TY - JOUR A1 - Klotz, Barbara A1 - Mentrup, Birgit A1 - Regensburger, Martina A1 - Zeck, Sabine A1 - Schneidereit, Jutta A1 - Schupp, Nicole A1 - Linden, Christian A1 - Merz, Cornelia A1 - Ebert, Regina A1 - Jakob, Franz T1 - 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Treatment Delays Cellular Aging in Human Mesenchymal Stem Cells while Maintaining Their Multipotent Capacity JF - PLoS ONE N2 - 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) was reported to induce premature organismal aging in fibroblast growth factor-23 (Fgf23) and klotho deficient mice, which is of main interest as 1,25D3 supplementation of its precursor cholecalciferol is used in basic osteoporosis treatment. We wanted to know if 1,25D3 is able to modulate aging processes on a cellular level in human mesenchymal stem cells (hMSC). Effects of 100 nM 1,25D3 on hMSC were analyzed by cell proliferation and apoptosis assay, beta-galactosidase staining, VDR and surface marker immunocytochemistry, RT-PCR of 1,25D3-responsive, quiescence-and replicative senescence-associated genes. 1,25D3 treatment significantly inhibited hMSC proliferation and apoptosis after 72 h and delayed the development of replicative senescence in long-term cultures according to beta-galactosidase staining and P16 expression. Cell morphology changed from a fibroblast like appearance to broad and rounded shapes. Long term treatment did not induce lineage commitment in terms of osteogenic pathways but maintained their clonogenic capacity, their surface marker characteristics (expression of CD73, CD90, CD105) and their multipotency to develop towards the chondrogenic, adipogenic and osteogenic pathways. In conclusion, 1,25D3 delays replicative senescence in primary hMSC while the pro-aging effects seen in mouse models might mainly be due to elevated systemic phosphate levels, which propagate organismal aging. KW - perspectives KW - bone marrow KW - mutant mice KW - oxidative stress KW - transcription factors KW - vitamin-D-receptor KW - differentiation KW - tissue KW - 2',7'-dichlorofluorescin KW - homeostasis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133392 VL - 7 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Leyh, Annekathrin T1 - In vitro Untersuchungen zur Genotoxizität von Insulin T1 - In vitro studies on genotoxicity of insulin N2 - Insulin ist ein essentielles Hormon im menschlichen Körper, welches für die Senkung der Blutglukosekonzentration, die Bildung von Energiespeichern und das Zellwachstum verantwortlich ist. Eine mit der Fehlregulation der Insulinproduktion einhergehenden Krankheit ist der Diabetes mellitus. Für diese Arbeit spielt der Typ 2 dieser Erkrankung eine wichtige Rolle. Es entwickelt sich bei Patienten mit diesem Typ des Diabetes mellitus langsam eine Insulinresistenz, die zunächst durch eine kompensatorische Überproduktion von Insulin charakterisiert ist. Dieser Zustand der Hyperinsulinämie kann Jahre bis Jahrzehnte andauern, ehe es zu einem Versagen der ß-Zellen des Pankreas und somit zu einer Hypoinsulinämie kommt. In dieser Arbeit war es Ziel herauszufinden, ob diese lange Zeit herrschende Hyperinsulinämie einen Einfluss auf die menschliche DNA hat. Die Genotoxizität von hohen Insulinkonzentrationen wurde in Hep-G2 Zellen, HT29 Zellen, sowie primären humanen peripheren Lymphozyten mithilfe des Comet Assays und des Mikrokerntests nachgewiesen. Oxidativer Stress bzw. dessen Reduzierung durch Antioxidantien und Inhibitoren wurde in HT29 Zellen mithilfe der DHE-Färbung detektiert. Diese Arbeit belegt dass sich Insulin schädigend auf das menschliche Genom in vitro auswirken kann. Eine besondere Relevanz haben die durchgeführten Experimente mit primären menschlichen Lymphozyten. Denn bei ihnen handelt es sich um Zellen, die im Gegensatz zu der auch genutzten humanen Leberkarzinomzelllinie Hep-G2 und der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 nicht transformiert sind. Eine weitere wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass schon pathophysiologisch vorliegende Insulinkonzentrationen in der Lage sind Genomschädigungen in vitro zu induzieren. HT29 Zellen zeigten bei Kurzzeitbehandlung mit nur 1nM Insulin eine signifikante Erhöhung der DNA-Schädigung. Bei Langzeitexposition von 6 Tagen konnten schon 0,5nM signifikante DNA-Schäden hervorrufen. Diese durch Insulin hervorgerufenen Schäden könnten, falls sie so auch in vivo entstehen, bei Versagen von Reparaturmechanismen zur Entstehung von Mutationen und sich daraus entwickelnden Karzinomen beitragen. Aus diesem Grund war ein weiteres Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob bestimmte Antioxidantien oder Inhibitoren in der Lage sind die Insulin-induzierten Genomschädigungen zu verringern. Hierfür wurde Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 und Wortmannin genutzt. Tatsächlich sind diese Substanzen in der Lage die durch Insulin hervorgerufene Schädigung zu reduzieren. Die positiven Ergebnisse dieser Arbeit könnten einen ersten Hinweis auf eine mögliche pharmakologische Intervention bei Hyperinsulinämie mit dem Ziel der Senkung des erhöhten Krebsrisikos geben. Eine wichtige Erkenntnis aus den Ergebnissen meiner Arbeit ist, dass die Reduzierung des oxidativen Stresses eine Reduzierung der Genomschädigung bewirkt. Die genutzten Substanzen Apocynin, Tempol, VAS2870 und Rotenone bewirkten in HT29 Zellen eine signifikante Reduzierung des durch Insulin ausgelösten oxidativen Stresses. Um aber genauere Aussagen über Möglichkeiten der Therapie bei Hyperinsulinämie zu treffen, sollten Folgestudien auch in vivo folgen, welche die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte bestätigen. N2 - Insulin is an essential hormone in the human body, which is responsible for the reduction of blood glucose concentration, the formation of energy holding compounds, and cell growth. A disease associated with the dysregulation of insulin production is diabetes mellitus. For this work, the type 2 of the disease plays an important role. Patients with this type of diabetes mellitus gradually develop an insulin resistance, which is initially characterized by a compensatory overproduction of insulin. This state of hyperinsulinemia may last years or even decades, before it comes to a break-down of the beta cells of the pancreas, and hence to a hypoinsulinemia. The target of this study was to evaluate, whether these long term lasting hyperinsulinemia has an impact on human DNA. The genotoxicity of high insulin concentrations was detected in HepG2 cells, HT29 cells as well as primary human peripheral lymphocytes, using the comet assay and the micronucleus test. Oxidative stress and it´s reduction by antioxidants and inhibitors was detected in HT29 cells using the DHE staining. This work shows that insulin may damage the human genome in vitro. A special relevance show experiments carried out with primary human lymphocytes. Because these are not transformed like the human liver carcinoma cell line HepG2, and the human colon carcinoma cell line HT29, also studied. Another significant finding of this study is, that even pathophysiologically present insulin concentrations are capable to damage the genome in vitro. HT29 cells showed a significant increase in DNA damage when short-term treated with only 1nM insulin. After long-term exposure of 6 days already 0.5nM were capable to significantly damage DNA. This induced insulin damage could, if also occurring in vivo, contribute to the development of mutations and carcinomas, if mechanisms of repairs are failing. A further aim of this study was therefore to check whether certain antioxidants or inhibitors would be capable of reducing insulin-induced genome damages. For this Tempol, Apocynin, Plumbagin, VAS2870, Rotenone, PPP, HNMPA-(AM)3 and Wortmannin were used. In fact, these substances are capable to reduce the damage caused by insulin. The positive results of this work could be a first indication of a possible pharmacological intervention against hyperinsulinemia with the aim of lowering stringent cancer risk. An important conclusion of the results of my work is that reduction of oxidative stress results in a reduction of genome damage. The substances used, Apocynin, Tempol, VAS2870 and Rotenone, caused a significant reduction of insulin-induced oxidative stress, in HT29 cells. In order to make more detailed statements about possibilities of hyperinsulinemia therapy, follow-up studies in vivo are required which would back-up the findings of this study. KW - Insulin KW - Genotoxizität KW - Hyperinsulinämie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131986 ER - TY - JOUR A1 - Vandenberg, Laura N. A1 - Chahoud, Ibrahim A1 - Heindel, Jerrold J. A1 - Padmanabhan, Vasantha A1 - Paumgartten, Francisco J. R. A1 - Schönfelder, Gilbert T1 - Urinary, Circulating, and Tissue Biomonitoring Studies Indicate Widespread Exposure to Bisphenol A T1 - Estudos de biomonitoração do sistema urinário, circulatório e tecidos indicam grande exposição ao Bisfenol A JF - Ciência & Saúde Coletiva N2 - Bisphenol A (BPA) is one of the highest-volume chemicals produced worldwide, and human exposure to BPA is thought to be ubiquitous. Thus, there are concerns that the amount of BPA to which humans are exposed may cause adverse health effects. We examined many possibilities for why biomonitoring and toxicokinetic studies could come to seemingly conflicting conclusions. More than 80 published human biomonitoring studies that measured BPA concentrations in human tissues, urine, blood, and other fluids, along with two toxicokinetic studies of human BPA metabolism were examined. Unconjugated BPA was routinely detected in blood (in the nanograms per milliliter range), and conjugated BPA was routinely detected in the vast majority of urine samples (also in the nanograms per milliliter range). In stark contrast, toxicokinetic studies proposed that humans are not internally exposed to BPA. Available data from biomonitoring studies clearly indicate that the general population is exposed to BPA and is at risk from internal exposure to unconjugated BPA. The two toxicokinetic studies that suggested human BPA exposure is negligible have significant deficiencies, are directly contradicted by hypothesis-driven studies, and are therefore not reliable for risk assessment purposes. N2 - Bisfenol A (BPA) é um dos produtos químicos mais produzido em todo o mundo, e a exposição humana a ele é considerada onipresente. Assim, há preocupações de que a quantidade de BPA para o qual os seres humanos estão expostos podem causar efeitos adversos à saúde. Nós examinamos muitas possibilidades sobre o porquê estudos de biomonitorização e toxicocinética podem chegar a conclusões aparentemente conflitantes. Mais de 80 estudos publicados de biomonitorização humana que mediram a concentração de BPA em tecidos humanos, urina, sangue e outros fluidos, juntamente com dois estudos de toxicocinética do metabolismo humano BPA foram examinados. BPA não conjugado foi detectado no sangue (nonanogramas por mililitro gama), e BPA conjugado foi detectado na grande maioria das amostras de urina. Em contraste, estudos de toxico-cinética propuseram que os seres humanos não são internamente expostos ao BPA. Dados disponíveis de estudos de biomonitorização indicam que a população em geral está exposta ao BPA e em risco de exposição interna ao BPA não conjugado. Os dois estudos de toxicocinética, que sugeriram a exposição humana ao BPA é insignificante, têm deficiências significativas e estão diretamente refutados por outros estudos e, portanto não são confiáveis para fins de avaliação de risco. KW - human KW - performance liquid-chromatography KW - toxicocinética KW - serum KW - fluorescence detection KW - disrupting chemicals KW - endocrine disruptor KW - human exposure KW - PBPK/PBTK model KW - pregnancy KW - risk assessment KW - toxicokinetics KW - solid-phase extraction KW - tandem mass-spectrometry KW - HPLC-MS/MS method KW - environmental phenols KW - estrogen receptor KW - adipose tissue KW - disruptor endócrino KW - exposição humana KW - modelo PBPK/PBTK KW - gravidez KW - avaliação de risco Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134332 VL - 17 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Wippel, Carolin A1 - Maurer, Jana A1 - Fortsch, Christina A1 - Hupp, Sabrina A1 - Bohl, Alexandra A1 - Ma, Jiangtao A1 - Mitchell, Timothy J. A1 - Bunkowski, Stephanie A1 - Brück, Wolfgang A1 - Nau, Roland A1 - Iliev, Asparouh I. T1 - Bacterial Cytolysin during Meningitis Disrupts the Regulation of Glutamate in the Brain, Leading to Synaptic Damage JF - PLoS Pathogens N2 - Abstract Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) meningitis is a common bacterial infection of the brain. The cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin represents a key factor, determining the neuropathogenic potential of the pneumococci. Here, we demonstrate selective synaptic loss within the superficial layers of the frontal neocortex of post-mortem brain samples from individuals with pneumococcal meningitis. A similar effect was observed in mice with pneumococcal meningitis only when the bacteria expressed the pore-forming cholesterol-dependent cytolysin pneumolysin. Exposure of acute mouse brain slices to only pore-competent pneumolysin at disease-relevant, non-lytic concentrations caused permanent dendritic swelling, dendritic spine elimination and synaptic loss. The NMDA glutamate receptor antagonists MK801 and D-AP5 reduced this pathology. Pneumolysin increased glutamate levels within the mouse brain slices. In mouse astrocytes, pneumolysin initiated the release of glutamate in a calcium-dependent manner. We propose that pneumolysin plays a significant synapto- and dendritotoxic role in pneumococcal meningitis by initiating glutamate release from astrocytes, leading to subsequent glutamate-dependent synaptic damage. We outline for the first time the occurrence of synaptic pathology in pneumococcal meningitis and demonstrate that a bacterial cytolysin can dysregulate the control of glutamate in the brain, inducing excitotoxic damage. Author Summary Bacterial meningitis is one of the most devastating brain diseases. Among the bacteria that cause meningitis, Streptococcus pneumoniae is the most common. Meningitis predominantly affects children, especially in the Third World, and most of them do not survive. Those that do survive often suffer permanent brain damage and hearing problems. The exact morphological substrates of brain damage in Streptococcus pneumoniae meningitis remain largely unknown. In our experiments, we found that the brain cortex of patients with meningitis demonstrated a loss of synapses (the contact points among neurons, responsible for the processes of learning and memory), and we identified the major pneumococcal neurotoxin pneumolysin as a sufficient cause of this loss. The effect was not direct but was mediated by the brain neurotransmitter glutamate, which was released upon toxin binding by one of the non-neuronal cell types of the brain – the astrocytes. Pneumolysin initiated calcium influx in astrocytes and subsequent glutamate release. Glutamate damaged the synapses via NMDA-receptors – a mechanism similar to the damage occurring in brain ischemia. Thus, we show that synaptic loss is present in pneumococcal meningitis, and we identify the toxic bacterial protein pneumolysin as the major factor in this process. These findings alter our understanding of bacterial meningitis and establish new therapeutic strategies for this fatal disease. KW - synapses KW - brain damage KW - astrocytes KW - neuronal dendrites KW - meningitis KW - glutamate KW - bacterial meningitis KW - neocortex Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130462 VL - 9 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Capra, Valérie A1 - Busnelli, Marta A1 - Perenna, Alessandro A1 - Ambrosio, Manuela A1 - Accomazzo, Maria Rosa A1 - Galés, Celine A1 - Chini, Bice A1 - Rovati, G. Enrico T1 - Full and Partial Agonists of Thromboxane Prostanoid Receptor Unveil Fine Tuning of Receptor Superactive Conformation and G Protein Activation JF - PLoS ONE N2 - The intrahelical salt bridge between \(E/D^{3.49}\) and \(R^{3.50}\) within the E/DRY motif on helix 3 (H3) and the interhelical hydrogen bonding between the E/DRY and residues on H6 are thought to be critical in stabilizing the class A G protein-coupled receptors in their inactive state. Removal of these interactions is expected to generate constitutively active receptors. This study examines how neutralization of \(E^{3.49/6.30}\) in the thromboxane prostanoid (TP) receptor alters ligand binding, basal, and agonist-induced activity and investigates the molecular mechanisms of G protein activation. We demonstrate here that a panel of full and partial agonists showed an increase in affinity and potency for E129V and E240V mutants. Yet, even augmenting the sensitivity to detect constitutive activity (CA) with overexpression of the receptor or the G protein revealed resistance to an increase in basal activity, while retaining fully the ability to cause agonist-induced signaling. However, direct G protein activation measured through bioluminescence resonance energy transfer (BRET) indicates that these mutants more efficiently communicate and/or activate their cognate G proteins. These results suggest the existence of additional constrains governing the shift of TP receptor to its active