TY - JOUR A1 - Akhoon, Bashir A. A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Tiwari, Sudeep A1 - Rathor, Laxmi A1 - Pant, Aakanksha A1 - Singh, Nivedita A1 - Gupta, Shailendra K. A1 - Dandekar, Thomas A1 - Pandey, Rakesh T1 - C. elegans protein interaction network analysis probes RNAi validated pro-longevity effect of nhr-6, a human homolog of tumor suppressor Nr4a1 JF - Scientific Reports N2 - Protein-protein interaction (PPI) studies are gaining momentum these days due to the plethora of various high-throughput experimental methods available for detecting PPIs. Proteins create complexes and networks by functioning in harmony with other proteins and here in silico network biology hold the promise to reveal new functionality of genes as it is very difficult and laborious to carry out experimental high-throughput genetic screens in living organisms. We demonstrate this approach by computationally screening C. elegans conserved homologs of already reported human tumor suppressor and aging associated genes. We select by this nhr-6, vab-3 and gst-23 as predicted longevity genes for RNAi screen. The RNAi results demonstrated the pro-longevity effect of these genes. Nuclear hormone receptor nhr-6 RNAi inhibition resulted in a C. elegans phenotype of 23.46% lifespan reduction. Moreover, we show that nhr-6 regulates oxidative stress resistance in worms and does not affect the feeding behavior of worms. These findings imply the potential of nhr-6 as a common therapeutic target for aging and cancer ailments, stressing the power of in silico PPI network analysis coupled with RNAi screens to describe gene function. KW - Computer modelling KW - Embryonic induction KW - RNAi Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202666 VL - 9 ER - TY - THES A1 - AL-Hijailan, Reem Saud T1 - Establishment of endothelialized cardiac tissue using human induced pluripotent stem cells generated cardiomyocytes T1 - Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen N2 - Cardiovascular diseases are considered the leading cause of death worldwide according to the World Health Organization. Heart failure is the last stage of most of these diseases, where loss of myocardium leads to architectural and functional decline. The definitive treatment option for patients with CVDs is organ or tissue transplantation, which relies on donor availability. Therefore, generating an autologous bioengineered myocardium or heart could overcome this limitation. In addition, generating cardiac patches will provide ventricular wall support and enable reparative stem cells delivery to damaged areas. Although many hurdles still exist, a good number of researches have attempted to create an engineered cardiac tissue which can induce endogenous cardiac repair by replacing damaged myocardium. The present study provided cardiac patches in two models, one by a detergent coronary perfusion decellularization protocol that was optimized, and the other that resulted in a 3D cell-free extracellular matrix with intact architecture and preserved s-glycosaminoglycan and vasculature conduits. Perfusion with 1% Sodium dodecyle sulfate (SDS) under constant pressure resulted in cell-free porcine scaffold within two and cell-free rat scaffold in 7 days, whereas scaffold perfused with 4% sodium deoxycholate (SDO) was not able to remove cells completely. Re-reendothelialization of tissue vasculature was obtained by injecting human microvascular endothelial cell and human fibroblast in 2:1 ratio in a dynamic culture. One-week later, CD31 positive cells and endothelium markers were observed, indicating new blood lining. Moreover, functionality test of re-endothelialized tissue revealed improvement in clotting seen in decellularized tissues. When the tissue was ready to be repopulated, porcine induced pluripotent stem cells (PiPSc) were generated by transfected reprogramming of porcine skin fibroblast and then differentiated to cardiac cells following a robust protocol, for an autologous cardiac tissue model. However, due to the limitation in the PiPSc cell number, alternatively, human induced pluripotent stem cells generated cardiac cells were used. For reseeding a coculture of human iPSc generated cardiac cells, human mesenchymal stem cells and human fibroblast in 2:1:1 ratio respectively were used in a dynamic culture for 6-8 weeks. Contractions at different areas of the tissue were recorded at an average beating rate of 67 beats/min. In addition, positive cardiac markers (Troponin T), Fibroblast (vemintin), and mesenchymal stem cells (CD90) were detected. Not only that, but by week 3, MSC started differentiating to cardiac cells progressively until few CD90 positive cells were very few by week 6 with increasing troponin t positive cells in parallel. Electrophysiological and drug studies were difficult to obtain due to tissue thickness and limited assessment sources. However, the same construct was established using small intestine submucosa (SISer) scaffold, which recorded a spontaneous beating rate between 0.88 and 1.2 Hz, a conduction velocity of 23.9 ± 0.74 cm s−1, and a maximal contraction force of 0.453 ± 0.015 mN. Moreover, electrophysiological studies demonstrated a drug-dependent response on beating rate; a higher adrenalin frequency was revealed in comparison to the untreated tissue and isoproterenol administration, whereas a decrease in beating rate was observed with propranolol and untreated tissue. The present study demonstrated the establishment of vascularized cardiac tissue, which can be used for human clinical application. N2 - Etablierung eines endothelialisierten kardialen Gewebes mittels Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen KW - cardiac tissue KW - biological scaffolds KW - decellularization KW - induced pluripotent stem cells Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173979 ER - TY - THES A1 - Anany, Mohamed Ahmed Mohamed Mohamed T1 - Enhancement of Toll-like receptor3 (TLR3)-induced death signaling by TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) T1 - Verstärkung der Toll-like receptor3 (TLR3)-induzierten Todessignalisierung durch TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) N2 - Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) is a member of the TNF superfamily (TNFSF) and is as such initially expressed as type II class transmembrane glycoprotein from which a soluble ligand form can be released by proteolytic processing. While the expression of TWEAK has been detected at the mRNA level in various cell lines and cell types, its cell surface expression has so far only been documented for dendritic cells, monocytes and interferon-γ stimulated NK cells. The fibroblast growth factor-inducible-14 (Fn14) is a TRAF2-interacting receptor of the TNF receptor superfamily (TNFRSF) and is the only receptor for TWEAK. The expression of Fn14 is strongly induced in a variety of non-hematopoietic cell types after tissue injury. The TWEAK/Fn14 system induces pleiotropic cellular activities such as induction of proinflammatory genes, stimulation of cellular angiogenesis, proliferation, differentiation, migration and in rare cases induction of apoptosis. On the other side, Toll-like receptor3 (TLR3) is one of DNA- and RNA-sensing pattern recognition receptors (PRRs), plays a crucial role in the first line of defense against virus and invading foreign pathogens and cancer cells. Polyinosinic-polycytidylic acid poly(I:C) is a synthetic analog of dsRNA, binds to TLR3 which acts through the adapter TRIF/TICAM1, leading to cytokine secretion, NF-B activation, IRF3 nuclear translocation, inflammatory response and may also elicit the cell death. TWEAK sensitizes cells for TNFR1-induced apoptosis and necroptosis by limiting the availability of protective TRAF2-cIAP1 and TRAF2-cIAP2 complexes, which interact with the TNFR1-binding proteins TRADD and RIPK1. In accordance with the fact that poly(I:C)-induced signaling also involves these proteins, we found enhanced necroptosis-induction in HaCaT and HeLa-RIPK3 by poly(I:C) in the presence of TWEAK (Figure 24). Analysis of a panel of TRADD, FADD, RIPK1 and caspase-8 knockout cells revealed furthermore similarities and differences in the way how these molecules act in cell death signaling by poly(I:C)/TWEAK and TNF and TRAIL. RIPK1 turned out to be essential for poly(I:C)/TWEAK-induced caspase-8-mediated apoptosis but was dispensable for these responses in TNF and TRAIL signaling. Lack of FADD protein abrogated TRAIL- but not TNF- and poly(I:C)-induced necroptosis. Moreover, we observed that both long and short FLIP rescued HaCaT and HeLa-RIPK3 cells from poly(I:C)-induced apoptosis or necroptosis. To sum up, our results demonstrate that TWEAK, which is produced by interferon stimulated myeloid cells, controls the induction of apoptosis and necroptosis by the TLR3 ligand poly(I:C) and may thus contribute to cancer or anti-viral immunity treatment. N2 - Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie (TNFSF) und wird als solches anfänglich als Transmembranglykoprotein der Klasse II exprimiert, aus dem eine lösliche Ligandenform durch proteolytische Prozessierung freigesetzt werden kann. Während die Expression von TWEAK auf mRNA-Ebene in verschiedenen Zelllinien und Zelltypen nachgewiesen wurde, konnte ihre Zelloberflächenexpression bisher nur für dendritische Zellen, Monozyten und Interferon-γ-stimulierte NK-Zellen dokumentiert werden. Fibroblast growth factor-inducible-14 (Fn14) ist ein TRAF2-wechselwirkender Rezeptor der TNF-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) und der einzige Rezeptor für TWEAK. Die Expression von Fn14 wird nach Gewebeverletzung in einer Vielzahl von nicht hämatopoetischen Zelltypen stark induziert. Das TWEAK / Fn14-System induziert pleiotrope zelluläre Aktivitäten, die von der proinflammatorischen Geninduktion über die Stimulierung der Angiogenese, Proliferation und Zelldifferenzierung bis hin zur Zellmigration und in seltenen Fällen zur Induktion von Apoptose reichen. Auf der anderen Seite spielt der Toll-like Rezeptor3 (TLR3), einer der DNA- and RNA-sensing pattern recognition receptors (PRRs), eine entscheidende Rolle in der ersten Verteidigungslinie gegen Viren und eindringende fremde Krankheitserreger und Krebszellen. Polyinosin-Polycytidylsäure-Poly (I: C) ist ein synthetisches Analogon von dsRNA, das an TLR3 bindet, das über den Adapter TRIF / TICAM1 wirkt und zu Zytokinsekretion, NF-B-Aktivierung, IRF3-Kerntranslokation und Entzündungsreaktion führt der Zelltod. TWEAK sensibilisiert Zellen für TNFR1-induzierte Apoptose und Nekroptose, indem es die Verfügbarkeit von schützenden TRAF2-cIAP1- und TRAF2-cIAP2-Komplexen begrenzt, die mit den TNFR1-bindenden Proteinen TRADD und RIPK1 interagieren. Entsprechend der Tatsache, dass diese Proteine auch von Poly (I: C) induziert werden, fanden wir eine verstärkte Nekroptose-Induktion in HaCaT und HeLa-RIPK3 durch Poly (I: C) in Gegenwart von TWEAK (Figure 24). Die Analyse eines Panels von TRADD-, FADD-, RIPK1- und Caspase-8-Knockout-Zellen ergab außerdem Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Art und Weise, wie diese Moleküle bei der Zelltodsignalisierung durch Poly (I: C) / TWEAK und TNF und TRAIL wirken. RIPK1 erwies sich als essentiell für die Poly (I: C) / TWEAK-induzierte Caspase-8-vermittelte Apoptose, war jedoch für diese Reaktionen bei TNF- und TRAIL-Signalen entbehrlich. Das Fehlen von FADD-Protein hob TRAIL-, aber nicht TNF- und Poly (I: C) -induzierte Nekroptose auf. Darüber hinaus beobachteten wir, dass sowohl langes als auch kurzes FLIP HaCaT- und HeLa-RIPK3-Zellen vor Poly (I: C) -induzierter Apoptose oder Nekroptose retteten. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass TWEAK, das von Interferon-stimulierten myeloischen Zellen produziert wird, die Induktion von Apoptose und Nekroptose durch den TLR3-Liganden Poly(I: C) steuert und somit zur Krebsbehandlung oder antiviralen Immunität beitragen kann. KW - Immunologe KW - TLR3 KW - TWEAK KW - Krebs Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189757 ER - TY - JOUR A1 - Annunziata, Ida A1 - van de Vlekkert, Diantha A1 - Wolf, Elmar A1 - Finkelstein, David A1 - Neale, Geoffrey A1 - Machado, Eda A1 - Mosca, Rosario A1 - Campos, Yvan A1 - Tillman, Heather A1 - Roussel, Martine F. A1 - Weesner, Jason Andrew A1 - Fremuth, Leigh Ellen A1 - Qiu, Xiaohui A1 - Han, Min-Joon A1 - Grosveld, Gerard C. A1 - d'Azzo, Alessandra T1 - MYC competes with MiT/TFE in regulating lysosomal biogenesis and autophagy through an epigenetic rheostat JF - Nature Communications N2 - Coordinated regulation of the lysosomal and autophagic systems ensures basal catabolism and normal cell physiology, and failure of either system causes disease. Here we describe an epigenetic rheostat orchestrated by c-MYC and histone deacetylases that inhibits lysosomal and autophagic biogenesis by concomitantly repressing the expression of the transcription factors MiT/TFE and FOXH1, and that of lysosomal and autophagy genes. Inhibition of histone deacetylases abates c-MYC binding to the promoters of lysosomal and autophagy genes, granting promoter occupancy to the MiT/TFE members, TFEB and TFE3, and/or the autophagy regulator FOXH1. In pluripotent stem cells and cancer, suppression of lysosomal and autophagic function is directly downstream of c-MYC overexpression and may represent a hallmark of malignant transformation. We propose that, by determining the fate of these catabolic systems, this hierarchical switch regulates the adaptive response of cells to pathological and physiological cues that could be exploited therapeutically. KW - autophagy KW - cancer KW - cancer metabolism KW - cell biology KW - mechanisms of disease Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-221189 VL - 10 ER - TY - THES A1 - Awad, Eman Da'as T1 - Modulation of insulin-induced genotoxicity in vitro and genomic damage in gestational diabetes T1 - Modulation der Insulin-induzierten Genotoxizität in vitro und Genomschäden bei Frauen mit Gestationsdiabetes N2 - Diabetes mellitus is a global health problem, where the risk of diabetes increases rapidly due to the lifestyle changes. Patients with type II diabetes have many complications with increased risk of morbidity and mortality. High levels of insulin may lead to DNA oxidation and damage. Several studies proposed that hyperinsulinemia may be an important risk factor for various types of cancer. To investigate insulin signaling pathway inducing oxidative stress and genomic damage, pharmaceutical and natural compounds which can interfere with the insulin pathway including PI3K inhibitors, resveratrol, lovastatin, and RAD-001 were selected due to their beneficial effects against metabolic disorder. Thus, the anti-genotoxic potential of these compounds regarding insulin-mediated oxidative stress were investigated in normal rat kidney cells in vitro. Our compounds showed protective effect against genotoxic damage and significantly decreased reactive oxygen specious after treatment of cells with insulin with different mechanisms of protection between the compounds. Thus, these compounds may be attractive candidates for future support of diabetes mellitus therapy. Next, we explored the link between gestational diabetes mellitus and genomic damage in cells derived from human blood. Moreover, we investigated the influence of estradiol, progesterone, adrenaline and triiodothyronine on insulin-induced genomic damage in vitro. First, we studied the effect of these hormones in human promyelocytic leukemia cells and next ex vivo with non-stimulated and stimulated peripheral blood mononuclear cells. In parallel, we also measured the basal genomic damage using three conditions (whole blood, non-stimulated and stimulated peripheral blood mononuclear cells) in a small patient study including non-pregnant controls with/without hormonal contraceptives, with a subgroup of obese women, pregnant women, and gestational diabetes affected women. A second-time point after delivery was also applied for analysis of the blood samples. Our results showed that GDM subjects and obese individuals exhibited higher basal DNA damage compared to lower weight nonpregnant or healthy pregnant women in stimulated peripheral blood mononuclear cells in both comet and micronucleus assays. On the other hand, the DNA damage in GDM women had decreased at two months after birth. Moreover, the applied hormones also showed an influence in vitro in the enhancement of the genomic damage in cells of the control and pregnant groups but this damage did not exceed the damage which existed in obese and gestational diabetes mellitus patients with high level of genomic damage. In conclusion, insulin can induce genomic damage in cultured cells, which can be modulated by pharmaceutical and naturals substances. This may be for future use in the protection of diabetic patients, who suffer from hyperinsulinemia during certain disease stages. A particular form of diabetes, GDM, was shown to lead to elevated DNA damage in affected women, which is reduced again after delivery. Cells of affected women do not show an enhanced, but rather a reduced sensitivity for further DNA damage induction by hormonal treatment in vitro. A potential reason may be an existence of a maximally inducible damage by hormonal influences. N2 - Diabetes mellitus stellt eine globales Gesundheitsproblem dar, das aufgrund der sich ändernden Lebensführung rapide ansteigt. Bei Patienten mit Diabetes Typ II kommt es verstärkt zu Komplikationen, was eine erhöhte Morbidität und Mortalität zur Folge hat. Ein hoher Insulinspiegel kann zur DNA-Oxidation und damit zu DNA-Schäden führen. Diverse Studien postulieren, dass Hyperinsulinämie ein entscheidender Risikofaktor für verschiedene Krebserkrankungen darstellt. Zur Untersuchung des Insulin- Signaltransduktionsweg, über den oxidativer Stress und daraus resultierender Genomschäden induziert werden, wurden aus diversen Pharmazeutika und Naturstoffen, welche den Insulin-Signalweg beeinträchtigen, PI3K Inhibitoren, Resveratrol, Lovastatin und RAD-001 aufgrund ihrer positiven Effekte bei Stoffwechselerkrankungen, ausgewählt. Mit diesen Verbindungen wurde die anti-Genotoxizität (Schutzwirkung) hinsichtlich des durch Insulin induzierten oxidativen Stresses und Genomschadens in einer primären Nierenzelllinie der Ratte in vitro untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten protektive Effekte der ausgewählten Substanzen hinsichtlich genotoxischer Schäden sowie einen signifikanten Rückgang reaktiver Sauerstoffspezies bei insulinbehandelten Zellen, wobei der Wirkmechanismus zwischen den Substanzen jedoch unterschiedlich war. Somit handelt es sich bei den untersuchten Stoffen um äußerst interessante Verbindungen, die in der Zukunft Diabetes mellitus Therapien unterstützen könnten. Außerdem untersuchten wir den Zusammenhang zwischen Schwangerschaftsdiabetes und Genomschäden in humanen Blutzellen. Dafür verwendeten wir neben humanen HL-60 Zellen nicht stimulierte sowie mit Hilfe von Phytohemagglutinin (PHA) zur Aufnahme des Zellzyklus stimulierte periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden sowie von Gestationsdiabetes betroffenen Probandinnen. Wir analysierten zunächst den Einfluss von Östradiol, Progesteron, Adrenalin und Triiodthyronin auf den Genomschaden dieser Zellen in vitro.. Parallel dazu bestimmten wir in die basalen Genomschäden im Vollblut, in nicht stimulierten sowie in PHA-stimulierten peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Studie schloss nicht-schwangere Frauen mit bzw. ohne Einnahme hormoneller Kontrazeptiva sowie je eine Subgruppen mit übergewichtigen Frauen, gesunden schwangeren Frauen und Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes ein. Bei Schwangeren wurde einige Zeit nach der Entbindung eine zweite Blutuntersuchung durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes sowie übergewichtige Frauen im Vergleich zu normalgewichtigen, nicht-schwangeren Frauen sowie gesunden schwangeren Frauen mehr basale DNA-Schäden sowohl im Comet-Assay als auch im Mikrokern-Test in stimulierten peripheren mononuklearen Zellen aufweisen. Des Weiteren sanken die DNA-Schäden bei Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes zwei Monate nach der Geburt. Darüber hinaus verstärkten die verwendeten Hormone in vitro die zellulären Genomschäden, jedoch überstiegen sie nicht die größere Menge an DNA-Schäden, welche bei übergewichtigen Frauen bzw. Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes nachgewiesenen wurden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Insulin Zellschäden in vitro induzieren kann, die jedoch durch Pharmazeutika und Naturstoffen reguliert werden können. Diese Erkenntnis könnte zukünftig Diabetespatienten helfen, die an Hyperinsulinämie leiden. Schwangerschaftsdiabetes, eine besondere Form des Diabetes, führt zu erhöhten DNASchäden bei betroffenen Frauen, die sich nach der Geburt jedoch wieder verringern. Die Zellen betroffener Frauen zeigen keine erhöhte, sondern vielmehr eine verminderte Sensitivität für weiteren DNA-Schäden durch hormonelle Behandlung in vitro. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass eine maximal induzierbare Zahl an DNASchäden, die durch hormonelle Einflüsse bzw. daraus resultierenden Aktivierungen von Signalkaskaden hervorgerufen werden können, existiert. KW - Gestationsdiabetes KW - DNA-Schäden KW - Insulin KW - Gestational diabetes KW - DNA damage Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161866 ER - TY - THES A1 - Bach, Matthias T1 - Massenspektrometrische Analyse der Interaktionen von Protein mit Proteinen und Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen T1 - Protein-protein and small molecule-protein interaction analyzed by mass spectrometry N2 - Proteine können aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu identifizieren und zu validieren. Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zusätzliche Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu können (Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexität verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im nächsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus Hefe angewendet. Die Probenkomplexität ist hierbei 500 - 1000-fach höher als bei der Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren substöchiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden. Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt: 1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der während der Messung selektiv durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu vereinfachen. Die Funktionalität der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend können die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren von zwei Peptiden nicht der Fall wäre. Beim Quervernetzen der rekombinanten Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu bestätigende Crosslink zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierfür könnte eine zu kurze Linkerlänge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschränkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da das Spalten des Linkers einen zusätzlichen Intensitätsverlust für die folgende Identifizierung der Peptide mit sich bringt. 2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um während der Messung direkt nach diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierfür war, dass quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur Hälfte enzymatisch mit 18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8 Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann während der Messung direkt gesucht werden. Die vollständige Markierung von Peptiden mit 18O wurde zunächst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich heraus, dass der enzymatische Rücktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die Markierungseffizienz von Aminosäuren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollständige Markierung für alle Peptide erreichen, was für diese Strategie essentiell gewesen wäre. 3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das Quervernetzen von Proteinen entstehen zusätzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE, die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensitätsmaxima der Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zusätzlichen Fraktionen gefunden werden, was den indirekten Nachweis für eine Interaktion darstellt. Die Funktionalität der Strategie konnte somit bestätigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50 Proteine in einer Fraktion, können potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet. Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten Bindungspartner wurde über quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und Überlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms (MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α- acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen möglichen Therapieansatz dar, wenn er zusammen mit hitzestressauslösenden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Armadillodomäne innerhalb der potentiellen Drug targets signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl Aminocarboxamide dar. Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat angereichert, deren Vorläufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende- und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell für das Spleißen in-vivo sind. Hierzu gehören mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren 3A und 3B. Die Veränderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst. N2 - Based on the huge biochemical variety of proteins they can interact in many different ways with other proteins or small molecules. The first part of this work is about protein-Protein interactions which were investigated with chemical crosslinking. The aim of this work was the development of new and improved methods for the construction of interaction networks. The second part is about protein-small molecule interactions to identify new drug targets with subsequent validation. Mass spectrometry (MS) is a powerful tool to investigate all protein-protein interactions after enrichment from a cell lysate (Co-IP). By adding crosslinking to Co-IP experiments it is possible to create a topology map which is important to differenciate between direct and indirect interactions. To validate the crosslinking procedure, a commercial available crosslinker and recombinant proteins of known interaction partners with low sample complexity were used. The interaction partners NPL4 and UFD1 were successfully crosslinked with BS3 and crosslinked peptides were identified with MS. Next step was to apply this workflow on the Co-IP of the yeast mediator complex. Here the sample complexity is 500 to 1000 times higher than with recombinant proteins. After successfully crosslinking, a topology map of the subunits of the mediator complex was created. The result matches the latest model of the complex. Crosslinks to known interation partners, like the RNA-Pol II, were not identified because of their substoichiometric enrichment. Because of the known limitations of protein crosslinking, new and improved methods were developed: 1. Application of the MS-cleavable crosslinker DSSO, which could be cleaved with low collision energy, to improve the database search of crosslinked peptides. Proof of concept was done by crosslinking Cytochrom C. In the first fragmentation step only DSSO is cleaved. Fragmentation of the separated peptides is done in the next step with higher energy. Peptid fragments are compatible with a standard database search. The application of this method on the interacting proteins UBX and p97N failed because the predicted crosslink could not be identified. This could be due to the lack of linker length of DSSO. But more important, this experiment revealed the drawbacks of the DSSO approach. Trypsin is needed because this leads to a positive charge on the C-Terminus. Furthermore large amounts of protein are required to reach the needed intensity for all fragmentation steps. 2. Since the low abundancy of crosslinked peptides is the main issue for their identification, a new method was developed to directly search for them during the MS measurement. The defining criterion for this search was the occurrence of two C-termini in crosslinked peptides. Samples were splitted, labeled with 18O or 16O, and mixed again to generate a mass shift of 8 Da which is unique for crosslinked peptides. This mass shift can be used to directly search for these peptides during the measurement. Proof of concept was tested by labeling beta-galactosidase. Complete labeling could not be reached because of enzymatic back-exchange from 18O with 16O. Furthermore the neighbouring amino acids at the C-termini influence the labeling efficiency. Due to the incomplete labeling, the method could not be used for identifying crosslinked peptides. 3. To circumvent all problems which occur with the identification of crosslinked peptides, another method was developed to identifiy crosslinked proteins by their mass shift after separation on a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). By crosslinking proteins additional protein bands are generated which appear in the upper part of the gel. All proteins in this region are potential interation partners. Proof of concept was done by enrichment (Co-IP) of the yeast mediator complex from a cell lysate with subsequent crosslinking. From the LC-MS/MS data, profiles for every protein of the complex were generated. The additionally generated crosslink intensity peaks of interacting subunits overlapped with each other, which is the indirect proof of the functionality of this approach. The main problem with this strategy is the low separation performance. When about 50 proteins are located in one fraction, it is not possible to unambiguously match a protein to a specific subunit of the protein complex. In the second part of this work, the interactions of proteins with small molecules were investigated by mass spectrometry, to identify potential drug targets. Biotinylated versions of active compounds were immobilized to magnetic streptavidin beads and incubated with INA6 cell lysate. By quantitiative analysis of proteins, which bind to the control beads and proteins, which bind to the inhibitor beads, potential drug targets were identified. With the used α-acyl aminocarboxamides several protein complexes and interacting proteins were specifically enriched. These included the four kinases DNA-PK, ATM, ATR and mTOR, which are involved in oncogenic signaling and survival mechanisms. Moreover it is known, that the DNA-PK interacts with HSF1 and therefore regulates the HSF1-mediated heat shock response. The inhibition of DNA-PK, ATM, ATR and mTOR with α-acyl aminocarboxamides is a new therapeutic opportunity when it is combined with other substances which trigger