TY - JOUR A1 - Akhoon, Bashir A. A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Tiwari, Sudeep A1 - Rathor, Laxmi A1 - Pant, Aakanksha A1 - Singh, Nivedita A1 - Gupta, Shailendra K. A1 - Dandekar, Thomas A1 - Pandey, Rakesh T1 - C. elegans protein interaction network analysis probes RNAi validated pro-longevity effect of nhr-6, a human homolog of tumor suppressor Nr4a1 JF - Scientific Reports N2 - Protein-protein interaction (PPI) studies are gaining momentum these days due to the plethora of various high-throughput experimental methods available for detecting PPIs. Proteins create complexes and networks by functioning in harmony with other proteins and here in silico network biology hold the promise to reveal new functionality of genes as it is very difficult and laborious to carry out experimental high-throughput genetic screens in living organisms. We demonstrate this approach by computationally screening C. elegans conserved homologs of already reported human tumor suppressor and aging associated genes. We select by this nhr-6, vab-3 and gst-23 as predicted longevity genes for RNAi screen. The RNAi results demonstrated the pro-longevity effect of these genes. Nuclear hormone receptor nhr-6 RNAi inhibition resulted in a C. elegans phenotype of 23.46% lifespan reduction. Moreover, we show that nhr-6 regulates oxidative stress resistance in worms and does not affect the feeding behavior of worms. These findings imply the potential of nhr-6 as a common therapeutic target for aging and cancer ailments, stressing the power of in silico PPI network analysis coupled with RNAi screens to describe gene function. KW - Computer modelling KW - Embryonic induction KW - RNAi Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202666 VL - 9 ER - TY - THES A1 - AL-Hijailan, Reem Saud T1 - Establishment of endothelialized cardiac tissue using human induced pluripotent stem cells generated cardiomyocytes T1 - Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen N2 - Cardiovascular diseases are considered the leading cause of death worldwide according to the World Health Organization. Heart failure is the last stage of most of these diseases, where loss of myocardium leads to architectural and functional decline. The definitive treatment option for patients with CVDs is organ or tissue transplantation, which relies on donor availability. Therefore, generating an autologous bioengineered myocardium or heart could overcome this limitation. In addition, generating cardiac patches will provide ventricular wall support and enable reparative stem cells delivery to damaged areas. Although many hurdles still exist, a good number of researches have attempted to create an engineered cardiac tissue which can induce endogenous cardiac repair by replacing damaged myocardium. The present study provided cardiac patches in two models, one by a detergent coronary perfusion decellularization protocol that was optimized, and the other that resulted in a 3D cell-free extracellular matrix with intact architecture and preserved s-glycosaminoglycan and vasculature conduits. Perfusion with 1% Sodium dodecyle sulfate (SDS) under constant pressure resulted in cell-free porcine scaffold within two and cell-free rat scaffold in 7 days, whereas scaffold perfused with 4% sodium deoxycholate (SDO) was not able to remove cells completely. Re-reendothelialization of tissue vasculature was obtained by injecting human microvascular endothelial cell and human fibroblast in 2:1 ratio in a dynamic culture. One-week later, CD31 positive cells and endothelium markers were observed, indicating new blood lining. Moreover, functionality test of re-endothelialized tissue revealed improvement in clotting seen in decellularized tissues. When the tissue was ready to be repopulated, porcine induced pluripotent stem cells (PiPSc) were generated by transfected reprogramming of porcine skin fibroblast and then differentiated to cardiac cells following a robust protocol, for an autologous cardiac tissue model. However, due to the limitation in the PiPSc cell number, alternatively, human induced pluripotent stem cells generated cardiac cells were used. For reseeding a coculture of human iPSc generated cardiac cells, human mesenchymal stem cells and human fibroblast in 2:1:1 ratio respectively were used in a dynamic culture for 6-8 weeks. Contractions at different areas of the tissue were recorded at an average beating rate of 67 beats/min. In addition, positive cardiac markers (Troponin T), Fibroblast (vemintin), and mesenchymal stem cells (CD90) were detected. Not only that, but by week 3, MSC started differentiating to cardiac cells progressively until few CD90 positive cells were very few by week 6 with increasing troponin t positive cells in parallel. Electrophysiological and drug studies were difficult to obtain due to tissue thickness and limited assessment sources. However, the same construct was established using small intestine submucosa (SISer) scaffold, which recorded a spontaneous beating rate between 0.88 and 1.2 Hz, a conduction velocity of 23.9 ± 0.74 cm s−1, and a maximal contraction force of 0.453 ± 0.015 mN. Moreover, electrophysiological studies demonstrated a drug-dependent response on beating rate; a higher adrenalin frequency was revealed in comparison to the untreated tissue and isoproterenol administration, whereas a decrease in beating rate was observed with propranolol and untreated tissue. The present study demonstrated the establishment of vascularized cardiac tissue, which can be used for human clinical application. N2 - Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen KW - cardiac tissue KW - biological scaffolds KW - decellularization KW - induced pluripotent stem cells Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173979 ER - TY - THES A1 - Anany, Mohamed Ahmed Mohamed Mohamed T1 - Enhancement of Toll-like receptor3 (TLR3)-induced death signaling by TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) T1 - Verstärkung der Toll-like receptor3 (TLR3)-induzierten Todessignalisierung durch TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) N2 - Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) is a member of the TNF superfamily (TNFSF) and is as such initially expressed as type II class transmembrane glycoprotein from which a soluble ligand form can be released by proteolytic processing. While the expression of TWEAK has been detected at the mRNA level in various cell lines and cell types, its cell surface expression has so far only been documented for dendritic cells, monocytes and interferon-γ stimulated NK cells. The fibroblast growth factor-inducible-14 (Fn14) is a TRAF2-interacting receptor of the TNF receptor superfamily (TNFRSF) and is the only receptor for TWEAK. The expression of Fn14 is strongly induced in a variety of non-hematopoietic cell types after tissue injury. The TWEAK/Fn14 system induces pleiotropic cellular activities such as induction of proinflammatory genes, stimulation of cellular angiogenesis, proliferation, differentiation, migration and in rare cases induction of apoptosis. On the other side, Toll-like receptor3 (TLR3) is one of DNA- and RNA-sensing pattern recognition receptors (PRRs), plays a crucial role in the first line of defense against virus and invading foreign pathogens and cancer cells. Polyinosinic-polycytidylic acid poly(I:C) is a synthetic analog of dsRNA, binds to TLR3 which acts through the adapter TRIF/TICAM1, leading to cytokine secretion, NF-B activation, IRF3 nuclear translocation, inflammatory response and may also elicit the cell death. TWEAK sensitizes cells for TNFR1-induced apoptosis and necroptosis by limiting the availability of protective TRAF2-cIAP1 and TRAF2-cIAP2 complexes, which interact with the TNFR1-binding proteins TRADD and RIPK1. In accordance with the fact that poly(I:C)-induced signaling also involves these proteins, we found enhanced necroptosis-induction in HaCaT and HeLa-RIPK3 by poly(I:C) in the presence of TWEAK (Figure 24). Analysis of a panel of TRADD, FADD, RIPK1 and caspase-8 knockout cells revealed furthermore similarities and differences in the way how these molecules act in cell death signaling by poly(I:C)/TWEAK and TNF and TRAIL. RIPK1 turned out to be essential for poly(I:C)/TWEAK-induced caspase-8-mediated apoptosis but was dispensable for these responses in TNF and TRAIL signaling. Lack of FADD protein abrogated TRAIL- but not TNF- and poly(I:C)-induced necroptosis. Moreover, we observed that both long and short FLIP rescued HaCaT and HeLa-RIPK3 cells from poly(I:C)-induced apoptosis or necroptosis. To sum up, our results demonstrate that TWEAK, which is produced by interferon stimulated myeloid cells, controls the induction of apoptosis and necroptosis by the TLR3 ligand poly(I:C) and may thus contribute to cancer or anti-viral immunity treatment. N2 - Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie (TNFSF) und wird als solches anfänglich als Transmembranglykoprotein der Klasse II exprimiert, aus dem eine lösliche Ligandenform durch proteolytische Prozessierung freigesetzt werden kann. Während die Expression von TWEAK auf mRNA-Ebene in verschiedenen Zelllinien und Zelltypen nachgewiesen wurde, konnte ihre Zelloberflächenexpression bisher nur für dendritische Zellen, Monozyten und Interferon-γ-stimulierte NK-Zellen dokumentiert werden. Fibroblast growth factor-inducible-14 (Fn14) ist ein TRAF2-wechselwirkender Rezeptor der TNF-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) und der einzige Rezeptor für TWEAK. Die Expression von Fn14 wird nach Gewebeverletzung in einer Vielzahl von nicht hämatopoetischen Zelltypen stark induziert. Das TWEAK / Fn14-System induziert pleiotrope zelluläre Aktivitäten, die von der proinflammatorischen Geninduktion über die Stimulierung der Angiogenese, Proliferation und Zelldifferenzierung bis hin zur Zellmigration und in seltenen Fällen zur Induktion von Apoptose reichen. Auf der anderen Seite spielt der Toll-like Rezeptor3 (TLR3), einer der DNA- and RNA-sensing pattern recognition receptors (PRRs), eine entscheidende Rolle in der ersten Verteidigungslinie gegen Viren und eindringende fremde Krankheitserreger und Krebszellen. Polyinosin-Polycytidylsäure-Poly (I: C) ist ein synthetisches Analogon von dsRNA, das an TLR3 bindet, das über den Adapter TRIF / TICAM1 wirkt und zu Zytokinsekretion, NF-B-Aktivierung, IRF3-Kerntranslokation und Entzündungsreaktion führt der Zelltod. TWEAK sensibilisiert Zellen für TNFR1-induzierte Apoptose und Nekroptose, indem es die Verfügbarkeit von schützenden TRAF2-cIAP1- und TRAF2-cIAP2-Komplexen begrenzt, die mit den TNFR1-bindenden Proteinen TRADD und RIPK1 interagieren. Entsprechend der Tatsache, dass diese Proteine auch von Poly (I: C) induziert werden, fanden wir eine verstärkte Nekroptose-Induktion in HaCaT und HeLa-RIPK3 durch Poly (I: C) in Gegenwart von TWEAK (Figure 24). Die Analyse eines Panels von TRADD-, FADD-, RIPK1- und Caspase-8-Knockout-Zellen ergab außerdem Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Art und Weise, wie diese Moleküle bei der Zelltodsignalisierung durch Poly (I: C) / TWEAK und TNF und TRAIL wirken. RIPK1 erwies sich als essentiell für die Poly (I: C) / TWEAK-induzierte Caspase-8-vermittelte Apoptose, war jedoch für diese Reaktionen bei TNF- und TRAIL-Signalen entbehrlich. Das Fehlen von FADD-Protein hob TRAIL-, aber nicht TNF- und Poly (I: C) -induzierte Nekroptose auf. Darüber hinaus beobachteten wir, dass sowohl langes als auch kurzes FLIP HaCaT- und HeLa-RIPK3-Zellen vor Poly (I: C) -induzierter Apoptose oder Nekroptose retteten. