TY - JOUR A1 - Figueiredo, Ludmilla A1 - Krauss, Jochen A1 - Steffan-Dewenter, Ingolf A1 - Cabral, Juliano Sarmento T1 - Understanding extinction debts: spatio-temporal scales, mechanisms and a roadmap for future research JF - Ecography N2 - Extinction debt refers to delayed species extinctions expected as a consequence of ecosystem perturbation. Quantifying such extinctions and investigating long‐term consequences of perturbations has proven challenging, because perturbations are not isolated and occur across various spatial and temporal scales, from local habitat losses to global warming. Additionally, the relative importance of eco‐evolutionary processes varies across scales, because levels of ecological organization, i.e. individuals, (meta)populations and (meta)communities, respond hierarchically to perturbations. To summarize our current knowledge of the scales and mechanisms influencing extinction debts, we reviewed recent empirical, theoretical and methodological studies addressing either the spatio–temporal scales of extinction debts or the eco‐evolutionary mechanisms delaying extinctions. Extinction debts were detected across a range of ecosystems and taxonomic groups, with estimates ranging from 9 to 90% of current species richness. The duration over which debts have been sustained varies from 5 to 570 yr, and projections of the total period required to settle a debt can extend to 1000 yr. Reported causes of delayed extinctions are 1) life‐history traits that prolong individual survival, and 2) population and metapopulation dynamics that maintain populations under deteriorated conditions. Other potential factors that may extend survival time such as microevolutionary dynamics, or delayed extinctions of interaction partners, have rarely been analyzed. Therefore, we propose a roadmap for future research with three key avenues: 1) the microevolutionary dynamics of extinction processes, 2) the disjunctive loss of interacting species and 3) the impact of multiple regimes of perturbation on the payment of debts. For their ability to integrate processes occurring at different levels of ecological organization, we highlight mechanistic simulation models as tools to address these knowledge gaps and to deepen our understanding of extinction dynamics. KW - Anthropocene KW - biotic interaction KW - extinction dynamics KW - mechanistic modelling KW - time lag KW - transient dynamics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204859 VL - 42 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Grebinyk, Anna A1 - Prylutska, Svitlana A1 - Buchelnikov, Anatoliy A1 - Tverdokhleb, Nina A1 - Grebinyk, Sergii A1 - Evstigneev, Maxim A1 - Matyshevska, Olga A1 - Cherepanov, Vsevolod A1 - Prylutskyy, Yuriy A1 - Yashchuk, Valeriy A1 - Naumovets, Anton A1 - Ritter, Uwe A1 - Dandekar, Thomas A1 - Frohme, Marcus T1 - C60 fullerene as an effective nanoplatform of alkaloid Berberine delivery into leukemic cells JF - Pharmaceutics N2 - A herbal alkaloid Berberine (Ber), used for centuries in Ayurvedic, Chinese, Middle-Eastern, and native American folk medicines, is nowadays proved to function as a safe anticancer agent. Yet, its poor water solubility, stability, and bioavailability hinder clinical application. In this study, we have explored a nanosized carbon nanoparticle—C60 fullerene (C60)—for optimized Ber delivery into leukemic cells. Water dispersions of noncovalent C60-Ber nanocomplexes in the 1:2, 1:1, and 2:1 molar ratios were prepared. UV–Vis spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), and atomic force microscopy (AFM) evidenced a complexation of the Ber cation with the negatively charged C60 molecule. The computer simulation showed that π-stacking dominates in Ber and C\(_{60}\) binding in an aqueous solution. Complexation with C\(_{60}\) was found to promote Ber intracellular uptake. By increasing C\(_{60}\) concentration, the C\(_{60}\)-Ber nanocomplexes exhibited higher antiproliferative potential towards CCRF-CEM cells, in accordance with the following order: free Ber < 1:2 < 1:1 < 2:1 (the most toxic). The activation of caspase 3/7 and accumulation in the sub-G1 phase of CCRF-CEM cells treated with C\(_{60}\)-Ber nanocomplexes evidenced apoptosis induction. Thus, this study indicates that the fast and easy noncovalent complexation of alkaloid Ber with C\(_{60}\) improved its in vitro efficiency against cancer cells. KW - C60 fullerene KW - Berberine KW - noncovalent nanocomplex KW - UV–Vis KW - DLS and AFM measurements KW - drug release KW - leukemic cells KW - uptake KW - cytotoxicity KW - apoptosis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193216 SN - 1999-4923 VL - 11 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Sauer, Mark T1 - Die microRNA-26 Familie kontrolliert über den REST-Komplex ein für die Neurogenese essentielles regulatorisches RNA Netzwerk T1 - The microRNA-26 family controls a regulatory RNA network which is essential for neurogenesis via the REST-complex N2 - In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert. Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt. N2 - The spatio-temporal control of gene expression in a developing multicellular organism is a key determinant for the formation, cellular identity and function of cells. The REST (repressor element silencing transcription factor) complex plays a crucial role in the process of neuronal differentiation and the maintenance of the neuronal status by suppressing neuronal genes which contain a RE1 (repressor element 1) recognition sequence within their promotor region in non-neuronal cells or in neural progenitors. During neuronal differentiation, the REST complex is gradually inactivated, leading to the initiation of a neuronal gene expression program. It is therefore assumed that the regulation of the REST complex is an essential component for the initiation of neurogenesis. Critical effector proteins of the REST complex are small phosphatases (CTDSPs = C-terminal domain small phosphatases), which reduces the polymerase II activity on target genes. In zebrafish it was shown that the REST complex-associated phosphatase ctdsp2 is negatively regulated by miR-26b. All miR-26 family members are evolutionarily conserved in vertebrates and located in introns of Ctdsp genes. Furthermore the miR-26 family members repress their own host genes through an intrinsic autoregulatory negative feedback loop. In this study, a murine embryonic stem cell (ESC) -based neural differentiation paradigm was used as a model system for neurogenesis. To analyze the function of the miR-26 family, the CRISPR/Cas9 technology was employed to generate