the heat shock response. A potential binding site of the α-acyl aminocarboxamides is the armadillo domain, because it was significantly enriched among the potential drug targets. Several naphtylisochinolines were also biotinylated, immobilized and incubated with INA6 cell lysate. Precursors of these substances showed activity against multiple myeloma cells and the malaria pathogen Plasmodium falciparum. Here we could enrich proteins which are associated with RNA-binding and mRNA splicing, including several subunits of the splicing factors 3A and 3B, which are essential for splicing. The change of the transcriptional regulation and the resulting effect on cancer cells by influencing mRNA splicing is already known and was shown by other inhibitors like Spliceostatin A. KW - Massenspektrometrie KW - Proteininteraktionen KW - Molekulare Zielstrukturen KW - Proteinquervernetzungen KW - Methodenentwicklung KW - Mass spectrometry KW - Protein interactions KW - Drug targets KW - Protein crosslinking KW - Method development Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160462 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER - TY - THES A1 - Baur, Florentin Philipp T1 - Establishment of a 3D tumour model and targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer T1 - Entwicklung eines 3D Tumormodells und zielgerichtete Behandlung von BRAF-mutiertem kolorektalen Karzinom N2 - Cancer remains after cardiovascular diseases the leading cause of death worldwide and an estimated 8.2 million people died of it in 2012. By 2030, 13 million cancer deaths are expected due to the growth and ageing of the population. Hereof, colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men and the second in women with a wide geographical variation across the world. Usually, CRC begins as a non-cancerous growth leading to an adenomatous polyp, or adenoma, arising from glandular cells. Since research has brought about better understanding of the mechanisms of cancer development, novel treatments such as targeted therapy have emerged in the past decades. Despite that, up to 95% of anticancer drugs tested in clinical phase I trials do not attain a market authorisation and hence these high attrition rates remain a key challenge for the pharmaceutical industry, making drug development processes enormously costly and inefficient. Therefore, new preclinical in vitro models which can predict drug responses in vivo more precisely are urgently needed. Tissue engineering not only provides the possibility of creating artificial three-dimensional (3D) in vitro tissues, such as functional organs, but also enables the investigation of drug responses in pathological tissue models, that is, in 3D cancer models which are superior to conventional two-dimensional (2D) cell cultures on petri dishes and can overcome the limitations of animal models, thereby reducing the need for preclinical in vivo models. In this thesis, novel 3D CRC models on the basis of a decellularised intestinal matrix were established. In the first part, it could be shown that the cell line SW480 exhibited different characteristics when grown in a 3D environment from those in conventional 2D culture. While the cells showed a mesenchymal phenotype in 2D culture, they displayed a more pronounced epithelial character in the 3D model. By adding stromal cells (fibroblasts), the cancer cells changed their growth pattern and built tumour-like structures together with the fibroblasts, thereby remodelling the natural mucosal structures of the scaffold. Additionally, the established 3D tumour model was used as a test system for treatment with standard chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU). The second part of the thesis focused on the establishment of a 3D in vitro test system for targeted therapy. The US Food and Drug Administration has already approved of a number of drugs for targeted therapy of specific types of cancer. For instance, the small molecule vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™) which demonstrated impressive response rates of 50–80% in melanoma patients with a mutation of the rapidly accelerated fibrosarcoma oncogene type B (BRAF) kinase which belongs to the mitogen active protein kinase (MAPK) signalling pathway. However, only 5% of CRC patients harbouring the same BRAF mutation respond to treatment with vemurafenib. An explanation for this unresponsiveness could be a feedback activation of the upstream EGFR, reactivating the MAPK pathway which sustains a proliferative signalling. To test this hypothesis, the two early passage cell lines HROC24 and HROC87, both presenting the mutation BRAF V600E but differing in other mutations, were used and their drug response to vemurafenib and/or gefitinib was assessed in conventional 2D cell culture and compared to the more advanced 3D model. Under 3D culture conditions, both cell lines showed a reduction of the proliferation rate only in the combination therapy approach. Furthermore, no significant differences between the various treatment approaches and the untreated control regarding apoptosis rate and viability for both cell lines could be found in the 3D tumour model which conferred an enhanced chemoresistance to the cancer cells. Because of the observed unresponsiveness to BRAF inhibition by vemurafenib as can be seen in the clinic for patients with BRAF mutations in CRC, the cell line HROC87 was used for further xenografting experiments and analysis of activation changes in the MAPK signalling pathway. It could be shown that the cells presented a reactivation of Akt in the 3D model when treated with both inhibitors, suggesting an escape mechanism for apoptosis which was not present in cells cultured under conventional 2D conditions. Moreover, the cells exhibited an activation of the hepatocyte growth factor receptor (HGFR, c-Met) in 2D and 3D culture, but this was not detectable in the xenograft model. This shows the limitations of in vivo models. The results suggest another feedback activation loop than that to the EGFR which might not primarily be involved in the resistance mechanism. This reflects the before mentioned high attrition rates in the preclinical drug testing. N2 - Krebs ist nach Herz- und Kreislauferkrankungen die führende Todesursache weltweit und 2012 starben daran geschätzt 8,2 Millionen Menschen. Für das Jahr 2030 werden 13 Millionen Krebstote erwartet, was auf das Bevölkerungswachstum und deren Überalterung zurückzuführen ist. Dabei ist das kolorektale Karzinom (engl. colorectal cancer, CRC) der dritthäufigste Krebs bei Männern und der zweithäufigste bei Frauen. Für gewöhnlich entwickelt sich CRC aus einem nicht-kanzerösen Wachstum, das zu einem adenomatösen Polyp bzw. Adenom führt, welches aus Drüsenzellen hervorgeht. Da die Forschung in den vergangenen Jahrzehnten ein besseres Verständnis für die Mechanistik der Krebsentstehung hervorgebracht hat, entstanden neuartige Behandlungsformen, wie die zielgerichtete Krebstherapie. Hohe Versagensraten, welche den Medikamentenentwicklungsprozess sehr kostenaufwendig und ineffizient machen, bleiben eine entscheidende Herausforderung für die pharmazeutische Industrie. Deshalb werden dringend neue präklinische in vitro Modelle, die bessere in vivo Wirkungsvorhersagen liefern, benötigt. Das Tissue Engineering bietet die Möglichkeit künstliche dreidimensionale (3D) in vitro Gewebe herzustellen, z.B. funktionelle Organe, aber es ermöglicht auch, die Reaktion auf ein Medikament in pathologischen Gewebemodellen, wie beispielsweise Krebsmodelle, zu untersuchen. Diese sind der konventionellen zweidimensionalen (2D) Zellkultur in Petrischalen überlegen und können die begrenzten Möglichkeiten von Tiermodellen erweitern, was zudem die Notwendigkeit für präklinische in vivo Modelle vermindert. In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige 3D CRC Modelle auf Basis einer dezellularisierten intestinalen Matrix entwickelt. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass die Zelllinie SW480 verschiedene Charakteristika bezüglich des Wachstums in der konventionellen 2D Zellkultur oder der 3D Umgebung aufwies. Im Gegensatz zu den mesenchymalen Eigenschaften der Zellen in der 2D Zellkultur, zeigten sie im 3D Modell einen betonteren epithelialen Charakter. Durch das Hinzufügen von Fibroblasten änderten die Krebszellen ihr Wachstumsverhalten und sie bildeten zusammen tumorartige Strukturen aus, wobei die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, Krypten und Villi, umgebaut wurden. Zusätzlich wurde das entwickelte 3D Tumormodell als Testsystem für das Standardchemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) herangezogen. Der zweite Teil der Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung eines 3D in vitro Testsystems für die zielgerichtete Behandlung. Es gibt schon eine Reihe von der US Food and Drug Administration zugelassenen Medikamente für die zielgerichtete Behandlung spezifischer Tumorentitäten, wie z.B. Vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™), das eindrucksvolle Ansprechraten von 50–80% bei Melanompatienten mit BRAF-Mutation erzielt. Trotzdem sprechen nur 5% der CRC-Patienten mit der gleichen BRAF-Mutation auf die Behandlung mit Vemurafenib an. Gründe für diese Unempfindlichkeit könnte eine Rückkoppelung zum aufwärtsgelegenen EGFR sein, der das Signal zur Proliferation aufrecht erhält. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die zwei Zelllinien HROC24 und HROC87, die beide die BRAF V600E-Mutation tragen aber sich in anderen Mutationen unterscheiden, mit Vemurafenib und/oder Gefitinib behandelt und das Ansprechen auf die Substanzen in der herkömmlichen 2D Zellkultur sowie im fortschrittlicheren 3D Modell verglichen. In 3D Kulturbedingungen zeigten beide Zelllinien eine Senkung der Proliferation nur im Kombinationstherapie-Ansatz. Außerdem wurden bei den 3D Modellen keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsansätzen und der unbehandelten Kontrolle, hinsichtlich der Apoptoserate und Viabilität, gefunden. Das deutet auf eine erhöhte Chemoresistenz der Krebszellen in der 3D Umgebung hin. Wegen der vorhandenen Unempfindlichkeit der Zelllinie HROC87 gegenüber der BRAF-Inhibierung mit Vemurafenib, wie es auch in der Klinik im Fall von Patienten mit BRAF-Mutation des CRC beobachtet werden kann, wurden diese Zellen für weitere Xenograft-Experimente und Analysen von Aktivierungsunterschieden im MAPK-Signaltransduktionsweg herangezogen. Weiterhin zeigten die Zellen eine Aktivierung des „hepatocyte growth factor receptor“ (HGFR, c-Met) in 2D und 3D Zellkultur, der jedoch nicht im Xenograft-Modell zu sehen war, was die limitierte Übertragbarkeit von Ergebnissen des Tiermodells auf den Menschen verdeutlicht. Dies spiegelt wiederum die obenstehend erwähnten hohen Versagensraten in der präklinischen Medikamententestung wider. Zusammengefasst kann das Tissue Engineering Möglichkeiten zur Herstellung und Entwicklung neuartiger 3D Testsysteme bieten, welche besser die in vivo Situation abbilden. Für eine Medikamententestung in Übereinstimmung mit personalisierter Medizin eröffnet das 3D Tumormodell vielversprechende Wege, welche in Zukunft das präklinische Screening verbessern sowie die hohen Versagensraten und Tierversuche vermindern könnten. KW - Dickdarmtumor KW - Therapie KW - BRAF-mutant KW - colorectal cancer KW - targeted therapy KW - 3D tumour model KW - BRAF-mutiert KW - kolorektales Karzinom KW - zielgerichtete Behandlung KW - 3D Tumormodell KW - In vitro KW - 3D KW - tumour Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174129 ER - TY - THES A1 - Beck, Sebastian T1 - Using optogenetics to influence the circadian clock of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Die Verwendung der Optogenetik zur Beeinflussung der circadianen Uhr von \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s. The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network. The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all. N2 - Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken. Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen. KW - Chronobiologie KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Optogenetics KW - Chronobiology KW - Channelrhodopsin KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184952 ER - TY - JOUR A1 - Beer, Katharina A1 - Schenk, Mariela A1 - Helfrich-Förster, Charlotte A1 - Holzschuh, Andrea T1 - The circadian clock uses different environmental time cues to synchronize emergence and locomotion of the solitary bee Osmia bicornis JF - Scientific Reports N2 - Life on earth adapted to the daily reoccurring changes in environment by evolving an endogenous circadian clock. Although the circadian clock has a crucial impact on survival and behavior of solitary bees, many aspects of solitary bee clock mechanisms remain unknown. Our study is the first to show that the circadian clock governs emergence in Osmia bicornis, a bee species which overwinters as adult inside its cocoon. Therefore, its eclosion from the pupal case is separated by an interjacent diapause from its emergence in spring. We show that this bee species synchronizes its emergence to the morning. The daily rhythms of emergence are triggered by temperature cycles but not by light cycles. In contrast to this, the bee’s daily rhythms in locomotion are synchronized by light cycles. Thus, we show that the circadian clock of O. bicornis is set by either temperature or light, depending on what activity is timed. Light is a valuable cue for setting the circadian clock when bees have left the nest. However, for pre-emerged bees, temperature is the most important cue, which may represent an evolutionary adaptation of the circadian system to the cavity-nesting life style of O. bicornis. KW - Behavioural ecology KW - Evolutionary developmental biology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202721 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Blümel, Rabea A1 - Zink, Miriam A1 - Klopocki, Eva A1 - Liedtke, Daniel T1 - On the traces of tcf12: Investigation of the gene expression pattern during development and cranial suture patterning in zebrafish (Danio rerio) JF - PLoS ONE N2 - The transcription factor 12 (tcf12) is a basic Helix-Loop-Helix protein (bHLH) of the E-protein family, proven to play an important role in developmental processes like neurogenesis, mesoderm formation, and cranial vault development. In humans, mutations in TCF12 lead to craniosynostosis, a congenital birth disorder characterized by the premature fusion of one or several of the cranial sutures. Current research has been primarily focused on functional studies of TCF12, hence the cellular expression profile of this gene during embryonic development and early stages of ossification remains poorly understood. Here we present the establishment and detailed analysis of two transgenic tcf12:EGFP fluorescent zebrafish (Danio rerio) reporter lines. Using these transgenic lines, we analyzed the general spatiotemporal expression pattern of tcf12 during different developmental stages and put emphasis on skeletal development and cranial suture patterning. We identified robust tcf12 promoter-driven EGFP expression in the central nervous system (CNS), the heart, the pronephros, and the somites of zebrafish embryos. Additionally, expression was observed inside the muscles and bones of the viscerocranium in juvenile and adult fish. During cranial vault development, the transgenic fish show a high amount of tcf12 expressing cells at the growth fronts of the ossifying frontal and parietal bones and inside the emerging cranial sutures. Subsequently, we tested the transcriptional activity of three evolutionary conserved non-coding elements (CNEs) located in the tcf12 locus by transient transgenic assays and compared their in vivo activity to the expression pattern determined in the transgenic tcf12:EGFP lines. We could validate two of them as tcf12 enhancer elements driving specific gene expression in the CNS during embryogenesis. Our newly established transgenic lines enhance the understanding of tcf12 gene regulation and open up the possibilities for further functional investigation of these novel tcf12 enhancer elements in zebrafish. KW - Zebrafish KW - Neurons KW - Skull KW - Enhancer elements KW - Hindbrain KW - Cranial sutures KW - Embryos KW - Somites Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201428 VL - 14 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Boetzl, Fabian A. A1 - Konle, Antonia A1 - Krauss, Jochen T1 - Aphid cards – useful model for assessing predation rates or bias prone nonsense? JF - Journal of Applied Entomology N2 - Predation on pest organisms is an essential ecosystem function supporting yields in modern agriculture. However, assessing predation rates is intricate, and they can rarely be linked directly to predator densities or functions. We tested whether sentinel prey aphid cards are useful tools to assess predation rates in the field. Therefore, we looked at aphid cards of different sizes on the ground level as well as within the vegetation. Additionally, by trapping ground‐dwelling predators, we examined whether obtained predation rates could be linked to predator densities and traits. Predation rates recorded with aphid cards were independent of aphid card size. However, predation rates on the ground level were three times higher than within the vegetation. We found both predatory carabid activity densities as well as community weighted mean body size to be good predictors for predation rates. Predation rates obtained from aphid cards are stable over card type and related to predator assemblages. Aphid cards, therefore, are a useful, efficient method for rapidly assessing the ecosystem function predation. Their use might especially be recommended for assessments on the ground level and when time and resource limitations rule out more elaborate sentinel prey methods using exclosures with living prey animals. KW - carabid beetles KW - ecosystem service KW - ground-dwelling predators KW - methods KW - natural pest control KW - sentinel prey Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204798 VL - 144 IS - 1-2 ER - TY - THES A1 - Breitenbach, Tim T1 - A mathematical optimal control based approach to pharmacological modulation with regulatory networks and external stimuli T1 - Ein auf mathematischer Optimalkontrolle basierender Ansatz für pharmakologische Modulation mit regulatorischen Netzwerken und externen Stimuli N2 - In this work models for molecular networks consisting of ordinary differential equations are extended by terms that include the interaction of the corresponding molecular network with the environment that the molecular network is embedded in. These terms model the effects of the external stimuli on the molecular network. The usability of this extension is demonstrated with a model of a circadian clock that is extended with certain terms and reproduces data from several experiments at the same time. Once the model including external stimuli is set up, a framework is developed in order to calculate external stimuli that have a predefined desired effect on the molecular network. For this purpose the task of finding appropriate external stimuli is formulated as a mathematical optimal control problem for which in order to solve it a lot of mathematical methods are available. Several methods are discussed and worked out in order to calculate a solution for the corresponding optimal control problem. The application of the framework to find pharmacological intervention points or effective drug combinations is pointed out and discussed. Furthermore the framework is related to existing network analysis tools and their combination for network analysis in order to find dedicated external stimuli is discussed. The total framework is verified with biological examples by comparing the calculated results with data from literature. For this purpose platelet aggregation is investigated based on a corresponding gene regulatory network and associated receptors are detected. Furthermore a transition from one to another type of T-helper cell is analyzed in a tumor setting where missing agents are calculated to induce the corresponding switch in vitro. Next a gene regulatory network of a myocardiocyte is investigated where it is shown how the presented framework can be used to compare different treatment strategies with respect to their beneficial effects and side effects quantitatively. Moreover a constitutively activated signaling pathway, which thus causes maleficent effects, is modeled and intervention points with corresponding