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass TWEAK, das von Interferon-stimulierten myeloischen Zellen produziert wird, die Induktion von Apoptose und Nekroptose durch den TLR3-Liganden Poly(I: C) steuert und somit zur Krebsbehandlung oder antiviralen Immunität beitragen kann. KW - Immunologe KW - TLR3 KW - TWEAK KW - Krebs Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189757 ER - TY - JOUR A1 - Annunziata, Ida A1 - van de Vlekkert, Diantha A1 - Wolf, Elmar A1 - Finkelstein, David A1 - Neale, Geoffrey A1 - Machado, Eda A1 - Mosca, Rosario A1 - Campos, Yvan A1 - Tillman, Heather A1 - Roussel, Martine F. A1 - Weesner, Jason Andrew A1 - Fremuth, Leigh Ellen A1 - Qiu, Xiaohui A1 - Han, Min-Joon A1 - Grosveld, Gerard C. A1 - d'Azzo, Alessandra T1 - MYC competes with MiT/TFE in regulating lysosomal biogenesis and autophagy through an epigenetic rheostat JF - Nature Communications N2 - Coordinated regulation of the lysosomal and autophagic systems ensures basal catabolism and normal cell physiology, and failure of either system causes disease. Here we describe an epigenetic rheostat orchestrated by c-MYC and histone deacetylases that inhibits lysosomal and autophagic biogenesis by concomitantly repressing the expression of the transcription factors MiT/TFE and FOXH1, and that of lysosomal and autophagy genes. Inhibition of histone deacetylases abates c-MYC binding to the promoters of lysosomal and autophagy genes, granting promoter occupancy to the MiT/TFE members, TFEB and TFE3, and/or the autophagy regulator FOXH1. In pluripotent stem cells and cancer, suppression of lysosomal and autophagic function is directly downstream of c-MYC overexpression and may represent a hallmark of malignant transformation. We propose that, by determining the fate of these catabolic systems, this hierarchical switch regulates the adaptive response of cells to pathological and physiological cues that could be exploited therapeutically. KW - autophagy KW - cancer KW - cancer metabolism KW - cell biology KW - mechanisms of disease Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-221189 VL - 10 ER - TY - THES A1 - Awad, Eman Da'as T1 - Modulation of insulin-induced genotoxicity in vitro and genomic damage in gestational diabetes T1 - Modulation der Insulin-induzierten Genotoxizität in vitro und Genomschäden bei Frauen mit Gestationsdiabetes N2 - Diabetes mellitus is a global health problem, where the risk of diabetes increases rapidly due to the lifestyle changes. Patients with type II diabetes have many complications with increased risk of morbidity and mortality. High levels of insulin may lead to DNA oxidation and damage. Several studies proposed that hyperinsulinemia may be an important risk factor for various types of cancer. To investigate insulin signaling pathway inducing oxidative stress and genomic damage, pharmaceutical and natural compounds which can interfere with the insulin pathway including PI3K inhibitors, resveratrol, lovastatin, and RAD-001 were selected due to their beneficial effects against metabolic disorder. Thus, the anti-genotoxic potential of these compounds regarding insulin-mediated oxidative stress were investigated in normal rat kidney cells in vitro. Our compounds showed protective effect against genotoxic damage and significantly decreased reactive oxygen specious after treatment of cells with insulin with different mechanisms of protection between the compounds. Thus, these compounds may be attractive candidates for future support of diabetes mellitus therapy. Next, we explored the link between gestational diabetes mellitus and genomic damage in cells derived from human blood. Moreover, we investigated the influence of estradiol, progesterone, adrenaline and triiodothyronine on insulin-induced genomic damage in vitro. First, we studied the effect of these hormones in human promyelocytic leukemia cells and next ex vivo with non-stimulated and stimulated peripheral blood mononuclear cells. In parallel, we also measured the basal genomic damage using three conditions (whole blood, non-stimulated and stimulated peripheral blood mononuclear cells) in a small patient study including non-pregnant controls with/without hormonal contraceptives, with a subgroup of obese women, pregnant women, and gestational diabetes affected women. A second-time point after delivery was also applied for analysis of the blood samples. Our results showed that GDM subjects and obese individuals exhibited higher basal DNA damage compared to lower weight nonpregnant or healthy pregnant women in stimulated peripheral blood mononuclear cells in both comet and micronucleus assays. On the other hand, the DNA damage in GDM women had decreased at two months after birth. Moreover, the applied hormones also showed an influence in vitro in the enhancement of the genomic damage in cells of the control and pregnant groups but this damage did not exceed the damage which existed in obese and gestational diabetes mellitus patients with high level of genomic damage. In conclusion, insulin can induce genomic damage in cultured cells, which can be modulated by pharmaceutical and naturals substances. This may be for future use