various miR-26 knockout (KO) ESC lines, with deletions of individual family members and the entire miR-26 family in the genome of ESCs. These miR-26-deficient ESCs retained their pluripotency and did not show altered proliferation, morphology, or cell identity during neural differentiation up to the neural progenitor cell (NPC) stage. However, deletion of the entire miR-26 family as well as of single members disrupted the terminal differentiation and led to a specific developmental arrest at the NPC stage and consequently a strong reduction of neuron and astroglia cell frequencies. Global gene expression analyses in differentiated miR-26-KO ESCs further revealed that genes, which are associated with neurogenesis, neuronal differentiation, but also gliogenesis, were downregulated. The absence of the miR-26 familiy resulted in the selective reduction of a specific set of miRNAs (REST-miRs), which on the one hand suppress the expression of REST complex components and on the other hand are themselves under the transcriptional control of the REST complex. Among others, several miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 and miR-218), which play an important role in various processes of neuronal development, belong to this REST-miR network. Moreover, the miR-26-KO led to the derepression of REST and CTDSP2 protein levels during terminal differentiation. Functional analyses with miRNA mimics showed that increased miR-26 levels resulted in an upregulation of REST-miRs. Further experiments aimed at elucidating the hierarchy of REST-miR regulation revealed that the miR-26 family act upstream to regulate RESTmiR expression and presumably has an initial function in the regulation of this network. Taken together, the data presented in this work suggest that the miR-26 family act as an initiator for the stepwise inactivation of the REST complex during neural differentiation. Therefore, these findings are consistent with the notion that the miR-26 family represents a central regulator for neural progenitor cell differentiation into postmitotic neurons. KW - Neurogenese KW - miR-26 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184008 ER - TY - INPR A1 - Dandekar, Thomas T1 - Biological heuristics applied to cosmology suggests a condensation nucleus as start of our universe and inflation cosmology replaced by a period of rapid Weiss domain-like crystal growth N2 - Cosmology often uses intricate formulas and mathematics to derive new theories and concepts. We do something different in this paper: We look at biological processes and derive from these heuristics so that the revised cosmology agrees with astronomical observations but does also agree with standard biological observations. We show that we then have to replace any type of singularity at the start of the universe by a condensation nucleus and that the very early period of the universe usually assumed to be inflation has to be replaced by a period of rapid crystal growth as in Weiss magnetization domains. Impressively, these minor modifications agree well with astronomical observations including removing the strong inflation perturbations which were never observed in the recent BICEP2 experiments. Furthermore, looking at biological principles suggests that such a new theory with a condensation nucleus at start and a first rapid phase of magnetization-like growth of the ordered, physical laws obeying lattice we live in is in fact the only convincing theory of the early phases of our universe that also is compatible with current observations. We show in detail in the following that such a process of crystal creation, breaking of new crystal seeds and ultimate evaporation of the present crystal readily leads over several generations to an evolution and selection of better, more stable and more self-organizing crystals. Moreover, this explains the “fine-tuning” question why our universe is fine-tuned to favor life: Our Universe is so self-organizing to have enough offspring and the detailed physics involved is at the same time highly favorable for all self-organizing processes including life. This biological theory contrasts with current standard inflation cosmologies. The latter do not perform well in explaining any phenomena of sophisticated structure creation or self-organization. As proteins can only thermodynamically fold by increasing the entropy in the solution around them we suggest for cosmology a condensation nucleus for a universe can form only in a “chaotic ocean” of string-soup or quantum foam if the entropy outside of the nucleus rapidly increases. We derive an interaction potential for 1 to n-dimensional strings or quantum-foams and show that they allow only 1D, 2D, 4D or octonion interactions. The latter is the richest structure and agrees to the E8 symmetry fundamental to particle physics and also compatible with the ten dimensional string theory E8 which is part of the M-theory. Interestingly, any other interactions of other dimensionality can be ruled out using Hurwitz compositional theorem. Crystallization explains also extremely well why we have only one macroscopic reality and where the worldlines of alternative trajectories exist: They are in other planes of the crystal and for energy reasons they crystallize mostly at the same time, yielding a beautiful and stable crystal. This explains decoherence and allows to determine the size of Planck´s quantum h (very small as separation of crystal layers by energy is extremely strong). Ultimate dissolution of real crystals suggests an explanation for dark energy agreeing with estimates for the “big rip”. The halo distribution of dark matter favoring galaxy formation is readily explained by a crystal seed starting with unit cells made of normal and dark matter. That we have only matter and not antimatter can be explained as there may be right handed mattercrystals and left-handed antimatter crystals. Similarly, real crystals are never perfect and we argue that exactly such irregularities allow formation of galaxies, clusters and superclusters. Finally, heuristics from genetics suggest to look for a systems perspective to derive correct vacuum and Higgs Boson energies. KW - heuristics KW - inflation KW - cosmology KW - crystallization KW - crystal growth KW - E8 symmetry KW - Hurwitz theorem KW - evolution KW - Lee Smolin Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183945 ER - TY - JOUR A1 - Beer, Katharina A1 - Schenk, Mariela A1 - Helfrich-Förster, Charlotte A1 - Holzschuh, Andrea T1 - The circadian clock uses different environmental time cues to synchronize emergence and locomotion of the solitary bee