treatment strategies are determined that steer the gene regulatory network from a pathological expression pattern to physiological one again. N2 - In dieser Arbeit werden Modelle für molekulare Netzwerke bestehend aus gewöhnlichen Differentialgleichungen durch Terme erweitert, die die Wechselwirkung zwischen dem entsprechenden molekularen Netzwerk und der Umgebung berücksichtigen, in die das molekulare Netzwerk eingebettet ist. Diese Terme modellieren die Effekte von externen Stimuli auf das molekulare Netzwerk. Die Nutzbarkeit dieser Erweiterung wird mit einem Modell der circadianen Uhr demonstriert, das mit gewissen Termen erweitert wird und Daten von mehreren verschiedenen Experimenten zugleich reproduziert. Sobald das Modell einschließlich der externen Stimuli aufgestellt ist, wird eine Grundstruktur entwickelt um externe Stimuli zu berechnen, die einen gewünschten vordefinierte Effekt auf das molekulare Netzwerk haben. Zu diesem Zweck wird die Aufgabe, geeignete externe Stimuli zu finden, als ein mathematisches optimales Steuerungsproblem formuliert, für welches, um es zu lösen, viele mathematische Methoden zur Verfügung stehen. Verschiedene Methoden werden diskutiert und ausgearbeitet um eine Lösung für das entsprechende optimale Steuerungsproblem zu berechnen. Auf die Anwendung dieser Grundstruktur pharmakologische Interventionspunkte oder effektive Wirkstoffkombinationen zu finden, wird hingewiesen und diese diskutiert. Weiterhin wird diese Grundstruktur in Bezug zu existierenden Netzwerkanalysewerkzeugen gesetzt und ihre Kombination für die Netzwerkanalyse diskutiert um zweckbestimmte externe Stimuli zu finden. Die gesamte Grundstruktur wird mit biologischen Beispielen verifiziert, indem man die berechneten Ergebnisse mit Daten aus der Literatur vergleicht. Zu diesem Zweck wird die Blutplättchenaggregation untersucht basierend auf einem entsprechenden genregulatorischen Netzwerk und damit assoziierte Rezeptoren werden detektiert. Weiterhin wird ein Wechsel von einem T-Helfer Zelltyp in einen anderen in einer Tumorumgebung analysiert, wobei fehlende Agenzien berechnet werden um den entsprechenden Wechsel in vitro zu induzieren. Als nächstes wird ein genregulatorisches Netzwerk eines Myokardiozyten untersucht, wobei gezeigt wird wie die präsentierte Grundstruktur genutzt werden kann um verschiedene Behandlungsstrategien in Bezug auf ihre nutzbringenden Wirkungen und Nebenwirkungen quantitativ zu vergleichen. Darüber hinaus wird ein konstitutiv aktivierter Signalweg, der deshalb unerwünschte Effekte verursacht, modelliert und Interventionspunkte mit entsprechenden Behandlungsstrategien werden bestimmt, die das genregulatorische Netzwerk wieder von einem pathologischen Expressionsmuster zu einem physiologischen steuern. KW - Bioinformatik KW - systematic drug targeting KW - optimal drug combination KW - disease modelling KW - external stimuli KW - intervention point analyzing KW - Molekülsystem KW - Reiz Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174368 ER - TY - JOUR A1 - Breitenbach, Tim A1 - Lorenz, Kristina A1 - Dandekar, Thomas T1 - How to steer and control ERK and the ERK signaling cascade exemplified by looking at cardiac insufficiency JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Mathematical optimization framework allows the identification of certain nodes within a signaling network. In this work, we analyzed the complex extracellular-signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) cascade in cardiomyocytes using the framework to find efficient adjustment screws for this cascade that is important for cardiomyocyte survival and maladaptive heart muscle growth. We modeled optimal pharmacological intervention points that are beneficial for the heart, but avoid the occurrence of a maladaptive ERK1/2 modification, the autophosphorylation of ERK at threonine 188 (ERK\(^{Thr188}\) phosphorylation), which causes cardiac hypertrophy. For this purpose, a network of a cardiomyocyte that was fitted to experimental data was equipped with external stimuli that model the pharmacological intervention points. Specifically, two situations were considered. In the first one, the cardiomyocyte was driven to a desired expression level with different treatment strategies. These strategies were quantified with respect to beneficial effects and maleficent side effects and then which one is the best treatment strategy was evaluated. In the second situation, it was shown how to model constitutively activated pathways and how to identify drug targets to obtain a desired activity level that is associated with a healthy state and in contrast to the maleficent expression pattern caused by the constitutively activated pathway. An implementation of the algorithms used for the calculations is also presented in this paper, which simplifies the application of the presented framework for drug targeting, optimal drug combinations and the systematic and automatic search for pharmacological intervention points. The codes were designed such that they can be combined with any mathematical model given by ordinary differential equations. KW - optimal pharmacological modulation KW - efficient intervention points KW - ERK signaling KW - optimal treatment strategies KW - optimal drug targeting KW - optimal drug combination Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285164 SN - 1422-0067 VL - 20 IS - 9 ER - TY - JOUR A1 - Coelho, Luis Pedro A1 - Alves, Renato A1 - Monteiro, Paulo A1 - Huerta-Cepas, Jaime A1 - Freitas, Ana Teresa A1 - Bork, Peer T1 - NG-meta-profiler: fast processing of metagenomes using NGLess, a domain-specific language JF - Microbiome N2 - Background Shotgun metagenomes contain a sample of all the genomic material in an environment, allowing for the characterization of a microbial community. In order to understand these communities, bioinformatics methods are crucial. A common first step in processing metagenomes is to compute abundance estimates of different taxonomic or functional groups from the raw sequencing data. Given the breadth of the field, computational solutions need to be flexible and extensible, enabling the combination of different tools into a larger pipeline. Results We present NGLess and NG-meta-profiler. NGLess is a domain specific language for describing next-generation sequence processing pipelines. It was developed with the goal of enabling user-friendly computational reproducibility. It provides built-in support for many common operations on sequencing data and is extensible with external tools with configuration files. Using this framework, we developed NG-meta-profiler, a fast profiler for metagenomes which performs sequence preprocessing, mapping to bundled databases, filtering of the mapping results, and profiling (taxonomic and functional). It is significantly faster than either MOCAT2 or htseq-count and (as it builds on NGLess) its results are perfectly reproducible. Conclusions NG-meta-profiler is a high-performance solution for metagenomics processing built on NGLess. It can be used as-is to execute standard analyses or serve as the starting point for customization in a perfectly reproducible fashion. NGLess and NG-meta-profiler are open source software (under the liberal MIT license) and can be downloaded from https://ngless.embl.de or installed through bioconda. KW - metagenomics KW - next-generation sequencing KW - domain-specific language Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223161 VL - 7 IS - 84 ER - TY - JOUR A1 - Dammert, Marcel A. A1 - Brägelmann, Johannes A1 - Olsen, Rachelle R. A1 - Böhm, Stefanie A1 - Monhasery, Niloufar A1 - Whitney, Christopher P. A1 - Chalishazar, Milind D. A1 - Tumbrink, Hannah L. A1 - Guthrie, Matthew R. A1 - Klein, Sebastian A1 - Ireland, Abbie S. A1 - Ryan, Jeremy A1 - Schmitt, Anna A1 - Marx, Annika A1 - Ozretić, Luka A1 - Castiglione, Roberta A1 - Lorenz, Carina A1 - Jachimowicz, Ron D. A1 - Wolf, Elmar A1 - Thomas, Roman K. A1 - Poirier, John T. A1 - Büttner, Reinhard A1 - Sen, Triparna A1 - Byers, Lauren A. A1 - Reinhardt, H. Christian A1 - Letai, Anthony A1 - Oliver, Trudy G. A1 - Sos, Martin L. T1 - MYC paralog-dependent apoptotic priming orchestrates a spectrum of vulnerabilities in small cell lung cancer JF - Nature Communications N2 - MYC paralogs are frequently activated in small cell lung cancer (SCLC) but represent poor drug targets. Thus, a detailed mapping of MYC-paralog-specific vulnerabilities may help to develop effective therapies for SCLC patients. Using a unique cellular CRISPR activation model, we uncover that, in contrast to MYCN and MYCL, MYC represses BCL2 transcription via interaction with MIZ1 and DNMT3a. The resulting lack of BCL2 expression promotes sensitivity to cell cycle control inhibition and dependency on MCL1. Furthermore, MYC activation leads to heightened apoptotic priming, intrinsic genotoxic stress and susceptibility to DNA damage checkpoint inhibitors. Finally, combined AURK and CHK1 inhibition substantially prolongs the survival of mice bearing MYC-driven SCLC beyond that of combination chemotherapy. These analyses uncover MYC-paralog-specific regulation of the apoptotic machinery with implications for genotype-based selection of targeted therapeutics in SCLC patients. KW - genetic engineering KW - oncogenes KW - small-cell lung cancer KW - targeted therapies Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223569 VL - 10 ER - TY - INPR A1 - Dandekar, Thomas T1 - Biological heuristics applied to cosmology suggests a condensation nucleus as start of our universe and inflation cosmology replaced by a period of rapid Weiss domain-like crystal growth N2 - Cosmology often uses intricate formulas and mathematics to derive new theories and concepts. We do something different in this paper: We look at biological processes and derive from these heuristics so that the revised cosmology agrees with astronomical observations but does also agree with standard biological observations. We show that we then have to replace any type of singularity at the start of the universe by a condensation nucleus and that the very early period of the universe usually assumed to be inflation has to be replaced by a period of rapid crystal growth as in Weiss magnetization domains. Impressively, these minor modifications agree well