TY - THES A1 - Arnold, Charlotte Antonia T1 - Reduktion des Genomschadens in peripheren Lymphozyten adipöser Patienten nach bariatrischer Operation T1 - Decreased chromosomal damage in peripheral lymphocytes of obese patients after bariatric surgery N2 - Übergewicht, das als Volkskrankheit ein wachsendes globales Problem darstellt, ist mit mehreren folgenreichen Komorbiditäten behaftet und die Assoziation der Erkrankung mit nachweisbarer Schädigung des Erbguts durch oxidativen Stress ist mittlerweile unangefochten. In der vorliegenden Studie wurden periphere Lymphozyten stark bis morbid adipöser Patienten mit Hilfe des Mikrokern-Assays untersucht und es konnte – begleitend zu der zu erwartenden BMI-Abnahme – eine signifikante Reduktion des Genomschadens durch Magenbypass bzw. Sleeve-Gastrektomie 12 Monate postoperativ detektiert werden. Daneben demonstrierte die Analyse zusätzlich erhobener Patientendaten, die u. a. Nüchternglucose, HbA1c, Blutdruck und Herzfrequenz sowie ein Blutbild der Patienten (inklusive CRP als Entzündungsmarker, Transaminasen, gGT sowie Lipidprofil) umfasste, eine deutliche Besserung vieler Parameter bis auf teilweise wieder physiologische Normwerte. All diese Ergebnisse stützen die These der metabolischen Wirksamkeit sowohl des Roux-en-Y-Magenbypass als auch der Sleeve- Gastrektomie. Ihre Bedeutung liegt nicht zuletzt in der angenommenen Reduktion des Krebserkrankungsrisikos, da jeweils ein Zusammenhang mit der Adipositas an sich, dem Diabetes und durch oxidativen Stress verursachter DNA-Schädigung besteht. Mit Blick auf eine gegenwärtig in der Forschung diskutierte potentielle therapeutische Anwendung von Antioxidantien zur Reduktion von Erbgutschädigungen, die durch oxidativen Stress zustande kommen, wurden die Substanzen Tricetinidin, Curcumin und Resveratrol im Rahmen des Mikrokerntests an HL60- und NRK-Zellen untersucht, in denen mit der Mischung aus Insulin und Angiotensin II eine gentoxische Wirkung erzielt worden war. N2 - Obesity, which constitutes an increasing global health problem, is accompanied by a large number of far-reaching comorbidities and it is nowadays undoubted that this disease is associated with a detectable chromosomal damage caused by oxidative stress. Therefore, the aim of this study was to examine peripheral lymphocytes of obese or morbidly obese patients undergoing bariatric surgery using the cytokinesis-block micronucleus assay. Apart from the predictable BMI reduction we were able to show a significant reduction of genomic damage 12 months after either Roux-en-Y gastric bypass or sleeve gastrectomy. Furthermore, the analysis of additionally collected patient data comprising fasting glucose, HbA1c, blood pressure, heart rate and blood count (including CRP as an inflammatory parameter, transaminases, γ- GT and lipid profile) indicated an improvement with regard to a lot of parameters, partly reaching a physiological level. All these results support the hypothesis that Roux-en-Y gastric bypass as well as sleeve gastrectomy are metabolically effective methods. Last but not least they are of importance concerning a presumed attenuation of cancer risk because of a link between obesity, diabetes and oxidative stress-associated chromosomal damage. The potential therapeutic use of antioxidants to reduce genomic damage resulting from oxidative stress is a topic of interest in current research. We therefore examined the substances tricetinidin, curcumin and resveratrol using the micronucleus frequency test, HL60 and NRK cells that had been treated with a mixture of insulin and angiotensin II to achieve a genotoxic effect. KW - Fettsucht KW - Magenchirurgie KW - Lymphozyt KW - Adipositaschirurgie KW - Genomschaden KW - bariatric surgery KW - peripheral lymphocytes KW - obesity KW - genomic damage KW - chromosomal damage Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211748 ER - TY - THES A1 - Maimari, Theopisti T1 - The influence of N-terminal peptides of G-protein coupled receptor kinase (GRK) 2, 3 and 5 on β-adrenergic signaling T1 - Der Einfluss von N-terminalen Peptiden der G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen (GRK) 2, 3 und 5 in der β-adrenergen Signaltransduktion N2 - G protein coupled receptor kinases (GRK) phosphorylate and thereby desensitize G protein coupled receptors (GPCR) including β-adrenergic receptors (βAR), which are critical regulators of cardiac function. We identified the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) as an endogenous inhibitor of GRK2 that leads to increased cardiac contractility via βAR activation. RKIP binds to the N-terminus (aa1-185) of GRK2, which is important for the GRK2/receptor interaction. Thereby it interferes with the GRK2/receptor interaction without interference with cytosolic GRK2 target activation. In this project, the RKIP/GRK interface was investigated to develop strategies that simulate the effects of RKIP on βAR. RKIP binding to different isoforms of GRK expressed in the heart was analyzed by protein interaction assays using full-length and N-termini of GRK2, GRK3 and GRK5: 1-53, 54-185 and 1-185. Co-immunoprecipitation (Co-IPs) and pull-down assays revealed that RKIP binds to the peptides of GRK2 and GRK3 but not to the ones of GRK5, which suggests the existence of several binding sites of RKIP within the N-termini of GRK2 and GRK3. To analyze whether the peptides of GRK2 and GRK3 are able to simulate the RKIP mediated interference of the GRK2/receptor interaction, we analyzed the β2-AR phosphorylation in the absence and presence of the peptides. Interestingly, N-termini (aa1-185) of GRK2 and GRK3 reduced β2AR phosphorylation to a comparable extent as RKIP. In line with reduced receptor phosphorylation, the peptides also reduced isoproterenol-stimulated receptor internalization as shown by [3H] CGP-12177 radioligand binding assay and fluorescence microscopy compared to control cells. Subsequently, these peptides increased downstream signaling of β2AR, i.e. the phosphorylation of the PKA substrate phosducin. In an attempt to elucidate the mechanism behind the observed effects, Co-IPs were performed in order to investigate whether the peptides bind directly to the β2-AR and block its phosphorylation by GRK2. Indeed, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 could bind the receptor, suggesting that this way GRK2 is prevented from inhibiting the receptor. To investigate the physiological effect of GRK2 1-185, GRK3 1-185 and GRK5 1-185, their effect on neonatal mouse cardiomyocyte contractility and hypertrophy was analyzed. After long-term isoproterenol stimulation, in the presence of GRK2 1 185 and GRK3 1-185 the cross-sectional area of the cardiomyocytes showed no significant increase in comparison to the unstimulated control cells. In addition, upon isoproterenol stimulation, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 increased the beat rate in cardiomyocytes, mimicking RKIP while the base impedance, an indicator of viability, remained stable. The N-termini (1-185) of GRK2 and GRK3 simulated RKIP’s function and had a significant influence on β2AR phosphorylation, on its downstream signaling and internalization, could bind β2-AR, increased beat rate and did not significantly induce hypertrophy, suggesting that they may serve as a model for the generation of new and more specific targeting strategies for GRK mediated receptor regulation. N2 - G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK) phosphorylieren und desensitisieren G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR), einschließlich β-adrenerge Rezeptoren (βAR), welche wichtige Regulatoren der Herzfunktion sind. Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) ist ein endogener Inhibitor von GRK2, der zur Aktivierung von βAR führt und dadurch zur Steigerung der Herzkontraktilität. RKIP bindet N-terminal (1-185) an GRK2; der GRK2 N-Terminus ist wichtig für die GRK2/Rezeptor Interaktion. Durch diese Bindung wird GRK2 inhibiert und derer Interaktion mit den Rezeptor gestört, allerdings bleiben die zytosolische GRK2 Substrate unbeeinflusst. In diesem Projekt wurde die Interaktion zwischen RKIP und GRK untersucht, um neue Targeting Strategien zu entwickeln, die die positiven Effekte von RKIP auf βAR Signalwege simulieren. Die Bindung von RKIP an verschiedene, im Herzen lokalisierte GRK-Isoformen wurde über protein interaction assays untersucht: mit GRK2, GRK3 und GRK5 und mit deren N-terminalen Peptiden 1-53, 54-185, 1-185. Die Co-Immunopräzipitationen (Co-IPs) und die pull-down Versuche haben gezeigt, dass RKIP sowohl GRK2 und GRK3 als auch deren N-Termini bindet, GRK5 und dessen N-termini hingegen nicht. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass sich mehrere RKIP Bindungsstellen an dem GRK2 N-Terminus befinden. Um zu analysieren, ob die GRK2- und GRK3-Peptide eine ähnliche Wirkung wie RKIP auf die Interaktion von GRK2 und Rezeptor aufweisen, wurde die Rezeptorphosphorylierung ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass GRK2 1-185 und GRK3 1-185 die Phosphorylierung des βAR reduzieren können. Radioligandbindungsassays mit [3H] CGP-12177 und Fluoreszenzmikroskopie zeigten zudem, dass GRK2 1-185 und GRK3 1-185 auch die Internalisierungsrate des βAR senken können. Anschließend hatten GRK2 1-185 und GRK3 1-185 einen positiven Effekt auf einem βAR downstream Signalmolekül. Hierbei handelte es sich um die Phosphorylierung von Phosducin, was ein PKA-Substrat ist. Um die Wirkungsweise der N-termini zu erläutern, wurde untersucht, ob diese direkt den β2AR binden und somit die GRK2 vermittelte Phosphorylierung hindern. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass GRK2 1-185 und GRK3 1- 185 den β2AR binden und dementsprechend einen Einfluss auf die Phosphorylierung haben. Des Weiteren, wurden die Effekte der Peptide auf Kontraktilität und Hypertrophie in neonatalen Mauskardiomyozyten analysiert. In Anwesenheit von GRK2 1-185 und GRK3 1-185 war die Querschnittsfläche der Mauskardiomyozyten nicht signifikant größer im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollzellen. Außerdem wurde eine signifikante Erhöhung der Kontraktilität in den Mauskardiomyozyten mit GRK2 1-185 und GRK3 1-185 beobachtet. Insgesamt, konnten GRK2 1-185 und GRK3 1-185 RKIPs Funktion simulieren: sie hatten einen signifikanten Effekt auf β2AR-Phosphorylierung, Internalisierung und downstream Signaling. Zudem konnten sie die Kontraktilität erhöhen und hatten keinen Einfluss auf Hypertrophie. Somit könnten sie als Prototyp für die Entwicklung neuer Targeting Strategien für die GRK-vermittelte Rezeptor Regulation, genutzt werden. KW - G protein-coupled receptor kinase KW - Raf kinase inhibitor protein KW - Inhibition KW - Heart failure KW - Peptides Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199322 ER - TY - THES A1 - Kircher, Malte Tim T1 - Neuronale Genotoxizität von Angiotensin II T1 - Neuronal Genotoxicity of Angiotensin II N2 - In recent decades, the acceptance has steadily increased that oxidative stress plays an important role in the development of chronic diseases, malignant neoplasia and the acceleration of the aging process. As one of the most common chronic diseases, hypertension is often associated with a misregulated renin-angiotensin-aldosterone system that causes chronic oxidative stress. Hypertension is a risk factor for neurological diseases such as vascular dementia (VaD) and many neurological disorders, including VaD, have an ROS-associated or inflammatory component in their etiology. Our group has already demonstrated AT-II-induced genotoxicity in kidney and myocardial cells and tissues. The aim of this dissertation was to investigate a possible association between AT-II and neurodegeneration that is triggered by neuronal genotoxicity of AT-II. First, we showed in two neuronal cell lines that AT-II causes dose-dependent genome damage. Subsequent experiments could attribute this toxicity to NOX-produced superoxide generated after AT-II binding to the AT1R. In addition, AT-II-induced depletion of the most important intracellular antioxidant - glutathione - was demonstrated. In vivo, we were able to show that AT1aR knockout mice after AT-II treatment showed significantly more genome damage in the subfornic organ (SFO) than wild-type mice. The SFO is one of the few structures in the brain with an interrupted blood-brain barrier, which makes it accessible and particularly sensitive to circulating AT-II. In the recent literature, these genome damages were also observed in kidney and heart tissues and prove an additional genotoxicity of AT-II independent of AT1aR and consequently independent of blood pressure. In summary, this work shows that increased AT-II levels in neuronal cells cause genome damage due to NOX-produced superoxide. It is hoped that these results will one day help to decipher the complete development of VaD. N2 - In den letzten Jahrzehnten ist die Akzeptanz stetig größer geworden, dass oxidativer Stress eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von chronischen Erkrankungen, malignen Neoplasien sowie der Beschleunigung des Alterungsprozesses spielt. Als eine der häufigsten chronischen Erkrankungen ist Hypertonie oft mit einem fehlregulierten Renin-Angiotensin-Aldosteron-System assoziiert, welches chronisch oxidativen Stress verursacht. Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für neurologische Erkrankungen wie der vaskulären Demenz (VaD) und viele neurologischen Störungen, einschließlich der VaD, haben eine ROS-assoziierte beziehungsweise inflammatorische Komponente in ihrer Entstehung. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits eine AT-II-induzierte Genotoxizität in Nieren- und Myokardzellen bzw. -Gewebe nachweisen. Ziel dieser Dissertation war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen AT-II und Neurodegeneration zu untersuchen, welche durch eine neuronale Genotoxizität von AT-II ausgelöst wird. Zunächst zeigten wir in zwei neuronalen Zelllinien, dass AT-II eine Dosis-abhängige Genomschädigung verursacht. Nachfolgende Experimente konnten diese Toxizität auf NOX-produziertes Superoxid zurückführen, das nach Bindung von AT-II an den AT1R generiert wird. Zudem konnte ein AT-II-induzierter Verbrauch des wichtigsten intrazellulären Antioxidans – Glutathion - nachgewiesen werden. In vivo konnten wir zeigen, dass AT1aR-Knockout-Mäuse nach AT-II-Behandlung signifikant mehr Genomschäden im Subfornikalorgan (SFO) aufwiesen als Wildtypmäuse. Das SFO hat als eine der wenigen Strukturen im Gehirn eine unterbrochene Blut-Hirn-Schranke, was es für zirkulierendes AT-II zugänglich und besonders empfindlich macht. Diese Genomschäden wurden in der neueren Literatur auch in Nieren- und Herzgewebe beschrieben und belegen eine zusätzliche, AT1aR- und damit Blutdruck-unabhängige Genotoxizität von AT-II. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass erhöhte AT-II-Konzentrationen in Nervenzellen Genomschäden durch NOX-produziertes Superoxid verursachen. Die Hoffnung ist, dass diese Ergebnisse dabei helfen, eines Tages die vollständige Entstehung der VaD zu entschlüsseln. KW - Angiotensin II KW - Toxizität KW - Neuronale KW - toxicity KW - angiotensin II KW - neuronal Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214273 ER - TY - THES A1 - Konrad, Charlotte T1 - Biochemische Charakterisierung von cAMP-Gradienten – Einfluss von Phosphodiesterasen T1 - Biochemical Characterization of cAMP Gradients – Influence of Phosphodiesterases N2 - Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquitärer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen Körper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellulärer Signale folgt jedoch eine Erhöhung desselben intrazellulären Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifität aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu ermöglichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signalübertragung ermöglichen. Eine mögliche Ursache für die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Domänen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivität von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die Fähigkeiten besitzen, cAMP zu degradieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Größe dieser Domänen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Größe als Nanodomänen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinität (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter Länge, werden zusätzlich die Nanodomänen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Größe und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Größe der Nanodomänen korreliert. Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Domäne wird zusätzlich der Einfluss von regulatorischen Domänen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren können. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche höchstwahrscheinlich dosisabhängig ist und somit graduell verläuft. Hiermit präsentieren sich die Domänen als dynamische Bereiche, d.h. sie können in ihrer Ausprägung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese bestätigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung lässt sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Größe reguliert werden können. Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verständnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch für das Verständnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist. N2 - Cyclic AMP is a ubiquitous second messenger, which is involved in a huge variety of signaling pathways. Nevertheless, thinking about signaling specificity, it is unclear how numerous diverse signals are all translated via the same second messenger. However, to ensure downstream specificity there is one accepted model - the compartmentalization of cAMP. Different levels of cAMP therefore lead to signaling islets or areas, which ensure a more diverse downstream signaling. One example, which guarantees areas with lower cAMP concentration, is the local hydrolysis of cAMP due to phosphodiesterases’ hydrolytic activity. In this thesis the ability of different phosphodiesterases to build cAMP gradients is compared to the ability of the PDE4 to build cAMP domains in the scale of nanometers, which was already shown by our group. To discriminate influence factors of the formation of those nanodomains, the focus was set on distinct PDEs’ kinetic properties. Therefore, a PDE with a high velocity (PDE2A3) for cAMP hydrolysis is compared to the PDE with the highest known affinity (PDE8A1) to cAMP. Furthermore, with the tools provided by our group, linkers, which are “nanorulers” of distinct size, were used to directly measure the radius of those domains. It is revealed, that the size of the nanodomains directly correlates with the hydrolysis velocity. Furthermore, by comparison of full length PDE with its catalytic domain, it is shown, that their regulatory domains can modulate the ability of phosphodiesterases to create cAMP gradients. In PDE2A3, modulation of cAMP gradients was observed upon cGMP stimulation, which probably occurs in a concentration-dependent matter. Thus, cAMP domains seem to be dynamic areas, i.e. they can be regulated in their size. It is postulated, that phosphodiesterases are one important force for creating compartments, but the family of PDEs itself is inhomogeneous. Not every PDE can build detectable compartments (PDE8A1), but others can build compartments, which are regulated through external stimuli (PDE2A3). The thesis builds the foundation for additional characterization of the other PDE families, which would provide further insight in strategies of cAMP compartmentalization. Moreover, the knowledge of distinct functions of PDEs on cAMP compartments is crucial for the understanding of the pathophysiology of several diseases and the understanding of present and future pharmacological therapies. KW - Cyclo-AMP KW - Phosphodiesterase KW - cAMP KW - PDE Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205728 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Florian T1 - Kontraktionsverhalten neonataler Rattenkardiomyozyten bei Überexpression phosphorylierungsdefizienter RKIP Mutanten S51/S52 T1 - Contractility of neonatal rat cardiomyocytes after overexpression of phosphorylation-deficient RKIP mutants S51 /S52 N2 - Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden. N2 - By phosphorylation, GRK2 inactivates cardiac ß-adrenoreceptors and thereby reduces the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. As a natural inhibitor of GRK2, RKIP influences cell signaling when ß-adrenoreceptors are stimulated. The presented research shows that an overexpression of RKIP increases the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. The number of spontaneous contractions occurring before and after stimulation with isoproterenol was recorded and a temporal analysis of calcium release and uptake after electrical stimulation was performed. In the unstimulated state, neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed wild-type RKIP showed no significant differences in terms of spontaneous contractions compared with the control group. After stimulation with isoproterenol, neonatal rat cardiomyocytes in which wild-type RKIP was overexpressed showed a significantly higher number of occurring spontaneous contractions. Neonatal rat cardiomyocytes overexpressing wild-type RKIP showed an increased calcium release during systole and an accelerated calcium reuptake during diastole. The RKIP mutants RKIPS51V and RKIPS52V were examined regarding their contractility. Neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed RKIPS51V and RKIPS52V showed no significant differences compared to the control group in terms of spontaneous contractions or calcium cycling. Since phosphorylation at amino acid position 51 or amino acid position 52 could also be possible without direct effect on contractility, an in vitro kinase assay focusing on PKA and PKC was performed. In the presented work, apart from phosphorylation at S153, no further phosphorylation of RKIP by PKC or PKA could be observed. KW - Herzinsuffizienz KW - Raf-Kinasen KW - Inhibition KW - Beta-Rezeptor KW - beta-adrenerge Signalwege KW - phopohrylierungsdefizient Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213747 ER - TY - JOUR A1 - Dekant, Wolfgang A1 - Bridges, James T1 - Assessment of reproductive and developmental effects of DINP, DnHP and DCHP using quantitative weight of evidence JF - Regulatory Toxicology and Pharmacology N2 - Quantitative weight of evidence (QWoE) methodology utilizes detailed scoring sheets to assess the quality/reliability of each publication on toxicity of a chemical and gives numerical scores for quality and observed toxicity. This QWoE-methodology was applied to the reproductive toxicity data on diisononylphthalate (DINP), di-n-hexylphthalate (DnHP), and dicyclohexylphthalate (DCHP) to determine if the scientific evidence for adverse effects meets the requirements for classification as reproductive toxicants. The scores for DINP were compared to those when applying the methodology DCHP and DnHP that have harmonized classifications. Based on the quality/reliability scores, application of the QWoE shows that the three databases are of similar quality; but effect scores differ widely. Application of QWoE to DINP studies resulted in an overall score well below the benchmark required to trigger classification. For DCHP, the QWoE also results in low scores. The high scores from the application of the QWoE methodology to the toxicological data for DnHP represent clear evidence for adverse effects and justify a classification of DnHP as category 1B for both development and fertility. The conclusions on classification based on the QWoE are well supported using a narrative assessment of consistency and biological plausibility. KW - n-hexyl phthalate KW - male rats KW - dicyclohexyl phthalate KW - Diisononyl phthalate KW - in-vivo KW - 2-Generation reproduction KW - testosterone production KW - sexual development KW - risk-assesment KW - fetal testis KW - weight of evidence KW - classification and labeling KW - reproductive and developmental toxicity KW - quantitative assessments Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186750 VL - 81 ER - TY - THES A1 - Berlin, Christopher T1 - Die Untersuchung der kardialen Folgen einer ubiquitären Deletion von RKIP in Mäusen T1 - The cardiac consequences of an ubiquitous knockout of RKIP in mice N2 - Die Herzinsuffizienz, eine der häufigsten chronischen Krankheiten in der westlichen Welt, ist als Folge einer Myokardschädigung durch eine verschlechterte Pumpfunktion des Herzens charakterisiert, die der Körper durch verschiedene Kompensationsmechanismen zur Kontraktilitätssteigerung auszugleichen versucht. Wichtiger Mechanismus hierfür ist die Kontraktilitäts- und Frequenzsteigerung über ß-adrenerge Rezeptorsignale, welche bei langfristiger Stimulation allerdings zu einer Abnahme der Funktionalität und Minderexpression eben dieses Rezeptorsystems, sowie der gleichzeitigen Verschlechterung der Herzinsuffizienz führt. Interessanterweise wird parallel zur verminderten Rezeptorexpression bei Herzinsuffizienzpatienten eine Zunahme der GRK-Aktivität beobachtet. Diese Kinase ist in der Lage, ß-adrenerge GPCR-Signale durch Phosphorylierung des membranständigen Rezeptors herunterzuregulieren. Durch einen PKC-abhängigen switch von Raf1 zu GRK2 konnte mit RKIP ein kardialer, endogener Inhibitor der GRK2 identifiziert werden. Es wurde in vitro und in vivo in Mäusen mit myokardialer Überexpression von RKIP gezeigt, dass RKIP fähig ist, die kontraktile Funktion von Herzmuskelzellen zu verbessern, negative kardiale Langzeitfolgen wie eine Verschlechterung der Insuffizienz, Remodeling-Prozesse wie Zunahme der Fibrosierung und eine gesteigerte Apoptoserate, sowie kardiale Rhythmusstörungen protektiv zu beeinflussen. Um die endogene Rolle von RKIP weiter zu erörtern, wurde in dieser Arbeit der Knockout von RKIP unter basalen Bedingungen, als auch nach transverser Aortenkonstriktion (TAC) untersucht. Zur Untersuchung physiologischer Parameter wie der Verkürzungsfraktion, oder dem linksventrikulärem diastolischen Durchmesser wurden echokardiographische Verfahren herangezogen. In diesen Untersuchungen zeigte sich nach dreiwöchiger TAC eine Verschlechterung der Pumpfunktion, sowie eine verstärkte Dilatation des linken Ventrikels in RKIP-/--Mäusen. Gestützt wurden diese Ergebnisse durch einen erhöhten pulmonalen Blutrückstau in RKIP-/--Mäusen nach chronischer Druckbelastung. Zudem wurde an isolierten Kardiomyozyten die Kinetik von Kalzium als für die Kontraktion verantwortlichen Botenstoff durch intrazelluläre Fluoreszenz-Echtzeit-Messungen, sowie die Kontraktion und Relaxation auf Zell- und Sarkomerebene durch ein optisches Kamerasystem untersucht. Hier zeigte sich ohne den Einfluss β-adrenerger Stimulantien äquivalent zum basalen Phänotyp dieser Tiere in RKIP-/--Kardiomyozyten keine Veränderung der Kalzium-Kinetik, sowie der Kontraktion und Relaxation auf Zell- und Sarkomerebene. Des Weiteren wurden mittels realtime PCR die Expressionslevels von Insuffizienzmarkern wie BNP und ANP, sowie von Kollagen 3 bestimmt. Der Grad der Fibrosierung wurde zusätzlich durch Quantifizierung der fibrosierten Areale in histologischen Querschnitten untersucht. Apoptotische Veränderungen wurden mittels TUNEL-Assay auf histologischer Ebene bestimmt. In all diesen Untersuchungen zeigte sich ein fortgeschrittenes kardiales Remodeling in RKIP-/--Mäusen nach TAC im Vergleich zu Wildtyptieren. Hand in Hand mit dem Bild einer fortgeschrittenen Herzinsuffizienz in RKIP-/--Mäusen nach TAC konnte zudem in diesen Tieren eine gesteigerte Mortalität nach chronischer Hochdruckbelastung festgestellt werden. In Kombination mit den protektiven Eigenschaften einer kardialen RKIP-Überexpression, sowie dem positiven Effekt einer retroviralen RKIP-Transfektion sprechen diese Ergebnisse für RKIP als einen interessanten körpereigenen Angriffspunkt für die kontraktilitätssteigernde Therapie der Herzinsuffizienz, den es in weiteren klinischen Studien zu untersuchen gilt.