolle des neuen Proteins "Tyrosin phosphatase" AUM für Zell-Adhäsion N2 - Cell adhesion and migration are essential for development and homeostasis. Adhesion to the extracellular matrix occurs at specialized plasma membrane domains where transmembrane adhesion receptors, signaling proteins such as kinases and phosphatases, and a large number of adaptor proteins interact with the cytoskeleton in a tightly regulated and synchronized fashion. Whereas altered cell adhesion and migration are known to be important in cardiovascular disease and malignant tumors, the target proteins and molecular interactions that regulate these complex processes still remain incompletely understood. Whereas numerous kinases are known to regulate cell adhesion dynamics, information about the involved protein phosphatases is still very limited. A newly emerging phosphatase family contains the unconventional active site sequence DXDX(T/V) and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases. Our laboratory has recently discovered AUM, a novel phosphatase that belongs to this poorly characterized enzyme family. Initial findings pointed toward a potential involvement of AUM in the regulation of cell adhesion to the extracellular matrix. The objective of the present study was to study the potential role of AUM in cell adhesion. We could show that cells stably depleted of AUM are characterized by accelerated adhesion on immobilized fibronectin. To confirm these findings, we used an siRNA-based approach for the acute depletion of AUM and observed a similar phenomenon. Rescue experiments were performed with stably AUM-depleted cells to ensure that the above mentioned effects are indeed AUM specific. We observed that the re-addition of AUM normalizes cellular adhesion kinetics on fibronectin. These results clearly show that AUM exerts important functions in cell-matrix adhesion. To investigate the molecular basis of these effects, we have characterized integrin expression patterns using flow cytometry. Interestingly, fibronectin-stimulated AUM-depleted cells are characterized by an increase in the cell surface expression of conformationally active 1-integrins. Consistent with the important role of 1-integrins in the regulation of RhoA activity, we also observed a specific increase in RhoA-GTP, but not Rac1-GTP-levels during cell adhesion to fibronectin. Consistent with these findings and with the important role of RhoA for focal adhesion maturation, AUM depleted cells showed more elongated and more centripetally oriented focal adhesions as compared to control cells when spread on fibronectin. Taken together, this study has revealed an important role of AUM for cell-matrix adhesion. Our findings strongly suggest that AUM functions as a negative regulator of 1-integrins and RhoA-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion. N2 - Die Adhäsion und Migration von Zellen auf extrazellulären Matrixmolekülen ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen. Die Adhäsion an extrazellulärer Matrix findet über spezialisierte Plasmamembran-Domänen statt, an denen transmembranäre Adhäsionsrezeptoren, Signalproteine wie Kinasen und Phosphatasen und eine große Anzahl von Adapterproteinen auf eng regulierte und synchronisierte Weise mit dem Zytoskelett interagieren. Während feststeht, dass Veränderungen der Zelladhäsion und Migration eine wichtige Rolle zum Beispiel bei kardiovaskulären Erkrankungen und bei metastasierenden Tumoren spielen, sind die Schlüsselmoleküle und Protein-Protein-Interaktionen, welche diese Prozesse regulieren immer noch unvollständig verstanden. Obwohl von zahlreichen Kinasen bekannt ist, dass sie die Zelladhäsions-Dynamik regulieren, existieren kaum Informationen über an diesen Prozessen beteiligte Phosphatasen. Seit Kurzem wird einer noch wenig charakterisierten Phosphatase-Familie mit der unkonventionellen Aminosäuresequenz DXDX(T/V) im aktiven Zentrum des Enzyms vermehrt Beachtung geschenkt. Diese Phosphatasen gehören zur Haloazid-Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen. Unserem Labor ist es kürzlich gelungen, eine neue Phosphatase aus dieser Enzymfamilie zu identifizieren. Erste Befunde aus unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, dass AUM möglicherweise an der Regulation der Zelladhäsion an extrazelluläre Matrixmoleküle beteiligt sein könnte. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die mögliche Rolle von AUM bei der Zelladhäsion genauer zu untersuchen. Es gelang uns zu zeigen, dass stabil AUM-shRNA exprimierende Zellen durch eine beschleunigte Adhäsion auf immobilisiertem Fibronektin gekennzeichnet sind. Um diese Befunde zu erhärten, wurde endogenes AUM mittels transienter Expression von siRNAs akut depletiert. Auch unter diesen Bedingungen konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der endogenen AUM-Proteinexpression die Zelladhäsion auf Fibronektin beschleunigt. Weiterhin wurden rescue-Experimente mit stabil AUM-depletierten Zellen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die oben genannten Effekte spezifisch sind. Dabei wurde beobachtet, dass die Re-Expression von AUM die zelluläre Adhäsionskinetik auf Fibronektin normalisiert. Diese Ergebnisse belegen eindeutig, dass AUM wichtige Funktionen bei der Zell-Matrix-Adhäsion erfüllt. Um die molekulare Grundlage dieser Effekte zu untersuchen, haben wir zunächst das zelluläre Integrin-Expressionsmuster mittels Durchflußzytometrie charakterisiert. Interessanterweise konnte nachgewiesen werden, dass Fibronektin-stimulierte, AUM-depletierte Zellen vermehrt 1-Integrine in ihrer aktiven Konformation auf der Zelloberfläche exprimieren. Übereinstimmend mit der wichtigen Rolle von 1-Integrinen für die Regulation der RhoA-Aktivität konnten wir auch eine spezifische Zunahme der RhoA-GTP, nicht aber der Rac1-GTP-Spiegel während der Zelladhäsion auf Fibronektin beobachten. Konsistent mit diesen Ergebnissen und der bekannten Rolle von RhoA für die Reifung fokaler Adhäsionen, zeigten AUM-depletierte Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen vermehrt elongierte und zentripetal orientierte fokale Adhäsionen. Zusammengenommen ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine wichtige Rolle von AUM bei der Zell-Matrix-Adhäsion aufzudecken. Unsere Befunde legen nahe, dass AUM im Rahmen der Zell-Adhäsion als ein negativer Regulator von 1-Integrinen und der RhoA-abhängigen Zytoskelett-Dynamik fungiert. KW - Proteintyrosinphosphatase KW - Zelladhäsion KW - Tyrosin phosphatase KW - Zell-Adhäsion KW - AUM KW - tyrosine phosphatase KW - AUM KW - cell adhesion Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65503 ER - TY - THES A1 - Schlipp [verh.: Wölfel], Angela T1 - Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with Förster resonance energy transfer microscopy T1 - Charakterisierung von anti-beta1-Adrenozeptor Antikörpern mittels Förster Resonanz Energie Transfer Mikroskopie N2 - Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. N2 - Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Beta-1-Rezeptor KW - Antikörper KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Adrenergic receptor KW - Beta-1-receptor KW - Antibodies KW - Fluorescence-resonance-energy-transfer KW - Dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162 ER - TY - JOUR A1 - Gonzalez-Calero, G. A1 - Cubero, A. A1 - Klotz, Karl-Norbert T1 - Characterization and photoaffinity labeling of A1 adenosine receptors in coated visicles form bovine brain N2 - The antagonist (3 II ) DPCPX exhi bitcd a Kd of 0. 