Osmia bicornis JF - Scientific Reports N2 - Life on earth adapted to the daily reoccurring changes in environment by evolving an endogenous circadian clock. Although the circadian clock has a crucial impact on survival and behavior of solitary bees, many aspects of solitary bee clock mechanisms remain unknown. Our study is the first to show that the circadian clock governs emergence in Osmia bicornis, a bee species which overwinters as adult inside its cocoon. Therefore, its eclosion from the pupal case is separated by an interjacent diapause from its emergence in spring. We show that this bee species synchronizes its emergence to the morning. The daily rhythms of emergence are triggered by temperature cycles but not by light cycles. In contrast to this, the bee’s daily rhythms in locomotion are synchronized by light cycles. Thus, we show that the circadian clock of O. bicornis is set by either temperature or light, depending on what activity is timed. Light is a valuable cue for setting the circadian clock when bees have left the nest. However, for pre-emerged bees, temperature is the most important cue, which may represent an evolutionary adaptation of the circadian system to the cavity-nesting life style of O. bicornis. KW - Behavioural ecology KW - Evolutionary developmental biology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202721 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Franke, Christian T1 - Advancing Single-Molecule Localization Microscopy: Quantitative Analyses and Photometric Three-Dimensional Imaging T1 - Weiterentwicklung von Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie: Quantitative Analysen und photometrische drei-dimensionale Bildgebung N2 - Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\ Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\ Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\ The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\ During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\ In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\ This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\ The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\ In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\ Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\ Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\ With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\ Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\ Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research. N2 - Seit ihrer ersten experimentellen Umsetzung in 2005 hat sich die Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie (\textit{engl.} single-molecule localization microscopy (SMLM)) als vielseitig einsetzbares Verfahren in der biologischen Bildgebung etabliert, vor allem aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens im Nanometer Bereich. Bis heute wurde eine Reihe neuer Erkenntnisse bezüglich der sub- und inter- zellulären Organisation durch den Einsatz der SMLM erlangt.\\ Aufgrund der Tatsache, dass alle SMLM Techniken auf dem Prinzip basieren, isolierte Fluorophore zu detektieren und zu analysieren, beinhalten SMLM Daten $per$ $definitionem$ molekulare Informationen.\\ Folgerichtig entwickelte sich das Feld der SMLM vom reinen Bildgebungsinstrument mit Nanometer-Auflösung hin zu quantitativer Mikroskopie, bei welcher der Fokus nicht länger vornehmlich auf dem hochaufgelöstem Bild, sondern vielmehr auf den Lokalisationsdaten liegt.\\ Die vorliegende Arbeit ist als Teil der anhaltenden Bestrebungen zu sehen, aus den $per$ $se$ molekularen Informationen der SMLM weiterführende Erkenntnisse über die strukturelle Organisation der markierten Proteine zu gewinnen. Obwohl mit der gleichen prinzipiellen Zielsetzung versehen, unterscheiden sich hierbei globale oder Segmentierungs- Clusteranalysen von Lokalisations-Meta-Analysen oder so genannten \textit{particle averaging} Ansätzen.\\ Während meiner Doktorarbeit habe ich verschiedene Quantifizierungs Ansätze entworfen, implementiert und angewendet, mit unterschiedlichen Graden an Komplexität und Breite des Anwendungsgebietes.\\ \\ In meinem ersten wesentlichem Projekt analysierte ich mit einem iterativen \textit{k}-means Algorithmus die Lokalisationsverteilung des integralen Proteins gp210, welches Teil des Kernporenkomplexes ist (\textit{engl.} nuclear pore complex (NPC)). Durch den Vergleich der charakteristischen Lokalisations-Statistik von separierten gp210 Domänen mit isolierten Fluoreszenzmarkern konnte unter anderem festgestellt werden, dass der Verankerungsring des NPC aus acht gp210 Homodimeren bestehen muss.\\ Diese Erkenntnis beantwortet zum einen eine jahrzehntealte Frage nach der Zusammensetzung des gp210 Rings und zum anderen liefert sie ein Beispiel dafür, dass durch eine geschickte Analyse der Lokalisationsstatistik strukturelle Informationen erlangt werden können, die jenseits des räumlichen Auflösungsvermögens von SMLM liegen.\\ \\ Das zweite hier vorgestellte wesentliche Projekt beinhaltet eine umfassende Studie des Synaptonemalen Komplexes (\textit{engl.} synaptonemal complex (SNC)) und damit verbundenen Cohesin Komplexen. Um die molekulare Organisation des SNC zu untersuchen, implementierte ich eine multi-level Meta-Analyse der Lokalisationsdaten mehrerer SNC Komponenten. Aus dessen Ergebnissen konnte ein neues drei dimensionales molekulares Modell des SNC erstellt werden.\\ Nachfolgend wurden die beiden murinen Cohesine SMC3 und STAG3 mit adaptierter Methodik untersucht. Hierbei musste die starke intrinsische Dispersion der Cohesin-Signale berücksichtigt werden. Die Analyse ergab deutliche Hinweise auf eine Polarisation der Cohesine innerhalb des SNC. Zudem zeigte sich eine mögliche Substruktur in der Organisation von STAG3, die unterhalb der Auflösungsgrenze von SMLM liegt.\\ \\ Weitere Nebenprojekte im Zusammenhang mit quantitativer Lokalisationsanalyse umfassten die Untersuchung der Lokalisationsverteilung von Plasma-Membran Glykanen, sowie zweier Flotillin Proteine in den Membranen von Bakterien, welche Cluster unterschiedlicher Form und Größe aufzeigten.\\ \\ Schließlich wird ein neuartiger Ansatz für dreidimensionale SMLM vorge-stellt, die auf der genauen Bestimmung von Einzel-Molekül Intensitäten basiert. Diese Methode, genannt TRABI, stützt sich auf die Prinzipien der Apertur Photometrie, welche für die SMLM angepasst und verbessert wurden.