� N2 - The mitogen-activated kinase cascade Raf1/MEK/ERK1/2 as well as G protein-coupled receptors (GPCR) play major roles in cardiac hypertrophy, contractility and cardiac remodeling. Both of these signaling cascades are regulated by a protein called RKIP. It coordinates its different regulatory functions dependent on its phosphorylation state either as monomer or as dimer. Unphosphorylated, monomeric RKIP inhibits Raf1 and thus the Raf1/MEK/ERK1/2 cascade, whereas phosphorylated, dimeric RKIP inhibits G protein coupled receptor kinase (GRK) 2, which is an important regulator of β-adrenergic receptors. RKIP knockout mice do not have an overt cardiac phenotype under basal conditions, but they develop severe heart failure in response to TAC. Our study indicates that RKIP has protective effects in pressure overload-induced heart failure and it may thus be a proficient principle in heart failure therapy. KW - RKIP Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152882 ER - TY - THES A1 - Hümmert, Martin W. T1 - Untersuchung einer monomeren Mutante der extrazellulär regulierten Kinase 2 (ERK2) bei kardialer Hypertrophie T1 - Analysis of a monomeric mutant of extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) on cardiac hypertrophy N2 - Die Raf-MEK-ERK1/2-Kaskade spielt eine wichtige Rolle in der Vermittlung von kardialer Hypertrophie und Zellüberleben. Durch unsere Arbeitsgruppe konnte im Vorfeld gezeigt werden, dass die Dimerisierung von ERK2 eine Voraussetzung für dessen Autophosphorylierung an Thr188 darstellt, welche wiederum für die Übermittlung der hypertrophen Effekten von ERK1/2 erforderlich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daraus abgeleitet die Fragestellung untersucht, ob mit Verhinderung der ERK2-Dimerisierung eine nützliche Strategie zur Inhibition von Hypertrophie vorliegt und welchen Einfluss diese auf das Zellüberleben hat. Die Auswirkungen der Dimerisierungsdefizienz von ERK2 wurden in neonatalen Kardiomyozyten der Ratte und in transgenen Mäusen mithilfe einer ERK2-Mutante untersucht, der einige Aminosäuren in der ERK-ERK-Interaktionsfläche fehlen und daher keine Dimere bilden kann (ERK2Δ174-177). Eine Überexpression von ERK2Δ174-177 in neonatalen Kardiomyozyten verringerte signifikant die Antwort auf hypertrophe Stimuli (Phenylephrin, Endothelin 1). Im Anschluss daran wurden die Effekte der Dimerisierungsdefizienz von ERK2 in vivo an transgenen Mäusen mit kardialer Überexpression von ERK2Δ174-177 erforscht. Diese Mäuse zeigten unter basalen Bedingungen keine Unterschiede gegenüber Wildtyp-Mäusen hinsichtlich Kardiomyozytengröße, Ventrikelwanddicke und kardialer Funktion. Unter chronischer Druckbelastung mittels TAC ließ sich hingegen ein signifikant vermindertes Ausmaß an Hypertrophie im Vergleich zu Wildtyp quantifizieren. Da der ERK1/2-Signalweg auch am Überleben von Kardiomyozyten beteiligt ist, wurde die Apoptose an histologischen Schnitten von Mausherzen analysiert. Interessanterweise fand sich bei Herzen, die das dimerisierungsdefiziente ERK2-Protein überexprimierten, eine mit Wildtyp vergleichbare Anzahl TUNEL-positiver Zellen. Ein ähnliches Ergebnis konnte bei der Messung des Fibrosegrades an Sirius-Rot gefärbten histologischen Schnitten beobachtet werden. Zuletzt wurden die Folgen der ERK2-Dimerisierungsdefizienz auf physiologische Hypertrophie mit einem Laufrad-Versuchsaufbau evaluiert. Transgene ERK2Δ174-177- und Wildtyp-Mäuse zeigten unter diesem physiologischen Stimulus keine Unterschiede im Hinblick auf die Zunahme an kardialer Hypertrophie. Da die Dimerisierungsdefizienz von ERK2 zu einer reduzierten pathologischen Hypertrophie, ohne negative Auswirkungen auf ERK1/2-vermittelte anti-apoptotische Effekte noch auf kardiale Funktion oder physiologische Hypertrophieprozesse führt, stellt die Hemmung der ERK-Dimerisierung ein attraktives Ziel zur Therapie pathologischer Hypertrophie sowie potentiell auch anderer auf den ERK1/2-Signalweg basierenden Krankheiten dar. N2 - The Raf-MEK-ERK1/2 pathway plays a crucial role in signal transmission of cardiac hypertrophy and cell survival. In advance, we showed that dimerization of ERK2 is a prerequisite for autophosphorylation on Thr188, promoting cardial hypertrophic effects. In this study we therefore investigated the role of ERK2-dimerization in cardiac hypertrophy and cell survival. Overexpression of the dimerization deficient mutant ERK2Δ174-177 in neonatal rat cardiomyocytes significantly attenuated the hypertrophic response on hypertrophic stimuli (phenylephrine, ET-1). Moreover mice with cardiac overexpression of ERK2Δ174-177 who underwent chronic pressure overload by transverse aortic constriction demonstrated significant lower cardiac hypertrophy compared to wild type mice in histological examination and echocardiography. No difference was found in the rate of apoptotic cells measured in histological sections by TUNEL assay. Interestingly, ERKΔ174-177-mice who underwent running-wheel experiments showed no difference in physiological hypertrophy compared to wild type mice. In conclusion, the dimerization deficiency of ERK2 lead to reduced pathological cardiac hypertrophy without negative impact neither on ERK1/2-mediated anti-apoptotic effects nor on physiological hypertrophic processes. Hence, inhibition of ERK-dimerization might be an attractive target to reduce pathological hypertrophy and potentially interferes with other diseases mediated by the ERK1/2 pathway. KW - ERK2d4 KW - ERK1/2 KW - ERK-Monomer KW - ERK Dimerisierungsdefizienz KW - kardiale Hypertrophie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155644 N1 - veröffentlicht am 01.07.2020 ER - TY - THES A1 - Arnaudov, Theresa Irina T1 - Anthocyane - Modulation oxidativen Stresses in vivo und in vitro T1 - Anthocyane - modulation of oxidative stress in vivo and in vitro N2 - Die menschliche Nahrung enthält antioxidative Stoffe, die den Menschen möglicherweise vor oxidativem Stress und seinen Konsequenzen schützen können. Im Fokus der vorliegenden Arbeit standen Anthocyane, die als vielversprechende antioxidative Pflanzenstoffe in unterschiedlichen Obst- und Gemüsesorten zu finden sind. Im ersten Teil der Arbeit wurden in einem HT-29-Zellkulturmodell die zwei wichtigsten Vertreter der Anthocyanidine, Delphinidin und Cyanidin, untersucht. Es galt zu prüfen, ob beide Pflanzenstoffe in geringen Konzentrationen in humanen Zellen antioxidativ wirken und oxidativen Genomschaden verhindern können. Im Comet-Assay reduzierten sowohl Delphinidin (ab 3,2 µM) als auch Cyanidin (ab 1 µM) signifikant die durch 100 µM Wasserstoffperoxid induzierten DNA-Schäden in den HT-29-Zellen. Im Comet-Assays mit FPG-Enzym wurde deutlich, dass eine Präinkubation mit Cyanidin wirksam die Oxidation der DNA-Basen verringert. Die Auswirkungen auf den Glutathionspiegel wurden mit Hilfe des Glutathion-Recycling-Assays nach Tietze untersucht. Die Präinkubation mit Cyanidin führte hierbei zu keinen signifikanten Veränderungen. Um die Auswirkungen der Anthocyanidine auf die intrazelluläre ROS-Produktion zu beobachten, wurde der fluoreszierenden Farbstoffs DHE verwendet. Sowohl Delphinidin (10 und 15 µM) als auch Cyanidin (10 und 20 µM) senkten signifikant die durch 25 µM Antimycin A angeregte ROS-Produktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein anthocyanreicher roter Fruchtsaft in einer 10-wöchigen Interventionsstudie am Menschen getestet. Hieran nahmen sowohl 19 Fibromyalgiepatienten als auch 10 gesunde Probanden teil. Es sollte die Hypothese geprüft werden, dass die konzentrierte und andauernde Einnahme des Saftes messbar oxidative Stressparameter im Blut verändert. Außerdem sollten mögliche Unterschiede im oxidativen Stresslevel zwischen Patienten und gesunden Probanden aufgedeckt werden. Nach jeder Studienphase erfolgte eine Befragung nach klinischen Symptomen und die Abgabe einer Urin- und Blutprobe in der Schmerzambulanz der Uniklinik Würzburg (2 Wochen Einwaschphase, 4 Wochen Fruchtsaftphase mit je 750 ml Saft täglich, 4 Wochen Auswaschphase). Das ROS-Level wurde mit 2 Methoden in den mononukleären Blutzellen untersucht: In der photometrischen NBT-Messung konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen oder Zeitpunkten beobachtet werden. Bei der durchflusszytometrischen Messung mit Hilfe des fluoreszierenden DCF-Farbstoffes lag das ROS-Level der Patientengruppe vor Fruchtsafteinnahme signifikant höher als das der Kontrollgruppe. Zur Messung der antioxidativen Kapazität wurde die Eisen-Reduktionsfähigkeit (FRAP) im Plasma untersucht. In der Patientengruppe zeigte sich eine Steigerung der antioxidativen Kapazität nach Einnahme des Fruchtsaftes. Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen waren gering. Sowohl das Gesamtglutathion als auch die oxidierte und reduzierte Form wurden in den Erythrozyten der Probanden mit dem Glutathion-Recycling-Assay gemessen. Nach der Fruchtsafteinnahme stieg die Konzentration des Gesamtglutathions in der Patientengruppe an. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Delphinidin und Cyanidin auch in geringen Konzentrationen (1µM - 20µM) einen antioxidativer Effekt in HT-29-Zellen haben und vor oxidativem DNA-Schaden schützen können. Die Ergebnisse der Interventionsstudie unterschieden sich teilweise in den einzelnen Endpunkten. Es war nicht möglich, den Fibromyalgiepatienten ein höheres oxidatives Stresslevel nachzuweisen. Ein Grund für die geringeren Effekte des Fruchtsaftes könnte in der eher geringen Bioverfügbarkeit der Anthocyane liegen. Außerdem könnte die Heterogenität der Fibromyalgieerkrankung genauso wie andere endogene oder exogene Faktoren wie etwa Alter oder Medikamenteneinnahme die teilweise großen interindividuellen Schwankungen der Messergebnisse hinsichtlich der oxidativen Stressparameter bedingen. Klinisch profitierten einige der Fibromyalgiepatienten von der Fruchtsafteinnahme insbesondere hinsichtlich der Reizdarmsymptomatik. Dieses Volksleiden könnte ein interessanter Ansatzpunkt für Folgeuntersuchungen mit einem anthocyanreichen Produkt sein. N2 - Human diet contains antioxidative components which might be protective against oxidative stress and its consequences. This study concentrates on anthocyanins which are promising antioxidative phytochemicals and can be found in numerous fruits and vegetables. The first part of this study focused on the two major anthocyanidins, delphinidin and cyanidin, and their effects in vitro (HT-29 cell line). The aim was to investigate whether low concentrations of these anthocyanidins were able to reduce oxidative stress and oxidative DNA damage in this human cell model. The effects on DNA damage and repair were monitored by the comet assay. Delphinidin (3, 2 µM) as well as cyanidin (1 µM) reduced significantly DNA damage induced by 100 µM H2O2. The comet assay extended by the FPG enzyme clarified that cyanidin was able to reduce the number of oxidized DNA bases. The amounts of total and oxidized glutathione measured by the glutathione recycling assay were not significantly influenced by cyanidin. The intracellular ROS concentration was measured by using the fluorescent ROS-indicator DHE. Delphinidin (10 and 15 µM) as well as cyanidin (10 and 20 µM) reduced significantly ROS productions induced by 25 µM antimycin a. The second part of this thesis was a human intervention study which investigated the effect of an anthocyanin rich fruit juice on patients suffering from fibromyalgia and on a healthy control group. The hypothesis was that the daily intake of 750 ml juice for 4 weeks would change the oxidative stress parameters measured in the blood of the probands. Furthermore, the oxidative stress-level of the fibromyalgia patients should be compared to that of the healthy probands. 19 patients and 10 controls were recruited and were cared for by the pain ambulance of the university hospital of Würzburg. A clinical questionnaire and blood and urine samples were collected after each phase of the study (2 weeks pre-wash phase, 4 weeks fruit juice phase, 4 weeks wash-out phase). The level of ROS was measured by 2 different methods in the fresh mononuclear blood cells. There were no significant differences between groups or time-points in ROS concentration detected in the photometric NBT-Assay. However, the flow cytometric DCF-Assay showed a higher ROS level in patients than in controls before the fruit juice phase. The antioxidative capacity were measured by investigating the Ferric Reducing Abilitiy of Plasma (FRAP). The antioxidative capacity of the patients increased after fruit juice intake. There were no significant differences between both groups. The amount of total, reduced and oxidized glutathione in erythrocytes was detected by the glutathione recycling assay. After fruit juice intake the amount of total glutathione increased in the patient group. The GSH/GSSG quotient, a marker of oxidative stress, were slightly but insignificantly improved in both groups after fruit juice intake. In summary the results of this thesis demonstrated that low concentrations of delphinidin or cyanidin (1 µM – 20 µM) have antioxidative effects on HT-29 cells and protect them from oxidative DNA damage. The different endpoints of the fruit juice study showed inconsistent results. There was no clear evidence for a higher oxidative stress level in fibromyalgia patient compared to the control group. One reason for the partially small effects of the red fruit juice could be the low bioavailability of the anthocyanins. The heterogeneity of the fibromyalgia disease as well as other endogenous and exogenous influences such as age or medication may have caused the partially large interindividual differences. However, some of patients gained clinical benefits from drinking the red fruit juice especially regarding the irritable bowel syndrome. It could be interesting to focus on this his common disease in further studies. KW - Oxidativer Stress KW - Anthocyane KW - Fibromyalgie Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152593 ER - TY - THES A1 - Basali, Timo T1 - Untersuchung der Nierenschädigung durch Aldosteron am Rattenmodell über die Quantifizierung von Schädigungsmarkern mittels Real-Time PCR-Technik T1 - Exploring renal damage caused by aldosterone by quantifying damage markers in rats via real time PCR technique N2 - Die Breite der Wirkungen von Aldosteron auf Nierenzellen wurde lange Zeit unterschätzt. Inzwischen zeigte sich ein nicht unerheblicher Anteil des Hyperaldosteronismus an arterieller Hypertonie und ebenso mehren sich die Hinweise auf damit assoziierter erhöhter Inzidenz für maligne Entartung von Nierengewebe. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Hyperaldosteronismus auf Nierenzellen von Ratten in vivo untersucht. Mittels real time quantitative PCR wurden die relative Expressionsveränderungen der mRNA von validierten Nierenschädigungsmarkern im Hyperaldosteronismusmodell kontrolliert beobachtet und statistisch ausgewertet. Anders als im analog durchgeführten Vorversuch mit DOCA an der Stelle von Aldosteron, ließ sich größtenteils kein über der natürlichen Streuung der Daten liegender, signifikanter Effekt der Nierenschädigung durch überhöhte Aldosteronspiegel nachweisen. Hierfür kommen vielfältige Gründe in Frage. Neben der technischen Variabilität, der Beschaffenheit der internen Kontrolle, potentiell vorhandenen Inhibitoren und der Qualität der mRNA, konnten eine Reihe von weiteren Gründen als Ursache für die Diskrepanz zu den Ergebnissen der mit DOCA behandelten Tiere ausgeschlossen werden. Neben der theoretischen Möglichkeit inter-methodischer Differenzen und sich daraus ergebender Variationen, sowie der noch weiter zu untersuchenden Rolle des Glukokortikoidrezeptors durch dessen variable gleichzeitige Aktivierung, ist die Interpretation im Sinne eines zu gering ausgeprägten Schädigungseffektes durch den Hyperaldosteronismus für den gewählten Stichprobenumfang naheliegend. Hiermit stimmt auch die Tatsache überein, dass der Effekt der Behandlung mit Aldosteron im Vergleich zur Behandlung mit DOCA von vorne herein deutlich geringer ausfallend erwartet wurde. N2 - The broad spectrum of effects of aldosterone on renal cells has been underestimated for a long time. Meanwhile it has been shown that hyperaldosteronism has a considerable share of all cases of arterial hypertension, and the indications for an associated higher incidence of malignant transforming of kidney tissue are also increasing. The subject of this study was to investigate the effect of Hyperaldosteronism on kidney cells in rats. By means of real-time quantitative PCR, the change in the relative expression of mRNA of validated kidney cell damage markers in the hyperaldosteronism model were monitored and statistically evaluated under controlled conditions. In contrast to the previous pre-test with DOCA instead of aldosterone, a significant effect of renal impairment due to excessive aldosterone levels could not be detected. Numerous reasons are conceivable for that. In addition to the technical variability, the nature of the internal control, potentially present inhibitors and the quality of the mRNA, a number of further reasons could be excluded as a cause of the discrepancy with the results of the animals treated with DOCA. Besides the theoretical possibility of inter-methodical differences and resulting variations, as well as the role of the glucocorticoid receptor, which is still to be investigated, the closest interpretation is a damage effect too small to be detected by the given sample size. This is also in agreement with the fact that the effect of the treatment with aldosterone compared with the treatment with DOCA was expected to be significantly lower from the outset. KW - Aldosteron KW - Nierenzellkarzinom KW - Real-Time quantitative PCR KW - Nierenschädigung KW - Aldosteron KW - Nierenschädigung KW - Real-Time quantitative PCR KW - Nierenschädigungsmarker Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151311 ER - TY - THES A1 - Gruse, Tamara T1 - Untersuchung der Rolle der ERK-Dimerisierung bei der ERK1/2- vermittelten Proliferation von Tumorzellen T1 - Investigation of the role of ERK dimerization in the ERK1/2-mediated proliferation of tumor cells N2 - Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt. N2 - The Raf-MEK-ERK signaling cascade plays an important role in many diseases, such as cardiac hypertrophy, diabetes and inflammation. ERK1/2 is involved in many cellular processes, i.a. proliferation, differentiation, growth, hypertrophy and apoptosis. This MAPK signaling pathway also has a significant function in tumorigenesis because it is clearly activated in about 50% of all cancers. The aim of this work was to investigate the role of a newly discovered phosphorylation site on threonine188 in ERK2 in the genesis and possible therapy of tumors. For this, a Myc- ERK2309-357 peptide was used, which was developed in the research group Lorenz in 2013. It has previously been shown that Myc-ERK2309-357 binds directly to ERK2, inhibits ERK1/2 dimerization, and prevents increased localization of ERK2 in the nucleus. In this project we demonstrated that the Myc-ERK2309-357 peptide reduces the tumor cell proliferation of various cancer cell lines (Caco-2, SCC68, PC / 1-1 and PC / 13-1) by 60-80%. Furthermore, we could show that Myc-ERK2309-357 has no influence on the phosphorylation of ERK1/2 on the TEY motif. The activation of ERK1/2 by the kinases MEK1/2 is thus unaffected and the cytosolic ERK functions, e.g. the anti-apoptotic effect, would thus persist. In addition, we discovered that Myc-ERK2309-357 inhibits proliferation of the tumor cells significantly better compared to the MEK inhibitors U0126 and PD98059 and compared to the EGFR antibody Cetuximab. KW - Dimerisierung KW - MAP-Kinase KW - Carcinogenese KW - ERK1/2 Dimerisierung KW - Tumorzellproliferation KW - Krebs Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159847 ER - TY - THES A1 - Montag [geb. Kukielka], Gracia Anna T1 - Rolle des Differenzierungszustandes für die Empfindlichkeit von Säugerzellen gegenüber genotoxischen Agenzien T1 - Role of the differentiation status for the sensitivity of mammalian cells to genotoxic agents N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse verschiedener genotoxischer Substanzen auf Säugertierzellen untersucht. Da ein Organismus der Ontogenese unterliegt und sich Zellen aus Stamm- und Vorläuferzellen entwickelt, gilt es diese ursprünglichen Zellen vor äußeren Einflüssen zu schützen. Da bisher kaum Untersuchungen von Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien durchgeführt wurden, wurden unter Verwendung vieler unterschiedlicher biologischer Endpunkte Effekte auf die Vitalität, Proliferation, Mitose und Apoptose dieser Zellen untersucht. Zudem erfolgte eine Interpretation der Ausbildung von Mikrokernen, Entstehung von DNS-Schäden und der zugrundeliegenden Reparaturmechanismen. So konnte mit Hilfe der Untersuchungen der hämatopoetischen Stammzellen und der TK6-Zellen postuliert werden, dass hämatopoetische Stammzellen weitestgehend weniger empfindlich gegenüber Zytostatika (Doxorubicin, Vinblastin, Methylmethansulfonat und Mitomycin C) sind als die lymphoblastoide Zelllinie TK6, welche in der Entwicklungshierarchie den Stammzellen folgt. Die Befürchtung, dass der Mikrokerntest in immortalisierten TK6-Zellen als Grundlage für Genotoxizitätsuntersuchungen nicht genügen würden, konnte mit Hilfe der Versuchsergebnisse dieser Arbeit widerlegt werden. Die Ergebnisse belegen, dass der Mikrokerntest in TK6-Zellen relevant ist, da TK6-Zellen empfindlicher auf genotoxische Agentien im Vergleich zu hämatopoetischen Stammzellen reagieren. Bei der Untersuchung der Leukämiezelllinie HL-60 wurden die Effekte klassischer (Vinblastin, Vincristin, Vinflunin und Vinorelbin) mit neu synthetisierten Vinca-Alkaloiden (4-Chlorochablastin, 4-Chlorochacristin, 16a, 17b und 18a) verglichen. Vinca-Alkaloide werden sehr häufig mit Nebenwirkungen, wie Neuropathien assoziiert, welche während einer Chemotherapie oftmals zu Therapieabbrüchen durch die Patienten führen. Aus diesem Grund war es erstrebenswert, neuartige Vinca-Alkaloide zu entwickeln, welche weniger Nebenwirkungen aber zugleich eine ähnliche Wirksamkeit aufweisen. Obwohl die Potenz der neuen Substanzen niedriger war als bei Vinblastin, Vincristin und Vinorelbin, zeigte ein Teil eine ähnliche Wirkung wie das Vinca-Alkaloid Vinflunin auf die Krebszelllinie HL-60 auf. Die Ergebnisse diese Arbeit können als erste Indikation in vitro genommen werden, dass sich diese Substanzen in der Krebstherapie als wirksam erweisen könnten und nach weiteren Ergebnissen in vivo als therapeutische Alternativen in Betracht gezogen werden. Auch bei der vergleichenden Untersuchung von exponentiell wachsenden mit differenzierten Zelllinien konnten Unterschiede detektiert werden. Die Zelllinie HT-22, welche selbst keine Krebszelllinie ist, zeigte nach Differenzierung zu nicht exponentiell wachsenden Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Alkylanz