in the protection of diabetic patients, who suffer from hyperinsulinemia during certain disease stages. A particular form of diabetes, GDM, was shown to lead to elevated DNA damage in affected women, which is reduced again after delivery. Cells of affected women do not show an enhanced, but rather a reduced sensitivity for further DNA damage induction by hormonal treatment in vitro. A potential reason may be an existence of a maximally inducible damage by hormonal influences. N2 - Diabetes mellitus stellt eine globales Gesundheitsproblem dar, das aufgrund der sich ändernden Lebensführung rapide ansteigt. Bei Patienten mit Diabetes Typ II kommt es verstärkt zu Komplikationen, was eine erhöhte Morbidität und Mortalität zur Folge hat. Ein hoher Insulinspiegel kann zur DNA-Oxidation und damit zu DNA-Schäden führen. Diverse Studien postulieren, dass Hyperinsulinämie ein entscheidender Risikofaktor für verschiedene Krebserkrankungen darstellt. Zur Untersuchung des Insulin- Signaltransduktionsweg, über den oxidativer Stress und daraus resultierender Genomschäden induziert werden, wurden aus diversen Pharmazeutika und Naturstoffen, welche den Insulin-Signalweg beeinträchtigen, PI3K Inhibitoren, Resveratrol, Lovastatin und RAD-001 aufgrund ihrer positiven Effekte bei Stoffwechselerkrankungen, ausgewählt. Mit diesen Verbindungen wurde die anti-Genotoxizität (Schutzwirkung) hinsichtlich des durch Insulin induzierten oxidativen Stresses und Genomschadens in einer primären Nierenzelllinie der Ratte in vitro untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten protektive Effekte der ausgewählten Substanzen hinsichtlich genotoxischer Schäden sowie einen signifikanten Rückgang reaktiver Sauerstoffspezies bei insulinbehandelten Zellen, wobei der Wirkmechanismus zwischen den Substanzen jedoch unterschiedlich war. Somit handelt es sich bei den untersuchten Stoffen um äußerst interessante Verbindungen, die in der Zukunft Diabetes mellitus Therapien unterstützen könnten. Außerdem untersuchten wir den Zusammenhang zwischen Schwangerschaftsdiabetes und Genomschäden in humanen Blutzellen. Dafür verwendeten wir neben humanen HL-60 Zellen nicht stimulierte sowie mit Hilfe von Phytohemagglutinin (PHA) zur Aufnahme des Zellzyklus stimulierte periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden sowie von Gestationsdiabetes betroffenen Probandinnen. Wir analysierten zunächst den Einfluss von Östradiol, Progesteron, Adrenalin und Triiodthyronin auf den Genomschaden dieser Zellen in vitro.. Parallel dazu bestimmten wir in die basalen Genomschäden im Vollblut, in nicht stimulierten sowie in PHA-stimulierten peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Studie schloss nicht-schwangere Frauen mit bzw. ohne Einnahme hormoneller Kontrazeptiva sowie je eine Subgruppen mit übergewichtigen Frauen, gesunden schwangeren Frauen und Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes ein. Bei Schwangeren wurde einige Zeit nach der Entbindung eine zweite Blutuntersuchung durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes sowie übergewichtige Frauen im Vergleich zu normalgewichtigen, nicht-schwangeren Frauen sowie gesunden schwangeren Frauen mehr basale DNA-Schäden sowohl im Comet-Assay als auch im Mikrokern-Test in stimulierten peripheren mononuklearen Zellen aufweisen. Des Weiteren sanken die DNA-Schäden bei Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes zwei Monate nach der Geburt. Darüber hinaus verstärkten die verwendeten Hormone in vitro die zellulären Genomschäden, jedoch überstiegen sie nicht die größere Menge an DNA-Schäden, welche bei übergewichtigen Frauen bzw. Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes nachgewiesenen wurden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Insulin Zellschäden in vitro induzieren kann, die jedoch durch Pharmazeutika und Naturstoffen reguliert werden können. Diese Erkenntnis könnte zukünftig Diabetespatienten helfen, die an Hyperinsulinämie leiden. Schwangerschaftsdiabetes, eine besondere Form des Diabetes, führt zu erhöhten DNASchäden bei betroffenen Frauen, die sich nach der Geburt jedoch wieder verringern. Die Zellen betroffener Frauen zeigen keine erhöhte, sondern vielmehr eine verminderte Sensitivität für weiteren DNA-Schäden durch hormonelle Behandlung in vitro. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass eine maximal induzierbare Zahl an DNASchäden, die durch hormonelle Einflüsse bzw. daraus resultierenden Aktivierungen von Signalkaskaden hervorgerufen werden können, existiert. KW - Gestationsdiabetes KW - DNA-Schäden KW - Insulin KW - Gestational diabetes KW - DNA damage Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161866 ER - TY - THES A1 - Bach, Matthias T1 - Massenspektrometrische Analyse der Interaktionen von Protein mit Proteinen und Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen T1 - Protein-protein and small molecule-protein interaction analyzed by mass spectrometry N2 - Proteine können aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu identifizieren und zu validieren. Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zusätzliche Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu können (Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexität verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im nächsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus Hefe angewendet. Die Probenkomplexität ist hierbei 500 - 1000-fach höher als bei der Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren substöchiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden. Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt: 1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der während der Messung selektiv durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu vereinfachen. Die Funktionalität der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend können die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren von zwei Peptiden nicht der Fall wäre. Beim Quervernetzen der rekombinanten Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu bestätigende Crosslink zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierfür könnte eine zu kurze Linkerlänge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschränkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da das Spalten des Linkers einen zusätzlichen Intensitätsverlust für die folgende Identifizierung der Peptide mit sich bringt. 2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um während der Messung direkt nach diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierfür war, dass quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur Hälfte enzymatisch mit 18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8 Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann während der Messung direkt gesucht werden. Die vollständige Markierung von Peptiden mit 18O wurde zunächst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich heraus, dass der enzymatische Rücktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die Markierungseffizienz von Aminosäuren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollständige Markierung für alle Peptide erreichen, was für diese Strategie essentiell gewesen wäre. 3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das Quervernetzen von Proteinen entstehen zusätzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE, die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensitätsmaxima der Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zusätzlichen Fraktionen gefunden werden, was den indirekten Nachweis für eine Interaktion darstellt. Die Funktionalität der Strategie konnte somit bestätigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50 Proteine in einer Fraktion, können potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet. Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten Bindungspartner wurde über quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und Überlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms (MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α- acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen möglichen Therapieansatz dar, wenn er zusammen mit hitzestressauslösenden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Armadillodomäne innerhalb der potentiellen Drug targets signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl Aminocarboxamide dar. Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat angereichert, deren Vorläufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende- und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell für das Spleißen in-vivo sind. Hierzu gehören mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren 3A und 3B. Die Veränderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst. N2 - Based on the huge biochemical variety of proteins they can interact in many different ways with other proteins or small molecules. The first part of this work is about protein-Protein interactions which were investigated with chemical crosslinking. The aim of this work was the development of new and improved methods for the construction of interaction networks. The second part is about protein-small molecule interactions to identify new drug targets with subsequent validation. Mass spectrometry (MS) is a powerful tool to investigate all protein-protein interactions after enrichment from a cell lysate (Co-IP). By adding crosslinking to Co-IP experiments it is possible to create a topology map which is important to differenciate between direct and indirect interactions. To validate the crosslinking procedure, a commercial available crosslinker and recombinant proteins of known interaction partners with low sample complexity were used. The interaction partners NPL4 and UFD1 were successfully crosslinked with BS3 and crosslinked peptides were identified with MS. Next step was to apply this workflow on the Co-IP of the yeast mediator complex. Here the sample complexity is 500 to 1000 times higher than with recombinant proteins. After successfully crosslinking, a topology map of the subunits of the mediator complex was created. The result matches the latest model of the complex. Crosslinks to known interation partners, like the RNA-Pol II, were not identified because of their substoichiometric enrichment. Because of the known limitations of protein crosslinking, new and improved methods were developed: 1. Application of the MS-cleavable crosslinker DSSO, which could be cleaved with low collision energy, to improve the database search of crosslinked peptides. Proof of concept was done by crosslinking Cytochrom C. In the first fragmentation step only DSSO is cleaved. Fragmentation of the separated peptides is done in the next step with higher energy. Peptid fragments are compatible with a standard database search. The application of this method on the interacting proteins UBX and p97N failed because the predicted crosslink could not be identified. This could be due to the lack of linker length of DSSO. But more important, this experiment revealed the drawbacks of the DSSO approach. Trypsin is needed because this leads to a positive charge on the C-Terminus. Furthermore large amounts of protein are required to reach the needed intensity for all fragmentation steps. 