\\ Mit TRABI konnte gezeigt werden, dass weit verbreitete Lokalisations-Software, die auf $Gaussian-Fitting$ basiert, die Photonenzahl von Emittern oftmals stark unterschätzt. Diese Diskrepanz kann als $z$-abhängiger Parameter verwendet werden um z.B. einen 2D SMLM Datenatz in einen virtuellen 3D Raum zu überführen. Außerdem wird gezeigt, dass TRABI vorteilhaft mit einem multi-plane Detektionsschema kombiniert werden kann und dabei höhere axiale Lokalisationsgenauigkeiten und Auflösungen er-reicht.\\ Zudem wurde TRABI eingesetzt, um einen neuen Fluoreszenzfarbstoff für SMLM zu charakterisieren und dessen verbesserte photo-physikalische Eigenschaften auf Einzel-Molekül Basis zu demonstrieren.\\ Auch nach Abschluss dieser Arbeit ist die TRABI Methode und deren Anwendung weiterhin Gegenstand diverser Forschungen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - dSTORM Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156355 ER - TY - THES A1 - Pahlavan, Pirasteh T1 - Integrated Systems Biology Analysis; Exemplified on Potyvirus and Geminivirus interaction with \(Nicotiana\) \(benthamiana\) T1 - Integrierte Systeme Biologie Analyse, Beispiel für Potyvirus und Geminivirus Interaktion mit \(Nicotiana\) \(benthamiana\) N2 - Viral infections induce a significant impact on various functional categories of biological processes in the host. The understanding of this complex modification of the infected host immune system requires a global and detailed overview on the infection process. Therefore it is essential to apply a powerful approach which identifies the involved components conferring the capacity to recognize and respond to specific pathogens, which in general are defeated in so-called compatible virus-plant infections. Comparative and integrated systems biology of plant-virus interaction progression may open a novel framework for a systemic picture on the modulation of plant immunity during different infections and understanding pathogenesis mechanisms. In this thesis these approaches were applied to study plant-virus infections during two main viral pathogens of cassava: Cassava brown streak virus and African cassava mosaic virus. Here, the infection process was reconstructed by a combination of omics data-based analyses and metabolic network modelling, to understand the major metabolic pathways and elements underlying viral infection responses in different time series, as well as the flux activity distribution to gain more insights into the metabolic flow and mechanism of regulation; this resulted in simultaneous investigations on a broad spectrum of changes in several levels including the gene expression, primary metabolites, and enzymatic flux associated with the characteristic disease development process induced in Nicotiana benthamiana plants due to infection with CBSV or ACMV. Firstly, the transcriptome dynamics of the infected plant was analysed by using mRNA-sequencing, in order to investigate the differential expression profile according the symptom developmental stage. The spreading pattern and different levels of biological functions of these genes were analysed associated with the infection stage and virus entity. A next step was the Real-Time expression modification of selected key pathway genes followed by their linear regression model. Subsequently, the functional loss of regulatory genes which trigger R-mediated resistance was observed. Substantial differences were observed between infected mutants/transgenic lines and wild-types and characterized in detail. In addition, we detected a massive localized accumulation of ROS and quantified the scavenging genes expression in the infected wild-type plants relative to mock infected controls. Moreover, we found coordinated regulated metabolites in response to viral infection measured by using LC-MS/MS and HPLC-UV-MS. This includes the profile of the phytohormones, carbohydrates, amino acids, and phenolics at different time points of infection with the RNA and DNA viruses. This was influenced by differentially regulated enzymatic activities along the salicylate, jasmonate, and chorismate biosynthesis, glycolysis, tricarboxylic acid cycle, and pentose phosphate pathways, as well as photosynthesis, photorespiration, transporting, amino acid and fatty acid biosynthesis. We calculated the flux redistribution considering a gradient of modulation for enzymes along different infection stages, ranging from pre-symptoms towards infection stability. Collectively, our reverse-engineering study consisting of the generation of experimental data and modelling supports the general insight with comparative and integrated systems biology into a model plant-virus interaction system. We refine the cross talk between transcriptome modification, metabolites modulation and enzymatic flux redistribution during compatible infection progression. The results highlight the global alteration in a susceptible host, correlation between symptoms severity and the alteration level. In addition we identify the detailed corresponding general and specific responses to RNA and DNA viruses at different stages of infection. To sum up, all the findings in this study strengthen the necessity of considering the timing of treatment, which greatly affects plant defence against viral infection, and might result in more efficient or combined targeting of a wider range of plant pathogens. N2 - Virale Infektionen haben einen signifikanten Einfluss auf verschiedene funktionelle Eigenschaften und biologische Prozesse im Wirt. Das Verständnis dieser komplexen Modifikation des infizierten Wirtsimmunsystems benötigt eine globale und detaillierte Einsicht in den Infektionsprozess. Diese erfordert einen leistungsfähigen Ansatz zur Identifizierung der beteiligten Komponenten, welche eine Pathogen-Erkennung und Antwort vermitteln bzw. eine kompatible Virus-Pflanze-Infektion voraussetzen. Die Anwendung der vergleichenden und integrierten Systembiologie zur Untersuchung dieser Pflanzen-Virus-Interaktionen im Infektionsverlauf kann eine neue Grundlage zum systematischen Verständnis der Modulation des Immunsystems der Pflanze und der Pathogen-Mechanismen während verschiedener Infektionen eröffnen. In dieser Arbeit wenden wir diese Ansätze an, um Pflanzen-Virus-Infektionen der zwei häufigsten viralen Pathogenen von Maniok zu untersuchen, den Cassava brown streak virus (CBSV) und den African cassava mosaic virus (ACMV). Dazu rekonstruieren wir den Infektionsprozess durch die Kombination von „omics“ basierten Datenanalysen und metabolischen Netzwerkmodellen um die wichtigen Elemente des viralen Infektionsprozesses zu verschieden Zeitpunkten aufzuklären. Metabolische Flussanalysen geben Einblick in metabolische Umsätze und deren Regulierung. Diese simultanen Untersuchungen erfassen ein breites Spektrum der Virus-vermittelten Veränderungen im Wirt über mehrere „omics“ Ebenen, einschließlich