Methylmethansulfonat, was auf einer verminderten Basenexzisionsreparatur beruhen könnte. Auch die differenzierte Form der Adenokarzinom-Zelllinie CaCo2 zeigte eine gesteigerte Sensitivität gegenüber dem Topoisomerase II-Inhibitor Etoposid auf, wohingegen der unselektive Topoisomerase II-Hemmer Doxorubicin keinen Effekt aufwies. Um den Sachverhalt zu klären ob die festgestellten Unterschiede auf das Enzym Topoisomerase II zurückzuführen oder zellartspezifisch waren, wurden weitere Analysen der Zelllinien HL-60 und deren differenzierten Zellart durchgeführt. Auch hier konnten signifikante Unterschiede bei der Einzelzellgelelektrophorese nach Behandlung mit Doxorubicin und Etoposid festgestellt werden. Neben den in dieser Arbeit nachgewiesenen Unterschieden bei der Reparatur zwischen den Zelltypen, könnten aber auch weitere Faktoren zu Varianzen führen und die Mutagenitätsforschung beeinflussen. Folglich ist davon auszugehen, dass zukünftige Testungen bei der pharmakologischen Substanzentwicklung in verschiedenen Zellsystemen von Nöten sind, bevor neue Substanzen zugelassen werden. Alles in allem konnte die Komplexität der Ergebnisse zwischen Zellen der verschiedenen Differenzierungsstadien in dieser Arbeit aufgezeigt werden. Deswegen sollte auch bei weiteren Forschungsvorhaben insbesondere ein Augenmerk auf den Differenzierungszustand der zu untersuchenden Zellpopulation geworfen werden. N2 - In the present study, the influences of different genotoxic substances on mammalian cells were investigated. Given that organisms develop on the basis of ontogenesis and cells develop from stem cells and progenitor cells, it is important to protect these original cells from external influences. Due to the fact so far only few studies have been carried out on cells in different differentiation stages, many different biological endpoints, like effects on vitality, proliferation, mitosis and apoptosis of these cells have been investigated. In addition, the formation of micronuclei, the development of DNA damage and the underlying repair mechanisms were interpreted. The investigations of hematopoietic stem cells and TK6 cells have shown that hematopoietic stem cells are predominantly less sensitive to cytostatic drugs (doxorubicin, vinblastine, methyl methanesulfonate and mitomycin C) than the lymphoblastoid cell line TK6, which follows the stem cells in the development hierarchy. The fear that the micronucleus test in immortalized TK6 cells would not be sufficient as a basis for genotoxicity studies could be refuted with the results of this work. The results show that the micronucleus test in TK6 cells is relevant because TK6 cells are more sensitive to genotoxic agents than hematopoietic stem cells. During the investigation of the leukemia cell line HL-60, the effects of classic vinca alkaloids (vinblastine, vincristine, vinflunine and vinorelbine) were compared with novel synthesized vinca alkaloids (4-chlorochablastine, 4-chlorochacristine, 16a, 17b and 18a). Vinca alkaloids are very often associated with side effects, such as neuropathies, which often lead to discontinuation of therapy by patients during chemotherapy. For this reason, it was desirable to develop novel vinca alkaloids with fewer side effects but similar efficacy. Although the potency on the cancer cell line HL-60 of the new substances was lower than in vinblastine, vincristine and vinorelbine, some showed a similar effect to the vinca alkaloid vinflunine. The results of this work can be taken as a first indication in vitro that these substances may prove effective in cancer therapy and will be considered as therapeutic alternatives in vivo according to further results. Differences were also detected in comparative investigations of exponentially growing with differentiated cell lines. The cell line HT-22, which itself is not a cancer cell line, showed an increased sensitivity to the alkylating agent methyl methanesulfonate after differentiation to non-exponentially growing cells, which could be due to reduced base excision repair. The differentiated form of the adenocarcinoma cell line CaCo2 also showed an increased sensitivity to the topoisomerase II inhibitor etoposide, whereas the non-selective topoisomerase II inhibitor doxorubicin had no effect. In order to clarify whether the found differences due to the enzyme topoisomerase II or were cell-type-specific, further analyses were carried out with the cell line HL-60 and their differentiated cell type. Again, significant differences in single cell gel electrophoresis after treatment with doxorubicin and etoposide were detected. In addition to the differences in repair between cell types shown in this study, other factors could also lead to variances and influence mutagenicity research. Therefore, it is reasonable to assume that future testings in different cell systems are necessary for the development of pharmacologically active substances before new substances will be approved. Altogether, the complexity of the results between cells in the different differentiation stages becomes apparent in this work, which also means that further research projects would pay particular attention to the differentiation stage of the investigated cell population. KW - Säugetiere KW - Blutstammzelle KW - Mutagenität KW - Zelldifferenzierung KW - Differenzierungszustand KW - Säugerzellen KW - genotoxische Agenzien KW - Mikrokerne KW - Einzelzellgelelektrophorese KW - differentiation status KW - mammalian cells KW - genotoxic agents KW - micronuclei KW - comet assay KW - Genotoxizität KW - Hämatopoetische Stammzellen KW - Empfindlichkeit Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164670 ER - TY - JOUR A1 - Arimany-Nardi, Cristina A1 - Minuesa, Gerard A1 - Pastor-Anglada, Marçal A1 - Keller, Thorsten A1 - Erkizia, Itziar A1 - Koepsell, Hermann A1 - Martinez-Picado, Javier T1 - Role of Human Organic Cation Transporter 1 (hOCT1) Polymorphisms in Lamivudine (3TC) Uptake and Drug-Drug Interactions JF - Frontiers in Pharmacology N2 - Lamivudine (3TC), a drug used in the treatment of HIV infection, needs to cross the plasma membrane to exert its therapeutic action. Human Organic cation transporter 1 (hOCT1), encoded by the SLC22A1 gene, is the transporter responsible for its uptake into target cells. As SLC22A1 is a highly polymorphic gene, the aim of this study was to determine how SNPs in the OCT1-encoding gene affected 3TC internalization and its interaction with other co-administered drugs. HEK293 cells stably transfected with either the wild type form or the polymorphic variants of hOCT1 were used to perform kinetic and drug-drug interaction studies. Protein co-immunoprecipitation was used to assess the impact of selected polymorphic cysteines on the oligomerization of the transporter. Results showed that 3TC transport efficiency was reduced in all polymorphic variants tested (R61C, C88R, S189L, M420del, and G465R). This was not caused by lack of oligomerization in case of variants located at the transporter extracellular loop (R61C and C88R). Drug-drug interaction measurements showed that co-administered drugs [abacavir (ABC), zidovudine (AZT), emtricitabine (FTC), tenofovir diproxil fumarate (TDF), efavirenz (EFV) and raltegravir (RAL)], differently inhibited 3TC uptake depending upon the polymorphic variant analyzed. These data highlight the need for accurate analysis of drug transporter polymorphic variants of clinical relevance, because polymorphisms can impact on substrate (3TC) translocation but even more importantly they can differentially affect drug-drug interactions at the transporter level. KW - hOCT1 KW - pharmacogenetics KW - lamivudine KW - HIV infection KW - therapy Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165236 VL - 7 IS - 175 ER - TY - JOUR A1 - Propping, Stefan A1 - Lorenz, Kristina A1 - Michel, Martin C. A1 - Wirth, Manfred P. A1 - Ravens, Ursula T1 - beta-Adrenoceptor-mediated Relaxation of Urinary Bladder Muscle in beta 2-Adrenoceptor Knockout Mice JF - Frontiers in Pharmacology N2 - Background and Objective: In order to characterize the β-adrenoceptor (AR) subtypes involved in agonist-stimulated relaxation of murine urinary bladder we studied the effects of (-)-isoprenaline and CL 316,243 on tonic contraction and spontaneous contractions in detrusor strips of wild-type (WT) and β2-AR knockout (β2-AR KO) mice. Materials and Methods: Urinary bladders were isolated from male WT and β2-AR KO mice. β-AR subtype expression was determined with quantitative real-time PCR. Intact muscle strips pre-contracted with KCl (40 mM) were exposed to cumulatively increasing concentrations of (-)-isoprenaline or β3-AR agonist CL 316,243 in the presence and absence of the subtype-selective β-AR blockers CGP 20712A (β1-ARs), ICI 118,551 (β2-ARs), and L748,337 (β3-ARs). Results: Quantitative real-time PCR confirmed lack of β2-AR expression in bladder tissue from β2-AR KO mice. In isolated detrusor strips, pre-contraction with KCl increased basal tone and enhanced spontaneous activity significantly more in β2-AR KO than in WT. (-)-Isoprenaline relaxed tonic tension and attenuated spontaneous activity with similar potency, but the concentrations required were two orders of magnitude higher in β2-AR KO than WT. The concentration-response curves (CRCs) for relaxation were not affected by CGP 20712A (300 nM), but were shifted to the right by ICI 118,551 (50 nM) and L748,337 (10 μM). The -logEC50 values for (-)-isoprenaline in WT and β2-AR KO tissue were 7.98 and 6.00, respectively, suggesting a large receptor reserve of β2-AR. (-)-CL 316,243 relaxed detrusor and attenuated spontaneous contractions from WT and β2-AR KO mice with a potency corresponding to the drug’s affinity for β3-AR. L743,337 shifted the CRCs to the right. Conclusion: Our findings in β2-AR KO mice suggest that there is a large receptor reserve for β2-AR in WT mice so that this β-AR subtype will mediate relaxation of tone and attenuation of spontaneous activity under physiological conditions. Nevertheless, upon removal of this reserve, β3-AR can also mediate murine detrusor relaxation. KW - detrusor muscle KW - relaxation KW - mucosa KW - beta2-adrenoceptor knockout KW - beta3 CL 316,243 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165245 VL - 7 IS - 118 ER - TY - CHAP A1 - Werner, Rudolf A1 - Wakabayashi, Hiroshi A1 - Jahns, Roland A1 - Ergün, Süleyman A1 - Jahns, Valerie A1 - Higuchi, Takahiro T1 - PET-Guided Histological Characterization of Myocardial Infiltrating Cells in a Rat Model of Myocarditis T2 - European Heart Journal - Cardiovascular Imaging N2 - No abstract available. KW - Myokarditis KW - positron emission tomography KW - myocarditis KW - PET KW - 18F-FDG Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161127 SN - 2047-2404 N1 - This is a pre-copyedited, author-produced version of an article accepted for publication in European Heart Journal Cardiovascular Imaging following peer review. The version of record . Eur Heart J Cardiovasc Imaging. ISSN: 2047-2404. Supplement, vol. 18, i1-i3, May 2017 is available online at: 10.1093/ehjci/jex071. VL - 18 IS - Supplement PB - Oxford University Press ER - TY - THES A1 - Curtaz, Carolin Julia T1 - \(In\) \(vitro\) Analysen der Wechselwirkung erhöhter Temperatur mit Zytostatika am Beispiel von Cisplatin T1 - \(In\) \(vitro\) analysis of the interaction of hyperthermia with cytostatica in case of cisplatin N2 - Neben der Chemotherapie ist heutzutage auch die Hyperthermie-Behandlung eine wichtige Säule der antitumorösen Therapie. Während der sogenannten HIPEC Therapie (Hypertherme intraperitoneale Chemoperfusion) werden die beiden Arten der Therapieformen kombiniert und in der klinischen Praxis erfolgreich angewendet. Genauere Kenntnisse über die zu Grunde liegenden toxikologischen in-vitro Mechanismen könnten zu neuen Möglichkeiten in der klinischen Anwendung führen. In unserer Arbeit untersuchten wir verschiedenen Tumorzelllinien (HT29,CaCo-2,HCT116,HaCaT) in Kombination mit Cisplatin und Hyperthermie mit verschiedenen Methoden, wie zum Beispiel Mikrokerntest, Comet-Assay, Durchflusszytometrie, Vitalitätstest und mikroskopischen Analysen. Unsere Ergebnisse führten uns zu der Hypothese, dass Hyperthermie alleine zu einer sogenannte mitotic catastrophe führt und zum Absterben der Tumorzellen. Im Gegensatz dazu zeigten Tumorzellen, welche mit Cisplatin alleine oder auch in Kombination mit Hyperthermie nicht in die Mitose eintreten und daher nicht durch Apoptose in den Zelltod gehen. N2 - Nowadays the use of chemotherapy, but also hyperthermia are main columns of the anti- cancer treatment. In the so-called HIPEC therapy (hypertherme intraperitoneale chemoperfusion) these both kinds of treatments are combined and successfully applieded with clinical relevance. More detailed knowledge about the underlying in-vitro toxicological mechanism may lead to new opportunities in the clinical practice. In our work we examined different cancer cells (HT29, CaCo2,HCT116,HaCaT) in the combination of with cisplatin and hyperthermia by using different methods e.g. micronucleus test, comet-assay, flow cytometry, vitality test and microscopical analysis. Our aquired results lead to the postulation that hyperthermia alone induces a so- called mitotic catastrophe provoking the death of tumor cells. However tumor cells treated with cisplatin with or without combination with hyperthermia do not enter into mitosis and therefore cannot undergo apoptosis through a mitotic catastrophe. KW - Hyperthermie KW - cisplatin KW - HIPEC therapy KW - mitotic catastrophe KW - comet assay KW - micronucleus test Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174543 ER - TY - JOUR A1 - Bankoglu, Ezgi Eyluel A1 - Tschopp, Oliver A1 - Schmitt, Johannes A1 - Burkard, Philipp A1 - Jahn, Daniel A1 - Geier, Andreas A1 - Stopper, Helga T1 - Role of PTEN in Oxidative Stress and DNA Damage in the Liver of Whole-Body Pten Haplodeficient Mice JF - PLoS One N2 - Type 2 diabetes (T2DM) and obesity are frequently associated with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and with an elevated cancer incidence. The molecular mechanisms of carcinogenesis in this context are only partially understood. High blood insulin levels are typical in early T2DM and excessive insulin can cause elevated reactive oxygen species (ROS) production and genomic instability. ROS are important for various cellular functions in signaling and host defense. However, elevated ROS formation is thought to be involved in cancer induction. In the molecular events from insulin receptor binding to genomic damage, some signaling steps have been identified, pointing at the PI3K/AKT pathway. For further elucidation Phosphatase and Tensin homolog (Pten), a tumour suppressor phosphatase that plays a role in insulin signaling by negative regulation of PI3K/AKT and its downstream targets, was investigated here. Dihydroethidium (DHE) staining was used to detect ROS formation in immortalized human hepatocytes. Comet assay and micronucleus test were performed to investigate genomic damage in vitro. In liver samples, DHE staining and western blot detection of HSP70 and HO-1 were performed to evaluate oxidative stress response. DNA double strand breaks (DSBs) were detected by immunohistostaining. Inhibition of PTEN with the pharmacologic inhibitor VO-OHpic resulted in increased ROS production and genomic damage in a liver cell line. Knockdown of Pten in a mouse model yielded increased oxidative stress levels, detected by ROS levels and expression of the two stress-proteins HSP70 and HO-1 and elevated genomic damage in the liver, which was significant in mice fed with a high fat diet. We conclude that PTEN is involved in oxidative stress and genomic damage induction in vitro and that this may also explain the in vivo observations. This further supports the hypothesis that the PI3K/AKT pathway is responsible for damaging effects of high levels of insulin. KW - insulin KW - mouse models DNA damage KW - oxidative stress KW - mammalian genomics KW - fatty liver KW - micronuclei KW - insulin signaling Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146970 VL - 11 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Schmid, Evelyn T1 - Effekte des Raf Kinase Inhibitor Proteins (RKIP) auf β-adrenerge Signalwege, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz T1 - Effects of the Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) on β-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure N2 - Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz. Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen. Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann. Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden. Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert. N2 - The Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a kinase regulator with a preference for the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in the heart. The mechanism is a direct interaction of GRK2 and RKIP, which is triggered by a PKC-mediated phosphorylation at serine 153 of RKIP. By binding the GRK2, RKIP prevents the GRK2-mediated GPCR-phosphorylation and, thus, desensitisation of GPCR. As a result, inhibition of GRK2-activity positively affects the responsiveness of cardiac G protein-coupled receptors (GPCR). The GPCR primarly responsible for the regulation of the cardiac contractility are the \textbeta-adrenergic receptors (\textbeta AR). Previous work proved an interrelation of RKIP-expression and contractile response of cardiomyocytes and set a basis for the subject of this thesis, dealing with the effects of RKIP-expression on beta-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure. The work describes the impact of RKIP on \textbeta-adrenergic signaling in more detail. An important feature of the inhibitory function of RKIP on GRK2 is a specificity for receptor targets (\textbeta AR) with no, or only minor, impact on the cytosolic targets of the GRK2. RKIP also increases \textbeta-adrenergic signalling. This appears in neonatal cardiac myocytes through an increased cAMP-generation, PKA-activity, contractile action and relaxation velocity after \textbeta-adrenergic stimulation. Similarly, RKIP-transgenic mice, with heart specific RKIP-expression, showed higher PKA and CaMKII-activities as well as, a positive inotropy. Analysis of the calcium cycling in these cardiomyocytes provided an explanation for the hypercontractile phenotype: an enhanced calcium reuptake into the sarcoplasmatic reticulum (SR), the resulting higher calcium load of the SR and an increased calcium amplitude in the cytosol during the systole cause the augmented contractile force. Furthermore, it could be ruled out, that two inward rectifying channels - L-type calcium channnel and Ryanodin Receptor 2 contribute to the positve inotropy in RKIP-transgenic mice. Besides, the RKIP-expression had additional protective effects in heart failure development, which were investigated by desease models. Hypertrophy was induced by chronic \textbeta-adrenergic stimulation and heart failure by induction of pressure overload. Under these conditions, RKIP could reduce the development of interstitial fibrosis and the expression of associated marker genes. The occurence of arrhythmias, in particular ectopic beats, was assessed by the analysis of \textit{in vivo} ECG-traces. Rated by the number of ectopic beats RKIP-transgenic mice were also protected against the induction of arrhythmia. The analysis of RKIP-expression in \textbeta AR subtype-KOs (\textbeta\textsubscript{1}KO, \textbeta\textsubscript{2}KO) could relate the different effects of RKIP to the signalling pathways of either \textbeta\textsubscript{1}AR or \textbeta\textsubscript{2}AR. As a result, RKIP effects the positive inotropy through signals of the \textbeta\textsubscript{1}AR and the protection against heart failure-related remodelling processes and arrhythmia through signals of the \textbeta\textsubscript{2}AR. Additionally a major importance could be assigned to the G\textalpha\textsubscript{i} coupling of the \textbeta\textsubscript{2}AR. This capacity of the \textbeta\textsubscript{2}AR can counteract potentially maladaptive signalling of the \textbeta\textsubscript{1}AR. A monitored growth of cardiomyocytes of RKIP-transgenic mice was assessed in greater depth using different markers to differentiate physiological from pathological hypertrophy. Thereby the occurring hypertrophy was characterised as physiological and compensatory. Taken together, these results point towards a balanced activation of both \textbeta AR. They influence each other through downstream signals and are protected from desensitisation and loss of \textbeta-adrenergic responsivness through inhibition of the GRK2 by RKIP. To validate the therapeutic potential of this mode of action, an AAV9-mediated gene therapy was conducted. In this setting, RKIP was able to prevent, or strongly reduce the most prominent changes during heart failure development. Among these are the decline of the left ventricular function, dilation of the left ventricle, development of a pulmonary congestion, interstitial fibrosis and the expression of heart failure associated genes. Moreover, the consequences of RKIP deletion, which are reflected in an accelerated and deteriorated heart failure development, could be reversed by the reexpression of RKIP. This work shows, that RKIP induces an even activation of \textbeta-adrenergic signalling, which results in a positive inotropy with concomitant protective effects. RKIPs mode of action represents a strategy and bears the possibilty to enhance cardiac contractility in the failing heart by stimulation of both \textbeta AR, which is contrary to the common belief. KW - Herzinsuffizienz KW - Raf-Kinasen KW - Inhibition KW - Kinase signaling KW - Beta-Rezeptor KW - beta-adrenerge Signalwege KW - Protein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142486 ER - TY - THES A1 - Kestler, Christian T1 - Untersuchungen über die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin T1 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin N2 - Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern. N2 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin KW - Dimerisierung KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Ortspezifische Mutagenese KW - Chronophin KW - Substratspezifitätsschleife Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777 ER - TY - THES A1 - Messerer, Regina T1 - Synthesis of Dualsteric Ligands for Muscarinic Acetylcholine Receptors and Cholinesterase Inhibitors T1 - Synthese von dualsteren Liganden für muskarinerge Acetylcholinrezeptoren sowie Inhibitoren der Cholinesterasen N2 - The study is dealing with the synthesis and pharmacological investigation of newly designed dualsteric ligands of muscarinic acetylcholine receptors belonging to the superfamily of G protein-coupled receptors. Such bipharmacophoric ligands combine the advantages of the orthosteric binding site (high-affinity) and of the topographically distinct allosteric binding site (subtype-selectivity) resulting in compounds with reduced side effects. This opens the way to a new therapeutic approach in the treatment of e.g. chronic pain, drug withdrawal, Parkinson`s and Alzheimer`s disease. Furthermore, the newly synthesized dualsteric compounds were pharmacologically investigated in order to get a better understanding of the activation and signaling processes in muscarinic acetylcholine receptors, especially with regard to partial agonism. The development of the “dynamic ligand binding” concept offers new perspectives for ligand binding and signaling at G protein-coupled receptors. GPCRs are no longer considered as simple on/off switches. Dualsteric ligands can bind in a dualsteric pose, reflecting an active receptor state as well as in a purely allosteric binding pose, characterized by an inactive receptor state resulting in partial agonism. The degree of partial agonism depends on the ratio of active versus inactive receptor populations. On this basis, orthosteric/orthosteric hybrid ligands consisting of the antagonist atropine and scopolamine, respectively, as well as of the agonist iperoxo and isoxazole, respectively, linked via different alkyl chain length were synthesized in order to investigate partial agonism (Figure 1). Figure 1: Structures of the synthesized iperoxo/isoxazole-atropine/scopolamine-hybrids. Furthermore, different sets of quaternary and tertiary homodimers consisting either of two iperoxo or two acetylcholine units were synthesized in order to study their extent on partial agonism (Figure 2). The two agonists were connected by varying alkyl chain length. Binding studies on CHO-hM2 cells of the quaternary compounds revealed that dimerization of the agonist results in a loss of potency. The iperoxo-dimers reached higher maximum effects on the Gi- as well as on the Gs pathway in comparison to the acetylcholine-dimers. Besides the choice of the orthosteric building block (potency of the agonist), the alkyl chain length is also crucial for the degree of partial agonism. Figure 2: Structures of the synthesized quat./tert. iperoxo/acetylcholine-homodimers. Quinolone-based hybrids connected to the superagonist iperoxo and to the endogenous ligand acetylcholine, respectively, linked through an alkyl chain of different length were synthesized in order to develop further partial agonists (Figure 3). FRET studies confirmed M1 subtype-selectivity as well as linker dependent receptor response. The greatest positive FRET