4 nM at coalcd vcsicles from bovine brain. Agonist compelition for ( 3 11) DPCPX bind in~ revcaled two affini ty slales for gonists. The pholoaffinity probe I25 I -AHPIA specifically labelled a band with a molecular weight of 35 Kd. KW - Pharmakologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86004 ER - TY - THES A1 - Eman, Maher Othman Sholkamy T1 - In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage T1 - In vitro und in vivo Untersuchungen von Insulin-induzierten oxidativen Stress und DNA-Schäden N2 - Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial. N2 - Hyperinsulinämie, ein Zustand mit sehr hohen Blutspiegeln an Insulin, ist mit einer erhöhten Krebsinzidenz verbunden. Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas und das polyzystische Ovarialsyndrom sind die häufigsten Krankheiten, die mit Hyperinsulinämie einhergehen. Da ein erhöhtes Krebsrisiko insbesondere für Krebserkrankungen des Dickdarms und der Niere beobachtet wurde, untersuchten wir erstmals die Induktion von Genomschäden durch Insulin in HT29-Zellen (humane Dickdarmzellen), LLC-PK1-Zellen (Nierenzellen vom Schwein), HK2-Zellen (humane Nierenzellen) und peripheren humanen Lymphozyten. Um die Gentoxizität von Insulin zu bestätigen, wurden auch andere Zellen aus unterschiedlichen Geweben untersucht. Um sicherzustellen, dass die Effekte durch Insulin nicht auf permanente Zelllinien beschränkt sind, wurden außerdem primäre Rattenzellen aus Dickdarm, Niere, Leber und Fettgewebe untersucht. Um die Befunde auf die in-vivo-Situation übertragen zu können, kamen zwei Hyperinsulinämie-Modelle zum Einsatz: mit Insulin infundierte ZDF-Ratten (Zucker Diabetic Fatty Rats) und periphere Lymphozyten von Patienten mit Diabetes Typ 2. Zuerst konnte in humanen Adenokarzinomzellen des Dickdarms (HT29) eine signifikante Erhöhung des DNA-Schadens in Standard-Protokollen des Comet Assays und des Mikrokerntests nach Behandlung mit 5 nM Insulin gezeigt werden. Bei Verlängerung der Behandlungszeit auf 6 Tage wurden signifikante Effekte bereits ab 0,5 nM beobachtet. Insulin erhöhte die zelluläre ROS-Produktion, die als Oxidation der Farbstoffe 2‘,7‘-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (H2DCF-DA) und Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen wurde. Befunde aus dem FPG-modifizierten Comet Assay und das Ergebnis, dass der Radikalfänger Tempol die Zellen schützte stellen die Verbindung zwischen Insulin-verursachtem DNA-Schaden und ROS produktion her. Um die ROS-Quelle nach Stimulation mit Insulin zu untersuchen, wurden Apocynin und VAS2870 als NADPH-Oxidase-Inhibitoren und Rotenon als Inhibitor der Mitochondrien mit Insulin kombiniert. Alle diese Stoffe reduzierten den Genomschaden. Zur Charakterisierung der Signalwege wurde zunächst die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor und an den IGF1-Rezeptor untersucht. Beide Rezeptoren sind an der Signaltransduktion beteiligt. Nach Aktivierung der Rezeptoren wird die PI3K aktiviert, dies führt zur Phosphorylierung von AKT. Dadurch werden zwei Wege zur ROS-Produktion aktiviert, der erste involviert die mitochondriale Atmungskette , der zweite agiert durch Rac1-Aktivierung. Letzteres resultiert in der Aktivierung der NADPH-Oxidase Isoform Nox1. Der Effekt von Insulin auf zelluläres Chromatin konnte in einer weiteren humanen Dickdarmkrebs-Zelllinie und in primären Dickdarmzellen der Ratte in vitro bestätigt werden. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass pathophysiologische Insulin-Blutspiegel DNA-Schäden im Dickdarm verursachen können. Dies könnte zur Induktion oder Progression von Dickdarmkrebs beitragen. Weiterhin verursachte Insulin bei einer Konzentration von 5 nM einen signifikanten Anstieg von DNA-Schäden in vitro. Dies war verbunden mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Bei Anwesenheit von Antioxidantien, von Inhibitoren des Insulin-Rezeptors bzw. des IGF-1-Rezeptors und eines Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-Inhibitors war der Insulin-vermittelte DNA-Schaden reduziert. Phosphorylierung von AKT war erhöht und das Protein P53 akkumulierte. Inhibierung