Geneexpression, Primärmetabolite und enzymatischer Aktivitäten, die mit dem charakteristischen Krankheitsentwicklungsprozess assoziiert sind, der in Nicotiana benthamiana Pflanzen aufgrund einer Infektion mit CBSV oder ACMV induziert wurde. Zuerst wurde die Dynamik des Transkriptoms infizierter Pflanzen mittels mRNA-Sequenzierung analysiert um das differentielle Expressionsprofil nach dem Symptomentwicklungsstadium zu untersuchen. Die Expressionsmuster und die biologischen Funktionen dieser Gene wurden im Hinblick auf die Infektionsstufe und den Virus Einheiten aufgelöst. Ein nächster Schritt war die Echtzeit-Expressionsmodifikation ausgewählter Schlüsselprozess-Gene, gefolgt von der Umsetzung im linearen Regressionsmodell. Anschließend wurde der funktionelle Verlust von regulatorischen Genen ermittelt, welche eine R-vermittelte Resistenz auslösen können. Es wurden erhebliche Unterschiede zwischen infizierten Mutanten / transgenen Linien und Wild-typen beobachtet und im Detail charakterisiert. Darüber hinaus entdeckten wir eine massive lokalisierte Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies und quantifizierten die Expression von Abbauproteinen in den infizierten Wildtyp-Pflanzen relativ zu Mock-infizierten Kontrollen. Darüber hinaus fanden wir koordinierte regulierte Metaboliten als Reaktion auf eine virale Infektion, gemessen unter Verwendung von LC-MS / MS und HPLC-UV-MS Techniken. Dazu gehören die Analyse der Profile von Phytohormonen, Kohlenhydraten, Aminosäuren, und Phenolika zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion mit den RNA und DNA-Viren. Diese wurden beeinflusst durch die differentielle regulierten enzymatischen Aktivitäten entlang der Salicylat-, Jasmonat- und Chorismat-Biosynthese, der Glykolyse, Tricarbonsäure und Pentose-Phosphat-Umsetzung, der Photosynthese und Photorespiration, des Transportes und der Aminosäure sowie Fettsäure-Biosynthese. Wir berechneten die Umverteilung des metabolischen Flusses unter Berücksichtigung einer ansteigenden Beeinflussung von Enzymen in den verschiedeneren Infektionsstadien, die von Prä-Symptomen zur Infektionsstabilität reichen. Zusammengefasst beinhaltet unsere Reverse-Engineering-Studie die Generierung von experimentellen Daten und deren Modellierung mittels vergleichender und integrierter Systembiologie zum Einblick in das Modell-Pflanzen-Virus-Interaktionssystem. Wir lösten die Interaktion zwischen Transkriptom-Modifikation, Metabolitenmodulation und die Umverteilung des metabolischen Flusses während des kompatiblen Infektionsprozesses auf. Das Ergebnis zeigt die globalen Veränderungen in einem anfälligen Wirt auf, sowie die Korrelation zwischen Symptomschwere und der Stärke dieser Veränderungen. Darüber hinaus identifizieren wir im Detail die entsprechenden allgemeinen und spezifischen Reaktionen auf RNA und DNA-Viren in den verschiedenen Stadien der Infektion. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Erkenntnisse aus dieser Studie die Notwendigkeit aufzeigen, den zeitlichen Ablauf bei einer Pflanzenschutzbehandlung zu berücksichtigen, welche die pflanzliche Abwehr gegen eine Virusinfektion stark beeinflusst; und insgesamt zu einer effizienteren oder kombinierten Anwendung gegen ein breiteres Spektrum von Pflanzenpathogenen führen könnte. KW - RNA-seq KW - virus KW - next generation sequencing KW - transcriptome KW - fluxosome KW - metabolite profiling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153412 N1 - I also provided some supplementary data in digital version, which are available on-request from the dean's office. ER - TY - THES A1 - Horn, Jessica T1 - Molecular and functional characterization of the long non-coding RNA SSR42 in \(Staphylococcus\) \(aureus\) T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung der langen nicht-kodierenden RNA SSR42 in \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - Staphylococcus aureus asymptomatically colonizes the skin and anterior nares of 20-30% of the healthy human population. As an opportunistic human pathogen it elicits a variety of infections ranging from skin and soft tissue infections to highly severe manifestations such as pneumonia, endocarditis and osteomyelitis. Due to the emergence of multi resistant strains, treatment of staphylococcal infections becomes more and more challenging and the WHO therefore classified S. aureus as a “superbug”. The variety of diseases triggered by S. aureus is the result of a versatile expression of a large set of virulence factors. The most prominent virulence factor is the cytotoxic and haemolytic pore-forming α-toxin whose expression is mediated by a complex regulatory network involving two-component systems such as the agr quorum-sensing system, accessory transcriptional regulators and alternative sigma-factors. However, the intricate regulatory network is not yet understood in its entirety. Recently, a transposon mutation screen identified the AraC-family transcriptional regulator ‘Repressor of surface proteins’ (Rsp) to regulate haemolysis, cytotoxicity and the expression of various virulence associated factors. Deletion of rsp was accompanied by a complete loss of transcription of a 1232 nt long non-coding RNA, SSR42. This doctoral thesis focuses on the molecular and functional characterization of SSR42. By analysing the transcriptome and proteome of mutants in either SSR42 or both SSR42 and rsp, as well as by complementation of SSR42 in trans, the ncRNA was identified as the main effector of Rsp-mediated virulence. Mutants in SSR42 exhibited strong effects on transcriptional and translational level when compared to wild-type bacteria. These changes resulted in phenotypic alterations such as strongly reduced haemolytic activity and cytotoxicity towards epithelial cells as well as reduced virulence in a murine infection model. Deletion of SSR42 further promoted the formation of small colony variants (SCV) during long term infection of endothelial cells and demonstrated the importance of this molecule for intracellular bacteria. The impact of this ncRNA on staphylococcal haemolysis was revealed to be executed by modulation of sae mRNA stability and by applying mutational studies functional domains within SSR42 were identified. Moreover, various stressors modulated the transcription of SSR42 and antibiotic challenge resulted in SSR42-dependently increased haemolysis and cytotoxicity. Transcription of SSR42 itself was found under control of various important global regulators including AgrA, SaeS, CodY and σB, thereby illustrating a central position in S. aureus virulence gene regulation. The present study thus demonstrates SSR42 