state, together with an increase propensity of these mutants to agonist-induced signaling, corroborating their definition as superactive mutants. The particular nature of the TP receptor as somehow "resistant" to CA should be examined in the context of its pathophysiological role in the cardiovascular system. Evolutionary forces may have favored regulation mechanisms leading to low basal activity and selected against more highly active phenotypes. KW - coupled receptor KW - ligand binding KW - intracellular loop KW - molecular dynamics KW - Beta(1)-adrenergic receptor KW - ionic look KW - Beta(2)-adrenergic receptor KW - crystal structure KW - constitutive activity Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131013 VL - 8 IS - 3 ER - TY - THES A1 - Knaus, Anne Elizabeth T1 - Pharmacological target proteins of alpha2-agonists in alpha2ABC-deficient mice T1 - Pharmakologische Zielproteine von alpha2-Agonisten bei alpha2ABC-Rezeptor-defizienten Mäusen N2 - Clonidine is an agonist at alpha2-adrenergic receptors that mediate a wide variety of the physiological responses to epinephrine and norepinephrine, such as inhibition of neurotransmitter release as well as sedation and analgesia. As with other therapeutically used alpha2-agonists such as moxonidine and rilmenidine, clonidine possesses an imidazoline structure and is believed to lower blood pressure not only via central and peripheral alpha2-receptors, but perhaps even more so by acting on central “imidazoline I1 receptors” in the brain stem. The molecular structure of these hypothetical “imidazoline I1 receptors” has not yet been identified. In order to test whether ligands with an imidazoline structure elicit pharmacological effects via alpha2-adrenergic receptors or via “imidazoline receptors”, mice were generated with a targeted deletion of all three alpha2-adrenergic receptor subtypes (alpha2ABC-KO). These alpha2ABC-KO mice were an ideal model in which to examine the pharmacological effects of the centrally acting antihypertensives clonidine, moxonidine and rilmenidine in the absence of alpha2-adrenergic receptors. As expected, sedative and analgesic actions of clonidine were completely absent in alpha2ABC-KO mice, confirming the sole role of alpha2-receptors in these properties of clonidine. Clonidine significantly lowered heart rate in anesthetized alpha2ABC-KO and wild-type mice by up to 150 beats/min. A similar bradycardic effect of clonidine was observed in isolated spontaneously beating right atria from alpha2ABC-KO mice. After treatment with the specific If inhibitor ZD 7288, clonidine was no longer able to lower spontaneous beating frequency, suggesting a common site of action. Furthermore, in HEK293 cells stably transfected with HCN2 and HCN4, it could be shown that clonidine inhibits the If current via blockade of pacemaker channels with similar affinity as in isolated alpha2ABC-KO and wild-type atria. This inhibition was demonstrated again in isolated sinoatrial node (SAN) cells from alpha2ABC-KO mice and was identical in potency and efficacy to clonidine inhibition observed in isolated wild-type SAN cells, confirming that inhibition of atrial HCN channels constitutes the alpha2-independent bradycardic action of clonidine. Direct inhibition of cardiac HCN pacemaker channels contributes to the bradycardic effects of clonidine in gene-targeted mice. Thus clonidine-like drugs represent novel structures for future HCN channel inhibitors. N2 - alpha2-adrenerge Rezeptoren vermitteln die vielfältigen Wirkungen der endogenen Catecholamine Noradrenalin und Adrenalin, darunter auch eine Hemmung der Noradrenalin-Freisetzung sowie Sedierung und Analgesie. Clonidin und die ebenfalls therapeutisch eingesetzten alpha2-Agonisten Moxonidin und Rilmenidin besitzen eine Imidazolin-Teilstrukur. Es wird zur Zeit diskutiert, ob die hypotensive Wirkung dieser Arzneimittel nicht nur auf zentrale und periphere alpha2-Rezeptoren zurückzuführen ist, sondern auch auf sogenannte “I1 Imidazolin-Rezeptoren” in der ventrolateralen Medulla. Bis heute ist die molekulare Struktur dieser hypothetischen Rezeptoren nicht bekannt. Um diese Imidazolin-Hypothese zu überprüfen wurden Mäuse mit einer gezielten Deletion in allen drei alpha2-Rezeptor Genen generiert (alpha2ABC-KO). Dieses Mausmodell eignete sich hervorragend, um die pharmakologische Wirkung von den zentral-wirksamen Antihypertensiva Clonidin, Moxonidin und Rilmenidin in der völligen Abwesenheit von alpha2-Rezeptoren zu untersuchen. Wie erwartet fehlten die sedativen und analgetischen Wirkungen des Clonidins bei alpha2ABC-KO Mäusen, wodurch die alleinige Beteiligung von alpha2-Rezeptoren an diesen Eigenschaften des Clonidins bestätigt wurde. Bei anästhesierten alpha2ABCKO und Wildtyp-Mäusen zeigte Clonidin eine signifikante Senkung der basalen Herzfrequenz in beiden Genotypen von bis zu 150 Schlägen/min. In ähnlicher Weise setzte Clonidin in isolierten, spontan schlagenden rechten Vorhöfen von alpha2ABC-KO die Schlagfrequenz herab. Nach Vorbehandlung der Vorhöfe mit dem spezifischen If Inhibitor ZD 7288 fand keine weitere Senkung der Schlagfrequenz durch Clonidin mehr statt, was auf einen gemeinsamen Wirkort der beiden Substanzen hindeutete. In stabil transfizierten HEK293 Zellen zeigte Clonidin eine Inhibition des If Stromes durch Blockade von HCN2- und HCN4-Kanälen mit ähnlicher Potenz wie in den isolierten Vorhöfen. Ebenfalls in isolierten Sinusknoten (SAN) Zellen von alpha2ABC-KO und Wildtyp-Mäusen inhibierte Clonidin den If Strom mit gleicher Potenz. Diese Befunde bestätigen, dass die Blockade von atrialen HCN-Kanälen den Mechanismus der alpha2-unabhängigen, Clonidin-induzierten Bradykardie darstellt. Die direkte Hemmung von kardialen HCN-Schrittmacher-Kanälen trägt wesentlich zur bradykarden Wirkung von Clonidin bei transgenen Mäusen bei. Clonidin-Derivate bilden somit die Basis für die Entwicklung neuer HCN-Kanal-Inhibitoren. KW - alpha2-Rezeptor KW - Clonidin KW - HCN-Kanal KW - alpha2-KO Maus KW - I1 Imidazolin Bindungsstelle KW - alpha2-receptor KW - clonidine KW - HCN channel KW - alpha2-KO mouse KW - I1 imidazoline binding site Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23752 ER - TY - THES A1 - Schober, Tilmann T1 - Erhöhte Calcium-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente - ein Mechanismus bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen T1 - Increased myofilament calcium sensitivity - a mechanism in the development of cardiac arrhythmias N2 - Die vorliegende Studie zeigt erstmals, dass eine erhöhte Ca2+-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente im Tiermodell einen selbstständigen Risikofaktor bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen darstellt. Dies konnte sowohl für chronische Erhöhung der Ca2+-Empfindlichkeit im Rahmen einer Familiären Hypertrophen Kardiomyopathie (FHK) als auch für eine akute Erhöhung mit Hilfe eines Ca2+-Sensitizers gezeigt werden. Die Ergebnisse der Arbeit bieten so eine mögliche Erklärung für plötzlichen Herztod bei bestimmten Patienten mit FHK. Sie schränken weiterhin den Einsatz von Ca2+-Sensitizern ein. Schließlich beleuchten sie einen bisher kaum untersuchten Aspekt in der Arrhythmogenese von Herzinsuffizienz und nach einem Myokard-Infarkt. Auf zellulärer Ebene findet sich ein veränderter Ca2+-Zyklus mit erniedrigten und verlangsamten Transienten. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich eine direkte Konsequenz der erhöhten Bindungsaffinität für Ca2+. Die Myofilamente sind „klebriger“ für Ca2+, während der Systole wird mehr Ca2+ gebunden, während der Diastole hingegen dissoziiert es langsamer. Bei adrenerger Stimulation und schnellen Herzfrequenzen mit entsprechender Verkürzung der Diastole kommt es zu erhöhtem diastolischem [Ca2+]i und zu erhöhten Ca2+-Inhalt des Sarkoplasmatischen Retikulums. Der so veränderte Ca2+-Zyklus führt wahrscheinlich mit Hilfe des Na+/Ca2+-Austauschers zu Veränderungen der Repolarisation des Aktionspotentials. Bei schnellen Herzfrequenzen treten Aktionspotential-Verlängerung, Ca2+-abhängige Nachdepolarisationen und getriggerte Schläge auf. Auf Organ-Ebene findet sich eine verkürzte Refraktärzeit. Damit sind sowohl ein Trigger als auch ein arrhythmogenes Substrat für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien gegeben. N2 - The present study shows for the first time that increased Ca2+-sensitity of the cardiac myofilaments is an indepent mechanism in the development of cardiac arrhythmias. This could be shown both for chronically increased Ca2+-sensitity in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy (FHC) and for acute drug-induced Ca2+-sensitization. The results provide an explanation for sudden cardiac death in certain patients with FHC. Moreover they limit the use of Ca2+-sensitizers. Furthermore they elucidate new aspects in the arrhythmogenesis of important aquired hearts diseases such as heart failure and myocardial infarction. On the cellular level the Ca2+-cycle is altered, Ca2+-transients show a smaller amplitude and slower rate of decay. These changes are probably a direct consequence of the increased Ca2+-puffering capacity. The myofilaments are “sticky” for Ca2+, durig systole more Ca2+ is bound while the dissociation during diastole is decelerated. With adrenergic stimulation and faster frequencies there is an increased diastolic [Ca2+]i and subsequently an Ca2+-overloading of the Sarcoplasmatic Reticulum. These changes in the Ca2+-cycle cause remodelling of the action potential repolarisation via the Na+-Ca2+-exchanger. At fast frequencies one finds action potential prolongation, Ca2+-dependent afterdepolarisations and triggered activity. On the organ level Ca+-sensitized hearts show a shortened refractory period. Thus there is both trigger and substrate for the observed ventricular arrhytrhmia. KW - Herzrhythmusstörung KW - Calcium KW - Troponin KW - Aktionspotenzial KW - EAD KW - Alternans KW - Hypertrophische Herzmuskelkrankheit KW - Natrium-Calcium-Austauscher KW - Calcium-bindende Proteine KW - MAP KW - Refraktärzeit KW - Elektrokardiogramm KW - Frank-Starling-Gesetz KW - Sekunde KW - Myofilament KW - FHK KW - plötzlicher Herztod KW - Sudden Cardiac Death Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33298 ER - TY - THES A1 - Sevastiadis, Emmanouil T1 - Mikrokernfrequenz peripherer Lymphozyten bei Dialyse- und Prädialysepatienten sowie bei gesunden Probanden nach in vitro Behandlung mit Methylmethansulfonat T1 - The micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes of patients on hemodialysis, of patients with advanced renal disease und healthy donors after in vitro treatment with methylmethanesulfonate. N2 - Nierenerkrankungen und die dazu gehörige Nierenersatztherapien spiegeln im Verlauf der letzten fünfzig Jahren die rasanten Entwicklungen der heutigen hochtechnisierten Medizin wider. Durch die zunehmende Lebenserwartung der Patienten unter langjährigen Blutreinigungsverfahren werden Probleme sichtbar, die vorher nicht zu erwarten waren, insbesondere ist hier die schwerwiegende Problematik der erhöhten Malignominzidenz in dieser Bevölkerungspopulation hervorzuheben. Die Ursachenforschung und die Prävention dieser erhöhten Malignominzidenz wird immer wichtiger. Die Zahl der Betroffenen steigt kontinuierlich. "Moderne" Erkrankungen wie Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie, die zur terminalen Niereninsuffizienz führen, haben die Dimension von Volkserkrankungen erreicht. Die Entstehung von Mikrokernen im Zellplasma neben dem eigentlichen Zellkern steht im dringendem Verdacht, dass sie einen Schritt in der Mutationsinduktion und Kanzerogenese darstellen und/oder diese Entwicklung anzeigen. Die Mikrokernfrequenz wird auch als Marker für eine akzidentelle oder chronische Schädigung des Genmaterials (z.B. nach beruflicher Exposition) genutzt. Auf zellulärer Ebene ist die Mikrokerninduktion auch Zeichen einer herabgesetzten Funktion der DNA-Repairmechanismen. Defekte dieser Mechanismen begünstigen nachgewiesenermaßen die Entstehung von Malignomen aller Art. Ziel der Arbeit war zu zeigen ob die in vivo beobachtete erhöhte Malignominzidenz bei Patienten unter Hämodialyse auch in Mikrokernfrequenzen abgebildet werden kann. Hier wurde die in vitro Behandlung mit einer bekannten kanzerogenen Substanz verwendet, um eine eventuell veränderte zelluläre Antwort in Form von gesteigerter Mikrokernfrequenzen in vitro zu provozieren. Dies wird als indirektes Zeichen der DNA-Repairfähigkeit angesehen. Als Substanz wurde Methylmethansulfonat verwendet. Die dafür modifizierte Methodik mit der Zusatz des kanzerogenen Methylmethansulfonat in Konzentrationen von 10, 20 und 40 µg/ml war ein zusätzlicher Stress für die Zellkulturen. Diese ließ aber in ausreichendem Maße die Vermehrung und Induktion von doppelkernigen Lymphozyten zu, so dass die Registrierung der Mikrokerne glaubhaft und repräsentativ war. Es wurden drei Gruppen von Probanden untersucht: Personen unter Dialyse, Patienten in einem Prädialysestadium und nierengesunde Probanden als Kontrollgruppe. Die Hämodialysepatienten zeigten keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollpatienten. Tendenziell erhöhte Mikrokernraten zeigten die Prädialysepatienten in allen Kategorien. Erwartungsgemäß war bei älteren Personen-Subgruppen eine gesteigterte Rate an in vitro induzierten Mikrokernen nach Erhöhung der kanzerogenen Substanzkonzentration zu finden. Es müssen sicherlich weitere Faktoren identifiziert werden, um den genetischen Schaden durch die verminderte DNA-Repairkapazität in Form von Mikrokernen zuverlässig abbilden zu können. Hier könnten eine Mindestdauer der Dialyse von 10 Jahren sowie ein Kreatininwert von über 5 mg/dl eine entscheidende Rolle spielen. N2 - End-stage renal disease (ESRD) patients on hemodialysis or renal transplantation patients have an increased incidence of cancer compared with the general human population. Various factors associated with renal failure and its therapeutic treatment may favour malignant transformation and cancer formation. The induction of micronuclei in cytoplasm is used as a marker of chronic or accidental genetic damage and is well established as a standard method for monitoring chromosome damage in human populations. The incidence of micronuclei seems to correlated with DNA repair processes. A reduced DNA repair capacity is associated with enhanced incidence of malignancy. This study investigated the spontaneous micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes of 10 patients on hemodialysis, 10 patients with advanced chronic renal failure (creatine level 3.0 mg/dl- 8.2 mg/dl) and 10 healthy non smoking donors in age- and sex-matched groups with the cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN assay) The micronuclei frequency has also been determinated after treatment of the lymphocytes culture with 10, 20 and 40 µg/ml of methyl methanesulfonate. The cultivation of these lymphocytes has shown reliable and representative results. There was no significant difference regarding the micronuclei frequency between the 3 groups. The group of patients with advanced chronic renal failure and the subgroup of long-term (more than 10 years) hemodialysis patients tended to show increased micronuclei frequencies in all age groups compared with all ESRD patients and the healthy control persons. In conclusion, more studies will have to be conducted in the future in order to identify the factors for an increased incidence of malignancy in those patients. KW - Hämodialyse KW - Mikrokerne KW - Mikrokernfrequenz KW - Hämodialyse KW - terminale Niereninsuffizienz KW - Cytochalasin-B micronucleus assay KW - Methymethansulfonat KW - micronuclei KW - end-stage renal disease KW - ESDR KW - cytokinesis-block micronucleus assay KW - methyl methanesulfonate Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33283 ER - TY - JOUR A1 - Banach, Katrin A1 - Bünemann, Moritz A1 - Hüser, Jörg A1 - Pott, Lutz T1 - Serum contains a potent factor that decreases \(\beta\)-adrenergic receptor-stimulated L-type Ca\(^{2+}\) current in cardiac myocytes N2 - No abstract available KW - Cardiac myocyte ; Beta-Receptor ; Muscarinic receptor ; cAMP ; G-protein ; Serum Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32027 ER - TY - THES A1 - Dorsch, Sandra T1 - Rezeptor-Rezeptor-Interaktion ß-adrenerger Rezeptoren T1 - Receptor-Receptor Interaction of ß-adrenergic Receptors N2 - Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden. N2 - Many membrane receptors exist as disulfide-bond dimers. In these cases dimerization is methodological clearly and easily provable. However, for most G-protein coupled receptors the postulated existence of di- or oligomerization nor their function is definitely demonstrated. Mostly, methods like co-immunoprecipitation and resonance energy transfer techniques like BRET and FRET were used to investigate protein-protein interactions. Despite their high sensitivity these methods have some limits and reveal sometimes distinct results regarding the occurrence of a protein-protein interaction depending on experimental approach and use of different controls. Neither the stability of the interaction nor the fraction of interacting proteins are determinable using resonance energy transfer assays. Furthermore the size of complexes is not or only technically difficult determinable. Therefore in this work a novel independent approach was developed to allow a more detailed investigation