2. Since the low abundancy of crosslinked peptides is the main issue for their identification, a new method was developed to directly search for them during the MS measurement. The defining criterion for this search was the occurrence of two C-termini in crosslinked peptides. Samples were splitted, labeled with 18O or 16O, and mixed again to generate a mass shift of 8 Da which is unique for crosslinked peptides. This mass shift can be used to directly search for these peptides during the measurement. Proof of concept was tested by labeling beta-galactosidase. Complete labeling could not be reached because of enzymatic back-exchange from 18O with 16O. Furthermore the neighbouring amino acids at the C-termini influence the labeling efficiency. Due to the incomplete labeling, the method could not be used for identifying crosslinked peptides. 3. To circumvent all problems which occur with the identification of crosslinked peptides, another method was developed to identifiy crosslinked proteins by their mass shift after separation on a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). By crosslinking proteins additional protein bands are generated which appear in the upper part of the gel. All proteins in this region are potential interation partners. Proof of concept was done by enrichment (Co-IP) of the yeast mediator complex from a cell lysate with subsequent crosslinking. From the LC-MS/MS data, profiles for every protein of the complex were generated. The additionally generated crosslink intensity peaks of interacting subunits overlapped with each other, which is the indirect proof of the functionality of this approach. The main problem with this strategy is the low separation performance. When about 50 proteins are located in one fraction, it is not possible to unambiguously match a protein to a specific subunit of the protein complex. In the second part of this work, the interactions of proteins with small molecules were investigated by mass spectrometry, to identify potential drug targets. Biotinylated versions of active compounds were immobilized to magnetic streptavidin beads and incubated with INA6 cell lysate. By quantitiative analysis of proteins, which bind to the control beads and proteins, which bind to the inhibitor beads, potential drug targets were identified. With the used α-acyl aminocarboxamides several protein complexes and interacting proteins were specifically enriched. These included the four kinases DNA-PK, ATM, ATR and mTOR, which are involved in oncogenic signaling and survival mechanisms. Moreover it is known, that the DNA-PK interacts with HSF1 and therefore regulates the HSF1-mediated heat shock response. The inhibition of DNA-PK, ATM, ATR and mTOR with α-acyl aminocarboxamides is a new therapeutic opportunity when it is combined with other substances which trigger the heat shock response. A potential binding site of the α-acyl aminocarboxamides is the armadillo domain, because it was significantly enriched among the potential drug targets. Several naphtylisochinolines were also biotinylated, immobilized and incubated with INA6 cell lysate. Precursors of these substances showed activity against multiple myeloma cells and the malaria pathogen Plasmodium falciparum. Here we could enrich proteins which are associated with RNA-binding and mRNA splicing, including several subunits of the splicing factors 3A and 3B, which are essential for splicing. The change of the transcriptional regulation and the resulting effect on cancer cells by influencing mRNA splicing is already known and was shown by other inhibitors like Spliceostatin A. KW - Massenspektrometrie KW - Proteininteraktionen KW - Molekulare Zielstrukturen KW - Proteinquervernetzungen KW - Methodenentwicklung KW - Mass spectrometry KW - Protein interactions KW - Drug targets KW - Protein crosslinking KW - Method development Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160462 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER - TY - THES A1 - Baur, Florentin Philipp T1 - Establishment of a 3D tumour model and targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer T1 - Entwicklung eines 3D Tumormodells und zielgerichtete Behandlung von BRAF-mutiertem kolorektalen Karzinom N2 - Cancer remains after cardiovascular diseases the leading cause of death worldwide and an estimated 8.2 million people died of it in 2012. By 2030, 13 million cancer deaths are expected due to the growth and ageing of the population. Hereof, colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men and the second in women with a wide geographical variation across the world. Usually, CRC begins as a non-cancerous growth leading to an adenomatous polyp, or adenoma, arising from glandular cells. Since research has brought about better understanding of the mechanisms of cancer development, novel treatments such as targeted therapy have emerged in the past decades. Despite that, up to 95% of anticancer drugs tested in clinical phase I trials do not attain a market authorisation and hence these high attrition rates remain a key challenge for the pharmaceutical industry, making drug development processes enormously costly and inefficient. Therefore, new preclinical in vitro models which can predict drug responses in vivo more precisely are urgently needed. Tissue engineering not only provides the possibility of creating artificial three-dimensional (3D) in vitro tissues, such as functional organs, but also enables the investigation of drug responses in pathological tissue models, that