as a global virulence regulatory RNA which is important for haemolysis, disease progression and adaption of S. aureus to intracellular conditions via formation of SCVs. N2 - Staphylococcus aureus kolonisiert asymptomatisch als Kommensal die Haut und Nasenschleimhäute von circa 20-30% der gesunden Weltbevölkerung. Als opportunistisches Humanpathogen löst S. aureus dagegen eine Reihe von Krankheiten aus, die von leichten Hautinfektionen und Abszessen bis hin zu schwerwiegenden und lebensbedrohlichen Krankheitsformen wie Pneumonie, Endokarditis und Osteomyelitis reichen können. Die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen stellt aufgrund der Entstehung multi-resistenter Stämme vermehrt eine Herausforderung dar, weshalb S. aureus von der WHO als „superbug“ klassifiziert wurde. Die Vielzahl an möglichen Krankheitsformen sind das Ergebnis der anpassungsfähigen und koordinierten Expression einer Vielzahl von Virulenzfaktoren. Der dabei wohl bedeutendste und am besten charakterisierte Virulenzfaktor ist das porenbildende α-toxin, dessen zytotoxische und hämolytische Aktivität für eine Reihe diverser Krankheiten verantwortlich ist. Die Expression dieses Toxins wird durch ein komplexes, bis jetzt noch nicht komplett verstandenes, regulatorisches Netzwerk gesteuert, das sowohl Zwei-Komponentensysteme wie das agr Quorum-sensing System, diverse akzessorische transkriptionelle Regulatoren sowie alternative Sigmafaktoren beinhaltet. Kürzlich wurde in einem Transposon-Mutanten-Screen der AraC-Familie transkriptionelle Regulator „Repressor of surface proteins” (Rsp) identifiziert, der die Expression diverser Virulenz-assoziierter Faktoren beeinflusste. Eine Deletion von rsp ging, neben reduzierter Hämolyse und Zytotoxizität, auch mit dem kompletten Verlust der Transkription einer 1232 nt langen nicht-kodierenden RNA, SSR42, einher. Diese Doktorarbeit befasst sich mit der molekularen und funktionellen Charakterisierung dieser nicht-kodierenden RNA. Mittels Transkriptom- und Proteomanalysen wurden eine SSR42 Deletionsmutante sowie eine Doppelmutante in SSR42 und rsp charakterisiert und SSR42 als Hauptfaktor der Rsp-vermittelten Virulenzregulation identifiziert. Neben weitreichenden Veränderungen auf trans-kriptioneller und translationaler Ebene wiesen Mutanten in SSR42 eine stark reduzierte hämolytische und zytotoxische Aktivität sowie verringerte Virulenz in einem murinen Infektionsmodell auf. Eine Deletion von SSR42 begünstigte weiterhin die Bildung von sog. „small colony variants“ während Langzeit-Infektionen von Endothelzellen und demonstrierte die Bedeutung dieser nicht-codierenden RNA für intrazelluläre Staphylokokken. Die regulatorische Wirkung von SSR42 auf die hämolytische Aktivität von S. aureus wurde in dieser Arbeit aufgeklärt. Dabei konnte ein stabilisierender Einfluss der nicht-kodierenden RNA auf sae mRNA nachgewiesen werden. Weiterhin wurde SSR42 durch Mutagenese-Studien auf molekularer Ebene charakterisiert, wobei funktionelle und stabilisierende Domänen identifiziert wurden. Ebenso wurden in dieser Arbeit diverse Stressoren und Antibiotika erfasst, die eine modulatorische Wirkung auf die Transkription von SSR42 ausüben. Neben einer Erhöhung der Transkription von SSR42 resultierte eine Behandlung von S. aureus mit sub-inhibitorischen Konzentrationen von Antibiotika in einer drastischen, SSR42-abhängigen, Steigerung der hämolytischen und zytotoxischen Aktivität. Mithilfe von Promotoraktivitätsstudien wurde der Einfluss diverser Regulatoren wie AgrA, SaeS, CodY und σB auf die transkriptionellen Regulation von SSR42 identifiziert und SSR42 somit eine zentrale Rolle in der Regulation von Virulenzgenen verliehen. SSR42 wurde demnach als ein neuartiger globaler Regulator identifiziert, der eine wichtige Rolle für Hämolyse, den Krankheitsverlauf sowie bei der Anpassung an intrazelluläre Bedingungen, über die Bildung von „small colony variants“, spielt. KW - Staphylococcus aureus KW - Non-coding RNA KW - SSR42 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175778 ER - TY - THES A1 - Neubert, Franziska T1 - Markierung postsynaptischer Proteine für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie T1 - Labeling of postsynaptic proteins for super-resolution microscopy N2 - Das menschliche Gehirn ist ein Organ, das aufgrund seiner Komplexität und zellulären Diversität noch am wenigsten verstanden ist. Eine der Ursachen dafür sind zahlreiche Herausforderungen in diversen neurobiologischen Bild-gebungsverfahren. Erst seit der Erfindung der hochauflösenden Fluoreszenz-mikroskopie ist es möglich, Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze zu visua-lisieren und somit eine maximale Auflösung von bis zu 20 nm zu erreichen. Zusätzlich hängt die Fähigkeit, biologische Strukturen aufzulösen, von der Markierungs-größe und -dichte ab. Derzeit ist die häufigste Methode zur Proteinfärbung die indirekte Antikörperfärbung, bei der ein Fluorophor-markierter Sekundärantikörper an einen Epitop-spezifischen Primärantikörper bindet. Dabei kann der Abstand von Zielstruktur und Fluorophor bis zu 30 nm betragen, was eine Auflösungs-verminderung zur Folge haben kann. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit alternative Markierungsmethoden getestet, um postsynaptische Proteine sicht-bar zu machen. Zunächst wurde der postsynaptische N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor mit Hilfe konventioneller indirekter Antikörperfärbung markiert. Hier war die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors von besonderem Interesse, da diese in der Autoimmunerkrankung Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis invol-viert ist. Patienten dieser seltenen Krankheit bilden Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit, wodurch ein schneller reversibler Verlust der NMDA-Rezeptoren auf der Postsynapse induziert wird. Wichtige Informationen können nicht mehr ausreichend weitergegeben werden, was psychiatrische und neurologi-sche Störungen zur Folge hat. In dieser Arbeit wurden sowohl kommerzielle NR1-Antikörper, als auch rekombinante monoklonale NR1-Antikörper von Patien-ten mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis getestet. In konfokalen und in hochaufgelösten SIM- (engl. structured illumination microscopy) und dSTORM- (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) Messun-gen konnten kommerzielle NR1-Antikörper keine erfolgreichen Färbungen erzielen. Dagegen erwiesen sich die rekombinanten monoklonalen NR1-Patientenantikörper als sehr spezifisch, sowohl in primären Neuronen als auch im Hippocampus von murinen Gehirnschnitten und lieferten gute Kolokalisati-onen mit dem