of receptor-receptor interactions in living cells. This method based on fluorescence recovery after photobleaching microscopy allows to determine the mobility of proteins. In order to measure homo-interactions between proteins two protein fractions with different mobility have to be distinguishable. Therefore one receptor fraction was extracellularly tagged with YFP and specifically immobilized using polyclonal antibodies against YFP. The other receptor fraction was intracellularly labeled with CFP or Cerulean and therefore not recognized by the extracellular antibodies. In this way using dual-color FRAP potential interactions between immobilized extracellularly-tagged receptors and intracellularly-tagged receptors were detectable due to a change of mobility of the latter. This method was validated using monomeric (CD86) and covalent dimeric (CD28) receptors. A specific immobilization of extracellularly-tagged proteins was achievable only by using polyclonal but not monoclonal antibodies against YFP. Intracellularly tagged proteins were not influenced in their mobility by extracellular antibodies. After immobilization of the extracellularly-labeled CD86 the coexpressed intracellularly-tagged CD86-CFP was still fully mobile. Furthermore the monomeric CD86 showed a relative CFP–YFP expression ratio independent mobility. This result led to the conclusion that extra- and intracellularly labeled CD86 did not interact with each other and exist as a monomer. The mobility of the covalent dimer CD28 however was depending on the relative CFP-YFP expression ratio and was in good agreement with theoretically expected values for a dimer. The application of the dual-color FRAP approach for the investigation of interactions between ß1- and ß2-adrenergic receptors showed differences between both receptor subtypes. ß1-AR exhibited a specific transient interaction, however ß2-AR existed as stable higher order oligomers. The transient interaction between ß1-AR and the stable higher order oligomerization of ß2-AR were not only observed in HEK 293T cells but also in neonatal rat cardiac myocytes and at 37°C. Furthermore the activation state of the respective receptor had no influence on the extent of the interaction. Between ß1- and ß2-AR only a weak and unstable hetero-interaction was observed using the dual-color FRAP approach. In order to control if a direct interaction between the adrenergic receptors is occurring the BRET method was applied. Using BRET a direct interaction between ß2-AR was observed, but it was not possible to distinguish between dimers and higher order oligomers. For ß1-AR a specific energy transfer occurred at higher YFP-Rluc expression ratios. At lower expression ratios the signal was in the unspecific range. Also the investigation of hetero-interactions between ß1- and ß2-AR revealed no clear conclusion about a specific interaction between both receptor subtypes. KW - Dimerisierung KW - FRAP KW - GPCR KW - ß-adrenerge Rezeptoren KW - BRET KW - FRAP KW - GPCR KW - ß-adrenergic Receptors KW - BRET Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39712 ER - TY - THES A1 - Humrich, Jan T1 - G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine T1 - G protein betagamma regulation by phosducin-like proteins N2 - Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert. N2 - Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated. KW - G-Proteine KW - Membranrezeptor KW - Regulation KW - Proteinfaltung KW - Phosphorylierung KW - Zellkultur KW - RNS-Interferenz KW - Proteinkinase A KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Proteinkinase CK2 KW - Immunoblot KW - Phosducin KW - Phosducin-like Proteine KW - CCT KW - TCP-1 alpha KW - Proteasom KW - WD 40 Repeat Proteins KW - Inhibition KW - Protein Folding KW - Protein Interaction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059 ER - TY - THES A1 - Hommers, Leif T1 - Modulation der Einwärtsgleichrichrichtung von GIRK-Kanälen durch G-Protein Untereinheiten T1 - Modulation of the rectification properties of GIRK channels by G Protein subunits N2 - G-Protein-gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kalium-Kanäle sind durch zwei Eigenschaften gekennzeichnet: (I) Die Leitfähigkeit für K+-Ionen ist positiv des Kalium-Gleichgewichtspotentials reduziert und (II) die Kanal-Aktivität wird durch Bindung von G betagamma-Dimere heterotrimerer Gi/o-Proteine reguliert. In der Literatur wurde die Aktivierung von GIRK-Kanälen als eine Zunahme ihrer Offenwahrscheinlichkeit unabhängig vom Membranpotential beschrieben. Die vorliegenden Untersuchungen zeigten, dass es bei starker Aktivierung des GIRK-Kanals durch G betagamma-Dimere auch zu einer Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung kommt. Im heterologen Expressionssystem konnte bei Rezeptor-Stimulation mit Agonist die Einwärtsgleichrichtung von GIRK-Kanälen abhängig von der Stärke der Koexpression von G betagamma-Dimeren geschwächt werden. Dieser Effekt entstand nicht durch eine Veränderung der Affinität, mit der Polyamine und Mg2+-Ionen den GIRK-Kanal membranpotentialabhängig blockieren. Die Kinetik, mit der Polyamine den GIRK-Kanal blockieren, war nicht verändert; eine Erhöhung der intrazellulären Mg2+-Konzentration um den Faktor 20 konnte eine Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung nicht mindern. Es wurde vermutet, dass eine Änderung der Konformation von Strukturen nahe des Selektivitätsfilters die Abschwächung der Einwärtsgleichrichtung verursacht. Gestützt wurde diese Vermutung zum einen dadurch, dass Ba2+- und Cs+-Ionen, die von extrazellulärer Seite her den Kanal an Strukturen nahe des Selektivitätsfilters blockieren können, unter schwach einwärtsgleichrichtenden Bedingungen eine geringere Bindungsaffinität hatten und zum anderen dadurch, dass das relative Ausmaß des GIRK-Kanal-Blocks durch Cs+-Ionen mit der Stärke der Einwärtsgleichrichtung korrelierte. N2 - G Protein-coupled inwardly rectifying potassium channels (GIRK channels) conduct K+ ions at membrane potentials negative of the potassium reversal potential and are activated by binding of G betagamma subunits of heterotrimeric Gi/o proteins. Activation of GIRK channels was described to be a process, which results in an increase in open probabilty independent of the membrane potential. The investigations of this thesis enhance this modell by supoorting evidence, that the degree of rectification becomes weakened upon strong GIRK channel activation. The weakened inward rectification was not associated with a shift in Mg2+ or polyamine binding affinities towards GIRK. It was concluded, that structeres close to the selectivity filter may be involved in the process, as proposed by the finding, that Cs+ and Ba2+ block (which is considered to take place near the selectivity filter) is less efficient in weakly inward rectifying GIRK channels. KW - GIRK KW - Einwärtsgleichrichtung KW - G Protein KW - Gi/o KW - G beta gamma KW - GIRK KW - Einwärtsgleichrichtung KW - G Protein KW - Gi/o KW - G beta gamma KW - GIRK KW - Inward Rectification KW - G Protein KW - Gi/o KW - G beta gamma Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40388 ER - TY - THES A1 - Schickinger, Stefanie T1 - Funktionsanalyse alpha2-adrenerger Rezeptoren auf molekularer und transgener Ebene T1 - Analysis of functions of alpha2-adrenergic receptors at molecular and transgenic levels N2 - alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt. N2 - alpha2-adrenergic receptors of which three different subtypes were cloned (alpha2A, alpha2B, alpha2C), are part of the family of G-protein coupled receptors and mediate many physiological functions of the transmitters adrenaline and noradrenaline. This study was initiated to determine whether receptor subtypes, their subcellular localization or the status of differentiation of a cell are responsible for the functional diversity of effects of alpha2-adrenergic receptors in vivo. In the first part of this project a transgenic mouse model was characterized, in which alpha2-adrenergic receptors were expressed under control of the dopamine-beta-hydroxylase-promotor in adrenergic neurons selectively. This model was used to test whether a single receptor subtype has identical functions in different neurons of the sympathetic nervous system in vivo. Transgenic alpha2A-adrenergic receptors inhibited the release of noradrenaline from sympathetic nerves in vivo, but not the exocytosis of adrenaline from the adrenal medulla. Therefore the question arose whether the functions of receptors are dependent on cell morphology, the status of differentiation of cells or the subcellular localization of receptors. To address this question, alpha2A-receptors were tagged with variants of the green fluorescent protein and investigated by means of FRET fluorescence microscopy. In PC12 rat pheochromocytoma cells which were stimulated by nerve growth factor to develop neurites, the conformational changes of alpha2A-adrenergic receptors upon agonist activation, however, did not dependent on the status of cellular differentiation or on the subcellular localization of receptors. Only in transiently transfected cells, higher agonist concentrations were necessary for the activation of receptors as determined by FRET microscopy. These findings demonstrate that the cellular context in which receptor subtypes are expressed play an essential role for their function. KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Adrenergisches System KW - Alpha-2-Rezeptor KW - Transgene Tiere KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - Sympathikus KW - Noradrenalin KW - Adrenalin KW - G-Protein-gekoppelter-Rezeptor KW - Dopamin-beta-Hydroxylase Promotor KW - Phäochromozytomzellen KW - G-protein coupled receptor KW - dopamine-beta-hydroxylase-promotor KW - pheochromocytoma cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31667 ER - TY - THES A1 - Fink, Kristin T1 - Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms T1 - Toxine in Nierenerkrankung und Dialyse Therapie : Genotoxisches Potential und Mechanismus N2 - In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes. N2 - Patienten, die an terminaler Niereninsuffizienz leiden und mittels Hämodialyse behandelt werden, weisen einen erhöhten Genomschaden auf. Dieser könnte ursächlich für die erhöhte Krebsinzidenz dieser Patientengruppe sein. Eine der möglichen Ursachen für den erhöhten Genomschaden stellt die Akkumulation genotoxischer Substanzen im Blut der Patienten dar. Diese Substanzen können prinzipiell aus zwei unterschiedlichen Quellen stammen. Erstens besteht die Möglichkeit, dass während der Dialyse Substanzen aus den Dialysatoren, dem Blutschlauchsystem oder gar aus verunreinigtem Dialysat in das Blut der Patienten übertreten. Zweitens führt der Verlust der Nierenfunktion zu einer stark verminderten Exkretion harnpflichtiger Substanzen. Diese Substanzen akkumulieren im Blut und bilden, sofern sie ein toxisches Potential besitzen, die Gruppe der so genannten urämischen Toxine. Einige dieser urämischen Toxine sind potentiell auch genotoxisch. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden exemplarische Vertreter der urämischen Toxine auf ihre genotoxische Wirkung hin untersucht (Homocstein, Homocystein-Thiolacton, Leptin, Advanced Glycation End-Products). Außerdem wurde analysiert, ob Substanzen aus Dialysatormembranen oder dem Blutschlauchsystem austreten und in in vitro-Toxizitätstests Effekte zeigen. Der Fokus der Analytik lag hierbei auf dem Nachweis von Bisphenol A, dem Hauptbestandteil verschiedener Kunststoffe die für Dialysatoren und Dialysatormembranen verwendet werden. KW - Bisphenol A KW - Homocystein KW - Extrakorporale Dialyse KW - Genomschaden KW - Urämische Toxine KW - bisphenol a KW - homocysteine KW - dialysis KW - genomic damage KW - uremic toxins Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082 ER - TY - JOUR A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, C. T1 - A closed inhalation system for pharmacokinetic and metabolism studies of volatile compounds with small laboratory animals N2 - In the inhalation system described an animal can be kept in the same atmosphere of a 2-liter desiccator for up to 24 h. The expired carbon dioxide is adsorbed with soda lime and the resulting reduced pressure is balanced by a supply of oxygen also used for the inflow of the chemical to be investigated. Urine and faeces can be collected ~eparately and the system allows a periodical control of the concentration of the chemical by sampling the air with needle and syringe. KW - Toxikologie Y1 - 1978 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80145 ER - TY - THES A1 - Baumann, Klaus T1 - Modulierende Effekte von Kaffee auf die Induktion von Mikrokernen durch mutagene Substanzen in Mauslymphomzellen L5178Y T1 - Coffee as an effect modifier of mutagenicity in L5178Y mouse lymphoma cells treated with mutages N2 - Kaffee, die in der westlichen Welt am häufigsten verwendete psychoaktive Substanz, erwies sich im Mikrokern-Testes an Maus-Lymphomzellen L 5178Y als modulierend auf bekannte mutagene Agentien. In dieser Arbeit wurde meist Instantkaffee verwendet, der gegen N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Mitomycin C (MMC), Genistein, und Methylmethansulfonat getestet wurde. Bei MMC und Genistein erwies sich Kaffee als antimutagen. Bei MNNG hatte Kaffee keinen klaren Einfluss auf die Gentoxizität, ebenso blieb die Kaffee-Wirkung bezüglich MMS unklar. Kaffee minderte dosisabhängig das Wachstum und die Überlebensrate von L 5178Y - Zellen. Es wurde die Frage nach den Ursachen der modulierenden Effekte diskutiert. Insbesondere wurde die Hypothese erörtert, dass für die Richtung der Modulation nicht so sehr die Konzentration des Kaffees, sondern die mutagene Potenz der koinkubierten Substanz eine entscheidende Rolle spielen könnte. Ggf. wirkt Kaffee - im Sinne eines "abhärtenden" Effektes - bei schwach mutagenen Substanzen anitmutagen, bei stark mutagenen Substanzen hingegen synergistisch mutagen. N2 - Coffee, the most commonly used psychoactive substance in the western hemisphere, was regarded as an effect modifier of mutagenicity in L5178Y mouse lymphoma cells treated with mutages. Mainly instant-coffee was tested against N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), mitomycin C (MMC), genistein, und methylmethanesulfonate (MMS). Coffee was antimutagen against mitomycin C (MMC) and genistein. No clearly influence was seen against MNNG or MMS. Dose-dependent Coffee reduces the growing and survival rate of L5178Y mouse lymphoma cells. The reasons for the modifying-effects of coffee were discussed. The hypothesis was found, that the concentration of the coffee ist not so influential in making antimutagene or mutagene effects, rather the mutagen power-factor of the coincubating substances. Coffee could be an “indurating” parameter: Causing antimutage effects in the presence of “gentle” mutagens, causing synergistic mutagen or zytotoxic effects in the presence of “strong” mutagens. KW - Kaffee KW - induzierte Mutation KW - Coffein KW - Antimutagen KW - Mutagen KW - Mauslymphomtest KW - Mauslymphomzellen L5178Y KW - Mikrokerne KW - Effekt-Modifizierung KW - Janus-Aktivität KW - coffee KW - caffeine KW - micronuclei KW - mouse lymphoma cells KW - mutagenicity KW - antimutagenicity Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36996 ER - TY - JOUR A1 - Bünemann, Moritz A1 - Pott, Lutz T1 - Membrane-delimited activation of muscarinic K current by an albumin-associated factor in guinea-pig atrial myocytes N2 - No abstract available KW - cardiac myocyte ; muscarinic K current ; G-protein ; Albumin ; serum Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31300 ER - TY - THES A1 - Rübeling, Karsten T1 - Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung von Adenosinrezeptoren in humanen Melanomzelllinien T1 - Identification and pharmacological characterization of adenosine receptors in human melanoma cell lines N2 - Adenosin steuert seine physiologische Funktionen über die vier G-Protein gekoppelten Adenosinrezeptoren A1, A2A, A2B und A3 und kann enormen Einfluss auf die Zellphysiologie und das Immunsystem haben. Hohe Adenosinkonzentrationen in Tumorgeweben haben das Interesse vieler Forschungsgruppen geweckt und den Nachweis von AR und dessen tumorfördernde sowie -hemmende Wirkung auf diverse Krebszellen nach sich gezogen. Melanome sind für 90% der letal ausgehenden Hautkrebsformen verantwortlich, da bereits kleinste Formen metastasieren können und vielmals eine rein chirurgische Therapie keine Heilung verspricht. Bei ungünstiger Prognose schränken adjuvante und systemische Therapieergänzungen die Lebensqualität erheblich ein. Auf der Suche nach gezielteren und schonenderen Therapieansätzen gilt es, die Rolle des Adenosins im Tumorgeschehen weiter aufzuklären, was den Nachweis und die Charakterisierung von AR und deren rezeptorspezifisch-gekoppelte Effekte voraussetzt. Daher sollten in der hier vorliegenden Arbeit die fünf humanen Melanomzelllinien A375, Brown, MV3, SK MEL23 und MEL2A auf die Expression von AR untersucht werden. Zu Beginn wurden die Zellen mit Hilfe von Bindungsexperimenten unter Einsatz radioaktiv markierter Liganden ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]ZM 241385) auf das Vorliegen der vier AR-Subtypen untersucht. A1- und A3-AR wurden nach Bindungsstudien mit [3H]CCPA bzw. [3H]HEMADO ausgeschlossen und nicht weiter untersucht. Durch