der ROS-Produktion der Mitochondrien bzw. der NADPH-Oxidase reduzierte den Insulin-vermittelten Schaden. In primären Rattenzellen induzierte Insulin ebenfalls Genomschaden. HK2-Zellen wurden zur Untersuchung der mechanistischen Signalwege in der Niere eingesetzt. Die Signalwege entsprechen denen der Dickdarmzellen bis zur Aktivierung der ROS-Produktion in den Mitochondrien. Als Folge der Aktivierung von PI3K wird Nox4 aktiviert. Eine Verbindung zwischen Mitochondrien und Nox4-Aktivierung wird vorgeschlagen. Als in-vivo-Modell wurden gesunde ZDF-Ratten mit Insulin infundiert, um normale bzw. erhöhte Insulin-Blutspiegel bei konstanten Glukose-Blutspiegeln zu erreichen. In den Nieren war der Gehalt an ROS und an P53 in der Gruppe mit erhöhten Insulin-Blutspiegeln im Vergleich zur Kontrolle erhöht. ROS und P53 waren ebenfalls in den diabetischen und adipösen ZDF-Ratten erhöht. Die Behandlung der diabetischen Ratten mit Metformin reduzierte die DNA-Oxidation, die in Form von 8-oxodG bestimmt wurde, und die ROS-Produktion in dieser Gruppe. HL60-Zellen und kultivierte Lymphozyten als Modelle für das hämatopoetische System zeigten eine signifikante Induktion von DNA-Schäden nach Behandlung mit Insulin. Diabetes-Patienten zeigten eine erhöhte Mikrokern-Bildung im Vergleich zu gesunden Probanden. In der vorliegenden Studie konnten wir erstmals zeigen, dass Insulin-induzierter oxidativer Stress zu Genomschaden führt, und dass in unterschiedlichen Geweben ROS aus verschiedenen Quellen stammten. Falls diese Mechanismen auch in Patienten auftreten, könnte Hyperinsulinämie durch ROS-Induktion zu Genomschaden führen und damit zu einem erhöhten Krebsrisiko beitragen. Unter bestimmten Bedingungen könnten Antioxidantien bzw. Inhibitoren der Mitochondrien oder der NADPH-Oxidase protektive Effekte ausüben. KW - Insulin KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - oxidativer Stress KW - DNA Schaden KW - Insulin KW - Insulin KW - Oxidative Stress KW - DNA Damage Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Kirchner, S. A1 - Schiffmann, D. A1 - Poot, M. T1 - Cell cycle disturbance in relation to micronucleus formation induced by the carcinogenic estrogen diethylstilbestrol N2 - In addition to its tumor-promoting activity in honnone-receptive tissue, the carcinogenic estrogen diethylstilbestrol (DES) has been found to induce cell transformation, aneuploidy and micronucleus formation in mammalian cells. The majority of these micronuclei contained whole chromosomes and were fonned during mitosis. Here a possible relationship between a disturbance in cell cycle progression and micronucleus fonnation is investigated by exposing Syrian hamster embryo (SHE) cells to DES. Continuous bromodeoxyuridine labeling followed by bivariate Hoechst 33258/ethidium bromide flow cytometry was employed for analysis of cell cycle transit and related to the time course of micronucleus formation. Treatment of SHE cells with DES resulted in delayed and impaired cell activation (exit from the GO/G 1 phase), impaired S-phase transit and, mainly, G2-phase traverse. Cells forming micronuclei, on the other hand, were predominantly in G2 phase during DES treatment. These results suggest that impairment of Sand G2 transit may involve a process ultimately leading to micronucleus formation. KW - Toxikologie KW - Flow cytometry KW - Micronucleus formation KW - Diethylstilbestrol KW - Hoechst 33258 dye KW - Bromodeoxyuridine labeling KW - continuous Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82250 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Zimmermann, U. A1 - Wecker, E. T1 - High yields of DNA-transfer into mouse L-cells by electropermeabilization N2 - no abstracts available KW - Toxikologie KW - Gene Transfer KW - Electric Field KW - Stable Transformation KW - Neomycin Resistance Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82408 ER -