postsynaptischen Markerprotein Homer. Um die optische Auflösung zu verbessern, wurde eine neue Markierungs-methode mit sog. „Super-Binde-Peptiden“ (SBPs) getestet. SBPs sind modifi-zierte Peptide, die erhöhte Affinitäten und Spezifitäten aufweisen und mit ei-ner Größe von ~ 2,5 nm wesentlich kleiner als Antikörper sind. In dieser Arbeit bestätigte sich ein kleines hochspezifisches SPB, das an den Fluoreszenzfarb-stoff Tetra- methylrhodamin (TMR) gekoppelt ist, als effektiver Marker für das Ankerpro-tein Gephyrin. Gephyrin ist für die Lokalisation und Verankerung einiger post-synaptischer Rezeptoren zuständig, indem es sie mit dem Cytoskelett der Zelle verbindet. SIM-Messungen in primären Neuronen zeigten eine bessere Clus-terrepräsentation bei der Färbung von Gephyrin mit SBPs, als mit Antikörper-färbung. Zusätzlich wurden Kolokalisationsanalysen von Gephyrin zusammen mit dem inhibito-rischen präsynaptischen vesikulären GABA-Transporter VGAT durchgeführt. Eine weitere Färbemethode stellte die bioorthogonale Click-Färbung durch die Erweiterung des eukaryotischen genetischen Codes (engl. genetic code ex-pansion, GCE) dar. Dabei wurde eine unnatürliche, nicht-kanonische Amino-säure (engl. non-canonical amino acid, ncAA) ins Zielprotein eingebaut und in Kombination mit der Click-Chemie ortsspezifisch mit organischen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten angefärbt. Organische Fluorophore haben den Vorteil, dass sie mit einer Größe von 0,5 – 2 nm sehr klein sind und damit die natürli-chen Funktionen der Proteine in der Zelle kaum beeinflussen. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass der tetramere postsynaptische NMDA-Rezeptor durch die Amber-Supres-sionsmethode bioorthogonal angefärbt werden konnte. Aus sieben verschiede-nen Amber-Mutanten der NR1-Untereinheit stellte sich die Y392TAG-NR1-Mutante als diejenige mit der besten Proteinexpression, Färbeeffizienz und rezeptorfunktionalität heraus. Dies konnte durch Fluoreszenzmikroskopie- und Whole-Cell Patch-Clamp-Experimenten gezeigt werden. Die bioorthogo-nale Click-Färbung durch GCE eignete sich für die Färbung des NMDA-Rezeptors in verschiedenen Zelllinien, mit unterschiedlichen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten und für Lebendzellexperimente. In dSTORM-Messungen erwies sich das Tetrazin-Cy5-Farbstoff-Konjugat als ideal aufgrund seiner Grö-ße, Photostabilität, Helligkeit und seines geeigneten Blinkverhaltens, sodass eine homogene NMDA-Rezeptorverteilung auf der Zellmembran gezeigt wer-den konnte. NR1-Antikörperfärbungen wiesen dagegen starke Clusterbildun-gen auf. Die Ergebnisse konnten belegen, dass kleinere Farbstoffe eine deut-lich bessere Zugänglichkeit zu ihrem Zielprotein haben und somit besser für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind. N2 - Due to its complexity and cellular diversity, the human brain is an organ which is poorly understood. In particular, there are numerous challenges in different neurobiological imaging processes. The advent of super-resolution fluorescence microscopy, where a maximal optical resolution of up to 20 nm is achievable, made it feasible to visualize structures beyond the diffraction limit. The ability to resolve biological structures is further dependent on the labeling size and density. Currently, indirect antibody staining is the most common method for protein labeling. Thereby, a fluorophore marked secondary anti-body binds an epitope specific primary antibody. Consequently, the off-distance between target structure and fluorophore can be up to 30 nm, which could provoke a decrease of resolution. As a result, alternative labeling methods were tested in this work to visualize postsynaptic proteins. Initially, labeling of the postsynaptic N-methyl-D-aspartate (NMDA) recep-tor was performed with conventional indirect antibody staining. Here, the NR1 subunit of the NMDA receptor was of special interest because it is involved in the autoimmune disease of Anti-NMDA receptor encephalitis. Patients of this rare disorder produce autoantibodies against the NR1 subunit, which induces a fast and reversible reduction of NMDA receptors on the postsynapse. Important synaptic information cannot be transferred sufficiently which results in psychiatrical and neurological deficiencies. In this work commercial NR1 antibodies as well as recombinant monoclonal NR1 antibodies from patients with Anti-NMDA receptor encephalitis were tested. In confocal and super-resolved SIM (structured illumination microscopy) and dSTORM (direct sto-chastic optical reconstruction microscopy) measurements the commercial NR1 antibodies could not obtain a successful staining. In contrast, recombinant monoclonal NR1 patient antibodies turn out to be very specific, both in primary neurons and in the hippocampus of murine brain slices. Additionally, they show perfect colocaliza-tion together with the postsynaptic marker protein Homer. To further improve the optical resolution, a new labeling method was tested with so called “super-binding peptides” (SBPs). SBPs are modified peptides with enhanced affinity and specificity. With a size of ~ 2.5 nm, they are much smaller than antibodies. In this work a small, highly specific SBP, coupled to the fluorescent dye tetramethylrhodamine (TMR), turned out to be an efficient marker for the postsynaptic anchor protein gephyrin. Gephyrin is responsible for the localization and anchoring of postsynaptic receptors by connecting them with the cytoskeleton of the cell. SIM measurements in primary neurons showed better cluster representation of gephyrin stained with SBPs than with antibody stain-ing. In addition, colocalization analysis of gephyrin together with the inhibitory presynaptic vesicular GABA transporter VGAT was performed. Another staining method was the bioorthogonal click chemistry by the eu-karyotic genetic code expansion (GCE). Thereby, an unnatural, non-canonical amino acid (ncAA) is incorporated into the target protein and click-labeled site- specifically with an organic tetrazine dye conjugate. Organic dyes are very small with a size of only 0.5 – 2 nm and barely influence the natural function of proteins within the cell, which is beneficial for super-resolution microscopy. In this work, tetrameric postsynaptic NMDA receptors were bioorthogonally la-beled via the amber suppression method for the first time. From a series of seven different amber mutants of the NR1 subunit, the Y392TAG mutant was the one with the best protein expression, labeling efficiency and receptor functionality, as shown by fluorescence microscopy and whole-cell patch clamp experiments. The bioortho-gonal