Bindungsstudien mit [3H]ZM 241385 konnten in den Zellen Brown, MV3, SK-MEL23 und MEL2A geringe Mengen von A2B-Rezeptoren detektiert werden. Es folgten funktionelle Untersuchungen zur Stimulation der AC mit den Liganden NECA und CGS 21680 unter besonderem Blick auf die Differenzierung zwischen einer A2A- oder A2B vermittelten Stimulation. Ein NECA vermittelter Anstieg des c[32P]AMP im AC-Versuch bestätigte die Anwesenheit von A2B-Rezeptoren in den Zellen A375, Brown, MV3 und SK-MEL23. Durch CGS 21680 kam es hingegen zu keiner AC-Stimulation, was eine A2A-AR-Beteiligung ausschloss. Zur Bestätigung einer A2B gekoppelten AC-Aktivität wurde zum Abschluss der Versuche die Wirkung von drei selektiven Antagonisten (DPCPX, SCH 58261 und MRE 3008 F20) auf ein NECA induziertes cAMP-Signal überprüft. Mit den drei Antagonisten konnte an den Zelllinien A375, Brown und MV3 die für A2B-AR zu erwartende Wirkung nachgewiesen und damit die Expression von A2B-AR in diesen Zellen bestätigt werden. Die gewonnenen Daten können als Ausgangspunkt weiterführender Untersuchungen genutzt werden, um die Rolle von AR in Krebszellen besser zu verstehen. Sie könnten als Grundlage für die Suche nach potenziellen Angriffspunkten für neue Therapieansätze dienen und so einen Beitrag für Fortschritte in der Behandlung von Tumoren leisten. N2 - Adenosine regulates its physiological function through four G protein-coupled adenosine receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine can have a tremendous impact on cell physiology and the immune system. A high concentration of adenosine in tumour tissue has drawn the interest of many research groups which then led to the detection of AR and its tumour-promoting and tumour-inhibiting effect on various cancer cells. Melanomas are responsible for 90% of all fatal skin cancers since already the smallest types can metastasise and, in many cases, surgical treatment alone will prove insufficient. In case of an unfavourable prognosis, adjuvant and systemic additional therapeutic measures will considerably impair the patient’s quality of life. In the search for more targeted and gentle therapeutic approaches it is crucial to further investigate the role of adenosine in tumour development which implies the detection and characterisation of AR and their receptor-specific coupled effects. Hence, in this thesis, the five human melanoma cell lines A375, Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A will be tested for the expression of AR. In the beginning, the cells were tested for the presence of four AR-subtypes with the help of binding experiments employing radioactively marked ligands ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA and [3H]ZM 241385). A1- and A3-AR were excluded after binding studies with [3H]CCPA and [3H]HEMADO and were not further investigated. Binding studies with [3H]ZM 241385 showed that small amounts of A2B-receptors were detectable in the cell lines Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A. This was followed by functional analyses regarding the stimulation of the AC with the ligands NECA and CGS 21680. Particular attention was paid to a differentiation between an A2A- or A2B-induced stimulation. A NECA-induced increase of the c[32P]AMP in the AC-test confirmed the presence of A2B-receptors in the cell lines A375, Brown, MV3 and SK-MEL23. CGS 21680, however, did not cause an AC-stimulation, which excluded an A2A-AR-involvement. In order to confirm an A2B-coupled AC-activity, the impact of three selective antagonists (DPCPX, SCH 58261 and MRE 3008-F20) on a NECA-induced cAMP-signal was tested to complete testing. The expected impact for A2B-AR could be proven on the cell lines A375, Brown and MV3 with the three antagonists and thus confirming the expression of A2B-AR in these cells. The data obtained can be used as a basis for further investigating the role of AR in cancer cells. They could be used in the search forpotential points of application for new therapeutic approaches and thus contribute to making progress in the treatment of tumours. KW - Adenosin KW - Adenosinrezeptor KW - Adenosine KW - Adenosine receptor KW - Melanoma KW - Melanomzelllinien KW - Functional analyses KW - Human Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115137 ER - TY - THES A1 - Riese, Thorsten T1 - Analysen zur potentiellen Gentoxizität von Terahertzstrahlung in vitro T1 - Analyses concerning potential genotoxicity of terahertz radiation in vitro N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden immortalisierte humane Keratinozyten (HaCaT-Zelllinie) über eine Dauer von 24 Stunden mit Terahertzstrahlung der Frequenz 0,106 THz und einer Leistungsflussdichte von 2 mW/cm² behandelt und anschließend mittels „cytokinesis-block micronucleus cytome assay“ ausgewertet. Ferner wurden Proben der gleichen Zelllinie über einen Zeitraum von 24 Stunden Temperaturen zwischen 37 °C und 42 °C ausgesetzt und zum einen auf Hinweise für Gentoxizität mit Hilfe des Mikrokerntests untersucht und zum anderen mittels Western Blot die Expressionsrate von Hitzeschockproteinen der 70 kDa Familie bestimmt. Die der Terahertzstrahlung ausgesetzten Zellen zeigten gegenüber den Kontrollen keine signifikanten Veränderungen der Marker für chromosomale Aberrationen oder der Zellteilung. Die der erhöhten Temperatur ausgesetzten Zellen zeigten einen signifikanten Anstieg der Mikrokernraten und weiterer Marker für Gentoxizität sowie eine damit korrelierende Zunahme der synthetisierten Proteinmenge der Hsp70 Proteine im Rahmen der Hitzeschockreaktion. N2 - In this dissertation HaCaT human keratinocytes were exposed to terahertz radiation (0.106 THz) and to different temperatures from 37 °C to 42 °C for 24 hours. Using the “cytokinesis-block micronucleus cytome assay” the appearance of different markers of genomic damage was analysed and compared to negative controls. Furthermore the heat-induced expression rate of the heat shock protein 70 was determined between 37 °C and 42 °C. The cells exposed to terahertz radiation showed no statistically significant elevation of genomic damage markers or change of proliferation compared to the controls. The hyperthermia-treated cells showed significantly increased micronucleus frequencies and an elevated heat-shock protein expression for temperatures above 37 °C. KW - Terahertzbereich KW - Gentoxizität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Terahertzstrahlung KW - Gentoxizität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - terahertz radiation KW - genotoxicity KW - non-ionizing radiation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116469 ER - TY - JOUR A1 - Agarwal, Shailesh R. A1 - Yang, Pei-Chi A1 - Rice, Monica A1 - Singer, Cherie A. A1 - Nikolaev, Viacheslav O. A1 - Lohse, Martin J. A1 - Clancy, Colleen E. A1 - Harvey, Robert D. T1 - Role of Membrane Microdomains in Compartmentation of cAMP Signaling JF - PLOS ONE N2 - Spatially restricting cAMP production to discrete subcellular locations permits selective regulation of specific functional responses. But exactly where and how cAMP signaling is confined is not fully understood. Different receptors and adenylyl cyclase isoforms responsible for cAMP production are not uniformly distributed between lipid raft and non-lipid raft domains of the plasma membrane. We sought to determine the role that these membrane domains play in organizing cAMP responses in HEK293 cells. The freely diffusible FRET-based biosensor Epac2-camps was used to measure global cAMP responses, while versions of the probe targeted to lipid raft (Epac2-MyrPalm) and non-raft (Epac2-CAAX) domains were used to monitor local cAMP production near the plasma membrane. Disruption of lipid rafts by cholesterol depletion selectively altered cAMP responses produced by raft-associated receptors. The results indicate that receptors associated with lipid raft as well as non-lipid raft domains can contribute to global cAMP responses. In addition, basal cAMP activity was found to be significantly higher in non-raft domains. This was supported by the fact that pharmacologic inhibition of adenylyl cyclase activity reduced basal cAMP activity detected by Epac2-CAAX but not Epac2-MyrPalm or Epac2-camps. Responses detected by Epac2-CAAX were also more sensitive to direct stimulation of adenylyl cyclase activity, but less sensitive to inhibition of phosphodiesterase activity. Quantitative modeling was used to demonstrate that differences in adenylyl cyclase and phosphodiesterase activities are necessary but not sufficient to explain compartmentation of cAMP associated with different microdomains of the plasma membrane. KW - protein-coupled-receptors KW - adenylyl-cyclase isoforms KW - adult cardiac myocytes KW - plasma membrane KW - lipid rafts KW - cholesterol depletion KW - BETA(2)-adrenergic receptor KW - living vells KW - cyclic-AMP KW - domains Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116673 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Brand, Susanne A1 - Amann, Kerstin A1 - Mandel, Philipp A1 - Zimnol, Anna A1 - Schupp, Nicole T1 - Oxidative DNA Damage in Kidneys and Heart of Hypertensive Mice Is Prevented by Blocking Angiotensin II and Aldosterone Receptors JF - PLOS ONE N2 - INTRODUCTION: Recently, we could show that angiotensin II, the reactive peptide of the blood pressure-regulating renin-angiotensin-aldosterone-system, causes the formation of reactive oxygen species and DNA damage in kidneys and hearts of hypertensive mice. To further investigate on the one hand the mechanism of DNA damage caused by angiotensin II, and on the other hand possible intervention strategies against end-organ damage, the effects of substances interfering with the renin-angiotensin-aldosterone-system on angiotensin II-induced genomic damage were studied. METHODS: In C57BL/6-mice, hypertension was induced by infusion of 600 ng/kg • min angiotensin II. The animals were additionally treated with the angiotensin II type 1 receptor blocker candesartan, the mineralocorticoid receptor blocker eplerenone and the antioxidant tempol. DNA damage and the activation of transcription factors were studied by immunohistochemistry and protein expression analysis. RESULTS: Administration of angiotensin II led to a significant increase of blood pressure, decreased only by candesartan. In kidneys and hearts of angiotensin II-treated animals, significant oxidative stress could be detected (1.5-fold over control). The redox-sensitive transcription factors Nrf2 and NF-κB were activated in the kidney by angiotensin II-treatment (4- and 3-fold over control, respectively) and reduced by all interventions. In kidneys and hearts an increase of DNA damage (3- and 2-fold over control, respectively) and of DNA repair (3-fold over control) was found. These effects were ameliorated by all interventions in both organs. Consistently, candesartan and tempol were more effective than eplerenone. CONCLUSION: Angiotensin II-induced DNA damage is caused by angiotensin II type 1 receptor-mediated formation of oxidative stress in vivo. The angiotensin II-mediated physiological increase of aldosterone adds to the DNA-damaging effects. Blocking angiotensin II and mineralocorticoid receptors therefore has beneficial effects on end-organ damage independent of blood pressure normalization. KW - aldosterone KW - oxidative stress KW - transcription factors KW - kidneys KW - heart KW - hypertension KW - DNA damage KW - blood pressure Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118011 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Claßen, Alexandra T1 - The ERK-cascade in the pathophysiology of cardiac hypertrophy T1 - Die ERK-Kaskade in der Pathophysiologie der Herzhypertrophie N2 - ERK1/2 are known key players in the pathophysiology of heart failure, but the members of the ERK cascade, in particular Raf1, can also protect the heart from cell death and ischemic injury. An additional autophosphorylation (ERK1 at Thr208, ERK2 at Thr188) empowers ERK1/2 translocation to the nucleus and phosphorylation of nuclear targets which take part in the development of cardiac hypertrophy. Thereby, targeting this additional phosphorylation is a promising pharmacological approach. In this thesis, an in silico model of ERK cascade in the cardiomyocyte is introduced. The model is a semi-quantitive model and its behavior was tested with different softwares (SQUAD and CellNetAnalyzer). Different phosphorylation states of ERK1/2 as well as different stimuli can be reproduced. The different types of stimuli include hypertrophic as well as non-hypertrophic stimuli. With the introduced in-silico model time courses and synergistic as well as antagonistic receptor stimuli combinations can be predicted. The simulated time courses were experimentally validated. SQUAD was mainly used to make predictions about time courses and thresholds, whereas CNA was used to analyze steady states and feedback loops. Furthermore, new targets of ERK1/2 which partially contribute, also in the formation of cardiac hypertrophy, were identified and the most promising of them were illuminated. Important further targets are Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 and SPIN90. Cardiomyocyte gene expression data sets were analyzed to verify involved components and to find further significantly altered genes after induced hypertrophy with TAC (transverse aortic constriction). Changes in the ultrastructure of the cardiomyocyte are the final result of induced hypertrophy. N2 - ERK1/2 sind bekannte Schlüsselfiguren bei der Entstehung der Herzinsuffizienz. Weitere Komponenten der ERK-Kaskade, insbesondere Raf1, können das Herz jedoch vor Zelltod und ischämischem Schaden schützen. Eine zusätzliche Autophosphorylierung von ERK1 an Thr208 bzw. von ERK2 an Thr188 ermöglicht ERK1/2 die Translokation zum Zellkern und befähigt ERK dort zur Phosphorylierung von nukleosolischen Zielproteinen, welche eine Herzmuskelhypertrophie auslösen. Daher erscheint diese zusätzliche Autophosphorylierung als eine vielversprechende pharmakologische Zielstruktur. In dieser Arbeit wird ein in-silico Modell der ERK-Kaskade im Kardiomyozyten präsentiert. Das Modell ist ein semi-quantitatives Modell und wurde mit den Programmen SQUAD und CellNetAnalyzer getestet. Verschiedene Phosphorylierungs-Zustände von ERK1/2 als auch verschiedene Stimuli (hypertrophe als auch nicht-hypertrophe) können mit dem Modell reproduziert werden. Mit dem präsentierten in-silico Modell können sowohl zeitliche Abläufe als auch synergistische und antagonistische Effekte vorhergesagt werden. Die simulierten zeitlichen Abläufe wurden durch in-vitro Experimente validiert. SQUAD wurde hauptsächlich für die Modellierung von zeitlichen Abläufen und Schwellenwerte genutzt, wohingegen CellNetAnalyzer vor allen Dingen zur Analyse von Fließgleichgewichten und Rückkopplungs-Mechanismen genutzt wurde. Darüberhinaus wurden Zielstrukturen von ERK1/2, welche zusätzlich an der Entstehung der Herzhypertrophie mitwirken, identifiziert. Diese umfassen unter anderem Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 und SPIN90. Gen-Expressions-Datensätze von Kardiomyozyten nach TAC (transverse aortic constriction) wurden analysiert. Diese wurden mit den im Model vorhandenen Strukturen verglichen und signifikant veränderte Expressionslevel wurden identifiziert. Veränderungen der Ultrastruktur des Kardiomyozyten sind das Ergebnis der induzierten Hypertrophie. KW - Herzhypertrophie KW - Systembiologie KW - ERK-cascade KW - ERK-Kaskade KW - cardiac hypertrophy KW - in-silico model KW - In-silico Modell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229664 ER - TY - JOUR A1 - Frey, Anna A1 - Gassenmaier, Tobias A1 - Hofmann, Ulrich A1 - Schmitt, Dominik A1 - Fette, Georg A1 - Marx, Almuth A1 - Heterich, Sabine A1 - Boivin-Jahns, Valérie A1 - Ertl, Georg A1 - Bley, Thorsten A1 - Frantz, Stefan A1 - Jahns, Roland A1 - Störk, Stefan T1 - Coagulation factor XIII activity predicts left ventricular remodelling after acute myocardial infarction JF - ESC Heart Failure N2 - Aims Acute myocardial infarction (MI) is the major cause of chronic heart failure. The activity of blood coagulation factor XIII (FXIIIa) plays an important role in rodents as a healing factor after MI, whereas its role in healing and remodelling processes in humans remains unclear. We prospectively evaluated the relevance of FXIIIa after acute MI as a potential early prognostic marker for adequate healing. Methods and results This monocentric prospective cohort study investigated cardiac remodelling in patients with ST-elevation MI and followed them up for 1 year. Serum FXIIIa was serially assessed during the first 9 days after MI and after 2, 6, and 12 months. Cardiac magnetic resonance imaging was performed within 4 days after MI (Scan 1), after 7 to 9 days (Scan 2), and after 12 months (Scan 3). The FXIII valine-to-leucine (V34L) single-nucleotide polymorphism rs5985 was genotyped. One hundred forty-six patients were investigated (mean age 58 ± 11 years, 13% women). Median FXIIIa was 118 % (quartiles, 102–132%) and dropped to a trough on the second day after MI: 109%(98–109%; P < 0.001). FXIIIa recovered slowly over time, reaching the baseline level after 2 to 6 months and surpassed baseline levels only after 12 months: 124 % (110–142%). The development of FXIIIa after MI was independent of the genotype. FXIIIa on Day 2 was strongly and inversely associated with the relative size of MI