signal was observed with quinolone-C6-iper resulting from a positive cooperativity between the two separated moieties, alloster and orthoster. However, the corresponding hybrids with a longer linker led to an inverse FRET signal indicating a different binding mode, e.g. purely allosteric, in contrast to the shorter linked hybrids. Furthermore, the flexible alkyl spacer was replaced by a rigidified linker resulting in the hybrid quinolone-rigid-iperoxo (Figure 3). FRET studies on the M1 receptor showed reduced FRET kinetics, resulting from interactions between the bulky linker and the aromatic lid, located between the orthosteric and allosteric binding site. A bitopic binding mode of the rigidified hybrid is presumed. For further clarity, mutational studies are necessary. Figure 3: M1-selective hybrid compounds. Another aim of this work was the design and synthesis of new hybrid compounds, acting as agonists at the M1 and M2 receptor and as inhibitors for AChE and BChE in the context of M. Alzheimer. Several sets of hybrid compounds consisting of different pharmacophoric units (catalytic active site: phthalimide, naphthalimide, tacrine; peripheric anionic site: iperoxo, isoxazole) linked through a polymethylene chain of varying length were synthesized. Tac-C10-iper (Figure 4), consisting of tacrine and the superagonist iperoxo linked by a C10 polymethylene spacer, was found to have excellent anticholinesterase activity for both AChE (pIC50 = 9.81) and BChE (pIC50 = 8.75). Docking experiments provided a structural model to rationalize the inhibitory power towards AChE. Additionally, the tacrine related hybrids showed affinity to the M1 and M2 receptor. Such compounds, addressing more than one molecular target are favorable for multifactorial diseases such as Alzheimer. Figure 4: Structure of the most active compound regarding anticholinesterase activity. In summary, the choice of the pharmacophoric units, their connecting point as well as the nature, length, and flexibility of the linker play an important role for the activity of designed bivalent ligands. A shorter linker length cannot bridge both binding sites simultaneously in contrast to longer linker chains. On the other hand, too long linker chains can result in unwanted steric interactions. Further investigations with respect to structural variations of hybrid compounds, with or without quaternary ammonium groups, are necessary in the light of drug development. N2 - Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Synthese und der pharmakologischen Untersuchung von neu entwickelten dualsteren Liganden des muskarinischen Acetylcholinrezeptors, welcher zur Superfamilie der G-Proteine gehört. In derartigen bipharmakophoren Liganden sind die Vorteile des orthosteren Bindemodus und des räumlich davon getrennten allosteren Bindemodus vereint. Der orthostere Bindemodus bewirkt eine hohe Affinität zum Rezeptor, während der allostere Bindemodus Subtypselektivität vermittelt. Dadurch weisen diese Verbindungen weniger Nebenwirkungen auf. Dies eröffnet einen neuen Therapieansatz in der medikamentösen Behandlung von z.B. chronischen Schmerzen, Drogenentzug, Morbus Parkinson und Morbus Alzheimer. Die neu synthetisierten, dualsteren Verbindungen wurden pharmakologisch untersucht, um ein besseres Verständnis über das Bindungsverhalten und die Signalweiterleitung an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren zu erhalten, besonders in Hinblick auf Partialagonismus. Die Entwicklung des Konzeptes der „dynamischen Ligandenbindung“ bietet neue Perspektiven in Hinblick auf das Bindungsverhalten und die Signalweiterleitung an G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Somit werden GPCRs nicht mehr nur in ihrem aktiven oder inaktiven Zustand betrachtet. Vielmehr können dualstere Liganden sowohl einen dualsteren Bindemodus, welcher den aktiven Rezeptorzustand widerspiegelt, als auch einen rein allosteren Bindemodus, welcher durch einen inaktiven Rezeptorzustand charakterisiert ist, einnehmen, was schließlich zu Partialagonismus führt. Die Stärke des resultierenden Partialagonismus hängt vom Verhältnis zwischen aktiver und inaktiver Rezeptorbesetzung ab. Auf Basis dessen wurden orthostere/orthostere Hybridverbindungen, bestehend aus einem Antagonisten, Atropin oder Scopolamin, und einem Agonisten, Iperoxo oder Isoxazol, die über eine Alkylkette unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft sind, synthetisiert, um mit deren Hilfe den Partialagonismus zu steuern (Abbildung 1). Abbildung 1: Strukturen der synthetisierten Iperoxo/Isoxazol-Atropin/Scopolamin-Hybride. Es wurden verschiedene quartäre sowie tertiäre Homodimere, welche entweder aus zwei Iperoxo-Einheiten oder aus zwei Acetylcholin-Einheiten bestehen, synthetisiert, um deren Ausmaß in Bezug auf Partialagonismus untersuchen zu können (Abbildung 2). Die beiden Agonisten wurden über unterschiedlich lange Alkylketten miteinander verknüpft. Bindungsstudien an CHO-hM2 Zellen der quartären Verbindungen zeigten, dass die Dimerisierung eines Agonisten zu einer verringerten Wirkstärke führt. Die Dimere von Iperoxo erreichten sowohl auf dem Gi- als auch auf dem Gs-Signalweg höhere Maximaleffekte als die Dimere von Acetylcholin. Neben der Wahl des orthosteren Bausteins (Wirkstärke des Agonisten) spielt auch die Länge der Alkylkette eine entscheidende Rolle für die Stärke des Partialagonismus. Abbildung 2: Strukturen der synthetisierten quart./tert. Iperoxo/Acetylcholin-Homodimere. Um weitere Partialagonisten zu entwickeln, wurden Chinolon-basierte Verbindungen, die mit dem Superagonisten Iperoxo oder mit dem endogenen Liganden Acetylcholin über eine Alkylkette mit unterschiedlicher Länge verknüpft sind, synthetisiert (Abbildung 3). FRET-Messungen bestätigen, dass es sich bei den Hybriden um M1-subtypselektive Substanzen handelt und das FRET-Signal von der Länge der Zwischenkette abhängig ist. Das stärkste positive FRET-Signal wurde mit der Verbindung Chinolon-C6-Iper erzielt, welches durch positive Kooperativität zwischen den beiden Liganden, Alloster und Orthoster, zustande kommt. Im Gegensatz zu den kurzkettigen Hybriden beobachtete man bei den langkettigen Hybriden ein inverses FRET-Signal, welches auf einen anderen Bindemodus zum Rezeptor hindeutet, z.B. könnte es sich um eine rein allostere Bindung handeln. Außerdem wurde die flexible Alkylkette durch einen starren Linker ersetzt, welches im Hybrid Chinolon-rigide-Iperoxo verwirklicht ist (Abbildung 3). FRET-Messungen dieser starren Hybridverbindung am M1-Rezeptor zeigten eine verzögerte FRET-Kinetik, welche vermutlich auf Wechselwirkungen zwischen dem starren Linker und dem aromatischen Deckel, der sich zwischen der orthosteren und der allosteren Bindestelle befindet, zurückzuführen ist. Es wird vermutet, dass das starre Hybrid bitopisch in den Rezeptor bindet. Um diese Annahme bestätigen zu können, müssten Mutationsstudien durchgeführt werden. Abbildung 3: M1-selektive Hybridverbindungen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war das Wirkstoffdesign und die Synthese von neuen Hybridverbindungen, die als Agonisten am M1- und am M2-Rezeptor sowie als Inhibitoren der AChE als auch der BChE im Hinblick auf die Alzheimer`sche Krankheit wirken sollen. Verschiedenartige Hybridverbindungen, bestehend aus unterschiedlichen pharmakophoren Gruppen (katalytische, aktive Seite: Phthalimid, Naphthalimid, Tacrin; periphere, anionische Seite: Iperoxo, Isoxazol), die über eine Polymethylenkette unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft sind, wurden synthetisiert. Tac-C10-Iper (Abbildung 4), bestehend aus Tacrin und dem Superagonisten Iperoxo, welche über eine C10 Polymethylenkette miteinander verknüpft sind, zeigte exzellente Anticholinesterase-Aktivitäten sowohl für die AChE (pIC50 = 9.81) als auch für die BChE (pIC50 = 8.75). Docking-Experimente lieferten ein Strukturmodell, welches die inhibitorische Aktivität in Bezug auf die AChE begründet. Zusätzlich zeigten die aus Tacrin bestehenden Hybride Affinität zum M1- als auch zum M2-Rezeptor. Solche Verbindungen, die mehr als ein Zielmolekül adressieren, sind für multifaktorielle Krankheiten, wie z.B. die Alzheimer`sche Krankheit, von Vorteil. Abbildung 4: Struktur der aktivsten Substanz in Bezug auf die Anticholinesterase-Aktivität. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sowohl die Wahl des Pharmakophors, deren Verbindungsstelle als auch die Zusammensetzung, Länge und Flexibilität des Linkers eine große Rolle für die Aktivität der entwickelten bivalenten Verbindungen spielen. Kurzkettige Linker können im Gegensatz zu längeren Zwischenketten nicht beide Bindestellen gleichzeitig überbrücken. Andererseits können zu lange Zwischenketten unerwünschte sterische Wechselwirkungen hervorrufen. Weitere Untersuchungen in Bezug auf strukturelle Veränderungen der Hybridverbindungen, mit oder ohne quartäre Ammoniumgruppen, sind in Bezug auf die Arzneimittelentwicklung notwendig.   KW - Cholinesteraseinhibitor KW - Muscarinrezeptor KW - Ligand KW - GTP-bindende Proteine KW - dualsteric ligands KW - muscarinic acetylcholine receptor KW - cholinesterase inhibitors KW - receptors KW - coupled KW - gprotein KW - inhibitors KW - cholinesterase Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149007 ER - TY - JOUR A1 - Vogl, Silvia A1 - Lutz, Roman W. A1 - Schönfelder, Gilbert A1 - Lutz, Werner K. T1 - CYP2C9 genotype vs. metabolic phenotype for individual drug dosing - a correlation analysis using flurbiprofen as probe drug JF - PLoS ONE N2 - Currently, genotyping of patients for polymorphic enzymes responsible for metabolic elimination is considered a possibility to adjust drug dose levels. For a patient to profit from this procedure, the interindividual differences in drug metabolism within one genotype should be smaller than those between different genotypes. We studied a large cohort of healthy young adults (283 subjects), correlating their CYP2C9 genotype to a simple phenotyping metric, using flurbiprofen as probe drug. Genotyping was conducted for CYP2C9*1, *2, *3. The urinary metabolic ratio MR (concentration of CYP2C9-dependent metabolite divided by concentration of flurbiprofen) determined two hours after flurbiprofen (8.75 mg) administration served as phenotyping metric. Linear statistical models correlating genotype and phenotype provided highly significant allele-specific MR estimates of 0.596 for the wild type allele CYP2C9*1, 0.405 for CYP2C9*2 (68 % of wild type), and 0.113 for CYP2C9*3 (19 % of wild type). If these estimates were used for flurbiprofen dose adjustment, taking 100 % for genotype *1/*1, an average reduction to 84 %, 60 %, 68 %, 43 %, and 19% would result for genotype *1/*2, *1/*3, *2/*2, *2/*3, and *3/*3, respectively. Due to the large individual variation within genotypes with coefficients of variation >= 20% and supposing the normal distribution, one in three individuals would be out of the average optimum dose by more than 20 %, one in 20 would be 40% off. Whether this problem also applies to other CYPs and other drugs has to be investigated case by case. Our data for the given example, however, puts the benefit of individual drug dosing to question, if it is exclusively based on genotype. KW - cytochrome P450 2C9 KW - warfarin polymorphisms KW - tolbutamide substrate KW - impact pharmacogenetics KW - 4'-hydroxylation KW - allelic variant KW - liver microsomes Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148783 VL - 10 IS - 3 ER - TY - THES A1 - Perpiñá Viciano, Cristina T1 - Study of the activation mechanisms of the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3) T1 - Untersuchung zum Aktivierungsmechanismus des CXC Chemokin‐Rezeptor 4 (CXCR4) und des atypischen Chemokin‐Rezeptor 3 (ACKR3) N2 - The CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3) are seven transmembrane receptors that are involved in numerous pathologies, including several types of cancers. Both receptors bind the same chemokine, CXCL12, leading to significantly different outcomes. While CXCR4 activation generally leads to canonical GPCR signaling, involving Gi proteins and β‐arrestins, ACKR3, which is predominantly found in intracellular vesicles, has been shown to signal via β‐arrestin‐dependent signaling pathways. Understanding the dynamics and kinetics of their activation in response to their ligands is of importance to understand how signaling proceeds via these two receptors. In this thesis, different Förster resonance energy transfer (FRET)‐based approaches have been combined to individually investigate the early events of their signaling cascades. In order to investigate receptor activation, intramolecular FRET sensors for CXCR4 and ACKR3 were developed by using the pair of fluorophores cyan fluorescence protein and fluorescence arsenical hairpin binder. The sensors, which exhibited similar functional properties to their wild‐type counterparts, allowed to monitor their ligand-induced conformational changes and represent the first RET‐based receptor sensors in the field of chemokine receptors. Additional FRET‐based settings were also established to investigate the coupling of receptors with G proteins, rearrangements within dimers, as well as G protein activation. On one hand, CXCR4 showed a complex activation mechanism in response to CXCL12 that involved rearrangements in the transmembrane domain of the receptor followed by rearrangements between the receptor and the G protein as well as rearrangements between CXCR4 protomers, suggesting a role of homodimers in the activation course of this receptor. This was followed by a prolonged activation of Gi proteins, but not Gq activation, via the axis CXCL12/CXCR4. In contrast, the structural rearrangements at each step of the signaling cascade in response to macrophage migration inhibitory factor (MIF) were dynamically and kinetically different and no Gi protein activation via this axis was detected. These findings suggest distinct mechanisms of action of CXCL12 and MIF on CXCR4 and provide evidence for a new type of sequential signaling events of a GPCR. Importantly, evidence in this work revealed that CXCR4 exhibits some degree of constitutive activity, a potentially important feature for drug development. On the other hand, by cotransfecting the ACKR3 sensor with K44A dynamin, it was possible to increase its presence in the plasma membrane and measure the ligand‐induced activation of this receptor. Different kinetics of ACKR3 activation were observed in response to CXCL12 and three other agonists by means of using the receptor sensor developed in this thesis, showing that it is a valuable tool to study the activation of this atypical receptor and pharmacologically characterize ligands. No CXCL12‐induced G protein activation via ACKR3 was observed even when the receptor was re-localized to the plasma membrane by means of using the mutant dynamin. Altogether, this thesis work provides the temporal resolution of signaling patterns of two chemokine receptors for the first time as well as valuable tools that can be applied to characterize their activation in response to pharmacologically relevant ligands. N2 - Der CXC Chemokin‐Rezeptor 4 (CXCR4) und der atypische Chemokin‐Rezeptor 3 (ACKR3) sind heptatransmembranäre Rezeptoren, die in zahlreichen Krankheitsbildern eine Rolle spielen, wie in einigen Krebsarten. Beide Rezeptoren werden zwar von dem gleichen Chemokin CXCL12 aktiviert, allerdings mit unterschiedlichen Signalweiterleitungsmustern. Die Aktivierung von CXCR4 führt zu kanonischer GPCR Signaltransduktion über Gi‐Proteine und β‐Arrestine. Die Signalweiterleitung des Rezeptors ACKR3 hingegen, welcher hauptsächlich in intrazellulären Vesikeln vorliegt, erfolgt über ß‐Arrestinabhängige Signalwege. Es ist von großer Wichtigkeit die Dynamik und Kinetik dieser beiden Rezeptoren hinsichtlich der Aktivierung durch ihre Liganden und der Signalweiterleitung zu verstehen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Förster‐Resonanzenergietransfer (FRET) Anwendungen kombiniert, um die frühen Phasen der Signal‐Kaskade von CXCR4 und ACKR3 zu untersuchen. Zur genaueren Aufklärung der Rezeptoraktivierung wurden intramolekulare FRET‐Sensoren entwickelt, hierzu wurden die Fluorophore Cyan‐fluoreszierendes Protein und engl. fluorescence arsenical hairpin binder verwendet. Die generierten Sensoren zeigten ähnliche funktionelle Eigenschaften wie die unveränderten Rezeptoren. Liganden‐induzierte Änderungen der Rezeptorkonformation können mittels dieser Sensoren beobachtet werden und stellen die ersten RET‐basierten Sensoren auf dem Forschungsgebiet der Chemokin‐Rezeptoren dar. Weitere FRET‐basierte Methoden wurden zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Rezeptor und G‐Protein, Neuanordnung von Dimeren, sowie der G‐Protein Aktivierung eingesetzt und für beide Chemokin‐Rezeptoren etabliert. CXCR4 zeigte einen komplexen Aktivierungsmechanismus nach Stimulation durch CXCL12, bei welchem zunächst eine Neuordnung der Rezeptor‐Transmembrandomäne gefolgt von Neuordnungen zwischen Rezeptor und G‐Protein und zuletzt eine Neuordnung zwischen CXCR4 Protomeren erfolgte. Dies impliziert, dass im Aktivierungsprozess des Rezeptors Homodimere eine Rolle spielen. Zudem wurde eine verlängerte Gi ‐Protein Aktivierung gegenüber der Gq‐Protein Aktivierung bei CXCL12 stimuliertem CXCR4 beobachtet. Hingegen zeigte eine Stimulierung mit dem Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) bei jedem Schritt der frühen Singal‐Kaskade veränderte Dynamiken und Kinetiken im Vergleich zu CXCL12. Darüber hinaus konnte keine Gi ‐Protein Aktivierung festgestellt werden. Dieser Befund zeigt individuelle Mechanismen für MIF und CXCL12 am CXCR4‐Rezeptor und liefert Belege für eine neuer Art von sequenziellen Signalweiterleitungen an GPCRs. Eine wichtige Beobachtung dieser Arbeit für eine potentielle Medikamentenentwicklung ist das CXCR4 ligandenunabhängige Aktivität zeigt. Um die Aktivierung des ACKR3 Sensors messen zu können wurde durch eine Co‐Transfektion mit K44A Dynamin eine höhere Membranständigkeit erreicht. CXCL12 und drei weiteren Agonisten zeigten am hier entwickelten ACKR3‐Sensor unterscheidbare Kinetiken. Mit diesem wertvollen Werkzeug können Liganden an diesem atypischen Rezeptor pharmakologisch charakterisiert werden. Es konnte keine CXCL12‐induzierte G‐Protein Aktivierung gemessen werden, trotz der stärkeren Präsenz an der Plasmamembran mit Hilfe der Dynamin‐Mutante. In Summe liefert diese Arbeit zum ersten Mal eine zeitliche Auflösung von Signalweiterleitungsmustern von zwei Chemokin‐Rezeptoren sowie wertvolle Werkzeuge zur Charakterisierung der frühen Phase der Signal‐Kaskade durch andere pharmakologisch relevanten Liganden. KW - G protein-coupled receptors KW - Chemokine receptors KW - GPCR signaling KW - Förster Resonance Energy Transfer KW - FRET sensors Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192371 ER - TY - THES A1 - Link, Samuel T1 - Aldosteron-vermittelte oxidative Nierenschädigung – Einfluss der antioxidativen Abwehr T1 - Aldosterone-dependent oxidative kidney damage – influence of the antioxidative defense N2 - Patienten mit erhöhten Aldosteronspiegeln zeigen eine gesteigerte Inzidenz für Malignome, insbesondere von Nierenzellkarzinomen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Aldosteron-vermittelte oxidative Nierenschädigung näher zu analysieren sowie die auf Zellebene gezeigte Beeinflussung der antioxidativen Schutzmechanismen im lebenden Organismus nachzuweisen und mögliche therapeutische Ansatzpunkte zu identifizieren. Dazu wurde ein Interventions-versuch über 28 Tage durchgeführt. Neben einer Aldosterongabe wurden folgende Interventionen verwendet: Spironolacton zur Blockade des Mineralkortikoid-Rezeptors (MR), Apocynin als Hemmstoff der NADPH-Oxidasen (Nox), L-NAME zur Blockade der NO-Synthasen (NOS), PDTC, einen Hemmstoff des Transkriptionsfaktors NF-kB sowie Sulforaphan, ein natürlicher Nrf2-Induktor. Eine weitere Gruppe erhielt Sulforaphan ohne additive Aldosterongabe. Die Nierenschäden wurden mittels histopathologischer Schädigungsscores und der Anzahl an DNA-Doppelstrangbrüche analysiert. Die Beeinflussung der antioxidativen Abwehr wurde durch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf2 und durch die Quantifizierung antioxidativer Enzyme bestimmt. Im Nierengewebe führte Aldosteron zu einer Zunahme von oxidativem Stress. Histologisch zeigte sich ein Anstieg von glomerulären Schäden. Auch kam es zu einer deutlichen Zunahme von Doppelstrangbrüchen der DNA. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Aldosteron auch in vivo zu einer Zunahme der Nrf2-Aktivität führte, wobei sich dies auf Proteinebene nicht in einer (dauerhaften) Synthesesteigerung von antioxidativen Enzymen wiederspiegelte und keinen ausreichenden Schutz des Nierengewebes bot. Für die Interventionsgruppen konnte keine signifikante Auswirkung auf das Vorliegen von oxidativem Stress gezeigt werden. Dies könnte an der Versuchsdauer bzw. an der gewählten Nachweismethode gelegen haben. Nichtsdestotrotz zeigte die Blockade der Nox durch Apocynin bzw. der NOS durch L-NAME eine effektive Reduktion der histologischen und genomischen Schäden. Die L-NAME-Gruppe wies dabei die höchsten Blutdruckwerte auf, diese waren auch zur Aldosterongruppe signifikant gesteigert. Die beobachteten Effekte waren folglich nicht durch den in der Aldosterongruppe erfolgten Blutdruckanstieg, sondern vielmehr durch den Anstieg von oxidativem Stress zu erklären. Ebenfalls blieb die Nrf2-Aktivität bei der Gabe von Apocynin und L-NAME weitgehend auf Kontrollniveau, was dafürspricht, dass der in der Aldosterongruppe messbare Nrf2-Anstieg am ehesten als Reaktion auf chronisch erhöhten oxidativen Stress erfolgte, welcher durch die Interventionen ausblieb. Die Blockade von NF-κB mittels PDTC führte zu vergleichbaren Effekten wie Apocynin und L-NAME. Das deutet darauf hin, dass Aldosteron über die Aktivierung von NF-κB die vermehrte Synthese von pro-oxidativen Enzymen wie Nox und NOS anregt. Die Gabe von Spironolacton hatte den stärksten protektiven Effekt, sowohl auf histologische Veränderungen als auch auf das Entstehen von DNA-Doppelstrangbrüchen, wobei die Nrf2-Aktivität in dieser Gruppe ebenfalls auf Kontrollniveau blieb. Die Aldosteroneffekte wurden folglich über den MR vermittelt. Eine additive Nrf2-Induktion mittels Sulforaphan konnte auch keinen (dauerhaften) Effekt auf die Synthese antioxidativer Enzyme zeigen. Dennoch zeigte diese Gruppe einen ähnlich effektiven Schutz vor den oxidativen Nierenschäden wie die Gabe von Spironolacton. Vieles spricht dafür, dass die Wirkung von Sulforaphan dabei über seine Wirkung als direktes Antioxidans bzw. Radikalfänger und nicht über den Nrf2-Weg zu erklären ist. Aldosteron führt in der Niere über oxidativen Stress zu glomerulärer Fibrose und DNA-Schäden. Das könnte eine Erklärung für die gesteigerte Inzidenz von Nierenzellkarzinomen in Patienten mit erhöhten Aldosteronspiegeln darstellen. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass Aldosteron über eine Signalkaskade über den MR zu einer Aktivierung von Nox und NOS führt. Der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB scheint dabei durch die Synthese pro-oxidativer Enzyme eine Art Verstärker-Effekt zuzukommen. Als Reaktion auf den durch Aldosteron gesteigerten oxidativen Stress kommt es zu einer Aktivierung des antioxidativen Transkriptionsfaktors Nrf2, jedoch ohne dass dies zu einem ausreichenden Schutz des Nierengewebes führt. Mögliche therapeutische Ansatzpunkte für einen Schutz vor den durch Aldosteron vermittelten oxidativen Nierenschäden scheinen eher innerhalb der Aldosteronsignalkaskade, insbesondere in der Blockade des MR, als in der antioxidativen Abwehr zu liegen. N2 - Patients with hyperaldosteronism show an increased risk for kidney cancer. It is known that aldosterone leads to oxidative stress and DNA damage through NADPH-Oxidase (Nox) and NO-Synthase (NOS) which could be a possible starting point for mutagenesis. We investigated aldosterone-dependent oxidative damage in rat kidney and the influence of the anti-oxidative pathway regulated by nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 (Nrf2). In rats with hyperaldosteronism the following interventions were used: Inhibition of the mineralocorticoid receptor (MR) with spironolactone, blockade of Nox with apocynin, inhibition of NOS by L-NAME, blocking of the proinflammatory transcription factor NF-κB with PTDC and activating of the Nrf2 pathway with sulphoraphane. Mediated by the MR aldosterone led to glomerulosclerosis and vascular remodeling in the kidney. The changes in the glomeruli seemed only partially induced by oxidative stress and were prevented by sulforaphane. Spironolacton, apocynin, L-NAME and PTDC were able to prevent aldosterone-induced vascular remodeling, suggesting that oxidative stress mediated by the MR and influenced by NF-κB seems to play a major role in vascular remodeling. In kidney tissue aldosterone led to an increase in oxidative stress and a clear rise of Nrf2 activation. Protein levels of GCLC, TRX, HO-1 and SOD showed no persistent effects to the changes in Nrf2 activation. Despite the activation of Nrf2 aldosterone led to a clear rise of DNA double-strand breaks in cortex and medulla. The different interventions were all able to reduce the aldosterone-induced DNA damage significantly, with the spironolactone group showing the lowest counts of DNA double-strand breaks. Even though the L-NAME-group showed the highest blood pressure levels it also had reduced DNA damage, proving that the observed effects were independent of increased blood pressure. Sulforaphane led to the strongest Nrf2-activation but was not able to enhance the Nrf2 levels significantly higher than aldosterone. Nonetheless sulforaphane clearly prevented aldosterone-induced DNA-damage, suggesting that sulforaphane acted at least partially as a direct radical scavenger. KW - Aldosteron KW - Oxidativer Stress KW - Antioxidans KW - Spironolacton KW - Hypernephrom KW - Sulforaphane KW - Sulforaphan Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186037 ER - TY - THES A1 - Zundler, Matthias T1 - Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten T1 - Role of phosphoglycolate phosphatase in the metabolism of signaling, membrane and storage lipids in murine embryos and lymphocytes N2 - Die Phosphoglykolat-Phosphatase PGP (früher auch als AUM bezeichnet) wurde in unserem Labor als Mitglied der HAD-Typ-Phosphatasen identifiziert. Die genetische Inaktivierung des Enzyms im gesamten Mausorganismus führt ab E8.5 zu einer Wachstumsverzögerung muriner Embryonen und bis E12.5 schließlich zu deren Tod. Im Gegensatz dazu sind Mäuse mit einer PGP-Inaktivierung in hämatopoetischen Zellen und im Endothel lebensfähig und phänotypisch unauffällig. Neue Erkenntnisse schreiben dem Enzym neben einer Aktivität gegenüber Phosphoglykolat auch Aktivitäten gegenüber Glycerin-3-phosphat (G3P), P-Erythronat und P-Lactat zu. Da diese Phosphatase-Aktivitäten Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel nahelegen, wurde in der vorliegenden Arbeit mittels massenspektrometrischer Methoden der Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten untersucht. Nach Inaktivierung der PGP im gesamten Organismus wurden in E8.5-Embryonen erhöhte Diacylglycerin (DG)-, Triacylglycerin (TG)- und Sphingomyelin (SM)-Spiegel gemessen, während niedrigere Phosphatidylcholin (PC)-Level vorlagen. In PGP-inaktivierten Lymphozyten waren G3P-, DG-, TG-, PC- und SM-Level nicht verändert. Dafür kam es zu signifikanten Erhöhungen der Phosphatidylglycerol (PG*)- und Cardiolipin (CL)-Spiegel. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die PGP in unterschiedlichen Geweben differenzielle Effekte auf die Spiegel verschiedener Lipide hat. Dies deckt neue Funktionen der PGP für die Regulation des Lipidmetabolismus auf. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen über die genauen Ursachen und Folgen dieser Regulation dar und lässt auf eine wichtige Rolle der PGP als metabolische Phosphatase im Organismus schließen. N2 - Our laboratory has previously identified the mammalian phosphoglycolate phosphatase PGP (also referred to as AUM) as a member of the HAD-type superfamily of hydrolases. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpD34N/D34N embryos until E12.5. In contrast, mice with a deficiency of PGP activity in endothelial and hematopoietic cells were viable and phenotypically normal. Recent findings demonstrate catalytic activities of the PGP towards phosphoglycolate, glycerol-3-phosphate (G3P), P-erythronate and P-lactate. Since these catalytic activities suggest implications for the lipid metabolism, this thesis examined the PGP-dependent formation of signal-, membrane- and storage lipids in E8.5 embryos and adult lymphocytes of mice by means of mass spectrometry. Following whole-body inactivation of PGP increased diacylglycerol (DG)-, triacylglycerol (TG)- and sphingomyeline (SM)-levels were detected in E8.5 embryos, whereas lower phosphatidylcholine (PC)-levels were present. In PGP-deficient lymphocytes G3P-, DG-, TG-, PC- and SM-level were unaltered. However, levels of phosphatidylglycerol (PG*) and cardiolipine (CL) were significantly increased. Taken together this thesis reveals new and tissue-dependent functions of PGP in the regulation of the lipid metabolism and indicates an important role of PGP as a metabolic phosphatase. It constitutes the basis for further studies on the exact roots and the physiological effects of the metabolic regulation by PGP. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Glycerinphosphate KW - Lipidomics KW - Flugzeitmassenspektrometrie KW - Phosphoglykolat KW - Phosphatase KW - Glycerin-3-phosphat KW - Lipidom KW - Time-of-flight Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168442 ER - TY - JOUR A1 - Mambretti, Egle M. A1 - Kistner, Katrin A1 - Mayer, Stefanie A1 - Massotte, Dominique A1 - Kieffer, Brigitte L. A1 - Hoffmann, Carsten A1 - Reeh, Peter W. A1 - Brack, Alexander A1 - Asan, Esther A1 - Rittner, Heike L. T1 - Functional and structural characterization of axonal opioid receptors as targets for analgesia JF - Molecular Pain N2 - Background Opioids are the gold standard for the treatment of acute pain despite serious side effects in the central and enteric nervous system. µ-opioid receptors (MOPs) are expressed and functional at the terminals of sensory axons, when activated by exogenous or endogenous ligands. However, the presence and function of MOP along nociceptive axons remains controversial particularly in naïve animals. Here, we characterized axonal MOPs by immunofluorescence, ultrastructural, and functional analyses. Furthermore, we evaluated hypertonic saline as a possible enhancer of opioid receptor function. Results Comparative immunolabeling showed that, among several tested antibodies, which all provided specific MOP detection in the rat central nervous system (CNS), only one monoclonal MOP-antibody yielded specificity and reproducibility for MOP detection in the rat peripheral nervous system including the sciatic nerve. Double immunolabeling documented that MOP immunoreactivity was confined to calcitonin gene-related peptide (CGRP) positive fibers and fiber bundles. Almost identical labeling and double labeling patterns were found using mcherry-immunolabeling on sciatic nerves of mice producing a MOP-mcherry fusion protein (MOP-mcherry knock-in mice). Preembedding immunogold electron microscopy on MOP-mcherry knock-in sciatic nerves indicated presence of MOP in cytoplasm and at membranes of unmyelinated axons. Application of [D-Ala\(^2\), N-MePhe\(^4\), Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) or fentanyl dose-dependently inhibited depolarization-induced CGRP release from rat sciatic nerve axons ex vivo, which was blocked by naloxone. When the lipophilic opioid fentanyl was applied perisciatically in naïve Wistar rats, mechanical nociceptive thresholds increased. Subthreshold doses of fentanyl or the hydrophilic opioid DAMGO were only effective if injected together with hypertonic saline. In vitro, using β-arrestin-2/MOP double-transfected human embryonic kidney cells, DAMGO as well as fentanyl lead to a recruitment of β-arrestin-2 to the membrane followed by a β-arrestin-2 reappearance in the cytosol and MOP internalization. Pretreatment with hypertonic saline prevented MOP internalization. Conclusion MOPs are present and functional in the axonal membrane from naïve animals. Hypertonic saline acutely decreases ligand-induced internalization of MOP and thereby might improve MOP function. Further studies should explore potential clinical applications of opioids together with enhancers for regional analgesia. KW - µ-Opioid receptor KW - hypertonic solution KW - fentanyl KW - calcitonin gene-related peptide KW - DAMGO KW - internalization KW - peripheral nerve KW - ultrastructure Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145917 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Othman, Eman M. A1 - Naseem, Muhammed A1 - Awad, Eman A1 - Dandekar, Thomas A1 - Stopper, Helga T1 - The Plant Hormone Cytokinin Confers Protection against Oxidative Stress in Mammalian Cells JF - PLoS One N2 - Modulating key dynamics of plant growth and development, the effects of the plant hormone cytokinin on animal cells gained much attention recently. Most previous studies on cytokinin effects on mammalian cells have been conducted with elevated cytokinin concentration (in the μM range). However, to examine physiologically relevant dose effects of cytokinins on animal cells, we systematically analyzed the impact of kinetin in cultured cells at low and high concentrations (1nM-10μM) and examined cytotoxic and genotoxic conditions. We furthermore measured the intrinsic antioxidant activity of kinetin in a cell-free system using the Ferric Reducing Antioxidant Power assay and in cells using the dihydroethidium staining method. Monitoring viability, we looked at kinetin effects in mammalian cells such as HL60 cells, HaCaT human keratinocyte cells, NRK rat epithelial kidney cells and human peripheral lymphocytes. Kinetin manifests no antioxidant activity in the cell free system and high doses of kinetin (500 nM and higher) reduce cell viability and mediate DNA damage in vitro. In contrast, low doses (concentrations up to 100 nM) of kinetin confer protection in cells against oxidative stress. Moreover, our results show that pretreatment of the cells with kinetin significantly reduces 4-nitroquinoline 1-oxide mediated reactive oxygen species production. Also, pretreatment with kinetin retains cellular GSH levels when they are also treated with the GSH-depleting agent patulin. Our results explicitly show that low kinetin doses reduce apoptosis and protect cells from oxidative stress mediated cell death. Future studies on the interaction between cytokinins and human cellular pathway targets will be intriguing. KW - DNA damage KW - apoptosis KW - oxidative stress KW - fluorescence recovery after photobleaching KW - lymphocytes KW - antioxidants KW - cell staining KW - cytokinins Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147983 VL - 11 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Berisha, Filip T1 - Molekulare Wirkmechanismen von Sulfonylharnstoffen: Direkte Epac-Aktivierung oder Hemmung der Phosphodiesterasen T1 - Mechanism of action of sulfonylurea: direct epac activation or PDE inhibition N2 - Diabetes mellitus ist die häufigste Stoffwechselerkrankung in Deutschland. Sulfonylharnstoffe (SH) stellen die älteste und eine sehr prominente Gruppe in der oralen Therapie des Diabetes mellitus Typ II dar, die eine verstärkte Insulinfreisetzung vorrangig durch die Hemmung eines ATP-sensitiven Kaliumkanals (K+ATPKanal) erreichen. Daneben konnten weitere Proteine identifiziert werden, die mit SH interagieren und zu deren Effekten beitragen. Während bereits in frühen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass SH Vertreter der Phosphodiesterasen (PDE)Familie in ihrer Funktion behindern können, wurde kürzlich Epac2 (exchange protein directly activated by cAMP 2) als weiteres Zielprotein für SH angeführt. Insbesondere die Fähigkeit von SH, direkt an Epac2 zu binden, wird in der Literatur kontrovers diskutiert und eine indirekte Aktivierung durch eine PDE-Hemmung und einen erhöhten cAMP-Spiegel als Mechanismus vermutet. Zur weiteren Untersuchung wurden in dieser Arbeit FRET-basierte Biosensoren verwendet, um die Wirkung von SH auf Epac und PDEs näher zu untersuchen. Dabei konnte sowohl in einem photometrischen Ansatz als auch in lebenden Zellen, die einen Epac2-basierten Sensor enthalten, gezeigt werden, dass eine Aktivierung durch SH stattfindet. Da sowohl Epac2-camps, der von allen hier verwendeten Sensoren mit der höchsten Sensitivität für cAMP, als auch CFP-Epac1δDEPYFP nicht auf SH reagieren, ist diese Aktivierung selektiv für die Isoform Epac2 und wird vorrangig nicht durch eine PDE-Hemmung verursacht. Die Verwendung weiterer Sensoren mit verschiedenen Varianten von Epac2 (verlängerte Version von Epac2-camps) zeigen mit zunehmender Länge über die cAMP-Bindedomäne hinaus eine beginnende Reaktion im Sinne einer instabilen FRET-Kurve (Epac2camps long) bzw. eine deutliche Aktivierung durch den SH (Epac2-camps superlong), wodurch eine direkte Aktivierung bestätigt wird, und suggerieren eine Bindestelle für SH, die sich von denen von cAMP unterschiedet und weiter eingeengt werden konnte (im näheren Bereich von Q454 bzw. E460). Obwohl hierdurch eine direkte Aktivierung gezeigt werden konnte, ist die grundsätzliche Fähigkeit der SH, PDE zu beeinflussen, keineswegs geklärt. Daher wurden weitere Sensoren konstruiert bzw. verwendet, die basierend auf Epac1-camps und Epac2-camps verschiedene PDEs enthalten. Dabei konnte durch die Zugabe von SH eine deutliche Aktivierung des jeweiligen Sensors und somit eine PDEHemmung nachgewiesen werden. Dies konnte sowohl für PDE4A als auch für die in Inselzellen überwiegend vorkommende PDE3B gezeigt werden. Dadurch ergeben sich einige (klinisch relevante) Implikationen. Zum einen stellt neben der direkten Epac-Aktivierung auch die direkte Hemmung der PDE einen wichtigen Mechanismus für die Sekretion von Insulin dar. Außerdem sind bei PDEHemmung und direkter Epac-Aktivierung außerhalb der Inselzellen auch Nebenwirkungen in anderen Organen zu erwarten wie z.B. die Entstehung lebensgefährlicher Rhythmusstörungen in Herzmuskelzellen. N2 - Diabetes is the most common metabolic disease in the developed world. Sulfonylurea (SU) are one of the oldest and prominent group of oral antidiabetic drugs that act by inhibiting an ATP-sensitive potassium channel and increasing insulin release. Furthermore, additional targets have been identified that interact with SU. Whereas early works could show that SU can inhibit the function of different phosphodiesterases (PDEs), Epac2 (exchange protein directly activated by cyclic AMP) has been identified as yet another target protein for CU. Especially the ability to activate Epac2 by direct binding has been subject of controversial debate. In this study we used FRET-based biosensor to investigate the effects of SU on Epac and different PDEs. We could show that SU can activate Epac by direct binding that is selective top the isoform Epac2. The use of different sensors that contain different parts of Epac2 even revealed the approximate location of the binding site that is different to that of cAMP. Moreover, the use of other biosensor containing isoforms of PDE showed the ability of SU to strongly inhibit PDE3 and PDE4. This leads to several (clinically relevant) implications. Firstly, the direct activation of Epac2 present an important mechanism of insulin release. On the other hand, the activation of Epac2 and inhibition of different PDEs in all cells and tissues might lead to numerous side effects in other organs, e.g. the formation of life threatening cardiac arrythmias. KW - Sulfonylharnstoffe KW - FRET KW - Epac KW - Phosphodiesterasen KW - PDE-Hemmung KW - sulfonylurea KW - biosensor KW - cAMP KW - CFP KW - YFP Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176535 ER - TY - THES A1 - Gläser, Katharina T1 - Einfluss hochfrequenter Felder des Mobilfunks auf das blutbildende System in vitro T1 - Effects of radiofrequency radiation on the human hematopoietic system in vitro N2 - Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenwärtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierfür verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard zählt LTE (4G). Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endgeräte existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelmäßig einer Exposition gegenüber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen Körper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgeführt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu können. Ein vollständiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum schädlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder können empfindlicher auf Umwelteinflüsse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise höher gegenüber EMF exponiert. Dies gilt vor allem für Kopfregionen, in denen sich das aktive, für die Hämatopoese verantwortliche Knochenmark befindet. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane hämatopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils über einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensitäten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. Mögliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und –Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder für die hämatopoetischen Stammzellen, noch für die Zelllinie HL-60. Die einzige Veränderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Schäden beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Schäden verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane hämatopoetische Stammzellen für derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als hämatopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem ermöglichen. Um über die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die hämatopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu können, sowie die Sensitivität von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegenübergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die hämatopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Schäden beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus möglich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu können, müssten noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden. N2 - Electromagnetic fields (EMF) are ubiquitous in the human environment. By using different frequencies, they form a basis for numerous technologies and are present in multiple applications of our everyday life. One very important application of EMF is mobile communication, where the frequencies vary depending on the modulation standard. The most common standards are the second (2G) and the third (3G) generation standard GSM and UMTS, respectively. The latest modulation type is the fourth generation standard (4G) LTE. Statistical data reveal that there are currently more than seven billion mobile phone subscriptions. With the widespread use of these technologies, many people, including an increasing number of children, are continuously exposed to EMF. Given its close proximity to the human body, the mobile phone is the main source of EMF exposure. A huge number of in vitro, in vivo and epidemiological studies have been performed in the past to investigate potential, non-thermal effects of mobile phone radiation on biological systems. However, no complete consensus has been reached, leading to ongoing concerns about the harmful potential of this type of non-ionizing radiation. Furthermore, two major concerns regarding long-term effects and children-specific effects were not thoroughly addressed so far. Children might react in a more sensitive way towards environmental influences and partially absorb more radiofrequency radiation than adults. This particularly applies to head regions where the active bone marrow, which is responsible for hematopoiesis, is located. The aim of the present study was to investigate effects of radiofrequency fields emitted by mobile phones on cells of the human hematopoietic system. The focus was on human hematopoietic stem cells which were exposed to modulated GSM (900 MHz), UMTS (1,950 MHz) and LTE (2,535 MHz) radiofrequency fields with SAR values ranging from 0 to 4 W/kg for short (4 h) and long (20 h) time periods. Comparative investigations were performed with cells of the promyelocytic cell line HL-60. Studied endpoints included apoptosis, oxidative stress, cell cycle, DNA damage and DNA repair, differentiation and epigenetics in terms of histone acetylation. In all but one of these end points, no clear effect of mobile phone radiation could be detected, neither in hematopoietic stem cells nor in HL-60 cells. The only alteration was observed when quantifying DNA damage. Compared to the sham exposure, a small but statistically significant decrease in DNA damage was found after exposure of hematopoietic stem cells to the GSM modulation for short time period. This observation could not be reproduced in subsequent replicate experiments, and was thus considered not biologically relevant. Overall, these investigations demonstrate that mobile phone radiation at frequencies used in the major technologies GSM, UMTS and LTE and with SAR values below and above the recommended safety limits did not induce effects in cells of the human hematopoietic system under the prevailing conditions. A particular focus was on the reproducibility of the results. Furthermore, for the first time human hematopoietic stem cells were subject for such investigations. This is of particular importance, since hematopoietic stem cells enable a broader analysis with respect to cancerogenesis and the immune system based on their multipotent characteristics. Moreover, in order to better characterize the hematopoietic stem cells as well as analyze the sensitivity of hematopoietic cells differing in their differentiation status, hematopoietic stem cells were compared to other cells of the hematopoietic system (i.e. undifferentiated and differentiated HL-60 cells and TK6 cells). Upon treatment with mutagenic substances, a clear distinction was observed between the stem cells and the other cell types for the majority of the investigated endpoints. Significant differences were revealed for oxidative stress, DNA repair and histone acetylation, whereas no difference was observed for DNA damage. A first interpretation of the results obtained can be made on the basis of the different characteristics of cells with a different differentiation status. However, in order to make a distinct statement, additional investigations need to be performed. KW - Mobilfunk KW - Elektromagnetische Felder KW - radiofrequency radiation KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Hämatopoese KW - In vitro KW - Humane Hämatopoetische Stammzellen KW - Apoptose KW - Gentoxizität KW - Oxidativer Stress KW - Zellzyklus KW - Differenzierung KW - Epigenetik KW - human hematopoietic stem cells KW - apoptosis KW - genotoxicity KW - oxidative stress KW - differentiation KW - epigenetics KW - Hämatopoetische Stammzellen KW - Blutbildendes System Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145733 ER - TY - THES A1 - Ramm, Susanne T1 - Mechanismen idiosynkratischer Lebertoxizität - Einfluss von Arzneistoff-unabhängigen Stressfaktoren auf die Bildung reaktiver Metaboliten und zellulären Stress T1 - Mechanisms of idiosyncratic hepatotoxicity - Impact of drug independent stress factors on reative metabolite formation and cellular stress N2 - Idiosynkratische Leberschädigung durch Arzneimittel (z.B. Diclofenac) stellt trotz ihres seltenen Auftretens eine erhebliche Komplikation in der Arzneimittelentwicklung und -therapie dar. Die zu idiosynkratischen Reaktionen führenden, komplexen chemischen und biologischen Abläufe sind noch weitgehend unklar. Inzwischen wird jedoch vermutet, dass die Toxizität eines Arzneimittels durch Arzneistoff-unabhängige Risikofaktoren, wie Krankheiten, Entzündungsreaktionen, Co-Medikation oder Alkohol, erhöht werden kann. Mögliche Mechanismen könnten hierbei eine vermehrte Bildung reaktiver Metaboliten bzw. eine veränderte zelluläre Stress- und Immunantwort sein. Um tiefere Einblicke in die Bedeutung möglicher Arzneistoff-unabhängiger Risikofaktoren zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss drei verschiedener Stressfaktoren auf die Toxizität von Diclofenac (Dcl) untersucht. Bei diesen Stressfaktoren handelte es sich um Lipopolysaccharid (LPS) und Poly I:C (PIC) zur Simulation einer bakteriellen bzw. viralen Entzündung sowie um Buthionin-Sulfoximin (BSO) zur Depletion zellulären Glutathions. Zusätzlich wurde getestet, ob eine durch Stressfaktoren ausgelöste Erhöhung der Toxizität von Dcl in Ratten mit Veränderungen in der Biotransformation bzw. mit einer Hochregulation co-stimulatorischer Faktoren (z.B. Zytokine oder Alarmsignale) einhergeht. Die Kombination einer einwöchigen therapeutisch dosierten Dcl-Behandlung mit einer einmaligen LPS-Dosis erzeugte in den Tieren eine ausgeprägte Hepatotoxizität, die mit erhöhten Aktivitäten der Aminotransferasen im Serum einherging. Diese adversen Effekte konnten jedoch nicht durch LPS oder Dcl alleine, bzw. in Kombination mit PIC oder BSO erzeugt werden. Es besteht die Annahme, dass die Bioaktivierung von Diclofenac zu 5-OH-Dcl oder Dcl-Acylglucuronid (AG) sowie die folgende Bildung kovalenter Proteinaddukte zur Entwicklung von Lebertoxizität beiträgt. Mittels LC-MS/MS-Messungen konnten wir jedoch nachweisen, dass die Gabe von LPS + Dcl keine erhöhte Bildung reaktiver Metaboliten oder Dcl-AG-abhängiger Proteinaddukte auslöst. Im Einklang damit wurden Enzyme, die für die Bio-aktivierung von Dcl zu reaktiven Metaboliten verantwortlich sind (z.B. Cyp2C11, Cyp2C7 und UGT2B1), sowie die MRP-Effluxtransporter der Leber durch die Co-Behandlung mit LPS in ihrer Genexpression gehemmt. Zusätzliche qRT-PCR-Analysen Nrf2-abhängiger Gene, als Sensor für elektrophilen oder oxidativen Stress, zeigten keine Hochregulation zytoprotektiver Faktoren und unterstützen die Schlussfolgerung, dass Arzneistoff-unabhängige Stress-faktoren keine erhöhte Bildung toxischer Dcl-Metaboliten auslösen. Schließlich ergaben unsere Analysen, dass eine Aktivierung co-stimulatorischer NFκB- und MAPK-Signalwege mit Hochregulation co-stimulatorischer Faktoren (z.B. IL-1β, TNF-α, CINC-1, iNOS) und Akkumulation neutrophiler Granulozyten in der Leber sowohl durch Behandlung mit LPS + Dcl als auch mit PIC + Dcl induziert wurde. Nur die Kombination von LPS und Diclofenac bewirkte jedoch darüber hinaus eine massive Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine, Chemokine sowie toxizitätsfördernder Alarmsignale (z.B. IL-1β, TNF-α, CINC-1, HMGB1, LTB4) ins Plasma. Zusätzlich waren schützende negative Feed-back-Mechanismen, wie die Hitzeschockreaktion, in den mit LPS und Dcl behandelten Tieren gehemmt. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass eine metabolische Aktivierung von Dcl bzw. eine Akkumulation reaktiver Dcl-Metaboliten an der Entwicklung idiosynkratischer Leberschädigung nicht ausschlaggebend beteiligt ist. Im Gegensatz zu PIC oder BSO führte in den verabreichten Dosen nur die Gabe von LPS als Stressfaktor zu einer Aktivierung co-stimulatorischer Signalwege sowie zu einer Hemmung protektiver Systeme, wodurch die leberschädigende Wirkung von Dcl potenziert wurde. N2 - Idiosyncratic drug reactions (IDRs) are rare but major complications of drug therapy and development. A basic understanding of the chemical and biological events leading to IDRs is still lacking. However, it appears that drug-independent risk factors may be critical determinants in the response to an otherwise non-toxic drug. It has been speculated that stress factors like an underlying disease, inflammation, co-medication or alcohol may increase reactive metabolite formation and/or alter cellular stress and immune response. Thus, we were interested to determine the impact of various drug-independent stress factors on the toxicity of diclofenac (Dcl), a model drug associated with rare but significant cases of serious hepatotoxicity. We tested the hypothesis that co-treatment with various drug-independent risk factors may enhance Dcl toxicity. These included lipopolysaccharide (LPS) and poly I:C (PIC) simulating bacterial and viral inflammation, respectively, and buthionine sulfoximine (BSO) as a model for cellular glutathione depletion. Additionally, we were interested to understand if stress factor-induced modulation of Dcl toxicity involves alterations in drug metabolism and/or up-regulation of co-stimulatory molecules thought to constitute “danger signals”. Co-treatment of rats repeatedly given therapeutic doses of Dcl for 7 days with a single dose of LPS resulted in severe liver toxicity accompanied by elevated serum aminotransferase activity. Neither LPS nor diclofenac alone or in combination with PIC or BSO had such an effect. It is thought that bioactivation to reactive 5-OH-Dcl or Dcl acyl glucuronides (AG) with subsequent protein adduct formation contribute to Dcl induced liver injury. However, LC-MS/MS analyses did not reveal increased formation of reactive metabolites or Dcl-AG-dependent protein adducts in animals treated with LPS + Dcl. Consistent with this, co-treatment with LPS induced down-regulation of enzymes responsible for Dcl bioactivation to reactive metabolites (e.g. Cyp2C11, Cyp2C7 and UGT2B1), as well as liver MRP efflux transporters. Furthermore, qRT-PCR analyses of Nrf2-dependent genes, as a sensor of electrophilic or oxidative stress, showed no up-regulation of cytoprotective factors, supporting the conclusion that drug-independent stress factors do not enhance formation of toxic Dcl metabolites. Hepatic gene expression analyses revealed activation of NFκB and MAPK pathways with up-regulation of co-stimulatory molecules (IL-1β, TNF-α, CINC-1, iNOS) and accumulation of neutrophil granulocytes in liver tissue by LPS + Dcl as well as by PIC + Dcl. However, only LPS + Dcl lead to extensive release of pro-inflammatory cytokines, chemokines and cytotoxic danger signals (IL-1β, TNF-α, CINC-1, HMGB1, LTB4) into plasma. Furthermore, down-regulation of protective factors (SOD2, HSPs, PGE2) suggested an impairment of negative feedback mechanisms in animals treated with LPS + Dcl. In summary our results show no major role of metabolic Dcl bioactivation or accumulation of reactive Dcl metabolites in the pathogenesis of idiosyncratic hepatotoxicity. In contrast to PIC or BSO only administration of LPS as stress factor lead to activation of co-stimulatory pathways as well as impairment of protective systems, resulting in potentiation of liver toxicity of therapeutic Dcl doses. KW - Leber KW - Diclofenac KW - Arzneimittel KW - Toxizität KW - idiosynkratische Arzneistofftoxizität KW - LPS KW - Liver KW - Diclofenac KW - idiosyncratic drug toxicity KW - LPS Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74342 ER - TY - JOUR A1 - Förtsch, Christina A1 - Hupp, Sabrina A1 - Ma, Jiangtao A1 - Mitchell, Timothy J. A1 - Maier, Elke A1 - Benz, Roland A1 - Iliev, Asparouh I. T1 - Changes in Astrocyte Shape Induced by Sublytic Concentrations of the Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin Still Require Pore-Forming Capacity N2 - Streptococcus pneumoniae is a common pathogen that causes various infections, such as sepsis and meningitis. A major pathogenic factor of S. pneumoniae is the cholesterol-dependent cytolysin, pneumolysin. It produces cell lysis at high concentrations and apoptosis at lower concentrations. We have shown that sublytic amounts of pneumolysin induce small GTPase-dependent actin cytoskeleton reorganization and microtubule stabilization in human neuroblastoma cells that are manifested by cell retraction and changes in cell shape. In this study, we utilized a live imaging approach to analyze the role of pneumolysin’s pore-forming capacity in the actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. After the initial challenge with the wild-type toxin, a permeabilized cell population was rapidly established within 20–40 minutes. After the initial rapid permeabilization, the size of the permeabilized population remained unchanged and reached a plateau. Thus, we analyzed the non-permeabilized (non-lytic) population, which demonstrated retraction and shape changes that were inhibited by actin depolymerization. Despite the non-lytic nature of pneumolysin treatment, the toxin’s lytic capacity remained critical for the initiation of cell shape changes. The non-lytic pneumolysin mutants W433F-pneumolysin and delta6-pneumolysin, which bind the cell membrane with affinities similar to that of the wild-type toxin, were not able to induce shape changes. The initiation of cell shape changes and cell retraction by the wild-type toxin were independent of calcium and sodium influx and membrane depolarization, which are known to occur following cellular challenge and suggested to result from the ion channel-like properties of the pneumolysin pores. Excluding the major pore-related phenomena as the initiation mechanism of cell shape changes, the existence of a more complex relationship between the pore-forming capacity of pneumolysin and the actin cytoskeleton reorganization is suggested. KW - Toxikologie KW - pneumolysin KW - pore formation KW - cytoskeleton Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69084 ER - TY - THES A1 - Müller, Stephanie T1 - Identification of early molecular changes associated with Fumonisin B1-induced carcinogenesis in vivo and in vitro T1 - Frühe molekulare Ereignisse im Mechanismus der Kanzerogenität des Mykotoxins Fumonisin B1 N2 - Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by various Fusarium species and constitutes a major contaminant of maize worldwide. A 2-year carcinogenicity study of the National Toxicology Program (NTP) in Fischer N344 rats showed that male rats were most susceptible to FB1-induced tumor formation in the kidney. Histopathologically, a rare and highly malignant tumor type originating from the proximal tubules of rat kidney with increased potential for invasion and metastasis was identified. However, mechanisms underlying the FB1-induced carcinogenesis in kidneys of male rats are still not clear. Previous studies have shown that FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism via inhibition of ceramide synthase is a primary key event in FB1 toxicity. The disruption of sphingolipid metabolism may cause time- and dose-related changes in the relative balance of various bioactive intermediates. Furthermore, the ability of FB1 to induce renal cell death and subsequent compensatory cell proliferation is well known, but it does not completely explain the invasive growth characteristics and exceptionally high metastatic potential of FB1-induced tumors. Considering the complexity of sphingolipid metabolism and the fact that various sphingolipids (e.g. ceramide, sphingoid bases and their respective 1-phosphates) act on opposing signaling pathways, it is hypothesized that the balance between individual sphingolipids and thus the overall cellular response to FB1 may shift with time and by continuing FB1 exposure, resulting in the disruption of specific cell signaling pathways, which may promote tumor formation in kidney. To identify early FB1-induced gene expression patterns in the kidney, which may be associated with sphingolipid-mediated signaling pathways in cancer, a short-term i.p. study on FB1 in male Sprague Dawley rats was performed and changes in gene expression were analyzed using a qRT-PCR array that comprises 84 relevant genes of 6 pathways pivotally involved in the formation of cancer. Furthermore, apoptosis and cell proliferation as well as changes in specific sphingolipids were investigated in FB1-treated kidneys. As shown by classical histopathology (H&E) and (immuno)-histochemical staining (TUNEL and BrdU), FB1 caused a time- and dose-dependent increase in tubular apoptosis in the cortex and OSOM of the kidney, which was compensated by the induction of proliferation in the affected areas. HPLC-MS/MS analysis of bioactive sphingolipids demonstrated that FB1 induced a marked elevation of the pro-apoptotic sphingoid bases sphinganine and sphingosine, which paralleled the time- and dose-dependent increase in renal tubular apoptosis. With prolonged exposure to FB1, increased metabolic conversion of the accumulated sphinganine to the sphinganine-1-phosphate, a second messenger with anti-apoptotic and proliferative properties, was observed in kidney. This finding was compliant with the increased regenerative cell proliferation in the cortex and OSOM. In addition to effects on sphingoid bases and their 1-phosphate metabolites, this study, for the first time, demonstrated reduced levels of specific ceramides in rat kidney after FB1 exposure. In particular, C16-ceramide, which is a widespread constituent of membrane-bound complex sphingolipids involved in cell adhesion, was time- and dose-dependently decreased after treatment with FB1. Besides its role as component of the cell membrane, C16-ceramide functions as a signaling molecule for the initiation of apoptosis in response to various stress stimuli. Under conditions of chronic FB1 exposure, a significant reduction in pro-apoptotic C16-ceramide together with markedly increased levels of anti-apoptotic and proliferation-promoting sphingoid base 1-phosphates may thus favor resistance to stress-induced apoptosis and facilitate the survival of abnormal cells with potential to initiate tumor formation. Our study also revealed that early exposure to FB1 resulted in increased expression of a plethora of genes involved in tumor initiation as well as tumor progression. While single FB1 exposure was demonstrated to predominately induce gene expression of proto-oncogenic transcription factors (e.g. Fos, Jun, Myc) and apoptotis-related genes (e.g. members of the tumor-necrosis factor family), repeated exposure resulted in marked upregulation of genes mediating cell survival and cell proliferation (e.g. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 and Egfr). Moreover, continued exposure to FB1 initiated increased expression of genes critically involved in tumor migration, adhesion, invasion and metastasis. A close correlation was established between gene expression changes in response to FB1 and known signaling pathways mediated by extracellular or intracellular action of sphingoid base 1-phosphates - bioactive lipids that were markedly increased after FB1 treatment. In particular, genes encoding components of the plasminogen activator system were abundantly upregulated. These mediate invasion and metastasis in response to So1P, and may hence particularly promote the formation of highly aggressive and invasive tumors in kidney as observed after chronic exposure to FB1. Thus, it is conceivable that upregulation of a majority of genes in response to FB1 may be a direct or indirect consequence of increased So1P signaling. Another aim of this study was to identify differences in the organ-specific susceptibility for tumor formation by comparing FB1-mediated effects on apoptosis, cell proliferation, sphingolipids, and selected cancer-related genes in kidney and liver. Collectively, the present results revealed that kidney and liver showed marked differences in several endpoints of FB1 toxicity, which seemed to be primarily associated with their different susceptibility to FB1-mediated alterations in sphingolipid metabolism. The strong correlation between histopathological lesions and alterations in sphingolipid metabolism as well as sphingoid base 1-phosphate accumulation and concomitant S1P receptor expression suggested that tumor formation and progression to highly malignant carcinomas seems to be rather favored in kidney compared to liver. However, genes mostly deregulated by FB1 treatment in kidney (PAI-1, Thbs1 and Itga2) were also found to be induced in liver. To verify FB1-induced gene expression in kidney, normal rat tubular epithelial (NRK-52E) cells were analyzed for FB1-induced expression changes of the same cancer-related genes as in vivo. The results of qRT-PCR analysis revealed that gene expression changes in NRK-52E cells after FB1 treatment strongly correlated with those found in rat kidney and paralleled the marked alterations in sphingolipid metabolism. Furthermore, a good correlation between FB1-induced expression changes of cancer-related genes obtained in vivo and in vitro and those known to be mediated by bioactive sphingoid base 1-phosphates in cancer was established. Moreover, experiments modeling the invasive behavior of NRK-52E cells showed that FB1 may enhance cell invasion, which also correlated with both the increase in invasion- and metastasis-associated genes and bioactive sphingoid base 1-phophates. Importantly, NRK-52E cells basally expressed the S1P receptors S1P2 and S1P3, which are known to be involved in tumor migration and invasion. Since these receptors were also identified as most abundant S1PRs in kidneys of male Sprague Dawley rats, they may present important mediators of gene expression and invasion in response to FB1 in vivo. In summary, FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism and subsequent time- and dose-related increase in intermediates, such as bioactive sphingoid base 1-phosphates, correlate with early changes in genes and signaling pathways that may mediate loss of growth control, replication, evasion of apoptosis, cell motility and invasion, and thus favor renal tumor formation in response to FB1. However, to clarify whether the obtained gene expression changes in cancer-related genes in kidney are specific to the biological action of sphingoid base 1-phosphates and their respective receptors, further mechanistic studies are necessary. N2 - Fumonisin B1 ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Spezies der Gattung Fusarium produziert wird, und weltweit wesentlich zur Kontamination von Mais beiträgt. Eine zweijährige Kanzerogenitätsstudie des National Toxicology Programs (NTP) zeigte, dass männliche Ratten nach Verabreichung von FB1 am anfälligsten für die Bildung von Nierentumoren waren. Aus histopathologischer Sicht handelte es sich dabei um sehr seltene und hoch maligne Formen von Tumoren des proximalen Tubulus der Niere, die eine verstärkte Neigung zur Invasion und Metastasierung aufwiesen. Jedoch sind bis heute die genauen Mechanismen nicht hinreichend geklärt, die zu einer FB1-induzierten Kanzerogenese in der Rattenniere führen können. Frühere Studien berichteten, dass die durch FB1 vermittelte Störung des Sphingolipidmetabolismus mittels Inhibierung der Ceramidesynthase ein initiales Ereignis in der Toxizität darstellt und zu zeit- und dosisabhängigen Veränderungen im relativen Gleichgewicht verschiedener bioaktiver Zwischenprodukte des Sphingolipidmetabolismus führen kann. Des Weiteren ist bekannt, dass FB1 dazu in der Lage ist, in der Niere Zelltod gefolgt von regenerativer Zellproliferation zu induzieren. Dies erklärt jedoch nicht vollständig, wie die durch FB1 verursachten Tumore ein invasives Wachstum und außergewöhnlich hohes Metastasierungspotential erlangen. Die Komplexität des Sphingolipidmetabolismus und die Tatsache, dass verschiedene Sphingolipide (z.B. Ceramide, Sphingoidbasen und ihre entsprechenden 1-Phosphate) einen Einfluss auf gegensätzliche Signalwege in der Zelle ausüben können, deuten darauf hin, dass das Gleichgewicht zwischen den einzelnen Sphingolipiden und somit die gesamten zellulären Effekte von FB1 über die Zeit und mit zunehmender Exposition gegenüber FB1 zu Störungen spezifischer Signalwegen führen können, die eine Tumorentstehung in der Niere begünstigen. Um frühere Effekte von FB1 auf das Expressionsmuster von Genen in der Niere zu ermitteln, die möglicherweise mit den durch Sphingolipide vermittelten Signalwegen und Krebs verbunden sind, wurde eine Kurzzeitstudie mit FB1 in männlichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt und die Veränderungen der Genexpression von 84 Genen der 6 wichtigsten, krebsrelevanten Signalwege mittels qRT-PCR untersucht. In diesem Zusammenhang wurden in Nieren der FB1-behandelten Tiere auch Untersuchungen zu Apoptose, Zellproliferation sowie zu Veränderungen der spezifischen Sphingolipide durchgeführt. Anhand klassischer histopatholgischer sowie (immun)-histologischer Färbungen konnte gezeigt werden, dass FB1 zu einem zeit- und dosisabhängigen Anstieg von Apoptose in Cortex und OSOM der Niere führte, dem gleichzeitig eine gesteigerte Proliferation in den entsprechenden Bereichen folgte. Die HPLC-MS/MS-Analyse bioaktiver Sphingolipide in der Niere zeigte, dass die Behandlung mit FB1 zeitgleich zu einem Anstieg der pro-apoptotischen Sphingoidbasen Sphinganin und Sphingosin und verstärkter tubulärer Apoptose führte. Mit anhaltender Exposition gegenüber FB1 konnte in der Niere eine Zunahme der metabolischen Umwandlung von Sphinganin in Sphinganine-1-Phosphat, einem sekundären Botenstoff mit anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Eigenschaften, beobachtet werden. Diese Beobachtung stimmte auch mit der verstärkten regenerativen Zellproliferation in Cortex und OSOM der Niere überein. Weiterhin konnte mittels Sphingolipidanalyse erstmals gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber FB1 zu einer Verminderung spezifischer Zellceramide führte. Insbesondere der Gehalt an C16-Ceramid wurden durch die Behandlung mit FB1 zeit- und dosishängig in der Niere reduziert. Neben seiner Funktion als Bestandteil der Zellmembran spielt C16-Ceramide eine wichtige Rolle als Grundbaustein von komplexen, Zelladhäsion fördernden Sphingolipiden und ist in Gegenwart verschiedener Stressfaktoren auch ein wichtiges Signalmolekül in der Initiierung von Apoptose. Im Fall einer chronischen Exposition gegenüber FB1 könnten demnach stark verminderte Gehalte an pro-apoptotischen C16-Ceramid, verbunden mit drastisch erhöhten Gehalten an anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu einer Resistenz gegenüber stressbedingter Apoptose führen, die das Überleben initiierter Zellen und damit die Tumorentstehung begünstigen. Weiterhin zeigte unsere Studie, dass bereits eine frühe Exposition gegenüber FB1 die Expression einer Reihe von Genen in der Niere erhöht, die in der Tumorentstehung- sowie Progression eine Rolle spielen. Während die einmalige Verabreichung von FB1 hauptsächlich zu einem Anstieg der Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. Protoonkogene wie Fos, Jun und Myc) und apoptotischen Gene (z.B. Mitglieder der Familie der Tumornekrosefaktorrezeptoren) führte, wurde nach mehrmaliger Exposition eine deutliche Heraufregulierung von Genen beobachtet, die das Wachstum und Überleben von Zellen (z.B. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 und Egfr) vermitteln. Des Weiteren führte die längere Exposition zu einem Anstieg der Expression von Genen, die entscheidend an Migration, Adhäsion, Invasion und Metastasierung von Tumoren beteiligt sind. Dabei konnte ein enger Zusammenhang zwischen den FB1-induzierten Genexpressionsveränderungen und bereits bekannten extrazellulären und intrazellulären Signalwegen von bioaktiven Sphingoidbasen-1-Phosphaten hergestellt werden. Dazu zählte vor allem die Erhöhung von Genen, die wichtige Komponenten des ‚Plasminogen-Aktivator‘-Systems kodieren, und in Gegenwart von Sphingosine-1-Phosphat zu einer Erhöhung der Invasivität und Metastasierung, und somit möglicherweise auch zu einer begünstigten Bildung hochaggressiver und invasiver Tumoren in der Niere nach chronischer Exposition gegenüber FB1 beitragen können. Ein weiteres Ziel der Studie war es, mögliche Unterschiede in der organspezifischen Disposition für die Entstehung von Tumoren zu ermitteln, indem die FB1-vermittelten Effekte auf Apoptose, Zellproliferation, Sphingolipide, und ausgewählte krebsrelevante Gene zwischen Niere und Leber verglichen wurden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass zwischen Niere und Leber deutliche Unterschiede in den verschiedenen Endpunkten der FB1-vermittelten Toxizität existieren, welche hauptsächlich mit der unterschiedlichen Anfälligkeit gegenüber den FB1-induzierten Veränderungen des Sphingolipidmetabolismus in Zusammenhang gebracht werden. Anhand der starken Korrelation zwischen den beobachteten histopathologischen Läsionen und gleichzeitig starken Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus, sowie der Akkumulation von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und entsprechender Expression der Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Niere, lässt sich vermuten, dass die Tumorentstehung- und Progression zu hoch malignen Karzinomen eher in der Niere als in der Leber begünstigt ist. Die durch die FB1-Behandlung am stärksten deregulierten Gene (PAI-1, Thbs1 und Itga2) in der Niere, wurden jedoch auch in der Leber durch FB1 induziert. Um die Genexpressionsveränderungen in der Niere zu verifizieren, wurden Ratten-tubulusepithelzellen (NRK-52E-Zellen) mit FB1 behandelt und Veränderungen in der Expression der gleichen krebsrelevanter Gene, die zuvor in vivo untersucht wurden, analysiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Analyse zeigten, dass die Genexpressionsveränderungen in NRK-52E-Zellen nach Behandlung mit FB1 sowie die damit verbundenen Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus stark mit denen in der Rattenniere korrelierten. Es konnte zudem sowohl in vivo als auch in vitro eine gute Übereinstimmung der FB1-induzierten Veränderungen in der Expression krebsrelevanter Gene gefunden werden, die auch in Signalwegen von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und der damit verbundenen Krebsentstehung eine Rolle spielen. Darüber hinaus zeigten Experimente zur Untersuchung der Invasivität von NRK-52E-Zellen, dass diese nach Behandlung mit FB1 ein höheres Invasionspotential aufweisen. Dies korrelierte sowohl mit der Beobachtung von Expressionserhöhungen von invasions- und metastasierungsfördernden Genen als auch dem Anstieg bioaktiver Sphingoidbasen-1-Phosphate. Interessanterweise konnte in der vorliegenden Studie festgestellt werden, dass NRK-52E-Zellen die Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren S1P2 und S1P3 expremieren und über diese Rezeptoren möglicherweise Signalwege zur Migration und Invasion anregen können. Da S1P2 und S1P3 auch als Hauptsphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Rattenniere identifiziert wurden, lässt sich vermuten, dass diese nach FB1-Behandlung in vivo wesentlich zur Expression von Genen, die die Invasivität von Zellen erhöhen, beitragen können. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die FB1-vermittelte Störung im Sphingolipidmetabolismus und der damit verbundene zeit- und dosisabhängige Anstieg bioaktiver Intermediate wie den Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu frühen Veränderungen in Genen und Signalwegen führen kann. Diese können Zellwachstum, Inhibierung von Apoptose, Migration und Invasion und somit die Bildung von Nierentumoren nach Exposition gegenüber FB1 fördern. Um jedoch zu klären, ob die ermittelten Genexpressionsveränderungen der untersuchten krebsrelevanten Genen in der Niere spezifisch mit der Wirkung von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und deren Rezeptoren zusammenhängen, sind weiterführende mechanistische Studien notwendig. KW - Nephrotoxizität KW - Carcinogenität KW - Fumonisine KW - Fumonisin B1 KW - Mykotoxin KW - mycotoxin KW - fumonisin B1 KW - nephrotoxicity KW - carcinogenicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71336 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Jones, H. A1 - Zimmermann, U. T1 - Large scale transfection of mouse L-cells by electropermeabilization N2 - Mouse L-cells were transfected by electropenneabilization using the selectable plasmid pSV2-neo which confers resistance to G-418 (Geneticin). 