is, in 3D cancer models which are superior to conventional two-dimensional (2D) cell cultures on petri dishes and can overcome the limitations of animal models, thereby reducing the need for preclinical in vivo models. In this thesis, novel 3D CRC models on the basis of a decellularised intestinal matrix were established. In the first part, it could be shown that the cell line SW480 exhibited different characteristics when grown in a 3D environment from those in conventional 2D culture. While the cells showed a mesenchymal phenotype in 2D culture, they displayed a more pronounced epithelial character in the 3D model. By adding stromal cells (fibroblasts), the cancer cells changed their growth pattern and built tumour-like structures together with the fibroblasts, thereby remodelling the natural mucosal structures of the scaffold. Additionally, the established 3D tumour model was used as a test system for treatment with standard chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU). The second part of the thesis focused on the establishment of a 3D in vitro test system for targeted therapy. The US Food and Drug Administration has already approved of a number of drugs for targeted therapy of specific types of cancer. For instance, the small molecule vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™) which demonstrated impressive response rates of 50–80% in melanoma patients with a mutation of the rapidly accelerated fibrosarcoma oncogene type B (BRAF) kinase which belongs to the mitogen active protein kinase (MAPK) signalling pathway. However, only 5% of CRC patients harbouring the same BRAF mutation respond to treatment with vemurafenib. An explanation for this unresponsiveness could be a feedback activation of the upstream EGFR, reactivating the MAPK pathway which sustains a proliferative signalling. To test this hypothesis, the two early passage cell lines HROC24 and HROC87, both presenting the mutation BRAF V600E but differing in other mutations, were used and their drug response to vemurafenib and/or gefitinib was assessed in conventional 2D cell culture and compared to the more advanced 3D model. Under 3D culture conditions, both cell lines showed a reduction of the proliferation rate only in the combination therapy approach. Furthermore, no significant differences between the various treatment approaches and the untreated control regarding apoptosis rate and viability for both cell lines could be found in the 3D tumour model which conferred an enhanced chemoresistance to the cancer cells. Because of the observed unresponsiveness to BRAF inhibition by vemurafenib as can be seen in the clinic for patients with BRAF mutations in CRC, the cell line HROC87 was used for further xenografting experiments and analysis of activation changes in the MAPK signalling pathway. It could be shown that the cells presented a reactivation of Akt in the 3D model when treated with both inhibitors, suggesting an escape mechanism for apoptosis which was not present in cells cultured under conventional 2D conditions. Moreover, the cells exhibited an activation of the hepatocyte growth factor receptor (HGFR, c-Met) in 2D and 3D culture, but this was not detectable in the xenograft model. This shows the limitations of in vivo models. The results suggest another feedback activation loop than that to the EGFR which might not primarily be involved in the resistance mechanism. This reflects the before mentioned high attrition rates in the preclinical drug testing. N2 - Krebs ist nach Herz- und Kreislauferkrankungen die führende Todesursache weltweit und 2012 starben daran geschätzt 8,2 Millionen Menschen. Für das Jahr 2030 werden 13 Millionen Krebstote erwartet, was auf das Bevölkerungswachstum und deren Überalterung zurückzuführen ist. Dabei ist das kolorektale Karzinom (engl. colorectal cancer, CRC) der dritthäufigste Krebs bei Männern und der zweithäufigste bei Frauen. Für gewöhnlich entwickelt sich CRC aus einem nicht-kanzerösen Wachstum, das zu einem adenomatösen Polyp bzw. Adenom führt, welches aus Drüsenzellen hervorgeht. Da die Forschung in den vergangenen Jahrzehnten ein besseres Verständnis für die Mechanistik der Krebsentstehung hervorgebracht hat, entstanden neuartige Behandlungsformen, wie die zielgerichtete Krebstherapie. Hohe Versagensraten, welche den Medikamentenentwicklungsprozess sehr kostenaufwendig und ineffizient machen, bleiben eine entscheidende Herausforderung für die pharmazeutische Industrie. Deshalb werden dringend neue präklinische in vitro Modelle, die bessere in vivo Wirkungsvorhersagen liefern, benötigt. Das Tissue Engineering bietet die Möglichkeit künstliche dreidimensionale (3D) in vitro Gewebe herzustellen, z.B. funktionelle Organe, aber es ermöglicht auch, die Reaktion auf ein Medikament in pathologischen Gewebemodellen, wie beispielsweise Krebsmodelle, zu untersuchen. Diese sind der konventionellen zweidimensionalen (2D) Zellkultur in Petrischalen überlegen und können die begrenzten Möglichkeiten von Tiermodellen erweitern, was zudem die Notwendigkeit für präklinische in vivo Modelle vermindert. In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige 3D CRC Modelle auf Basis einer dezellularisierten intestinalen Matrix entwickelt. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass die Zelllinie SW480 verschiedene Charakteristika bezüglich des Wachstums in der konventionellen 2D Zellkultur oder der 3D Umgebung aufwies. Im Gegensatz zu den mesenchymalen Eigenschaften der Zellen in der 2D Zellkultur, zeigten sie im 3D Modell einen betonteren epithelialen Charakter. Durch das Hinzufügen von Fibroblasten änderten die Krebszellen ihr Wachstumsverhalten und sie bildeten zusammen tumorartige Strukturen aus, wobei die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, Krypten und Villi, umgebaut wurden. Zusätzlich wurde das entwickelte 3D Tumormodell als Testsystem für das Standardchemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) herangezogen. Der zweite Teil der Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung eines 3D in vitro Testsystems für die zielgerichtete Behandlung. Es gibt schon eine Reihe von der US Food and Drug Administration zugelassenen Medikamente für die zielgerichtete Behandlung spezifischer Tumorentitäten, wie z.B. Vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™), das eindrucksvolle Ansprechraten von 50–80% bei Melanompatienten mit BRAF-Mutation erzielt. Trotzdem sprechen nur 5% der CRC-Patienten mit der gleichen BRAF-Mutation auf die Behandlung mit Vemurafenib an. Gründe für diese Unempfindlichkeit könnte eine Rückkoppelung zum aufwärtsgelegenen EGFR sein, der das Signal zur Proliferation aufrecht erhält. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die zwei Zelllinien HROC24 und HROC87, die beide die BRAF V600E-Mutation tragen aber sich in anderen Mutationen unterscheiden, mit Vemurafenib und/oder Gefitinib behandelt und das Ansprechen auf die Substanzen in der herkömmlichen 2D Zellkultur sowie im fortschrittlicheren 3D Modell verglichen. In 3D Kulturbedingungen zeigten beide Zelllinien eine Senkung der Proliferation nur im Kombinationstherapie-Ansatz. Außerdem wurden bei den 3D Modellen keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsansätzen und der unbehandelten Kontrolle, hinsichtlich der Apoptoserate und Viabilität, gefunden. Das deutet auf eine erhöhte Chemoresistenz der Krebszellen in der 3D Umgebung hin. Wegen der vorhandenen Unempfindlichkeit der Zelllinie HROC87 gegenüber der BRAF-Inhibierung mit Vemurafenib, wie es auch in der Klinik im Fall von Patienten mit BRAF-Mutation des CRC beobachtet werden kann, wurden diese Zellen für weitere Xenograft-Experimente und Analysen von Aktivierungsunterschieden im MAPK-Signaltransduktionsweg herangezogen. Weiterhin zeigten die Zellen eine Aktivierung des „hepatocyte growth factor receptor“ (HGFR, c-Met) in 2D und 3D Zellkultur, der jedoch nicht im Xenograft-Modell zu sehen war, was die limitierte Übertragbarkeit von Ergebnissen des Tiermodells auf den Menschen verdeutlicht. Dies spiegelt wiederum die obenstehend erwähnten hohen Versagensraten in der präklinischen Medikamententestung wider. Zusammengefasst kann das Tissue Engineering Möglichkeiten zur Herstellung und Entwicklung neuartiger 3D Testsysteme bieten, welche besser die in vivo Situation abbilden. Für eine Medikamententestung in Übereinstimmung mit personalisierter Medizin eröffnet das 3D Tumormodell vielversprechende Wege, welche in Zukunft das präklinische Screening verbessern sowie die hohen Versagensraten und Tierversuche vermindern könnten. KW - Dickdarmtumor KW - Therapie KW - BRAF-mutant KW - colorectal cancer KW - targeted therapy KW - 3D tumour model KW - BRAF-mutiert KW - kolorektales Karzinom KW - zielgerichtete Behandlung KW - 3D Tumormodell KW - In vitro KW - 3D KW - tumour Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174129 ER - TY - THES A1 - Beck, Sebastian T1 - Using optogenetics to influence the circadian clock of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Die Verwendung der Optogenetik zur Beeinflussung der circadianen Uhr von \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s. The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network. The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all. N2 - Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken. Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen. KW - Chronobiologie KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Optogenetics KW - Chronobiology KW - Channelrhodopsin KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184952 ER - TY - JOUR A1 - Beer, Katharina A1 - Schenk, Mariela A1 - Helfrich-Förster, Charlotte A1 - Holzschuh, Andrea T1 - The circadian clock uses different environmental time cues to synchronize emergence and locomotion of the solitary bee Osmia bicornis JF - Scientific Reports N2 - Life on earth adapted to the daily reoccurring changes in environment by evolving an endogenous circadian clock. Although the circadian clock has a crucial impact on survival and behavior of solitary bees, many aspects of solitary bee clock mechanisms remain unknown. Our study is the first to show that the circadian clock governs emergence in Osmia bicornis, a bee species which overwinters as adult inside its cocoon. Therefore, its eclosion from the pupal case is separated by an interjacent diapause from its emergence in spring. We show that this bee species synchronizes its emergence to the morning. The daily rhythms of emergence are triggered by temperature cycles but not by light cycles. In contrast to this, the bee’s daily rhythms in locomotion are synchronized by light cycles. Thus, we show that the circadian clock of O. bicornis is set by either temperature or light, depending on what activity is timed. Light is a valuable cue for setting the circadian clock when bees have left the nest. However, for pre-emerged bees, temperature is the most important cue, which may represent an evolutionary adaptation of the circadian system to the cavity-nesting life style of O. bicornis. KW - Behavioural ecology KW - Evolutionary developmental biology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202721 VL - 9 ER -