in Scan 1 (Spearman’s ρ = –0.31; P = 0.01) and Scan 3 (ρ = –0.39; P < 0.01) and positively associated with left ventricular ejection fraction: ρ = 0.32 (P < 0.01) and ρ = 0.24 (P = 0.04), respectively. Conclusions FXIII activity after MI is highly dynamic, exhibiting a significant decline in the early healing period, with reconstitution 6 months later. Depressed FXIIIa early after MI predicted a greater size of MI and lower left ventricular ejection fraction after 1 year. The clinical relevance of these findings awaits to be tested in a randomized trial. KW - blood coagulation factor XIII KW - ST-elevation myocardial infarction KW - healing and remodelling processes KW - cardiac magnetic resonance imaging Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236013 VL - 7 IS - 5 ER - TY - THES A1 - Kramer, Sofia T1 - Hemmung pathologischer kardialer Hypertrophie über das Dimer-Interface von ERK1/2 T1 - Inhibition of pathological cardiac hypertrophy by the dimer interface of ERK1/2 N2 - Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden. N2 - The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) have a central role in cardiac hypertrophy and cell survival. Hypertrophic stimuli activate ERK1/2, trigger ERK dimerization and subsequently ERKT188-autophosphorylation. This newly discovered autophosphorylation is a prerequisite for nuclear ERK1/2 translocation and leads to the development of pathological cardiac hypertrophy. As the ERK dimer interface is a potential target to selectively interfere with nuclear ERK1/2 signaling, we investigated whether the interference with ERK dimerization may serve as a therapeutic strategy to prevent pathological cardiac hypertrophy. For this, we generated ERK2 mutants and peptide constructs that interfere with ERK dimerization. These constructs were evaluated in various cell types by their effects on nuclear ERK translocation and dimerization by fluorescence microcopy, co-immunoprecipitation and Duolink proximity ligation assays. We showed that the peptides indeed prevented ERK-ERK interaction in response to phenylephrine and/or carbachol stimulation. In addition, the peptides prevented ERKT188-phosphorylation and interfered with all ERK1/2 effects that are associated with ERKT188-phosphorylation e.g. nuclear ERK translocation and cardiomyocyte hypertrophy. Interestingly, the peptide did not inhibit the general activation of ERK1/2. These data indicate that the ERK dimer interface is a valuable target for selective inhibition of nuclear ERK1/2 signaling, that is able to effectively attenuate ERK1/2 mediated cardiomyocyte growth but without impairing cell survival. KW - Dimerisierung KW - Herzhypertrophie KW - Interferenz KW - MAP-Kinase KW - ERK1/2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233739 ER - TY - THES A1 - Brand, Susanne T1 - Oxidativer Stress und DNA-Schäden induziert durch das Peptidhormon Angiotensin II in vivo : Identifizierung des AT1-Rezeptors und reaktiver Sauerstoffspezies als ursächliche Faktoren T1 - Oxidative Stress and DNA damage mediated via Angiotensin II in vivo N2 - Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck und den Wasser- und Elektrolythaushalt des Körpers. Angiotensin II (Ang II), das aktive Peptid des RAAS, bewirkt eine Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen Bluthochdruck. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine Verbindung zwischen Hypertonie und dem gehäuften Auftreten von Krebs besteht. Eine Metaanalyse von 13 Fall-Kontroll-Studien konnte einen Zusammenhang zwischen Hypertonie und einem erhöhten Risiko, an einem Nierenzellkarzinom zu erkranken nachweisen. In vitro-Studien und Studien an der isolierten Niere konnten bereits genotoxische Effekte des blutdruckregulierenden Hormons Ang II zeigen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, zunächst in vivo zu prüfen, ob steigende Ang II-Konzentrationen einen Einfluss auf die genomische Stabilität von Nieren- und Herzzellen besitzen. Hierzu wurden im Dosisversuch männliche C57BL/6-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die Ang II in vier verschiedenen Konzentrationen zwischen 60 ng/kg min und 1 µg/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgeben sollten. Während des Versuchszeitraums fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an der Maus statt. Die Behandlung mit Ang II führte zu einem signifikanten Anstieg des Blutdrucks und zu histopathologischen Veränderungen der Glomeruli und des Tubulussystems, was sich in einer verschlechterten Albumin-Ausscheidung wiederspiegelte. Außerdem induzierte die Behandlung mit Ang II die dosisabhängige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, DNA-Doppelstrangbrüchen und oxidativer DNA-Schäden. Diese Parameter waren bereits in Tieren erhöht, die keinen Bluthochdruck entwickelten und stiegen mit der höchsten Ang II-Konzentration noch an, obwohl hier im Vergleich zur Vorgängergruppe, die eine geringere Ang II-Konzentration erhielt, kein höherer Blutdruck vorlag. Diese Beobachtung deutet auf eine mögliche Unabhängigkeit des entstandenen Schadens vom Bluthochdruck hin und lenkt die Aufmerksamkeit auf Ang II als genomschädigenden Faktor. Der folgende Interventionsversuch sollte Aufschluss über die mögliche blutdruckunabhängige genomschädigende Wirkung von Ang II geben. Dazu wurden C57BL/6-Mäuse neben der Ang II-Behandlung in einer Konzentration von 600 ng/kg min zusätzlich über einen Zeitraum von 28 Tagen mit 5 verschiedenen Substanzen behandelt: Candesartan, Ramipril, Hydralazin, Eplerenon und Tempol. Candesartan ist ein Ang II-Rezeptor-Antagonist, der selektiv den AT1-Rezeptor blockiert. Ramipril wirkt als Hemmer des Angiotensin-Konversions-Enzyms und verhindert die Bildung von endogenem Ang II aus Ang I. Hydralazin, als Vasodilatator, greift nicht in das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ein. Eplerenon blockiert als selektiver Aldosteronantagonist den Mineralkortikoidrezeptor. Tempol wirkt als Antioxidans. Die Behandlung mit Ang II in einer Konzentration von 600 ng/kg min im Interventionsversuch führte zur Hochregulierung der NADPH-Oxidase 4 und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in der Niere und im kardiovaskulären Gewebe. Der entstandene oxidative Stress führte wiederum zu DNA-Schäden und einer Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Nrf2 und NF-B. Nrf2-vermittelt wurde die Induktion antioxidativer Gene ausgelöst, was allerdings nicht ausreichend war, um vor Ang II-induzierten ROS und DNA-Schäden zu schützen. Eine längerfristige NF-B-Aktivierung durch hohe Ang II-Spiegel kann das Überleben und die Proliferation von Zellen, die DNA-Schäden in Form von Doppelstrangbrüchen tragen, fördern, was eine Tumor-initiierende Wirkung haben könnte. Die beschriebenen Effekte erhöhter Ang II-Spiegel konnten durch die Intervention mit dem AT1-Rezeptorblocker Candesartan verhindert werden, was die Beteiligung des Rezeptors nachweist. Eine blutdruckunabhängige, genomschädigende Wirkung von Ang II konnte leider durch die Intervention mit Hydralazin nicht verdeutlicht werden, da die erwünschte langfristige Blutdrucksenkung ausblieb. Allerdings zeigte die Intervention mit Tempol eine Abnahme an oxidativem Stress und DNA-Schäden trotz ausbleibender Blutdrucksenkung. Die Bedeutung von ROS in der Bildung von DNA-Schäden und die Unabhängigkeit dieser Schäden vom Blutdruck konnten somit hervorgehoben werden. Die Tatsache, dass die Intervention mit Ramipril den Blutdruck nicht senken konnte, der oxidative Stress und die DNA-Schäden durch mögliche antioxidative Eigenschaften aber vermindert wurden, unterstützt diese Beobachtung. Die Intervention mit Eplerenon führte zum Teil zu einer Verminderung an ROS und DNA-Schäden, brachte diese Parameter aber nicht auf Kontrollniveau zurück. Somit ist eine Beteiligung von Aldosteron nicht auszuschließen. N2 - The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) regulates blood pressure, water balance and electrolyte metabolism. Angiotensin II (Ang II), the reactive peptide of RAAS, causes vasoconstriction and, in higher concentrations, increased blood pressure. Epidemiological studies found an increased cancer incidence in hypertensive patients. A meta-analysis of 13 longitudinal studies revealed a connection between hypertension and a higher risk to develop kidney cancer. In vitro studies and studies of the isolated mouse kidney already showed genotoxic effects of Ang II. First, the aim of the study was to investigate in vivo the effect of increasing concentrations of Ang II on the genomic stability of kidney and heart cells. Therefore, male C57/BL6 mice were equipped with osmotic mini pumps, delivering Ang II in four different concentrations between 60 ng/kg min and 1 µg/kg min during 28 days. During the 4 weeks blood pressure was measured non-invasively. Treatment with Ang II raised the blood pressure significantly and led to histopathological changes of glomeruli and tubuli, reflecting an impaired albumin-excretion. Furthermore, the formation of reactive oxygen species (ROS), DNA double strand breaks and oxidative DNA damage was induced dose-dependently by Ang II. These parameters were already increased in animals with normal blood pressure and were further increased by the highest Ang II concentration, although blood pressure was not higher than in the precursor group, which received less Ang II. These observations might hint to a possible independency of the Ang II-induced damage from the blood pressure, focusing on Ang II as the genotoxic substance. The following intervention experiment was conducted to investigate the possible blood pressure independent genotoxic effects of Ang II. Besides the treatment with Ang II in a concentration of 600 ng/kg min, C57BL/6 mice were additionally treated with 5 different interventions: candesartan, an AT1 receptor antagonist, ramipril, a angiotensin-converting-enzyme blocker, hydralazine, a vasodilator, eplerenone, a mineralocorticoid receptor blocker and tempol, an antioxidant. In the intervention experiment, Ang II treatment in a concentration of 600 ng/kg min caused an up-regulation of NOX 4 resulting in the production of ROS in the kidney and heart. The oxidative stress led to the formation of DNA damage and to an activation of the transcription factors Nrf2 and NF-B. The induction of Nrf2 was accompanied by up-regulation of antioxidative enzymes, which, however, were not able to defend against ROS-production and DNA damage. A long-term activation of NF-B by high Ang II levels can promote the survival and proliferation of cells with DNA damage in form of DNA double strand breaks, probably initiating carcinogenesis. The AT1 receptor blocker candesartan could prevent the Ang II-induced damage, demonstrating the involvement of the Ang II receptor. The intervention with hydralazine failed to show a genotoxic effect of Ang II independent of the blood pressure, since a long-term decrease of blood pressure was missing. However, despite of the high blood pressure, the intervention with tempol was able to prevent oxidative stress and DNA-damage. The importance of ROS in the formation of DNA damage and an independency of this damage from the increased blood pressure was shown. The fact that, although not lowering blood pressure, ramipril was able to reduce oxidative stress and DNA damage by possible antioxidative properties, supported this observation. Eplerenone led to slight decrease in ROS and DNA damage showing the possible involvement of aldosterone. Ang II contributes to damage detected in the kidney and in the heart during high blood pressure, probably initiating cancer. The involvement of ROS for the formation of DNA damage and the independency of this damage from the increased blood pressure was shown by the effects of the antioxidant tempol. We could demonstrate that the importance of an AT1 receptor antagonist in the treatment of high blood pressure plays a leading role. Compared to other antihypertensive therapies, treatment with a sartan is the best option. Starting at an early stage with this therapy, a long-term damage, induced by Ang II, could be avoided. KW - Oxidativer Stress KW - Hypertonie KW - DNS-Schädigung KW - Angiotensin II KW - Hypertension KW - DNA-Schäden KW - Angiotensin II KW - oxidativer Stress KW - hypertension KW - DNA-damage KW - Angiotensin II KW - oxidative stress Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77573 ER - TY - THES A1 - Kannen Cardoso, Vinicius T1 - The role of Fluoxetine against preneoplastic lesions and tumors in colon tissue T1 - Die Rolle von Fluoxetin gegen präneoplastische Läsionen und Tumoren im Darmgewebe N2 - Introduction: Colon cancer is one of the major human malignancies worldwide, and much effort has been applied to understand the process of colon carcinogenesis, as well as the role of potential treatments and co-therapeutical agents against it. A growing body of evidence suggests that the use of fluoxetine (FLX), an antidepressant belonging to the selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), may be associated with a reduced colon cancer risk. However, controversial opinions have been published and an identification of the mechanisms of the activity of FLX on colon cells would help in the clarification of this controversy. Objectives: Using several in vitro and in vivo-based methods and analyses, we aimed to verify whether FLX has antioxidant, pro-oxidant or DNA-damaging potential in standard toxicological assays; to check whether and how FLX could prevent and reduce colon preneoplastic lesions; to ascertain whether FLX has any oncostatic potential against colon tumors; and, to investigate whether FLX activity could be comparable with a known and current applied chemotherapeutic agent against colon cancer. Results: FLX did not have any antioxidant potential in our experiments. Although it did not induce reactive oxygen species (ROS) generation or DNA-damage in fibroblast and colon tumor cell lines, FLX reduced dysplasia and proliferation in two different carcinogen models. Further, a significant decrease in colon stromal reactivity and angiogenesis was found in both carcinogen-induced preneoplasia models. In a xenograft model of colon cancer, FLX shrank tumors, reduced tumor proliferation, arrested cancer cells at the G0/G1 cell-cycle phase, and took ROS generation under control. Such effects were detected together with an intracellular acidification and loss of mitochondrial membrane potential in FLX-treated cells. Modulating mitochondrial respiratory chain, HIF-1 expression and Akt/mTOR signaling pathway, FLX was found to reduce colon tumors similar to the widely used chemotherapeutic agent 5-Fluoracil activity. Conclusion: Our collective data suggest that FLX is a remarkable chemopreventive and oncostatic agent against colon preneoplastic lesions and tumors, acting without DNA-damage or ROS generation. N2 - Einleitung: Darmkrebs ist eine der wichtigsten menschlichen Tumorarten weltweit und viel Aufwand wurde unternommen, um den Prozess der Colonkarzinogenese, sowie die Rolle der möglichen Behandlungen und Co-therapeutische Mittel zu verstehen. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deuted darauf hin, dass die Verwendung von Fluoxetin (FLX), einem Antidepressivum aus der Klasse der selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs), mit einem reduzierten Dickdarmkrebs-Risiko verbunden sein kann. Allerdings sind auch kontroverse Meinungen veröffentlicht worden und eine Identifizierung der Mechanismen der Aktivität von FLX auf Darmzellen würde bei der Klärung dieser Kontroverse helfen. Ziele: Mit in vitro-und in vivo-Methoden wollten wir prüfen, ob FLX antioxidatives, prooxidatives oder DNA-schädigendes Potential in Standard-toxikologischen Untersuchungen hat; des weiteren sollte analysiert werden, ob und wie FLX präneoplastischen Läsionen verhindern und reduzieren kann, sowie ob FLX onkostatisches Potenzial gegen Darmtumoren hat. Letzteres sollte im direkten Vergleich mit dem etablierten Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil untersucht werden. Ergebnisse: FLX zeigte keine direkte antioxidative Kapazität in unseren Testsystemen. Obwohl es keine Bildung reaktiver Sauerstoffspecies (ROS) und keine Induktion von DNA-Schaden in Fibroblasten und Kolon Tumorzellinien verursachte, reduzierte FLX Dysplasien und Proliferation in zwei verschiedenen Kanzerogen-Modellen in vivo. Ferner wurde eine signifikante Abnahme der Reaktivität der Stromazellen und von Angiogenese in beiden Karzinogen-induzierten Präneoplasie-Modellen gefunden. In einem Xenograft Modell des Kolonkarzinoms brachte FLX die Tumoren durch verringerte Proliferation zum Schrumpfen. In vitro wurde in den entsprechenden Zellinien eine Anreicherung der Zellen in der Ga0/G1 Zellzyklus-Phase, eine Reduktion Hypoxie-verursachter ROS-Bildung, intrazelluläre Ansäuerung und Velust des mitochondrialen Membranpotentials nach FLX-Behandlung gefunden. Weitere Aktivitäten waren auf die mitochondriale Atmungskette, HIF-1 Expression und den Akt/mTOR-Sinalweg zu beobachten. Die Reduktion der Kolontumoren war der mit 5-Fluoruracil erzielten vergleichbar. Schlussfolgerung: Unsere Daten deuten darauf hin, dass FLX eine bemerkenswerte chemopräventive und onkostatischen Aktivität gegen präneoplastische Läsionen und Tumore im Darm aufweist, die ohne Induktion von DNA-Schäden ROS stattfindet. KW - Fluoxetin KW - Magenkrebs KW - Fluoxetine KW - Colon cancer Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77589 ER - TY - THES A1 - Kämpf, Anne Kristina T1 - Does methylphenidate cause a cytogenetic effect in children with attention deficit hyperactivity disorder? T1 - Zytogenetische Veränderungen durch Methylphenidat bei Kindern mit ADHS? N2 - MPH wird seit über 50 Jahren zur Therapie des ADHS eingesetzt. Gerade in den letzten Jahren wurde deutlich, dass der Einsatz ohne fundierte Kenntnis über mögliche Langzeit-effekte erfolgte, da zum Zeitpunkt der Zulassung aufgrund der begrenzten technischen Möglichkeiten weniger strenge und weniger umfassende Einschränkungen beachtet wer-den mussten (Walitza, Werner et al. 2007). Da in den letzten Jahren die Anzahl der verschrieben Tagesdosen MPH sprunghaft anstiegen, ist es wichtig, auch die langfristigen Nebenwirkungen von MPH zu untersuchen (Janhsen 2007). Eine Studie von El-Zein et al. von 2005 brachte die Frage auf, ob MPH eventuell Genomschäden hervorrufe. Bei 11 von 12 untersuchten Kindern wurde unter der Therapie mit MPH um das 2,4fache erhöhte Mikrokernfrequenzen gefunden (El-Zein, Abdel-Rahman et al. 2005). Dies beunruhig-te vor allem im Hinblick auf das mit erhöhten Mikrokernfrequenzen korrelierte erhöhte Karzinomrisiko. Eine daraufhin von Walitza et al. durchgeführte Studie, die ebenfalls Mikrokernfrequenzen in peripheren Blutzellen untersuchte (Walitza, Werner et al. 2007), konnte keine Hinweise auf eine Genomschädigung durch MPH erbringen. Zahlreiche weitere Untersuchungen zur potentiellen Genomschädigung durch MPH konnten die Ergebnisse durch in vivo- oder in vitro-Studien nicht bestätigen und kritisierten die ge-ringe Stichprobengröße sowie mangelnde Transparenz der Arbeit von El-Zein (Preston, Kollins et al. 2005; El-Zein, Hay et al. 2006; Holtmann, Kaina et al. 2006; Suter, Martus et al. 2006). Da jedoch keine weitere Studie sich konkret mit zytogenetischen Effekten in peripheren Blutzellen befasste, soll die vorliegende Arbeit dazu dienen, den Verdacht einer Genomschädigung endgültig auszuräumen (Walitza, Kampf et al. 2009). Dazu wurde eine größere Gruppe von Kindern eingeschlossen, sowie Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten während der MPH-Einnahme, bis hin zu Untersuchungen nach einem Zeitraum von 12 Monaten der MPH- Einnahme, durchgeführt. Mit Hilfe eines Mikrokerntestes wurden in der vorliegenden Studie versucht, DNS-Schäden an periphe-ren Lymphozyten zu bestimmen, um daraus auf ein potentiell erhöhtes Krebsrisiko schließen zu können. Im Vergleich mit einer gesunden Kontrollgruppe waren die Werte von ADHS-Kindern ohne MPH-Therapie sowie nach 3 und 12 Monaten MPH-Therapie zwar signifikant er-höht, diese gesunde Kontrollgruppe wies jedoch im Vergleich mit internationalen Refe-renzwerten eine extrem niedrige Mikrokernfrequenz auf, so dass davon ausgegangen werden muss, dass diese Vergleiche nur begrenzte Aussagekraft haben. In keiner der verschiedenen mit MPH therapierten Gruppen konnten über die Dauer der Einnahme eine signifikant Erhöhung der Mikrokernfrequenzen im Vergleich zu den Werten vor Einnahmebeginn nachgewiesen werden, was den Schluss zulässt, dass eine Therapie mit Methylphenidat in therapieüblichen Dosen bei Kindern das Erbgut nicht zu schädigen scheint. Dieses Ergebnis bestätigen inzwischen auch weitere Studien. Der Mikrokerntest erfasst Genomschäden, nicht jedoch etwaige tumorpromovierende Eigenschaften des verabreichten Medikaments. Damit ist unklar, ob MPH auf andere Art als über eine Schädigung des Genoms das Karzinomrisiko erhöhen könnte. Erste epidemiologische Studien sehen jedoch keinen Hinweis auf eine wie auch immer entstandene erhöhte Karzinominzidenz unter der Therapie mit MPH (Selby, Friedman et al. 1989; Oestreicher, Friedman et al. 2007). Hier scheinen jedoch weitere epidemiologische Studien, die mög-lichst große Zeitspannen umfassen, nötig zu sein N2 - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is the most frequent psychiatric disorder in children and adolescents and is often treated with methylphenidate (MPH), resulting in MPH exposure in more than 1% of all children in many countries. A 2005 report on cytogenetic effects in peripheral lymphocytes from 12 ADHD children treated for 3 months with MPH raised questions about its genetic toxicity and potential carcinogenicity. A healthy control group (23 individuals), a chronically MPH-treated (>12 months) group (21 patients), and a drug naïve group of ADHD-affected children (26 patients), which was analyzed again after 3 months (17 patients) and 6 months (11 patients), provided samples for analysis of micronucleated lymphocytes. No significant alteration in genomic damage as seen as micronucleus frequency in peripheral lypmphocytes was detected after MPH treatment. No indication for genomic damage induced by MPH was obtained in this study. Ongoing studies in the USA, as well as continuation of recently published epidemiological cancer incidence analysis should provide additional reassurance for MPH-treated ADHD patients. KW - Methylphenidat KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - Kleinkern KW - micronucleus assay KW - cytogenetic effects KW - mutagenicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77652 ER - TY - JOUR A1 - Hintzsche, Henning A1 - Jastrow, Christian A1 - Kleine-Ostmann, Thomas A1 - Kärst, Uwe A1 - Schrader, Thorsten A1 - Stopper, Helga T1 - Terahertz electromagnetic fields (0.106 THz) do not induce manifest genomic damage in vitro N2 - Terahertz electromagnetic fields are non-ionizing electromagnetic fields in the frequency range from 0.1 to 10 THz. Potential applications of these electromagnetic fields include the whole body scanners, which currently apply millimeter waves just below the terahertz range, but future scanners will use higher frequencies in the terahertz range. These and other applications will bring along human exposure to these fields. Up to now, only a limited number of investigations on biological effects of terahertz electromagnetic fields have been performed. Therefore, research is strongly needed to enable reliable risk assessment. Cells were exposed for 2 h, 8 h, and 24 h with different power intensities ranging from 0.04 mW/cm2 to 2 mW/cm2, representing levels below, at, and above current safety limits. Genomic damage on the chromosomal level was measured as micronucleus formation. DNA strand breaks and alkali-labile sites were quantified with the comet assay. No DNA strand breaks or alkali-labile sites were observed as a consequence of exposure to terahertz electromagnetic fields in the comet assay. The fields did not cause chromosomal damage in the form of micronucleus induction. KW - Toxikologie Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76268 ER - TY - CHAP A1 - Lutz, Werner K. A1 - Schlatter, C. T1 - Extrapolation of carcinogenicity data to low doses with a dose-response study of the binding of benzo(a)pyrene to rat liver DNA N2 - The binding of tritiated benzo(a)pyrene (BP) to liver DNA of 25 adult male rats (SIV 50) has been determined 50 h after a single intraperitoneal injection of doses between 40 ug/kg and 4; mg/kg. The dose-response relations~ ip is linear up to i mg/kg, shows a sigmoid step towards 2 mg/kg and a shallow linear. slope above that value. TlJe 0 bserved bin ding ranges from 1.7 to 180 nmoles BP per mole DNA phosphate. The non-linearity between 1 and 2 mg/kg could be explained 0):1 the basis of an induction of metabolizing enzymes. A pure1y mathematical extrapolation of therumour incidence from a carcinogenic dose (1 x 40mg/kg for a 20% hepatoma incidence in newborn mice) to human exposure levels (aboilt 0.1 ug/kg per day) would never have followed a step like the on~ found in our experiments. Our dose-effect study therefore shows how carcinogenitity data could be extrapolated in a biologically founded way to low doses. KW - Toxikologie Y1 - 1978 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80157 ER - TY - JOUR A1 - Wilken, Anke A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Tawfik-Schlieper, Hoda A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Pharmacological characterization of the adenylate cyclase-coupled adenosine receptor in isolated guinea pig atrial myocytes N2 - No abstract available. KW - Pharmakologie Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86061 ER - TY - JOUR A1 - Lohse, Martin J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Mechanism of A2 adenosine receptor activation. I. Blockade of A2 adenosine receptors by photoaffinity labeling N2 - It has previously been shown that covalent incorporation of the photoreactive adenosine derivative (R)-2-azido-N6-p-hydroxyphenytisopropyladenosine [(R)-AHPIA] into the A, adenosine receptor of intact fat cells leads to a persistent activation of this receptor, resulting in a reduction of celular cAMP Ieveis [Mol. Pharmacol. 30:403-409 (1986)]. In contrast, covalent incorporation of (R)-AHPIA into human platelet membranes, which contain only stimulatory A2 adenosine receptors, reduces adenytate cyclase Stimulation via these receptors. This effect of (R)-AHPIA is specific for the A2 receptor and can be prevented by the adenosine receptor antagonist theophylline. Binding studies in-dicate that up to 90% of A2 receptors can be blocked by photoincorporation of (R)-AHPIA. However, the remaining 10-20% of A2 receptors are sufficient to mediate an adenylate cyclase Stimulation of up to SOOk of the control value. Similarly, the activation via these 10-20% of receptors occurs with a halflife that is only 2 times Ionger than that in control membranes. This indicates the presence of a receptor reserve, with respect to both the extent and the rate of adenytate cyclase Stimulation. These observations require a modification of the models of receptor-adenytate cyclase coupling, which is described in the accompanying paper [Mol. Pharmacol. 39:524-530 (1991)]. KW - Adenosinrezeptor Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86073 ER - TY - JOUR A1 - Spielman, William S. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Arend, Lois J. A1 - Olson, Barbara A. A1 - LeVier, David G. A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Characterization of adenosine A1 receptor in a cell line (28A) derived from the rabbit collecting tubule N2 - We have previously reported that in several renal cell types, adenosine receptor agonists inhibit adenylyl cyclase and activate phospholipase C via a pertussis toxin-sensitive G protein. In the present study, in 28A cells, both uf these adenosine receptor-mediated responses were inhibited by 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX). a highly selective A1 adenosine receptor antagonist. The binding characteristics of the adenosine A 1 receptor in the 28A renal cell line were studied using the radiolabeled antagonist f:1H]DPCPX to determine whether two separate binding sites could account for these responses. Saturation binding of [: 1H]DPCPX to 28A cell membranes revealed a single class of A1 binding sites with an apparent Kd value of 1.4 nM and maximal binding capacity of 64 fmol/mg protein. Competition experiments with a variety of adenosine agonists gave biphasic displacement curves with a pharmacological profile characteristic of A1 receptors. Comparison of [: 1H]DPCPX competition binding data from 28A cell membranes with rabbit brain membranes, a tissue with well-characterized A1 receptors, reveals that the A 1 receptor population in 28A cells has similar agonist binding affinities to the receptor population in brain but has a considerably lower density. Addition of guanosine ;)' -triphosphate ( 100 ,uM) to 28A cell membranes caused the competition curves to shift from biphasic to monophasic. indicating that the A1 receptors exist in two interconvertible affinity states because of their coupling to G proteins. In the absence of evidence for subpopulations of the A1 receptor, it appears that in 28A cells. A single A1 receptor population. As defined by ligand binding characteristics, couples via one or more pertussis toxin-sensitive guanine nucleotide binding proteins to two different biological signaling mechanisms. KW - calcium KW - phosphoinositides KW - adenosine 3',5'-cyclic monophosphate KW - receptor binding KW - signal transduction KW - G proteins Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86083 ER - TY - CHAP A1 - Lohse, Martin J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Effects of barbiturates on A1 adenosine receptors of rat brain N2 - Barbiturates inhibit binding of radioligands to A 1(Ri) adenosine receptors of rat brain membranes. This inhibition is dose-dependent and stereospecific and occurs in the range of pharmacologically active concentrations. The displacement of radiolabelled A1antagonists by barbiturates is not modified by GTP, indicating that barbiturates might act as antagonists at this receptor. This action of barbiturates does not seem to be related to the binding of barbiturates to plasma membranes, as the latter process has different characteristics. Barbiturates also inhibit the binding of radioligands to solubilized A1receptors, and saturation and kinetic experiments suggest that this is due to a competitive antagonism. These results indicate that barbiturates interact with the recognition site of the A1adenosine receptor. KW - Barbiturat KW - Adenosinrezeptor KW - Ratte Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70100 ER - TY - CHAP A1 - Lohse, Martin J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Functional characterization of A1 adenoosine receptors by photoaffinity labelling N2 - The ligand-binding subunit ofthe A1 adenosine receptor has been identified in membranes with the photoaffinity Iabel R-2-azido-N6-p-hydroxyphenylisopropyladenosine (R-AHPIA). Covalent labelling ofthe A1 receptor can also be achieved in intact cells. The dissociation of the radioiodinated label (1251-AHPIA) from isolated rat fat cells was incomplete after UV irradiation, leaving about 20°/o of irreversible specific binding. Such covalent labelling of the receptor led to a concentration-dependent reduction of cellular cyclic AMP levels. This persistent effect of covalent labeHing occurred with an IC50 value of 9 nM, as compared to an IC50 value of 0.9 nM for the direct reduction of cyclic AMP Ievels by the ligand. The difference in the IC5o values can be explained by assuming spare receptors. This hypothesis was verified in binding studies using [ 3HJPIA as a radioligand. R-AHPIA inhibited binding of [3H)PIA to intact fat cells with a K1 value of about 20 nM, which is about 20 tim es high er than the corresponding IC50 value of cyclic AMP reduction. These data show that the A1 receptor is activated according to the occupancy theory. The high sensitivity of the activation in intact ceJis is due to a large number of spare receptors. KW - Adenosinrezeptor Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86097 ER - TY - CHAP A1 - Lohse, Martin J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Maurer, K. A1 - Ott, I. A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Effects of adenosine on mast cells N2 - No abstract available KW - Adenosin KW - Mastzelle Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86101 ER - TY - CHAP A1 - Spielmann, W.-S. A1 - Arend, L. J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, U. T1 - Adenosine receptors and singnaling in the kidney N2 - No abstract available. KW - Adenosinrezeptor KW - Niere Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86114 ER - TY - CHAP A1 - Spielmann, W. S. A1 - Arend, L. J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, U. T1 - Adenosine control of the renal Collecting tubule: receptors and signaling N2 - No abstract available. KW - Adenosin Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86129 ER - TY - JOUR A1 - Lohse, Martin J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Effectes of temperature and membrane phase transitions on ligand binding to a2-receptors of human platelets N2 - The binding of agonists and antagonists to a2-adrenergic receptors of human platelets was studied. The receptors showed homogeneaus affinities for antagonists but two affinity states for the agonist (-)-epinephrine, which were modulated by guanine nucleotides. Van't Hoffplots of antagonist binding had a break point at about 18° and considerable diversity between 18° and 0°. Agonist binding to both affinity states showed a similar break point; agonist binding to the high affinity state was characterized by a large entropy component compared to the low affinity state. This entropy component was reduced at higher concentrations of sodium, indicating that it may be due to Iiberation of sodium ions. Measurements of the fluorescence of 1-anilin-8-naphthalenesulfonate showed thermotropic phase transitions of theplatelet membranes at about 17°. The transition temperature was decreased to about 12° by addition of 1 0 mM octanoic acid. Octanoic acidalso shifted the break points of the van't Hoffplot of antagonist and low affinity agonist binding from 18° to 12°. High affinity agonist binding, however, remained unchanged. It is concluded that agonist-specific thennodynamic characteristics of ligand binding to a2-receptors of human platelets can only be investigated by regarding differences between high and low affinity agonist binding. These differences include an entropy increase upon Iigand binding, which is in part due to enhanced liberation of sodium ions, and a loss of sensitivity to fluidity changes in the outer layer of the plasma membrane. KW - Molekularpharmakologie Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86023 ER - TY - CHAP A1 - Shephard, S. E. A1 - Schlatter, C. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Model risk analysis of nitrosatable compounds in the diet as precursors of potential endogenous carcinogens N2 - The potential health risk posed by the endogenous formation of N-nitroso compounds (NOC) from nitrosation of dietary ureas, guanidines, amides, amino acids and amanes (primary, secondary and aromatic) was estimated according to the model: Risk = ( daily intake of precursor] X (gastric concentration of nitrite ]n X [nitrosatability rate constant] X [cilrcinogenicity of derivative]. The daily intakes ofthese compound classes span five orders ofmagnitude (100 g/day amides, top; 1-10 mg/day secondary amines, ureas, bottom); the nitrosation rate constants span seven orders of magnitude (aryl amines, ureas, top; amides, secondary amines, bottom); and the carcinogenicity estimates span a 10 000-fold range from 'very strong' to 'virtually noncarcinogenic'. The resulting risk estimates likewise span an enormous range (nine orders of magnitude ): dietary ureas and aromatic amines combined with high nitrite concentration could pose as great a risk as the intake of preformed N-nitrosodimethylamine in the diet. In contrast, the risk posed by the in-vivo nitrosation of primary and secondary amines is probably negligible. The risk contributed by amides (including protein), guanidines and primary amino acids is intermediate between these two extremes. KW - Risikoanalyse KW - Carcinogen KW - Ernährung Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86188 ER - TY - CHAP A1 - Shephard, S. E. A1 - Hegi, M. E. A1 - Lutz, Werner K. T1 - In-vitro assays to detect alkylating and mutagenic activities of dietary components nitrosated in situ N2 - Nitrosation of dietary components has been combined with the 4-(para-nitrobenzyl)pyridine (NBP) colorimetric test for screening alkylating agents and with the Ames test for the detection of mutagenic activity. This allowed the investigation of short-hved nitrosation products of dietary components which generate electrophilic degradation products requiring no metabolic activation (natural amino acids and some derivatives, ureas, guanidines, primary alkyl and aryl amines). In a first system, precursor, nitrous acid and NBP were present simultaneously. All amino acids tested, except glutamic acid and glutamine, gave positive results. The reactivities spanned more than three orders of magnitude, with the aromatic amino acids and methionine the most active; two primary amines, tryptamine and histamine, were also strongly reactive. All guanidines tested, except the amino acid arginine, gave negative results. A second system consisted of two phases: NBP was added only after destruction of residual nitrite and adjustment of the pH to neutrality. This system was useful for the study of ureas, which are stable in acid but not in neutral media. The range of responses covered more than two orders of magnitude. Most amino acids and primary amines also gave positive results, but could be assessed only after analysing the kinetics of the competing reactions and choosing appropriate reaction times. In a third system, Salmonella typhimurium strain TA1OO replaced NBP. Representatives of the class of amino acids, ureas, the primary amine tryptamine, and aniline became higbly mutagenic upon nitrosation. Methylguanidine was only weakly mutagenic under the present assay conditions. The results indicate that further studies with unstable nitrosation products of dietary components are required to understand more thoroughly the role of endogenous nitrosation in gastric cancer. KW - Medizin Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86194 ER - TY - CHAP A1 - Lohse, M. J. A1 - Klotz, K.-N. A1 - Schwabe, U. A1 - Christalli, G. A1 - Vittori, S. A1 - Grifantini, M. T1 - Pharmacology and Biochemistry of Adenosine Receptors N2 - Adenosine modulates a variety of physiological functions via membrane-bound receptors. These receptors couple via G proteins to adenylate cyclase and K+channels. The A1 subtype mediates an inhibition of adenylate cyclase and an opening of K+-channels, and the A2 subtype a Stimulation of adenylate cyclase. Both subtypes have been characterized by radioligand binding. This has facilitated the development of agonists and antagonists with more than 1000-fold A1 selectivity. A1-selective photoaffinity labels have been used for the biochemical characterization of A1 receptors and the study of their coupling to adenylate cyclase. Such selective ligands allow the analysis of the involvement of adenosine receptors in physiological functions. Selective interference with adenosine receptors provides new pharmacological tools and eventually new therapeutic approaches to a number of pathophysiological states. KW - Adenosinrezeptor KW - Pharmakologie KW - Toxikologie Y1 - 1988 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86251 ER - TY - JOUR A1 - Lohse, Martin J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Agonist photoaffinity labeling of A1 adenosine receptors: Persistent activation reveals spare receptors N2 - No abstract available. KW - Pharmazie KW - Pharmakologie Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87966 ER - TY - JOUR A1 - Meier, Friedegund A1 - Gross, Eva A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Ruzicka, Thomas T1 - Leukotriene B4 receptors on neutrophils in patients with psoriasis and atopic exzema N2 - Polymorphonuclear leukocyte (PMNL) infiltration is an important characteristic in psoriatic lesions. Elevated concentrations of the chemoattractant eicosanoid leukotriene B4 (L TB4) are present in psoriatic skin. Its chemotactic activity is mediated via high affinity receptors on PMNL. The goal of our work was to ascertain whether PMNL infiltration in psoriasis can be accounted for by functional abnormalities of the circulating PMNL due to alterations in the LTB4 receptor density or affinity (or both). No significant difference was found between patients with psoriasis, healthy controls and patients with another inflammatory dermatosis (atopic eczema) with regard to the binding parameters of LTB4 receptors on PMNL. Our findings suggest that PMNL accumulation in psoriatic skin may be the result of an excess of cutaneous hemoattractant rather than the increased readiness of psoriatic PMNL to migrate towards L TB4 due to altered LTB4 receptor density or affinity. KW - Dermatologie KW - Venerologie KW - Pharmakologie KW - Pharmazie KW - LTB4 receptor KW - neutrophils KW - psoriasis KW - atopic eczema Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86265 ER - TY - CHAP A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Keil, Roger A1 - Zimmer, Franz-Josef A1 - Schwabe, Ulrich T1 - Modulation of (§H) DPCPX binding to membrane-bound ans solubilized A1 adenosine receptors by guanine nucleotides N2 - No abstract available KW - Adenosinrezeptor Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86153 ER - TY - JOUR A1 - Shephard, S. E. A1 - Lutz, Werner K. T1 - Nitrosation of dietary precursors N2 - The diet contains a large number of constituents which can be nitrosated in the gastrointestinal tract (especially in the stomach) to potentially carcinogenic nitroso compounds (NOC). The nitrosation of food mixtures has been investigated with a number of assays, such as chemical analysis or detection of alkylating potential, mutagenicity and carcinogenicity. Relatively good information is available on the formation of stable nitrosamines using high nitrite concentrations. Little is known, however, about the formation of chemically unstable NOC at low nitrite concentration and their genotoxicity in target cells. A comparison of the precursor classes, alkylamines, aromatic amines, amino acids, amides and peptides, ureas and guanidines, reveals a vast range, both with respect to daily intake (105-fold) and nitrosation rate (104-fold both for 1st and 2nd order nitrite dependence). A total span of 108 results for the relative yield of NOC in the stomach. The endogenous NOC burden from dietary ureas and aromatic amines may represent as large a hazard as the intake of preformed NOC. Recent evidence also indicates that heterocyclic amines and phenols must be considered and that the half-life of nitrosated a-amino acids can be much longer than that of nitrosated primary alkylamines. In these classes, more information should be collected on dietary concentrations, on the nitrosation under realistic conditions and on the genotoxicity in stomach lining cells. Within a chemical precursor class, a wide range is seen with respect to alkylating potency. It cannot, therefore, be excluded that individual precursors within the top ranking classes might become more important than single preformed NOC. Not considered in the above analysis but probably just as important for a risk evaluation in a population is the knowledge of the nitrosation conditions and target cell susceptibility in individuals. KW - Ernährung KW - diet KW - amine KW - amino acid KW - urea KW - nitrosation KW - nitroso compound KW - endogenous KW - stomach KW - alkylation KW - 4-(p-nitrobenzyl)pyridine KW - DNA binding KW - genotoxic KW - mutagen KW - carcinogen KW - Nitrosierung Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70311 ER - TY - THES A1 - Heinlein, U-Ju T1 - Adenosinrezeptoren auf Ovarialkarzinomzellen T1 - adenosine receptors in ovarian cancer cells N2 - Seit der Entdeckung, dass Adenosin auch als Botenstoff dient, beschäftigen sich Forschungsgruppen mit Adenosinrezeptoren und ihrer möglichen therapeutischen Modulation, insbesondere in Zusammenhang mit Krebserkrankungen. Bislang sind die Rezeptoren auf diversen Krebszellen nachgewiesen worden. So konnten beispielsweise in einer Brustkrebszelllinie A2B Adenosinrezeptoren nachgewiesen werden, deren Stimulation zu einer Hemmung der wachstumsfördernden MAP Kinase führt. Pharmaka zur weitgehend selektiven Aktivierung oder Hemmung einzelner Adenosinrezeptor-Subtypen stehen ebenfalls zur Verfügung. Beim Ovarialkarzinom mit seiner leider meist erst spät auftretenden Symptomatik besteht derzeit noch keine Möglichkeit zur frühen Diagnosestellung, sodass die Prognose ausgesprochen ungünstig ausfällt und die Erkrankung bei Frauen eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen darstellt. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob Adenosinrezeptoren auf diesen Zellen einen möglichen therapeutischen Angriffspunkt bieten. Dazu untersuchten wir die vier Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3, SK-OV-3, PA-1 und OAW-42 auf eine mögliche Expression von allen vier Adenosinrezeptorsubtypen. Zunächst wurden mit radioaktiv markierten Liganden ([3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]HEMADO) Bindungsstudien für den A1-, A2A- und A3-Subtyp durchgeführt. Die Expression des A2B-Rezeptors wurde mithilfe eines funktionellen Nachweises, der Stimulation der Adenylylcyclase mithilfe von NECA (einem unspezifischen Adenosinrezeptoragonisten) analysiert. Im Anschluss daran untersuchten wir an OAW-42 und SK-OV-3 Zellen, ob sich ihr Proliferationsverhalten durch eine Stimulation mit NECA verändern ließe und ob sich das Ansprechen auf gängige Chemotherapeutika bzw. einen Todesliganden ändern würde. Trotz des erfolgreichen Nachweises von Adenosinrezeptoren auf allen Zelllinien waren die Ergebnisse der Proliferationsstudien aber nicht eindeutig. OAW-42 und SK-OV-3 Zellen reagierten zwar auf eine NECA-Stimulation mit sinkendem BrdU-Einbau, OAW-42 Zellen zeigten aber nach Behandlung mit NECA eine leicht erhöhte Resistenz gegenüber Cisplatin. NECA-behandelte SK-OV-3 Zellen reagierten hingegen etwas sensitiver auf Doxorubicin und Fas-Ligand. Die Unterschiede waren aber insgesamt sehr gering und wurden daher von uns als nicht entscheidender Effekt gewertet. Auch Untersuchungen zur Expression der Adenosin-generierenden Enzyme CD39 und CD73 vor und nach NECA-Stimulation blieben ohne erkennbare Veränderung. Insofern ergaben unsere Untersuchungen keine Hinweise darauf, dass Adenosinrezeptoren eine mögliche therapeutische Zielstruktur darstellen könnten. Zukünftige Studien können aber die gewonnenen Daten als Grundlage und Ausgangspunkt nützen, um auch andere Tumorzellarten zu untersuchen und im Kampf gegen den Krebs nach neuen potenziellen pharmakologischen Angriffspunkten zu suchen. N2 - Purpose of the study: Adenosine and adenosine receptors are widely distributed throughout the human body. While they are thought to be involved in many diseases, they seem to play a particularly important role in cancer. Adenosine receptors were already identified in many different cancer tissues. Moreover, extracellular adenosine accumulates in solid tumor masses as a consequence of poor blood supply leading to hypoxia, cell death and concomitant adenine nucleotide breakdown. From a pharmacological point-of-view, numerous tools for activating or inhibiting adenosine receptors have been developed which could be used as therapeutics to combat cancer.One such strategy, for instance, might be based on the identification of A2B adenosine receptors in a breast cancer cell line which mediate the inhibition of growth-promoting MAP kinase activity. Among genuinely gynecological cancers, ovarian carcinoma is associated with the highest mortality rate. Its poor prognosis is mostly due to late primary diagnosis caused by the absence of early symptoms and by the lack of suitable screening programs. As current therapies show limited efficacy against late-stage ovarian cancer, there is an unmet medical need to be addressed by scientists and physicians. In this study we investigated if the human ovarian cancer cell lines OVCAR-3, SK-OV-3, PA-1 and OAW-42 express adenosine receptors on their surfaces. We used binding assays with the help of tritiated radioligands ([3H]CCPA , [3H]NECA und [3H]HEMADO) to identify the A1, A2A, A3 subtype and used a functional assay, namely the stimulation of the adenylylcyclase to detect A2B adenosine receptors with [32P]ATP and the nonselective adenosine receptor agonist NECA. Furthermore we investigated whether stimulation of adenosine receptors with NECA had any effect on the proliferation of OAW-42 and SK-OV-3 cells or on their sensitivity towards chemotherapeutic agents like cisplatin and doxorubicin. Results: We found adenosine receptors in all of the screened ovarian cancer cells, but their effects on proliferation and survival were ambiguous. OAW-42 and SK-OV-3 cells slightly reduced the incorporation of BrdU after treatment with 10 µM NECA. However, OAW-42 cells also became more resistant to cisplatin after treatment with NECA. SK-OV-3 cells, in contrast, were sensitized to doxorubicin and Fas ligand after incubation with NECA. Flow cytometry (FACS) further showed that the cell surface expression for the adenosine-generating ectonucleotidases CD39 and CD73 remained unaltered after stimulation of the cells with NECA. Taken together, the observed effects were quite small and it is questionable whether adenosine receptors represent suitable targets in ovarian cancer. Nevertheless, adenosine receptors remain interesting targets for cancer therapy. Our studies may thus stimulate future research on different tumor entities, with the purpose of finding the best application for the available adenosine receptor-specific drugs. KW - Eierstockkrebs KW - Adenosin KW - Adenosinrezeptor KW - ovarian cancer KW - adenosine KW - adenosine receptor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-81920 ER - TY - THES A1 - Soliman, Alexander T1 - Einfluss des Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und den DNS-Schaden in adipösen Patient*innen nach bariatrischer Chirurgie T1 - Influence of bariatric surgery induced weight loss on oxidative stress and DNA damage in obese patients N2 - Einfluss des Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und den DNS-Schaden in adipösen Patient*innen nach bariatrischer Chirurgie Adipositas ist eine Erkrankung, die durch ein erhöhtes Krebsrisiko neben zahlreichen anderen Komorbiditäten mit weitreichenden Folgen für die Gesundheit adipöser Patient*innen einhergeht. In der Pathogenese der adipositas-assoziierten Krebsarten sind dabei ein erhöhter oxidativer Stress sowie die damit einhergehende Schädigung der DNS maßgeblich beteiligt. Im Umkehrschluss wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss eines durch bariatrische Chirurgie induzierten Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und DNS-Schaden in adipösen Patient*innen anhand von Blutproben präoperativ sowie 6 und 12 Monate postoperativ untersucht. In einer Subpopulation der Patient*innen konnte eine tendenzielle Verringerung des DNS-Schadens anhand des Comet-Assays in peripheren Lymphozyten beobachtet werden. Im Hinblick auf den oxidativen Stress wurde im Plasma die Eisenreduktionsfähigkeit als Maß für antioxidative Kapazität sowie Malondialdehyd als Surrogatmarker für das Ausmaß an Lipidperoxidation bestimmt. Weiterhin wurde in Erythrozyten das Gesamtglutathion und oxidierte Glutathion bestimmt. Die oxidativen Stressparameter zeigten insgesamt nach einer initialen Zunahme im oxidativen Stress 6 Monate postoperativ eine rückläufige Tendenz im oxidativen Stress am Studienende. Somit geben die