1be DNA concentration used was 1 l'gfml, the field strength was 10 kV fcm, the duration of the pulse was S ~s. Transfeetion yield was optimal at a temperature of 4°C when using a time in between consecutive pulses of 1 minute compared to shorter (of the order of seoonds) or Ionger (3 minutes) time intervals. A more detailed study of the relationship between the number of pulses applied (up to 10) and transfection yield showed it to be almost linear in this range at 4 o C. The yield of transfectants in response to 10 pulses was up to 1000 per 106 cells (using 3.3 pg DNA per cell). The inßuence of the growth phase of the cells on the transfection yield and I or the subpopulation of the mouse L--ceU line used was shown. Furthennore the clone yield depended on the DNA per ceU ratio within a very small range. KW - Toxikologie KW - Electrical breakdown KW - Electropermeabilization KW - Volume distribution KW - Gene transfer KW - Transfection KW - (Mouse L-cell) Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63497 ER - TY - JOUR A1 - Holler, E. A1 - Fischer, H. A1 - Weber, C. A1 - Stopper, Helga A1 - Steger, H. A1 - Simek, H. T1 - A DNA polymerase with unusual properties from the slime mold Physarum polycephalum N2 - Two forms of a DNA polymerase have been purified from microplasmodia of Physarum polycephalum by poly(ethyleneimine) precipitation and chromatography on DEAE-Sephacel, phosphocellulose, heparin Sepharose, hydroxyapatite, DNA-agarose, blue-Sepharose. They were separated from DNA polymerase cx on phosphocellulose and from each other on heparin-Sepharose. Form HS1 enzymewas 30-40% pure and form HS2 enzyme 60% with regard toprotein contents of the preparations. Form HS2 enzymewas generated from form HS1 enzyme on prolonged standing of enzyme preparations. The DNA polymerases were obtained as complexes of a 60-kDa protein associated with either a 135-kDa (HS1) or a 110-kDa (HS2) DNA-polymerizing polypeptidein a 1:1 molar stoichiometry. The biochemical function of the 60-kDa protein remained unknown. The complexes tended to dissociate during gradient centrifugation and during partition chromatography as weil as during polyacrylamide gradient gel electrophoresis under nondenaturing conditions at high dilutions of samples. Both forms existed in plasmodia extracts, their proportions depending on several factors including those which promoted proteolysis. The DNA polymerases resembled eucaryotic DNA polymerase ß by several criteria and were functionally indistinguishable from each other. It is suggested that lower eucaryotes contain repair DNA polymerases, which are similar to those of eubacteria on a molecular mass basis. KW - Toxikologie Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63501 ER - TY - JOUR A1 - Zimmermann, U. A1 - Stopper, Helga T1 - Elektrofusion und Elektropermeabilisierung von Zellen : Eine neuartige Methode der Biotechnologie zur gezieltenVeränderung der genetischen Eigenschaften von Zellen N2 - No abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63514 ER - TY - THES A1 - Bätz, Julia T1 - FRET-basierte Untersuchungen zur ligandenselektiven Beeinflussung der Rezeptorkonformation durch orthosterische und allosterische Liganden am Beispiel des muskarinischen M2 Acetylcholinrezeptors T1 - FRET-based analysis of the ligandselective influence of orthosteric and allosteric ligands on the change of receptor conformation of the muscarinic m2 acetylcholine receptor N2 - Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven Änderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Phänomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) können in fünf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen fünf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, können so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. Für ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden für den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gewählt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angefügt. Die zur Markierung mit FlAsH nötige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellulären Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bezüglich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zunächst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkstärke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabhängig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabhängig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformationsänderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen für 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare Änderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob für die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkstärke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine äußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant stärker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine stärkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine stärkere Bewegung unterhalb von Transmembrandomäne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse für EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine größere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einflüsse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen möglich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Während eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-Änderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzuklären, wurden verschiedene Ansätze gewählt: Mit kettenverlängerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine Änderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins führte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signaländerung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu ermöglichen. Ein anderer Erklärungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformationsänderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Darüber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivität mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformationsänderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias für diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bezüglich ihrer Fähigkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verlängerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformationsänderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den ursprünglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle möglich ist, ursächlich für die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war. N2 - A large body of experimental evidence suggests that upon receptor activation G-protein coupled receptors are subject to ligandspecific changes of receptor conformation. The aim of this study was to investigate this phenomenon using the muscarinic M2 acetylcholine receptor (M2 AChR). Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) can be subdivided into five different subtypes (M1-M5). Their involvement in various physiological processes makes them an important target of pharma-cological therapies. With the orthosteric binding site (= binding site of the endogenous ligand) being highly conserved across all five mAChR subtypes, the unselective receptor modulation can lead to severe side effects. Thus the clinical use of drugs modulating muscarinic receptors is currently limited. Allosteric modulation is one attempt to achieve subtype-selective receptor regulation. Since the allosteric binding site of mAChR is less well conserved, it is possible to selectively target one mAChR subtype. As far as allosteric modulation is concerned, the M2 AChR represents a well characterized model with a large number of allosteric modulators being available. For the M2 AChR bitopic ligands which contain an allosteric as well as an orthosteric binding block have been developed as well. In the first part of this study several FRET-sensors of the M2 AChR were designed and characterized. The cyan fluorescent protein (CFP) was fused to the C-terminus of both sensors while the FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) binding site was inserted into the N-terminal (M2i3-N) or the C terminal (M2i3-C) region of the third interacellular loop (IL). The receptor sensors were characterized concerning ligand affinity, activation of the Gi protein and -arrestin2 translocation and did not display any significant differences compared to the wildtype M2 or the M2 CFP receptor. Various orthosteric as well as allosteric ligands were investigated regarding their affinity and efficacy at both sensors. Using FRET-measurements iperoxo was proven to behave as a superagonist. The characteristics of the allosteric ligands were investigated by measuring the receptor deactivation kinetics and their maximum inhibitory effect on a pre-stimulated receptor. All allosteric test substances displayed faster deactivation kinetics compared to the antagonist atropine and similar EC50 values at both receptor sensors. When investigating the change of receptor conformation of the M2 AChR upon ligand binding there were no ligand selective differences in the FRET-signal detected for either of the 19 orthosteric ligands at both M2 sensors. This data suggest that all orthosteric ligands induced a change in receptor conformation comparable to acetylcholine (ACh). In order to correlate the efficacy of various orthosteric ligands to activate the M2 AChR in FRET-experiments with their effect on downstream signaling pathways, the translocation of  arrestin2 upon receptor activation with orthosteric ligands was investigated using confocal microscopy. Except for 5 methylfurmethiodide all orthosteric ligands induced -arrestin2 translocation to an extent which was comparable to the maximal receptor activation observed with each other ligand, respectively. In contrast 5-methylfurmethiodide evoked a half maximal receptor activation compared to the endogenous ligand ACh while only a minimal translocation of -arrestin2 was observed. The second aim of this study was to investigate the effects of allosteric ligands on the change of receptor conformation of the M2 AChR. The allosteric ligands JK 337 and seminaph more strongly influenced the M2i3-C than the M2i3-N, whilst EHW 477 behaved just the opposite way. This data suggest that the orthosteric ligands induce a conformation of the M2 AChR comparable to ACh. JK 337 and seminaph seem to evoke a greater movement underneath TM 6 compared to TM 5 whereas EHW 477 probably induces a larger movement beneath TM 5. The allosteric ligands were tested via FRET-measurements concerning their ability to activate the Gi protein and to translocate  arrestin2. The activation of the Gi protein as well as the -arrestin2 translocation were selectively influenced by all allosteric ligands. However, due to the experimental setup, a quantification of the effects was not possible. Furthermore the bitopic ligands hybrid 1 and 2 (H 1, H 2) were tested regarding their effect on the receptor conformation of the M2 AChR. While stimulation with H 1 induced FRET signals that were comparable for both receptor sensors, it wasn’t possible to detect any change in the FRET ratio neither of the M2i3-N nor of the M2i3-C with H 2. The lack of effect of H 1 and H 2 in the FRET-experiments was explored using two different approaches: Derivatives of H 1 and H 2, in which the carbon linker between the allosteric and the orthosteric building block had been elongated, were able to induce changes in the FRET ratio. Upon the removal of the allosteric building block a half-maximal activation of both receptor sensors could be detected. However, the mutation of the allosteric binding site did not result in any change of the FRET-signals upon stimulation of the receptor mutants with H 1 or H 2. These data suggest that the carbon linker, which connects the allosteric and the orthosteric building block, is not long enough to enable a simultaneous binding to the allosteric and the orthosteric binding site. Another explanation would be that upon binding of an orthoster the channel between the orthosteric and the allosteric binding site of the M2 AChR is closed because of the change in receptor conformation, hence a stable, dual-steric binding of the hybrid substances to the M2 AChR would not be possible. In the course of this study it was possible to prove the existence of a ligand selective receptor conformation of the M2 AChR with allosteric ligands using FRET-experiments. In addition a connection was found to the occurrence of a functional selctivity with allosteric ligands. The investigation of 19 orthosteric ligands regarding their influence on the receptor conformation of the M2 AChR did not reveal any evidence of the existence of a ligand selective change of the receptor conformation. Regarding the translocation of β arrestin2 induced by orthosteric ligands there was a direct correlation between the efficency of the orthosteric ligands to activate the receptor and the extend of β-arrestin2 translocation observed. With the only exception being 5-methylfurmethiodide which induced far less β arrestin2 translocation compared to the magnitude of the conformational change of the receptor. This data suggest the existence of a signaling bias for this ligand. The analysis of the dualsteric ligands H 1 and H 2 concerning their ability to activate the M2 AChR revealed that an activation of the M2 AChR could just be observed upon elongation of the linker which connects the orthosteric with the allosteric building block. This suggests that the short linker chain of the original hybrid substances inhibited a dualsteric binding to the orthosteric and the allosteric binding site and thus caused the difficency of H 1 and H 2 to activate the M2 AChR. KW - Muscarinrezeptor KW - Allosterie KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - allosteric modulation KW - muscarinic aceylcholine receptor KW - GPCR Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72836 ER - TY - THES A1 - Glaser, Nina T1 - Influence of natural food compounds on DNA stability T1 - Einfluss natürlicher Nahrungsbestandteile auf die DNA Stabilität N2 - Cancer is one of the leading causes of death all over the world. Malnutrition and toxic contaminations of food with substances such as mycotoxins have been thought to account for a high percentage of cancers. However, human diet can deliver both mutagens and components that decrease the cancer risk. Genomic damage could be reduced by food components through different mechanisms such as scavenging of reactive oxygen species. In the first part of this study we tried to investigate the effects of patulin and resveratrol on DNA stability in V79 cells. Patulin is a mycotoxin, which is frequently found in spoiled apples and other fruits. The WHO has established a safety level of 50 µg/L, which is indeed not observed by all manufacturers. The acute toxicity of patulin in high concentrations is well known, however its potential carcinogenicity is still a matter of debate. Therefore we wanted to investigate further steps in the mechanism of patulin-induced genotoxicity. Patulin caused the formation of micronuclei and nucleoplasmic bridges in a dose-dependent manner. Further analysis revealed that patulin induced both kinetochore-negative and positive micronuclei. Time course of incubation indicate a new mechanism for patulin-induced nucleoplasmic bridge formation. We hypothized a mechanism via cross-linking of DNA, which was confirmed by a modified version of comet assay. Incubations of cells with patulin led to an increased number of multinucleated cells and multipolar mitoses. Cell cytometry revealed a G2 arrest by patulin, which might explain the amplification of centrosomes and patulin-induced aneuploidy. Patulin cause a dose-dependent DNA damage in comet assay which was influenced by the cellular GSH content. However, an induction of oxidative stress was just seen with higher concentrations of patulin. Levels of cellular glutathione were increased after 24 h incubation indicating an adaptive response to patulin-induced stress. There is growing interest in polyphenols such as resveratrol which have shown many positive effects on human health. The beneficial properties are partially attributed to their ability to scavenge reactive oxygen species. Co-incubation of V79 cells with patulin and 10 µM of the antioxidant resveratrol led to a slight reduction of micronucleus frequency compared to cells which were just treated with patulin. However, in higher concentrations resveratrol themselves caused the formation of micronuclei in V79 cells. Kinetochore analysis indicated only clastogenic properties for resveratrol but no disturbance of mitosis. The antioxidant properties of resveratrol were shown in ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. However, in cellular system resveratrol in higher concentrations revealed also prooxidative properties, as shown in 2,7-dichlordihydrofluorescein (DCF) assay. The increased level of glutathione after resveratrol treatment might reflect an adaptive response to resveratrol-induced oxidative stress. For the second part of this thesis we investigated the effects of an anthocyanin-rich grape extract on hypertensive Ren-2 rats. Ren-2 rats are an accepted genetically modified rat model for the investigation of hypertension and increased oxidative stress. We divided 23 female Ren-2 rats into three groups. One group was fed with an anthocyanin-rich Dacapo grape extract, one group was treated with the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril and the third group was kept without medication during the experiment. After one week untreated group showed a clear increase in systolic and diastolic blood pressure compared to the ramipril treated rats. This was in part attenuated in the animals fed with anthocyanin-rich Dacapo grape extract. Effects on blood pressure were also reflected in an increased thirst of untreated and extract fed animals. Comet assay with cells of kidney and liver revealed a slight protective impact of Dacapo extract on DNA damage compared to the other groups. Similar results were obtained after evaluation of ɣ-H2AX-staining of kidney and heart sections. However, in the small intestine oppositional effects were seen, indicating an increased number of double strand breaks probably due to the high local concentration of polyphenols after oral ingestion. Antioxidative properties of the extract were shown in FRAP assay. However, this effect was not reflected in an increased antioxidative capacity in serum or a protective impact in the dihydroethidium (DHE) assay. The extract showed protective effects on DNA damage in comet assay and ɣ-H2AX-staining, but was not able to reduce hypertension back to the control level of ramipril treated animals. High local concentrations could also result in an increased damage of the affected tissue. Therefore, the administration of such concentrated compounds should be handled with care. N2 - Krebs ist eine der häufigsten weltweiten Todesursachen. Fehlernährung und Kontaminationen der Nahrungsmittel mit Toxinen wie Schimmelpilzgift tragen zu einem hohen Prozentsatz zu Krebserkrankungen bei. Allerdings enthält die Nahrung neben Mutagenen auch Bestandteile, die dazu beitragen das Krebsrisiko zu senken. Schäden am Genom können durch Nahrungsbestandteile über verschiedene Mechanismen, wie zum Beispiel das Abfangen von freien Radikalen reduziert werden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir versucht die Effekte von Patulin und Resveratrol auf die DNA Stabilität von V79 Zellen zu untersuchen. Patulin ist ein Schimmelpilztoxin, welches häufig in verfaulten Äpfeln und anderen Früchten gefunden wird. Die WHO hat einen Grenzwert von 50 µg/L festgelegt, der jedoch nicht von allen Herstellern eingehalten wird. Die akute Giftwirkung von Patulin in hohen Dosen ist gut bekannt, wohingegen seine potentielle Kanzerogenität immer noch umstritten ist. Daher wollten wir weitere Schritte der Patulin induzierten Genotoxizität aufdecken. Patulin führte zu einer dosisabhängigen Bildung von Mikrokernen und Nucleoplasmic Bridges. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Patulin sowohl kinetochor-positive wie auch kinetochor-negative Mikrokerne verursacht. Bei der Analyse des Zeitverlaufs einer Patulininkubation deutete sich ein neuer Mechanismus für die Patulin induzierte Bildung von Nucleoplasmic Bridges an. Wir haben die Hypothese einer Quervernetzung von DNA-Strängen aufgestellt, die durch eine modifizierte Version des Comet Assays bestätigt wurde. Die Inkubation mit Patulin führte zudem zu einer erhöhten Anzahl von vielkernigen Zellen und multipolaren Mitosen. Mittels Durchflusszytometrie konnten wir einen durch Patulin verursachten G2 Arrest nachweisen, der die Amplifikation von Centrosomen und die Patulin induzierte Aneuploidie erklären könnte. Patulin verursachte einen dosisabhängigen Schaden im Comet Assay, der durch den zellulären Glutathiongehalt beeinflusst ist. Eine Auslösung von oxidativem Stress wurde dagegen erst bei höheren Konzentrationen an Patulin beobachtet. Der zelluläre Gluathiongehalt war nach 24 h Inkubationszeit erhöht, was auf eine adaptive Antwort auf den durch Patulin verursachten zellulären Stress hindeutet. Polyphenole wie Resveratrol gewinnen zunehmend an Bedeutung, da zahlreiche positive Effekte auf die menschliche Gesundheit bewiesen wurden. Diese vorteilhaften Eigenschaften werden zum Teil ihrer Eigenschaft als Radikalfänger zugeschrieben. Die Co-Inkubation von V79 Zellen mit Patulin und Resveratrol führte zu einer leichten Reduktion der Mikrokernfrequenz im Vergleich zu Zellen, die nur mit Patulin inkubiert wurden. Allerdings löste Resveratrol in höheren Konzentrationen selbst die Bildung von Mikrokernen aus. Die Kinetochor-Analyse zeigte für Resveratrol clastogene Eigenschaften aber keine störende Effekte auf den Ablauf der Mitose. Die antioxidativen Eigenschaften von Resveratrol wurden im FRAP (ferric reducing antioxidant power) -Assay nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden im zellulären System mittels DCF (2,7-Dichlordihydro-fluorescein) -Assay in höheren Konzentrationen auch prooxidative Eigenschaften festgestellt. Der erhöhte zelluläre Glutathionspiegel nach Resveratrol-Behandlung könnte dabei auf eine adaptive Anwort auf den durch Resveratrol ausgelösten oxidativen Stress hindeuten Im zweiten Teil dieser Doktorabeit haben wir die Effekte eines anthocyanreichen Traubenextrakts auf hypertensive Ren-2 Ratten untersucht. Ren-2 Ratten sind ein anerkanntes genetisch modifiziertes Rattenmodell zur Untersuchung von Bluthochdruck und erhöhtem oxidativem Stress. Wir haben 23 weibliche Ren-2 Ratten in 3 Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde mit einem anthocyan-reichen Dacapo Traubenextrakt gefüttert, eine Gruppe wurde mit dem ACE (angiotensin converting enzyme) Inhibitor Ramipril behandelt und eine dritte Gruppe wurde während dem Experiment nicht medikamentös behandelt. Nach einer Woche zeigte die nicht therapierte Gruppe einen deutlichen Anstieg des systolischen und diastolischen Blutdrucks. Dieser Anstieg war bei der mit anthocyanreichem Dacapo Traubenextrakt gefütterten Gruppe abgeschwächt. Die Effekte auf den Blutdruck spiegelten sich auch in einer erhöhten Trinkmenge der unbehandelten und mit Extrakt behandelten Tiere wider. Ein Comet Assay mit Nieren- und Leberzellen zeigte einen schwachen schützenden Einfluß des Dacapoextrakts auf den DNA Schaden im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Auswertung der ɣ-H2AX Färbung in Nieren- und Herzschnitten erzielt. Im Dünndarm wurden dagegen gegensätzliche Effekte beobachtet, die auf eine erhöhte Doppelstrangfrequenz durch die hohe lokale Konzentration an Polyphenolen nach oraler Aufnahme hindeuten. Die antioxidative Eigenschaften des Extrakts wurden im FRAP_Assay nachgewiesen. Diese Effekte spiegelten sich jedoch nicht in einer erhöhten antioxidativen Kapazität des Serums oder einem schützenden Effekt im DHE-Assay wider. Der Extrakt zeigte schützende Eigenschaften im Comet Assay und in der ɣ-H2AX-Färbung, war aber nicht in der Lage den Bluthochdruck auf das Kontrollniveau der Ramipril-behandelten Tiere herabzusenken. Hohe lokale Konzentrationen können auch zu einem erhöhten Schaden des betroffenen Gewebes führen. Daher sollte die Anwendung solcher hochkonzentrierter Präparate mit Vorsicht bedacht werden. KW - Patulin KW - Anthocyane KW - Resveratrol KW - Oxidativer Stress KW - Mutagenität KW - Genotoxizität KW - Patulin KW - anthocyanins KW - resveratrol KW - genotoxicity KW - oxidative stress Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72872 ER - TY - THES A1 - Wippel, Carolin T1 - Alterations of brain dendrite and synapse structure by the Streptococcus pneumoniae neurotoxin pneumolysin - Insights and pharmacological modulation T1 - Morphologische Veränderungen von Dendriten und Synapsen durch das Neurotoxin Pneumolysin - Einblicke und pharmakologischer Ansatz N2 - Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus) is one of the leading causes of childhood meningitis,pneumonia and sepsis. Despite the availability of childhood vaccination programs and antimicrobial agents, childhood pneumococcal meningitis is still a devastating illness with mortality rates among the highest of any cause of bacterial meningitis. Especially in low-income countries, where medical care is less accessible, mortality rates up to 50 % have been reported. In surviving patients, neurological sequelae, including hearing loss, focal neurological deficits and cognitive impairment, is reported in 30 to 50 %. Growing resistance of pneumococci towards conventional antibiotics emphasize the need for effective therapies and development of effective vaccines against Streptococcus pneumoniae. One major virulence factor of Streptococcus pneumoniae is the protein toxin Pneumolysin (PLY). PLY belongs to a family of structurally related toxins, the so-called cholesterol-dependent cytolysins (CDCs). Pneumolysin is produced by almost all clinical isolates of the bacterium. It is expressed during the late log phase of bacterial