click staining by GCE was suitable for the NMDA receptor stain-ing in different cell lines, with various tetrazine dye conjugates and for live-cell experiments. In dSTORM measurements the tetrazine-Cy5 dye conjugate was ideal because of its size, photostability, brightness and appropriate blinking be-havior. Accordingly, a homogenous NMDA receptor distribution on the cell membrane was observed. In contrast, NR1 antibody staining showed big cluster formation. The results show that small labels have a better accessibility to its target and are therefore much more suitable for super-resolution microscopy. KW - hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie KW - Markierungen synaptischer Proteine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192394 ER - TY - THES A1 - Grimm, Johannes T1 - Autocrine and paracrine effects of BRAF inhibitor induced senescence in melanoma T1 - Autokrine und parakrine Effekte BRAF-Inhibitor-induzierter Seneszenz im Melanom N2 - The FDA approval of targeted therapy with BRAFV600E inhibitors like vemurafenib and dabrafenib in 2011 has been the first major breakthrough in the treatment of metastatic melanoma since almost three decades. Despite increased progression free survival and elevated overall survival rates, complete responses are scarce due to resistance development approximately six months after the initial drug treatment. It was previously shown in our group that melanoma cells under vemurafenib pressure in vitro and in vivo exhibit features of drug-induced senescence. It is known that some cell types, which undergo this cell cycle arrest, develop a so-called senescence associated secretome and it has been reported that melanoma cell lines also upregulate the expression of different factors after senescence induction. This work describes the effect of the vemurafenib-induced secretome on cells. Conditioned supernatants of vemurafenib-treated cells increased the viability of naive fibroblast and melanoma cell lines. RNA analysis of donor melanoma cells revealed elevated transcriptional levels of FGF1, MMP2 and CCL2 in the majority of tested cell lines under vemurafenib pressure, and I could confirm the secretion of functional proteins. Similar observations were also done after MEK inhibition as well as in a combined BRAF and MEK inhibitor treatment situation. Interestingly, the transcription of other FGF ligands (FGF7, FGF17) was also elevated after MEK/ERK1/2 inhibition. As FGF receptors are therapeutically relevant, I focused on the analysis of FGFR-dependent processes in response to BRAF inhibition. Recombinant FGF1 increased the survival rate of melanoma cells under vemurafenib pressure, while inhibition of the FGFR pathway diminished the viability of melanoma cells in combination with vemurafenib and blocked the stimulatory effect of vemurafenib conditioned medium. The BRAF inhibitor induced secretome is regulated by active PI3K/AKT signaling, and the joint inhibition of mTor and BRAFV600E led to decreased senescence induction and to a diminished induction of the secretome-associated genes. In parallel, combined inhibition of MEK and PI3K also drastically decreased mRNA levels of the relevant secretome components back to basal levels. In summary, I could demonstrate that BRAF inhibitor treated melanoma cell lines acquire a specific PI3K/AKT dependent secretome, which is characterized by FGF1, CCL2 and MMP2. This secretome is able to stimulate other cells such as naive melanoma cells and fibroblasts and contributes to a better survival under drug pressure. These data are therapeutically highly relevant, as they imply the usage of novel drug combinations, especially specific FGFR inhibitors, with BRAF inhibitors in the clinic. N2 - Die Zulassung der spezifischen BRAFV600E Inhibitoren Vemurafenib und Dabrafenib im Jahr 2011 war der erste wirksame Schritt nach Jahrzehnten der Stagnation in der Behandlung des metastasierenden Melanoms. Allerdings zeigte sich, dass trotz erhöhter Gesamtüberlebensrate und gestiegenem progressionsfreien Überleben komplette Remissionen selten waren. Wir konnten in vorangegangenen Versuchen zeigen, dass eine Behandlung BRAFV600E-mutierter Melanom Zelllinien mit Vemurafenib mit der Induktion von Seneszenz-assoziierten Merkmalen einhergeht. Da bekannt ist, dass seneszente Zellen, darunter auch Melanom Zellen, ein sogenanntes Sekretom ausbilden können, welches andere Zellen beeinflussen kann, war die Identifizierung und Charakterisierung von Vemurafenib-induzierten sezernierten Faktoren das Ziel meiner Arbeit. Initiale Versuche zeigten, dass konditionierter Überstand von Vemurafenib behandelten Zellen das Wachstum naiver Zelllinien erhöhen kann. Ich konnte in weiteren Versuchen zeigen, dass sich die Transkription und Expression des Cytokins CCL2, der Matrixmetalloprotease MMP2 und des Wachstumsfaktors FGF1 nach Vemurafenib Behandlung erhöht. Darüber hinaus konnte ich interessanterweise auch eine gesteigerte Transkription anderer FGF Liganden (FGF7, FGF17) feststellen, was meinen Fokus auf die Analyse von FGFR abhängigen Prozessen als Antwort auf die BRAF Inhibition gelenkt hat. Es zeigte sich, dass sich Melanomzellen mittels Zugabe von FGF1 besser gegen die Vemurafenib-induzierte MEK/ERK1/2 Hemmung behaupten können. Darüber hinaus konnte durch den Einsatz eines spezifischen FGFR Inhibitors die Viabilität von Melanomzellen unter Vemurafenib Behandlung vermindert werden. Auch der stimulierende Effekt des Vemurafenib konditionierten Überstandes konnte dadurch teilweise aufgehoben werden. Die Induktion des BRAF Inhibitor assoziierten Sekretoms ist auf einen aktiven PI3K/AKT Signalweg angewiesen. So führt eine gleichzeitige Hemmung des MEK/ERK1/2 und PI3K/AKT Signalwegs zu einer verminderten Seneszenzinduktion und einer niedrigeren Transkription der Seneszenz-assoziierten Gene. Zudem konnte ich feststellen, dass auch eine gemeinsame Hemmung von BRAF und MEK Seneszenz und das damit einhergehende Sekretom unter Beteiligung von CCL2, MMP2 und den FGFs induziert. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass BRAFV600E-mutierte Melanomzellen nach Vemurafenib Behandlung ein Sekretom ausbilden, welches potentiell wachstumsfördernde und matrix-modellierende Faktoren beinhaltet. Dies ist abhängig vom PI3K/AKT Signalweg und charakterisiert durch die Sekretion von FGF1, CCL2 und MMP2. Klinische Relevanz erlangen diese Erkenntnisse durch die Möglichkeit, diese Faktoren im Rahmen einer Kombinationstherapie, z.B. mit einem spezifischen FGFR Inhibitor, zu inaktivieren. KW - Melanoma KW - Inhibitor KW - Melanom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181161 ER -