Beobachtungen dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, dass adipöse Patient*innen durch einen bariatrisch induzierten Gewichtsverlust von einer Verringerung des Krebsrisikos profitieren könnten. N2 - Obesity is a disease that is linked with a higher risk of cancer among other comorbidities of obese patients. Especially oxidative stress and DNA damage have been shown to play a major role in the pathogenesis of obesity associated cancers. Therefore the aim of this study was to examine the effect of a massive weight loss induced by bariatric surgery on oxidative stress and DNA damage in whole blood samples of obese patients at 6 and 12 month after bariatric surgery. In a subpopulation of the study population a tending decrease in DNA damage in peripheral lymphocytes could be observed. Concerning oxidative stress parameters, determination of ferric-reducing antioxidative power and malondialdehyde levels as a marker for lipidperoxidation were carried out on plasma samples. Furthermore total and oxidised glutathione levels were determined in erythrocytes of patients. In synopsis oxidative stress parameters indicated a initial increase in oxidative stress 6 month after bariatric surgery and a decreasing trend at the end of the study. These findings give hope that obese patients may benefit from a reduced cancer risk through bariatric surgery induced weight loss. KW - Magenchirurgie KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - bariatrische Chirurgie KW - DNS-Schaden KW - Adipositas KW - bariatric surgery KW - DNA damage KW - oxidative stress Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259737 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27835 ER - TY - THES A1 - Jonas, René T1 - Toxizität und Gentoxizität von Phytohormonen und deren Metaboliten T1 - Toxicity and genotoxicity of phytohormones and their metabolites N2 - Phytohormone, insbesondere solche mit östrogenem Potential werden heute vermehrt in der postklimakterischen Hormonersatztherapie als natürliche Alternative zu Designeröstrogenen eingesetzt, da sie vermutlich ein besseres Wirkungs-Nebenwirkungsprofil besitzten. Mengenmäßig am bedeutensten sind die Phytoöstrogene aus den Stoffgruppen der Isoflavone, Cumestane und Indol-3-carbinole. Weit über 100 Pflanzen produzieren Phytohormone. Die bekanntesten sind die Sojabohne, Weintrauben, Leinsamen, Haferflocken, Spargel, Traubensilberkerze und roter Klee. Phytohormone können täglich in großer Menge aufgenommen werden (1mg pro kg Körpergewicht), wobei durchaus Plasmaspiegel von über 1µM erreicht werden. Gerade deshalb darf nicht davon ausgegangen werden, daß natürliche Produkte per se gut für die Gesundheit wären. Phytohormone und insbesondere deren Metaboliten, die während der intestinalen Passage entstehen, wurden vielfach nicht den gleichen Prüfbedingungen unterzogen wie sie für andere in Lebensmitteln vorkommenden Substanzen, wie z.B. Konservierungs-, Farb- oder Aromastoffen, heute selbstverständlich ist. Diese Arbeit soll deshalb anhand von in-vitro Tests an Mauslymphomzellen L5178Y für eine Auswahl an Phytohormonen und deren Metaboliten mögliche toxische oder gentoxische Effekte detektieren und die bestehende Datenlage ergänzen. Aus der Gruppe der Isoflavone wurden die Daidzeinmetaboloiten Equol und O-desmethylangolensin und die Glyceteinmetaboliten 3,4,7- und 4,6,7-Trihyroxyisoflavon untersucht. Aus der Gruppe der Flavone wurde Fisetin und aus der Gruppe der Stilbene Resveratrol untersucht. Weiterhin wurden Daten zu den Anthocyanen Delphinidin-, Pelargonidin- und Cyanidin-Chlorid erhoben. Toxische Effekte wurden anhand von Proliferatiosexperimenten, durch die Bestimmung der Zellvitalität (Ethidiumbromid-Flouresceinmethode) und durch die Analyse der Teilungsaktivität nach Behandlung mit Cytocalasin B und anschließender Bestimmung des Anteils mehrkerniger Zellen detektiert. Zur Bestimmung von gentoxischen Effekte wurde auf den Mikrokerntest zurückgegriffen. Ergänzend sollte eine Immunfloureszenzfärbung der Kinetochorproteine in Mikrokernen Aufschluß über aneugene oder klastogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen geben. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten weisen darauf hin, daß erste adverse Effekte der Phytohormone oder deren Metaboliten im Bereich der erreichbaren Plasmakonzentration liegen, so daß eine übertriebene Aufnahme hochdosierter Phytohormonen derzeit als kritisch erachtet und weiterer Forschungsbedarf festgestellt werden muß. N2 - Phytohormones, particulary those which have oestrogen potential, are nowadays increasingly used in the postclimacteric hormone replacement therapy, as a natural alternative to artificially synthesized oestrogens, since they are thought to have a better effect/side effect profile.Most important in terms of quantity are the phytoestroges which are part of either the isoflavone- coumestane- or indol 3 carbinol-substance group. For more than 100 plants produce phytohormones, the most well-known of which are the soy bean, the grape, linseeds, oat flakes, asparagus and red clover. Phytohormones can be taken up in large quantities each day (1 mg per kg body weight), whereby plasma levels of more than 1 µM can be reached. That is exactely why one can not proceed on the assumption that natural products are per se healthy. In many cases, when phytohormones and especially their metabolites, which are synthesized during the intestinal passage process, are tested, the test conditions, which are used today for the testing of other substances which are contained in food (e.g. preservatives, artificial colourings or flavouring substances), are not applied. This work is intended to detect possible toxic or genotoxic effects of phytohormones and their metabolites on the basis of tests with mouse lymphoma cells. From the isoflavone-group, the daidzein metabolites equol and o-desmethylangolensine, and the glycetein metabolites 3,4,7- and 4,6,7-trihydroxyisoflavone have therefore been examined, as well as fisetin and resveratrol from the substance-group of flavones and stilbenes respectively. This work also provides new data on anthocyanes delphinidin-, pelargonidin- and cyanidin-chloride. Toxic effects were detected o the basis of experimental registration of the proliferation process, by determining the cell vitality (ethidium bromide – flouresceine – method) and by analysis of the separation-activity after the application of cytochalsine B, directely followed by the determination of the proportion of cells with more than one nucleus. The detemination of genotoxic effects was done using the micronucleus-test. Additionally, an immune flourescense couloring of the kinetochore proteins in micronuclei should explain the aneugene or clastogene effectiveness of the substances examined. The data established through this study indicates that primary adverse effects of phytohormones or their metabolites can be detected within reachable plasma concentrations, so that an excessive take-up of phytohormones has to be classified as critical and it also shows, that there is need for further research in this field. KW - Phytohormone KW - Östrogen KW - Toxizität KW - Gentoxizität KW - Mikrokerne KW - phytohormones KW - estrogen KW - toxicity KW - genotoxicity KW - micronuclei Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11063 ER - TY - THES A1 - Nedvetsky, Pavel I. T1 - Regulation of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase T1 - Regulation des Rezeptor des Stickstoffoxides löslicher Guanylylcyclase N2 - Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier. N2 - Lösliche Guanylylcyclase (sGC) ist der Hauptrezeptor für Stickstoffmonooxid (NO), der sich an der Regulation zahlreicher physiologischer Funktionen beteiligt. Trotz ihrer sehr gut untersuchten Rolle in der Regulation der Blutgefässenrelaxation, synaptische Plastizität, Aggregation der Trombozyten, renale Sekretion und anderen wichtigen Funktionen, ist die Regulation der sGC selber noch nicht ausreichend verstanden. Der einzige, zur Zeit bekannte, physiologische Regulator der sGC ist NO. In der vorgelegten Arbeit wurde die Existenz anderer Möglichkeiten der sGC Regulation gezeigt. Zuerst, wurde die Fähigkeit verschiedener NO Donoren sGC zu stimulieren untersucht. DEA/NO stimulierte sGC viel stärker als SNP. Interessanterweise, wurde keine Korrelation zwischen der Verteilung des sGC Proteins und der Enzymaktivität unter Vmax- Bedingungen in verschiedenen Rattenhirnregionen gefunden. Das deutet auf zusätzliche Regulationsmechanismen hin. Die fehlende Fähigkeit von SNP sGC maximal zu stimulieren könnte ein Grund dafür sein, warum dieses Phänomen nicht schon früher gezeigt wurde. Langfristige Behandlung von Endothelzellen mit NO Donoren produzierte eine Desensitisierung der nachfolgenden cGMP Antwort. Diese Desensitisierung kann nicht durch erhöhte Phosphodiesterase-Aktivität erklärt werden, da Phosphodiesterasenhemmer die durch NO Donor verursachte Abnahme der cGMP Antwort nicht rückgängig macht. SHreduzierende Substanzen waren nicht in der Lage die cGMP Antwort zu verbessern, was zur Annahme führt, dass SH-Gruppenoxidation keine wichtige Rolle bei der Wirkung von NO auf sGC spielt. Es müssen daher andere Regulationsmechanismen vorhanden sein. Oxidation des Häms scheint ein möglicher Mechanismus der NO-induzierten sGC Desensitisierung. Einkürzlich beschriebener Aktivator der oxidierten (bzw. Häm-freien) sGC, BAY58-2667, stimulierte sGC nach Vorbehandlung mit NO Donoreb stärker als ohne Vorbehandlung. Es wird vermutet, dass oxidierte sGC verstärkt abgebaut wird was die durch NO oder Häm oxidierende Substanzen induzierte sGC Proteinabnahme erklären würde. Tatsächlich, nahm sGC Proteinlevel nach der Behandlung mit der Häm oxidierenden Substanz, ODQ, ab. BAY58-2667 verhinderte diesen Effekt. Ferner erhöht die Membranassoziation von sGC derer Empfindlichkeit gegenüber NO. Die Membranassoziation der sGC in Endothelzellen ist reguliert. Behandlung isolierter Lunge mit VEGF erhöht den Anteil an membrangebundener sGC in Endothelzellen dramatisch. In kultivierten Endothelzellen könnte VEGF die Membranassoziation jedoch nicht stimulieren, was einen komplexen Mechanismus der Membranassoziation der sGC in vivo vermuten lässt. Wenig ist bekannt über die Interaktionen von sGC mit anderen Protein und der möglichen Rolle dieser Interaktionen bei der Regulation des Enzyms. Proteininteraktionen scheinen aber ein möglicher Mechanismus für die Membranassoziation der sGC zu sein. Aus diesem Grund wurde die Rolle eines vor kurzem beschriebenen sGC-bindenden Proteins, Hsp90, auf die sGC Regulation untersucht. Kurzfristige Behandlung der Endothelzellen mit Hsp90 Inhibitoren hat keine Auswirkung auf NO Donor- und Calciumionophore-stimulierte cGMP-Produktion. Langfristige Hemmung von Hsp90 führte dagegen zur schnellen und deutlichen Abnahme des sGC Proteins. Dieser Effekt ist nicht durch eine Veränderung der Translation zu erklären, weil Tranlationshemmer einen viel langsameren sGC Abfall verursachten. Im Gegenteil, konnte ein Proteasomeninhibitor, MG132, die Effekte von Hsp90 Hemmern rückgängig machen. Das lässt eine proteolytische Abbau der sGC für die Effekte von Hsp90 Hemmer verantwortlich machen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Hsp90 für Aufrechterhaltung des Enzyms notwendig ist. Zusammenfassend, wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass sGC Aktivität und ihre Empfindlichkeit gegenüber ihren Aktivator NO durch multiple Faktoren beeinflusst werden kann. Oxidation des Häms durch NO könnte ein Mechanismus der negativen Regulation der sGC bei dauernd erhöhter Konzentration von NO sein. Ein zusätzlicher Mechanismus der Regulation der Empfindlichkeit der sGC gegenüber NO scheint die intrazellulare Translokation zu sein. Wir konnten hier zeigen, das die Membranassoziation der sGC ihre Empfindlichkeit gegenüber NO erhöht. Auch dieProteinlevel der sGC scheinen unter Kontrolle verschiedener Faktoren zu sein. Einer davon ist Hsp90, der für die Aufrechterhaltung des sGC Proteins sowohl in Endothelzellen als auch in anderen Zelltypen notwendig ist. Alle diese Daten zeigen, dass Regulation der sGC ein viel komplexerer Vorgang ist als bis her angenommen wurde und eröffnen interessante neue Forschungsrichtungen innerhalb dieses wichtigen Signalweges. KW - Guanylatcyclase KW - Regulation KW - lösliche Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Häm KW - Hsp90 KW - soluble guanylyl cyclase KW - cGMP KW - heme KW - Hsp90 Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7046 ER - TY - THES A1 - Bücheler, Markus T1 - Regulation der Neurotransmission im zentralen Nervensystem durch alpha2-adrenerge Rezeptoren T1 - Regulation of neural transmission by alpha2-adrenergic receptors in the central nervous system N2 - Die Gruppe der adrenergen Rezeptoren (AR) umfasst neun Rezeptoren (3 alpha1-, 3 alpha2-, 3 beta-AR), die alle durch die physiologischen Liganden Adrenalin und Noradrenalin aktiviert werden können. Eine Subgruppe der AR bilden die drei alpha2-AR alpha2A, alpha2B und alpha2C. Sie können prä- oder postsynaptisch lokalisiert sein. Präsynaptisch lokalisierte alpha2-AR hemmen die Transmitterfreisetzung im Sinne einer negativen Rückkopplung. Die Hauptrolle bei der präsynaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung spielen alpha2-AR vom Subtyp alpha2A. Es lagen zu Beginn dieser Arbeit auch Hinweise vor, daß noch weitere alpha2-Rezeptorsubtypen an dieser Funktion beteiligt sind. Eine eindeutige Zuordnung dieser alpha2-AR zu den Subtypen alpha2B oder alpha2C gelang aber bisher nicht. In dieser Arbeit sollte deshalb die Frage beantwortet werden, welche alpha2-AR neben dem alpha2A-AR an der präsynaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Zur Subtypunterscheidung wurden "knockout"-Mäuse verwendet, die nur einen oder zwei alpha2-Rezeptorsubtypen exprimierten. Gehirnschnitte aus dem Neokortex und den Basalganglien dieser Mauslinien wurden mit radoaktiv markiertem Noradrenalin bzw. Dopamin inkubiert. Anschließend wurde in Transmitterfreisetzungsexperimenten mit den so behandelten Gehirnschnitten Konzentrations-Wirkungskurven mit verschiedenen Liganden erstellt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, daß neben den alpha2A-AR auch alpha2C-AR präsynaptisch die Transmitterfreisetzung von Noradrenalin und Dopamin hemmen. In einem weiteren Schritt wurde die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der alpha2A- und alpha2C-AR im heterologen Expressionssystem untersucht. Hierzu wurden stabile HEK293-Zellinien generiert, die entweder alpha2A- oder alpha2C-AR unterschiedlich stark exprimierten. Diese Zellinien wurden transient mit GIRK-Kanälen transfiziert, um die durch Stimulation mit Noradrenalin resultierenden Kaliumströme mit der "patch-clamp"-Technik zu messen. Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen alpha2A- und alpha2C-AR bezüglich der Aktivierungskinetik. Alpha2C-AR deaktivierten jedoch deutlich langsamer als alpha2A-AR. Diese Befunde belegen, daß zwei der drei alpha2-AR-Subtypen, alpha2A und alpha2C, als präsynaptische Autorezeptoren (Noradrenalin) bzw. Heterorezeptoren (Dopamin) die Neurotransmission modulieren. Dies könnte in der Zukunft für die Entwicklung neuer, subtypspezifischer Pharmaka von großer Bedeutung sein. N2 - The group of adrenergic receptors (AR) consists of 9 receptors (3 alpha1-, 3 alpha2-, 3 alpha-AR). They can be activated by their physiological ligands, epinephrine and norepinephrine. One group consists of three alpha2-AR subtypes, alpha2A, alpha2B and alpha2C. Alpha2-AR can be localised either pre- or postsynaptically in neurons. Presynaptic alpha2-AR inhibit transmitter release via a negative feedback mechanism. The most important subtype for the presynaptic inhibiton is alpha2A. At the beginning of this work there were hints, indicating that more than one alpha2-AR subtype is involved in presynaptic inhibition. However, it was not feasible so far to determine which subtypes contribute to presynaptic feedback inhibition. The aim of this thesis was to determine which further subtypes inhibit transmitter release in the central nervous system. In order to distiguish between the different subtypes, knockout mice were used which expressed only one or two subtypes of the three alpha2-AR. Brain slices of the neocortex or the basal ganglia were incubated with radioactively labelled norepinephrine or dopamine, respectively. Then, concentration response curves with different ligands were made. These experiments revealed that alpha2C-AR can inhibit the release of norepinephrine and dopamine in addition to alpha2A-AR. Next, alpha2A- and alpha2C-AR were stabily expressed in HEK 293 cells to determine the kinetics in signal transduction. These cells were transiently transfected with GIRK channels to determine the potassium currents elicited by norepinephrine stimulation with the patch clamp technique. No significant differences between alpha2A- and alpha2C-AR with respect to activation kinetics were detected. However, alpha2C-AR deactivated significantly slower than alpha2A-AR. These results demonstrate that two alpha2-AR, alpha2A- and alpha2C, modulate synaptic transmission in the central nervous system. These findings are of importance for future development of subtype-selective ligands. KW - transgen KW - Maus KW - Adrenozeptor KW - alpha2 KW - transgenic KW - mouse KW - adrenoceptor KW - alpha2 Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7803 ER -