growth and gets released mainly through spontaneous autolysis of the bacterial cell. After binding to cholesterol in the host cell membranes, oligomerization of up to 50 toxin monomers and rearrangement of the protein structure, PLY forms large pores, leading to cell lysis in higher toxin concentrations. At sub-lytic concentrations, however, PLY mediates several other effects, such as activation of the classic complement pathway and the induction of apoptosis. First experiments with pneumococcal strains, deficient in pneumolysin, showed a reduced virulence of the organism, which emphasizes the contribution of this toxin to the course of bacterial meningitis and the urgent need for the understanding of the multiple mechanisms leading to invasive pneumococcal disease. The aim of this thesis was to shed light on the contribution of pneumolysin to the course of the disease as well as to the mental illness patients are suffering from after recovery from pneumococcal meningitis. Therefore, we firstly investigated the effects of sub-lytic pneumolysin concentrations onto primary mouse neurons, transfected with a GFP construct and imaged with the help of laser scanning confocal microscopy. We discovered two major morphological changes in the dendrites of primary mouse neurons: The formation of focal swellings along the dendrites (so-called varicosities) and the reduction of dendritic spines. To study these effects in a more complex system, closer to the in vivo situation, we established a reproducible method for acute brain slice culturing. With the help of this culturing method, we were able to discover the same morphological changes in dendrites upon challenge with sub-lytic concentrations of pneumolysin. We were able to reverse the seen alterations in dendritic structure with the help of two antagonists of the NMDA receptor, connecting the toxin´s mode of action to a non-physiological stimulation of this subtype of glutamate receptors. The loss of dendritic spines (representing the postsynapse) in our brain slice model could be verified with the help of brain slices from adult mice, suffering from pneumococcal meningitis. By immunohistochemical staining with an antibody against synapsin I, serving as a presynaptic marker, we were able to identify a reduction of synapsin I in the cortex of mice, infected with a pneumococcal strain which is capable of producing pneumolysin. The reduction of synapsin I was higher in these brain slices compared to mice infected with a pneumococcal strain which is not capable of producing pneumolysin, illustrating a clear role for the toxin in the reduction of dendritic spines. The fact that the seen effects weren´t abolished under calcium free conditions clarifies that not only the influx of calcium through the pneumolysin-pore is responsible for the alterations. These findings were further supported by calcium imaging experiments, where an inhibitor of the NMDA receptor was capable of delaying the time point, when the maximum of calcium influx upon PLY challenge was reached. Additionally, we were able to observe the dendritic beadings with the help of immunohistochemistry with an antibody against MAP2, a neuron-specific cytoskeletal protein. These observations also connect pneumolysin´s mode of action to excitotoxicity, as several studies mention the aggregation of MAP2 in dendritic beadings in response to excitotoxic stimuli. All in all, this is the first study connecting pneumolysin to excitotoxic events, which might be a novel chance to tie in other options of treatment for patients suffering from pneumococcal meningitis. N2 - Streptococcus pneumoniae ist einer der Hauptauslöser für bakterielle Meningitis, Lungenentzündung und Sepsis. Ungeachtet der Tatsache, dass es heutzutage viele Impfprogramme zur Prävention, sowie Antibiotika zur Behandlung gibt, ist die bakterielle Meningitis im Kindesalter, ausgelöst durch S. pneumoniae, immer noch eine ernstzunehmende Krankheit mit Sterberaten von bis zu 50 %. Bei 30 bis 50 % der Patienten, die die Krankheit überstehen, bleiben teilweise schwere neurologische Störungen zurück. Die steigende Resistenz des Erregers gegenüber herkömmlichen Antibiotika macht zudem die Dringlichkeit zur Entwicklung effektiver Therapieansätze deutlich. Ein Hauptpathogenitätsfaktor von Streptococcus pneumoniae ist das Proteintoxin Pneumolysin (PLY). PLY gehört zu einer Familie strukturell verwandter Toxine; die sogenannten cholesterinabhängigen Cytolysine (CDCs). Das Toxin wird hauptsächlich nach spontaner Autolyse des Bakteriums freigesetzt. Nach Bindung des Proteins an das Cholesterin in den Zellmembranen des Wirtsorganismus, Oligomerisierung von bis zu 50 Toxinmonomeren und Umordnung der Proteinstruktur, bildet das Toxin Poren in der Zellmembran, die in höheren Konzentrationen von PLY zur Zelllyse führen. In niedrigeren Konzentrationen löst das Toxin jedoch verschiedene andere Prozesse, darunter Apoptose und Aktivierung des Komplementsystems, aus. Erste Experimente, die mit einem mutierten Pneumokokkenstamm (unfähig, Pneumolysin zu exprimieren) durchgeführt wurden, konnten eine reduzierte Virulez des Erregers zeigen, was die Beteiligung des Toxins am Verlauf der Krankheit verdeutlicht. Ziel vorliegender Arbeit war, die Beteiligung von Pneumolysin sowohl am Verlauf der bakteriellen Meningitis, hervorgerufen durch Pneumolysin, zu erforschen, als auch dessen Beteiligung an der Entstehung von neurologischen Störungen, wie sie auch nach Rehabilitation von einer Meningitis noch bestehen können. Dafür wurden zuerst die Effekte von sublytischen Konzentrationen des Toxins auf primäre Mausneuronen (transfiziert mit GFP und mit Hilfe eines Konfokalmikroskopes aufgenommen) erfasst. Dabei zeigten sich hauptsächlich zwei morphologische Veränderungen in den Dendriten der mikroskopierten Neurone: Die Entstehung von fokalen Schwellungen der Dendriten (sogenannte „varicosities“) sowie eine Verminderung der Anzahl von dendritischen Dornfortsätzen (sogenannte „dendritic spines“). Um diese Effekte in einem komplexeren System näher untersuchen zu können, entwickelten wir eine reproduzierbare Methode um akute Gehirnschnitte über längere Zeit kultivieren zu können. Mithilfe dieser Methode konnten wir die Veränderungen, die wir schon in der Primärkultur beobachteten, ebenso nachweisen. Die Entwicklung der fokalen Schwellungen der Dendriten konnten mithilfe zweier Antagonisten des NMDA Rezeptors rückgängig gemacht werden, wodurch erstmals eine Verbindung der Effekte mit einer Aktivierung von Glutamatrezeptoren aufgezeigt wurde. Die Verminderung der Anzahl dendritischer Dornfortsätze im Gehirnschnittmodell wurde untermauert von den Ergebnissen, die wir durch Gehirnschnitte von Mäusen, die tatsächlich an pneumokokkaler Meningitis erkrankt waren, erlangen konnten. Durch immunohistologische Färbungen mit einem Antikörper gegen Synapsin I (ein präsynaptisches Protein) konnten wir eine Reduktion dieses Proteins im Cortex erkrankter Mäuse nachweisen. Die Tatsache, dass die morphologischen Veränderungen der Dendriten ebenfalls in calciumfreiem Puffer beobachtet werden konnten, macht deutlich, dass nicht nur der Calciuminflux durch die Pneumolysinpore verantwortlich ist für dessen Neurotoxizität. Diese These wird untermauert durch die Ergebnisse, die wir mithilfe der Calciummikroskopie erhielten: Die Applikation eines Antagonisten des NMDA Rezeptors konnte den Zeitpunkt des maximalen Calciuminfluxes in die Zelle nach Behandlung mit Pneumolysin hinauszögern. Zudem konnten wir die Schwellungen in den Dendriten auch durch einen Antikörper gegen MAP2 (ein neuronenspezifisches Protein des Zytoskeletts) darstellen, was ebenfalls eine Verbindung von Pneumolysin zu „excitotoxicity“ (Toxizität aufgrund einer Übererregung von Glutamatrezeptoren) darstellt, da verschiedene Studien die Aggregation von MAP2 in fokalen dendritischen Schwellungen als Reaktion auf die Einwirkung von „excitotoxischen“ Stimuli nachweisen konnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies die erste Studie ist, die Pneumolysin in Zusammenhang mit einer Überaktivierung von Glutamatrezeptoren bringt, was eine komplett neue Sichtweise darstellt und eventuell neue Möglichkeiten der Therapie für Patienten, die an dieser Form der bakteriellen Hirnhautentzündung leiden, eröffnet. KW - Nervenzelle KW - Nervennetz KW - Bakterien KW - Bakterielle Hirnhautentzündung KW - Bakteriengift KW - Bacterial meningitis KW - Pneumolysin KW - Excitotoxicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72016 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Metzler, M. T1 - Carcinogenic oestrogens induce respiration deficiency mutation in yeast N2 - In addition to hormonal activity, genetic darnage has been proposed as an important factor in oestrogen-mediated carcinogenesis. However, as short-term tests for oestrogens usually fail to show DNA mutations, lesions other than dassie nuclear DNA mutation have to be considered. Oestrogeninduced mitochondrial darnage was studied in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Stilbene-type, but not steroidal, oestrogens were found to induce respiration-dcficient petite mutation. The effect was inversely correlated with cytotoxicity and required aromatic hydroxyl groups at the stilbene molecule. It only occurred under growth conditions and apparently was not due to the A TPase inhibitory qualities of stilbene oestrogens. Other studies have shown that petite mutation clones, which can be induced by a variety of substances, contain altered mitochondrial DNA. The mechanism of petite mutation induction might be important in tumorigenesis by also acting on nuclear DNA or facilitating carcinogenesis by disturbance of mitochondrial function. KW - Toxikologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63466 ER - TY - THES A1 - Deiß, Katharina T1 - Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2) T1 - Regulation of the kinase modulator Raf kinase inhibitor protein (RKIP): Influence of phosphorylation and dimerization on its interaction with Raf1 and G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2) N2 - RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen. N2 - RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved. KW - Signaltransduktion KW - Dimerisierung KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Proteinkinase C KW - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) KW - G protein-gekoppelte Rezeptor Kinase 2 (GRK2) KW - Raf1 KW - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) KW - G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) KW - Raf1 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884 ER - TY - JOUR A1 - Schupp, Nicole A1 - Heidland, August A1 - Stopper, Helga T1 - Genomic Damage in Endstage Renal Disease - Contribution of Uremic Toxins N2 - Patients with end-stage renal disease (ESRD), whether on conservative, peritoneal or hemodialysis therapy, have elevated genomic damage in peripheral blood lymphocytes and an increased cancer incidence, especially of the kidney. The damage is possibly due to accumulation of uremic toxins like advanced glycation endproducts or homocysteine. However, other endogenous substances with genotoxic properties, which are increased in ESRD, could be involved, such as the blood pressure regulating hormones angiotensin II and aldosterone or the inflammatory cytokine TNF-. This review provides an overview of genomic damage observed in ESRD patients, focuses on possible underlying causes and shows modulations of the damage by modern dialysis strategies and vitamin upplementation. KW - Toxin KW - dialysis KW - genotoxicity KW - uremic toxins Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68653 ER - TY - THES A1 - Bieber, Daniela T1 - Der A2B-Adenosinrezeptor und MAP-Kinase Aktivität in MDA-MB-231 Brustkrebszellen T1 - The A2B adenosine receptor and MAP-kinase activity in MDA-MB-231 breast cancer cells N2 - Sowohl MAPK als auch Adenosin werden mit Tumorproliferation und Angiogenese in Verbindung gebracht. MDA-MB-231 Östrogenrezeptor-negative Brustkrebszellen zeigen eine sehr starke Expression des A2BAR, der außerdem der einzige von dieser Zelllinie exprimierte Adenosinrezeptor ist. Es konnte gezeigt werden, dass MDA-MB-231-Brustkrebszellen eine hohe basale MAPK-Aktivität aufweisen, welche durch Stimulation mit FCS nicht weiter gesteigert werden kann. Diese hohe basale MAPK-Aktivität wird durch die src-Kinase und Her2 verursacht, da eine Inhibition dieser beiden Tyrosinkinasen eine Hemmung der basalen ERK-Phosphorylierung induziert. Interessanterweise führt die Stimulation des A2BAR der MDA-MB-231-Brustkrebszellen mit dem unselektiven Agonisten NECA zu einer zeitanhängigen Inhibition der ERK-1/2-Phosphorylierung. Eine Behandlung der Brustkrebszelllinie mit 10 µM CGS 21680 zeigten keinen Einfluss auf die ERK-Aktivität, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass die zeitabhängige Inhibition der ERK-1/2-Phosphorylierung durch den A2BAR vermittelt wird. Eine Beteiligung von cAMP an der MAPK-Signaltransduktion des A2BAR scheint insofern wahrscheinlich, als sowohl eine Behandlung der Zellen mit Forskolin als auch der Kombination aus cAMP-AM und dem PDE4-Inhibitor Rolipram eine zeitabhängige Hemmung der ERK-1/2-Phosphorylierung induzieren. Jedoch scheint weder die PKA noch die PI3K an dieser Signaltransduktion des A2BAR beteiligt zu sein, da die A2BAR-vermittelte Inhibition der MAPK auch in Anwesenheit von PKA- und PI3K-Inhibitoren bestehen bleibt. Auch scheinen cAMP-GEFs wie beispielsweise Epac in diesem Zusammenhang keine Rolle zu spielen. In Gegenwart des PLC-Inhibitors U-73122 und des Ca2+-Chelators BAPTA verschwand die NECA-induzierte Hemmung der ERK-1/2-Phosphorylierung, was für eine Beteiligung der PLC und des Ca2+ an der A2BAR-vermittelten Hemmung der MAPK-Aktivität spricht. Letzten Endes konnte jedoch kein Mechanismus eruiert werden, welcher diese A2BAR-vermittelte, Ca2+-abhängige MAPK-Hemmung mediiert, da weder eine Inhibition der PKC, der CamKII oder des Calcineurins Einfluss auf die NECA-induzierte MAPK-Hemmung hatten. Was Wachstum und Proliferation der Östrogenrezeptor-negativen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 anbelangt, so konnte gezeigt werden, dass der unselektive Agonist NECA zu einer signifikanten Wachstumshemmung dieser Brustkrebszelllinie führt. Allerdings kommt es aufgrund einer Desensitisierung der A2BAR in MDA-MB-231-Brustkrebszellen lediglich zu einem transienten proliferationshemmenden Effekt nach Stimulation mit NECA. N2 - MAP kinases as well as adenosine are involved in angiogenesis and proliferation of malignant tumors. The estrogen receptor-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 expresses A2B adenosine receptors (A2BAR) as the sole adenosine receptor subtype at remarkably high levels. These MDA-MB-231 cells show a very high basal MAPK activity which seems to be maximal as it can not be stimulated further with FCS or EGF. This high basal MAPK activity is caused by src-kinase and her2, as inhibition of these two tyrosinkinases induces an inhibition of basal ERK1/2 phosphorylation. Interestingly, stimulation of A2BAR in MDA-MB-231 breast cancer cells with the unselective agonist NECA leads to a time-dependent inhibition of ERK1/2 phosphorylation whereas treatment of the cells with 10 µM CGS 21680 had no influence on ERK-activity. Thus it can be assumed that the time-dependent inhibition of ERK1/2 phosphorylation is mediated via the A2BAR subtype. A role of cAMP for the MAPK signal transduction of the A2BAR seems to be likely because stimulation of the cells with Forskolin as well as treatment with a combination of cAMP-AM and the PDE4-inhibitor Rolipram results in a time-dependent inhibition of ERK1/2 phosphorlyation. However, neither PKA nor PI3K seem to be involved in the signal transduction of the A2B adenosine receptor, as the A2BAR-mediated inhibition of MAPK persists in the presence of PKA- and PI3K-inhibitors. CAMP-GEFs like EPAC do not seem to play a role in this signal transduction mechanism either. The presence of the PLC-inhibitor U-73122 and the Ca2+-chelator BAPTA abolishes the NECA effect, suggesting a role for PLC and Ca2+ for the A2BAR-mediated inhibition of ERK1/2 phosphorylation. Finally, a mechanism leading to this A2BAR-mediated and Ca2+-dependent MAPK inhibition could not be found out because neither an inhibition of PKC, nor inhibition of CamKII or Calcineurin had an influence on the NECA effect. Concerning growth and proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells it could be shown that the unselective agonist NECA leads to a slight but significant growth inhibition in these cells. However, this proliferation-inhibiting effect of NECA is only transient because of a desensitization of A2B adenosine receptors in these breast cancer cells. KW - Adenosinrezeptor KW - MAP-Kinase KW - MDA-MB-231-Brustkrebszellen KW - adenosine receptor KW - MAP-kinase KW - MDA-MB-231 breast cancer cells Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65707 ER - TY - JOUR A1 - Fischer, W. H. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Short communication : Mouse skin papilloma formation by chronic dermal application of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene is not reduced by diet restriction N2 - No abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60644 ER - TY - JOUR A1 - Grunicke, H. A1 - Pyerin, W. A1 - Eisenbrand, G. A1 - Havemann, K. A1 - Rabes, H. M. A1 - Molling, K. A1 - Schwab, M. A1 - Lutz, Werner K. A1 - Wahrendorf, J. A1 - Schirrmacher, V. T1 - 7th International Symposium of the Division of Experimental Cancer Research (AEK) of the German Cancer Society : [Meeting report] N2 - No abstract available KW - Toxikologie Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60651 ER - TY - JOUR A1 - Kirchner, S. A1 - Stopper, Helga A1 - Papp, T. A1 - Eckert, I. A1 - Yoo, H. J. A1 - Vig, B. K. A1 - Schiffmann, D. T1 - Cytogenetic changes in primary, immortalized and malignant mammalian cells N2 - Some chromosomes in transformed rat cells and somatic cell hybrids fail to display the presence of kinetochore proteins as detected by antikinetochore antibodies. Suchchromosomes (K- Chromosomes) may constitute a novel mechanism for the genesis of aneuploidy. Wehave analyzed primary~ immortalized and malignant marnmalian cells for the presence of kinetochore proteins and micronuclei. Our resuJts suggest a correlation of the K- chromosome and micronucleus frequency with the variability in chromosome number. Upon in situ hybridization with the minor satellite and alpha satellite sequences some Kchromosomes showed a signal. This indicates that the observed lack of kinetocbores is not necessarily due to a lack of centromeric DNA. We conclude that dislocated K- chromosomes may become incorporated into micronuclei which are prone to loss. Such events would be associated with the generation of aneuploidy. KW - Toxikologie KW - Micronuclei KW - Kinetochore KW - Chromosome distribution Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63439 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Pechan, R. A1 - Schiffmann, D. T1 - 5-azacytidine induces micronuclei in and morphological transformation of Syrian hamster embryo fibroblasts in the absence of unscheduled DNA synthesis N2 - lt is known that 5-azacytidine (5-AC) induces tumors in several organs of rats and mice. The mechanisms of these effects are still poorly understood although it is known that 5-AC can be incorporated into DNA. Furthermore, it can inhibit DNA methylation. The known data on its clastogenic andjor gene mutation-inducing potential are still controversial. Therefore, we have investigated the kinds of genotoxic effects caused by 5-AC in Syrian hamster embryo (SHE) fibroblasts. Three different endp6ints (micronucleus formation, unscheduled DNA synthesis (UDS) and cell transforrnation) were assayed under similar conditions of metabolism and dose at target in this cell system. 5-AC induces morphological transformation of SHE cells, but not UDS. Therefore, 5-AC does not seem to cause repairable DNA lesions. Furthermore, our studies revealed that 5-AC is a potent inducer of mkronuclei in the SHE system. Immunocytochemical analysis revealed that a certain percentage of these contain kinetochores indicating that 5-AC may induce both clastogenic events and numerical chromosome changes. KW - Toxikologie KW - 5-Azacytidine KW - Micronuclei KW - Kinetochores KW - Unscheduled DNA synthesis KW - Cell transformation Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63443 ER - TY - JOUR A1 - Tas, P. A1 - Stopper, Helga A1 - Koschel, K. A1 - Schiffmann, D. T1 - Influence of the carcinogenic oestrogen diethylstilboestrol on the intracellular calcium level in C6 rat glioma cells N2 - The ~fthetic oes~rog~n diethylsti~boestrol (DES) causes a dose-dependent elevation of the cytoplasuuc Ca concentratton m C6 rat ghoma cells. This Ca2+ rise is caused neither by Ca2+ influx nor ~-r release from the ~a2 + stores of the endoplasmic reticulum. Therefore it seems likely that DES mob!hzes Ca2+ from a nutochondrial source. The DES-induced Ca2+ signal is remarkably similar to the one mduced by the. tumou~ promotor ~hapsigargin. As this compound causes leakage of calcium from the endoplasmt~ rettculum tt ~ms posstble that DES induces a similar leakage from mitochondrial Ca2+ stores. It remaans to be estabhshed whether the DES-mediated rise in intracellular calcium is causally related to the tumour-promoting properties of this compound KW - Toxikologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63459 ER - TY - JOUR A1 - Epe, B. A1 - Harttig, U. A1 - Stopper, Helga A1 - Metzler, M. T1 - Covalent binding of reactive estrogen metabolites to microtubular protein as a possible mechanism of aneuploidy induction and neoplastic cell transformation N2 - Neoplastic cell transfonnation induced by estrogens and some other carcinogen& such as benzene appears to involve the induction of mitotic aneuploidy rather than DNA damage and point mutations. As metabolic activation may also play an important roJe in the mechanism of carcinogenesis of these nongenotoxic compounds, we have studied the Interaction of reactive quinone metabolites of various estrogens and of benzene with the major microtubular protein, tubulin, in a cell-free system. Covalent binding of the radioactively labeled metabolites to the a- and 13-subunit of tubulin was found to depend on the structure of the metabolite. When the adducted tubulins were tested in vitro for their ability to polymerize to microtubules, Inhibition of microtubule assembly was obsened in every case, although to varying extents. It is proposed that the fonnation of covalent tubulin adducts may impair the formation of mitotic spindies and thus contribute to chromosomal nondisjunction and aneuploidy induction. KW - Toxikologie Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63478 ER - TY - JOUR A1 - Stopper, Helga A1 - Zimmermann, U. A1 - Neil, G. A. T1 - Increased efficiency of transfection of murine hybridoma cells with DNA by electropermeabilization N2 - Dispase-treated murine hybridoma cells (SP2/0-Ag14) were transfected with the G418 resistance gene bearing plasmid pSV2-neo by electropermeabilization with a high degree of efficiency. The cells were subjected to intermittent multiple high-voltage short duration (5 p.s) DC pulses at intervals of 1 min in a weakly conducting medium followed by selection in G418-containing medium. The transfection medium, temperature, pulse duration, and voltage were empirically determined by preliminary electropermeabilization experiments. Increasing the number of pulses resulted in a higher percentage of transfected cells, but a decrease in the number of viable cells, with the optimal transfectant yield resulting when five pulses of 10 kV jcm were administered. This method allows the rapid and efficient injection of DNA into mammalian cells, and permits the rapid production of stable, drug resistant hybridoma celllines for use in subsequent fusion experiments. KW - Toxikologie KW - DNA transfection KW - Electropermeabilization KW - Eukaryotic cell KW - Hybridoma KW - Drug resistance Y1 - 1988 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-63488 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. A1 - Poetzsch, J. A1 - Schlatter, J. A1 - Schlatter, C. T1 - The real role of risk assessment in cancer risk management N2 - Rtgulatory aclio11s Iaken to reduu tht risk of harmfultffects of exposure to chemieals ofltn arenot commensurDtt with the toxicologicDf risk SJsstS&ment. A numbtr of factors relating to psychology, sociology, economics Dntl politics rather than science and medicine afftct tht final decision. Wemer Lutz and colleagues illustratt the situation using tht feuktmia-indudng chtmiCJJI benzene as an examplt. KW - Toxikologie Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-60730 ER - TY - THES A1 - Frölich, Nadine T1 - Analyse der µ-Opiatrezeptoraktivierung und Signaltransduktion in lebenden Zellen mittels FRET-Mikroskopie T1 - Analysis of µ-opioid receptor activation and signal transduction in living cells using FRET microscopy N2 - Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind. N2 - Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways. KW - Opiatrezeptor KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Morphin KW - Stoffwechsel KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Mikroskopie KW - Metabolite von Morphin KW - Metabolismus KW - Metabolites of morphine Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71009 ER -