with astronomical observations including removing the strong inflation perturbations which were never observed in the recent BICEP2 experiments. Furthermore, looking at biological principles suggests that such a new theory with a condensation nucleus at start and a first rapid phase of magnetization-like growth of the ordered, physical laws obeying lattice we live in is in fact the only convincing theory of the early phases of our universe that also is compatible with current observations. We show in detail in the following that such a process of crystal creation, breaking of new crystal seeds and ultimate evaporation of the present crystal readily leads over several generations to an evolution and selection of better, more stable and more self-organizing crystals. Moreover, this explains the “fine-tuning” question why our universe is fine-tuned to favor life: Our Universe is so self-organizing to have enough offspring and the detailed physics involved is at the same time highly favorable for all self-organizing processes including life. This biological theory contrasts with current standard inflation cosmologies. The latter do not perform well in explaining any phenomena of sophisticated structure creation or self-organization. As proteins can only thermodynamically fold by increasing the entropy in the solution around them we suggest for cosmology a condensation nucleus for a universe can form only in a “chaotic ocean” of string-soup or quantum foam if the entropy outside of the nucleus rapidly increases. We derive an interaction potential for 1 to n-dimensional strings or quantum-foams and show that they allow only 1D, 2D, 4D or octonion interactions. The latter is the richest structure and agrees to the E8 symmetry fundamental to particle physics and also compatible with the ten dimensional string theory E8 which is part of the M-theory. Interestingly, any other interactions of other dimensionality can be ruled out using Hurwitz compositional theorem. Crystallization explains also extremely well why we have only one macroscopic reality and where the worldlines of alternative trajectories exist: They are in other planes of the crystal and for energy reasons they crystallize mostly at the same time, yielding a beautiful and stable crystal. This explains decoherence and allows to determine the size of Planck´s quantum h (very small as separation of crystal layers by energy is extremely strong). Ultimate dissolution of real crystals suggests an explanation for dark energy agreeing with estimates for the “big rip”. The halo distribution of dark matter favoring galaxy formation is readily explained by a crystal seed starting with unit cells made of normal and dark matter. That we have only matter and not antimatter can be explained as there may be right handed mattercrystals and left-handed antimatter crystals. Similarly, real crystals are never perfect and we argue that exactly such irregularities allow formation of galaxies, clusters and superclusters. Finally, heuristics from genetics suggest to look for a systems perspective to derive correct vacuum and Higgs Boson energies. KW - heuristics KW - inflation KW - cosmology KW - crystallization KW - crystal growth KW - E8 symmetry KW - Hurwitz theorem KW - evolution KW - Lee Smolin Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183945 ER - TY - JOUR A1 - Dechaud, Corentin A1 - Volff, Jean-Nicolas A1 - Schartl, Manfred A1 - Naville, Magali T1 - Sex and the TEs: transposable elements in sexual development and function in animals JF - Mobile DNA N2 - Transposable elements are endogenous DNA sequences able to integrate into and multiply within genomes. They constitute a major source of genetic innovations, as they can not only rearrange genomes but also spread ready-to-use regulatory sequences able to modify host gene expression, and even can give birth to new host genes. As their evolutionary success depends on their vertical transmission, transposable elements are intrinsically linked to reproduction. In organisms with sexual reproduction, this implies that transposable elements have to manifest their transpositional activity in germ cells or their progenitors. The control of sexual development and function can be very versatile, and several studies have demonstrated the implication of transposable elements in the evolution of sex. In this review, we report the functional and evolutionary relationships between transposable elements and sexual reproduction in animals. In particular, we highlight how transposable elements can influence expression of sexual development genes, and how, reciprocally, they are tightly controlled in gonads. We also review how transposable elements contribute to the organization, expression and evolution of sexual development genes and sex chromosomes. This underscores the intricate co-evolution between host functions and transposable elements, which regularly shift from a parasitic to a domesticated status useful to the host. KW - Transposable element KW - Sex determination KW - Sexual development and function KW - Germline KW - piRNA KW - Sex chromosome Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202510 VL - 10 ER - TY - THES A1 - del Olmo Toledo, Valentina T1 - Evolution of DNA binding preferences in a family of eukaryotic transcription regulators T1 - Evolutionäre Entwicklung der Bindeaffinität an bestimmte DNA Sequenzen in einer Familie von eukaryotischen Transkriptionsfaktoren N2 - Regulation of gene expression by the control of transcription is essential for any cell to adapt to the environment and survive. Transcription regulators, i.e. sequence-specific DNA binding proteins that regulate gene expression, are central elements within the gene networks of most organisms. Transcription regulators are grouped into distinct families based on structural features that determine, to a large extent, the DNA sequence(s) that they can recognise and bind. Less is known, however, about how the DNA binding preferences can diversify within transcription regulator families during evolutionary timescales, and how such diversification can affect the biology of the organism. In this dissertation I study the SREBP (sterol regulatory element binding protein) family of transcriptional regulators in yeasts, and in Candida albicans in particular, as an experimental system to address these questions. The SREBPs are conserved from fungi to humans and represent a subgroup of basic helix-loop-helix DNA binding proteins. Early chromatin immunoprecipitation experiments with SREBPs from humans and yeasts showed that these proteins bound in vivo to the canonical DNA sequence, termed E-box, most basic helix-loop-helix proteins bind to. By contrast, most recent analysis carried out with less-studied fungal SREBPs revealed a non-canonical DNA motif to be the most overrepresented sequence in the bound regions. This study aims to establish the intrinsic DNA binding preferences of key branches of this family and to determine how the divergence in DNA binding affinities originated. To this end, I combined phylogenetic and ancestral reconstruction with extensive biochemical characterisation of key SREBP proteins. The results indicated that while the most-studied SREBPs (in mammals) indeed show preference for the E-box, a second branch of the family preferentially binds the non-E-box, and a third one is able to bind both sequences with similar affinity. The preference for one or the other DNA sequence is an intrinsic property of each protein because their purified DNA binding domain was sufficient to recapitulate their in vivo binding preference. The ancestor that gave rise to these two different types of SREBPs (the branch that binds E-box and the one that binds non-E-box DNA) appears to be a protein with a broader DNA binding capability that had a slight preference for the non-canonical motif. Thus, the results imply these two branches originated by either enhancing the original ancestral preference for non-E-box or tilting it towards the E-box DNA and flipping the preference for this sequence. The main function associated with members of the SREBP family in most eukaryotes is the control of lipid biosynthesis. I have further studied the function of these proteins in the lineage that encompasses the human associated yeast C. albicans. Strikingly, the three SREBPs present in the fungus’ genome contribute to the colonisation of the mammalian gut by regulating cellular processes unrelated to lipid metabolism. Here I describe that two of the three C. albicans SREBPs form a regulatory cascade that regulates morphology and cell wall modifications under anaerobic conditions, whereas the third SREBP has been shown to be involved in the regulation of glycolysis genes. Therefore, I posit that the described diversification in DNA binding specificity in these proteins and the concomitant expansion of targets of regulation were key in enabling this fungal lineage to associate with animals. N2 - Für jede Zelle ist es essenziell die Transkription über die Genexpression zu regulieren, um sich an unterschiedliche Lebensbedingungen anzupassen. Regulatoren der Transkription, zum Beispiel sequenzspezifische DNA-binde Proteine, sind ein zentrales Element des Genregulationsnetzwerks in den meisten Organismen. Auf Grund ihres Aufbaus sowie der daraus resultierenden spezifischen Eigenschaften DNA zu binden, werden diese Regulatoren in unterschiedliche Familien unterteilt. Bisher ist wenig darüber bekannt, wie unterschiedlich die DNA Sequenzen sein können, welche von einer Familie von Transkriptionsregulatoren gebunden werden, wie sich diese Diversität der Bindung in der Evolution über die Zeit verändert hat und ob diese unterschiedlichen Bindeaffinitäten die Biologie eines Organismus beeinflussen. In dieser Dissertation befasse ich mich mit der Transkriptionsregulator Familie der SREBPs (sterol regulatory element binding protein) in Hefen, als Modelorganismus diente dabei Candida albicans. Die Familie der SREBPs ist vom Pilz zu den Menschen genetisch weitestgehend konserviert und repräsentiert eine Unterfamilie der Helix-loop-helix DNA-binde Proteine. Erste Chromatin-Immunpräzipitation Experimente der SREBPs in Menschen und Hefen zeigen in vivo eine Bindung an eine kanonische DNA Sequenz genannt E-box, welche von den meisten der Helix-loop-helix Proteine gebunden wird. Im Gegensatz zeigen neuere Analysen, welche mit weniger bekannten SREBPs aus Pilzen durchgeführt wurden, dass hauptsächlich nicht-kanonische DNA Sequenzen gebunden werden. Diese Arbeit versucht die Präferenzen, mit welchen einige der wichtigsten Mitglieder der Familie der SREBPs an bestimmte DNA Sequenzen binden aufzudecken und heraus zu finden wie es innerhalb dieser Gruppe zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten kam. Dafür wurden phylogenetische Rekonstruktionsanalysen und aufwändige biochemische Charakterisierungen einiger der Proteine der SREBP Familie durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten der bisher charakterisierten SREBPs (in Säugetieren) es vorziehen an die E-box Sequenz zu binden, ein anderer Zweig des SREBP Familienstammbaums bevorzugt hingegen die non-E-box Sequenz, ein dritter Zweig des Stammbaums ist in der Lage beide Sequenzen mit gleicher Affinität zu binden. Das Bevorzugen einer der beiden DNA Sequenzen ist eine natürliche Eigenschaft des jeweiligen Proteins, da in Experimenten die isolierte DNA-binde Domäne der Proteine ausreichend war, um die in vivo Bindepräferenzen zu replizieren. Der Ursprung dieser beiden Gruppen (der E-box bindenden Gruppe und der Gruppe die non-E-box Sequenzen bindet) liegt wahrscheinlich in einem Protein, welches beide Sequenzen binden konnte, mit einem Vorzug für die nicht-kanonische Sequenz. Dies impliziert, dass die Gruppen entstanden sind indem sich entweder eine Präferenz des Vorgängerproteins für die nicht-kanonische Sequenz durchgesetzt hat oder, dass sich eine Präferenz für die E-box bindende Sequenz durchgesetzt hat und somit die Affinität dahingehend verschoben wurde. Die Hauptfunktion der meisten Proteine der SREBP Familie in Eukaryoten ist die Kontrolle der Lipid Biosynthese. In meiner Arbeit habe ich mich auf die Erforschung der SREBPs in einer Gruppe von Organismen zugewandt, die auch den mit dem Menschen assoziierten Hefepilz Candida albicans umfasst. Erstaunlicherweise beeinflussen die drei SREBPs die im Candida albicans Genom zu finden sind, die Kolonisierung des Säugetierdarms, jedoch nicht durch die Kontrolle der Lipid Biosynthese. Im Folgenden werde ich beschreiben wie zwei der drei SREBPs aus Candida albicans eine regulatorische Kaskade bilden, welche Einfluss auf die Regulierung der Morphologie und der Zellwandzusammensetzung des Pilzes unter anaeroben Bedingungen hat, wohingegen das dritte Protein der SREBP Familie für die Regulierung der Glykolyse von Bedeutung ist. Ich habe festgestellt, dass die beschriebene Vielfalt mit der diese Proteine an bestimmte DNA Sequenzen binden und die damit einhergehende Expansion der regulierbaren Ziele ein wesentlicher Grund dafür ist, dass Organismen dieses Stammbaums erfolgreich Säugetiere kolonisieren können. KW - Candida albicans KW - SREBP KW - evolution Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187890 ER - TY - THES A1 - Derakhshani, Shaghayegh T1 - Measles virus infection enhances dendritic cell migration in a 3D environment T1 - Die Masernvirusinfektion verstärkt die Migration dendritischer Zellen in einer 3D-Umgebung N2 - The respiratory system is amongst the most important compartments in the human body. Due to its connection to the external environment, it is one of the most common portals of pathogen entry. Airborne pathogens like measles virus (MV) carried in liquid droplets exhaled from the infected individuals via a cough or sneeze enter the body from the upper respiratory tract and travel down to the lower respiratory tract and reach the alveoli. There, pathogens are captured by the resident dendritic cells (DCs) or macrophages and brought to the lymph node where immune responses or, as in case of MV, dissemination via the hematopoietic cell compartment are initiated. Basic mechanisms governing MV exit from the respiratory tract, especially virus transmission from infected immune cells to the epithelial cells have not been fully addressed before. Considering the importance of these factors in the viral spread, a complex close-to-in-vivo 3D human respiratory tract model was generated. This model was established using de-cellularized porcine intestine tissue as a biological scaffold and H358 cells as targets for infection. The scaffold was embedded with fibroblast cells, and later on, an endothelial cell layer seeded at the basolateral side. This provided an environment resembling the respiratory tract where MV infected DCs had to transmigrate through the collagen scaffold and transmit the virus to epithelial cells in a Nectin-4 dependent manner. For viral transmission, the access of infected DCs to the recipient epithelial cells is an essential prerequisite and therefore, this important factor which is reflected by cell migration was analyzed in this 3D system. The enhanced motility of specifically MV-infected DCs in the 3D models was observed, which occurred independently of factors released from the other cell types in the models. Enhanced motility of infected DCs in 3D collagen matrices suggested infection-induced cytoskeletal remodeling, as also verified by detection of cytoskeletal polarization, uropod formation. This enforced migration was sensitive to ROCK inhibition revealing that MV infection induces an amoeboid migration mode in DCs. In support of this, the formation of podosome structures and filopodia, as well as their activity, were reduced in infected DCs and retained in their uninfected siblings. Differential migration modes of uninfected and infected DCs did not cause differential maturation, which was found to be identical for both populations. As an underlying mechanism driving this enforced migration, the role of sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) was studied in MV-exposed cultures. It was shown in this thesis that MV-infection increased S1P production, and this was identified as a contributing factor as inhibition sphingosine kinase activity abolished enforced migration of MV-infected DCs. These findings revealed that MV infection induces a fast push-and-squeeze amoeboid mode of migration, which is supported by SphK/S1P axis. However, this push-and-squeeze amoeboid migration mode did not prevent the transendothelial migration of MV-infected DCs. Altogether, this 3D system has been proven to be a suitable model to study specific parameters of mechanisms involved in infections in an in vivo-like conditions. N2 - Die respiratorische System ist ein wesentlicher physiologischer Bestandteil. Durch die direkte und konstante Verbindung der Atemwege mit der äußeren Umgebung sind sie einer der häufigsten Pfade für den Eintritt von Krankheitserregern in den Körper. Luftübertragene Krankheitserreger wie das Masern-Virus (MV), das in Flüssigkeitströpfchen mitgeführt und von Patienten durch Husten oder Niesen ausgeatmet wird, können über die oberen Atemwege in den Körper gelangen und sich bis in die unteren Atemwege und bis zu den Alveolen ausbreiten. Dort werden diese Krankheitserreger von den dort residenten dendritischen Zellen (DC) oder Makrophagen erworben und zu sekundären lymphatischen Organen transportiert, in denen sowohl virus-spezifische Immunantworten, aber auch – wie im Falle von MV – die hämatogene Dissemination initiiert wird. Der Austrittsmechanismus des MV aus den Atemwegen, insbesondere dessen Übertragung von infizierten Immunzellen auf die Epithelzellen und die Faktoren, die diesen Ablauf bestimmen, wurden jedoch bisher unzureichend untersucht. In Anbetracht der Bedeutung dieser Faktoren für die Virusausbreitung wurde ein komplexes, realitätsnahes in-vivo 3D-Modell der menschlichen Atemwege erstellt. Dieses Modell wurde unter Verwendung von de-zellularisiertem Schweinedarmgewebe als biologischem Gerüst und H358 Epithelzellen als Empfänger etabliert. Dieses Grundgerüst wurde mit Fibroblastenzellen eingebettet. Später wurde auf der basolateralen Seite der Modelle eine Endothelzellschicht eingebracht, um eine Umgebung zu schaffen, die der der Atemwege ähnelt. Somit mussten die Virus-Donoren, MV-infizierte DC durch das Kollagengerüst wandern und das Virus auf Epithelzellen in einer Nektin-4 abhängigen Weise übertragen. Für die Virusübertragung ist der Zugang infizierter DC zu den Empfänger-Epithelzellen eine wesentliche Voraussetzung, weshalb dieser wichtige Faktor, der sich in der Zellmigration widerspiegelt, in diesem 3D-System analysiert wurde. Eine erhöhte Beweglichkeit spezifisch MV-infizierter DCs wurde in den 3D-Modellen beobachtet. Dies erwies sich als unabhängig von löslichen Faktoren der anderen Zelltypen in den Modellen. Erhöhte Beweglichkeit infizierten DCs wurde auch in 3D-Kollagenmatrizes gesehen, was auf einen infektionsvermittelten zytoskelettalen Umbau hindeutete, der auch anhand von Zytoskelettpolarisation und Uropodbildung bestätigt wurde. Die MV-Infektion induzierte einen schnellen amöboiden Migrationsmodus in den DCs, der sich als sensitiv gegenüber ROCK-Hemmung erwies. Im Gegensatz zu uninfizierten DCs gleichen Reifungsstadiums waren in infizierten DCs Podosomenstrukturen und Filopodien sowie deren Aktivität stark reduziert. Als potentiell zur verstärkten Motilität infizierter DCs beitragender Faktor wurde die Rolle der Sphingosinkinase (SphK) und des Sphingosin-1-phosphats (S1P) in MV-exponierten Kulturen untersucht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die S1P-Produktion durch eine MV-Infektion erhöht wurde, und in der Tat zur für infizierte DCs beobachteten erhöhten Geschwindigkeit beitrug, da diese sensitiv gegenüber Hemmung der Sphingosinkinase-Aktivität war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die MV-Infektion einen schnellen amöboid-artigen Migrationsmodus induziert, der von der SphK/S1P-Achse unterstützt wird. Dieser Push-and-Squeeze-Amoeboid-Migrationsmodus verhinderte jedoch nicht die transendotheliale Migration von MV-infizierten DCs. Insgesamt hat sich dieses 3D-System als geeignetes Modell erwiesen, um die spezifische Parameter von Mechanismen von Infektionen in einem in-vivo-ähnlichen Zustand zu untersuchen. KW - Dendritische Zelle KW - Zell Migration KW - Masern-Virus KW - 3D-Modell KW - Sphingosine-1-phosphats KW - Dendritic cell KW - Cell migration KW - Measles virus KW - 3D tissue model KW - Tissue engineering KW - Sphingosine-1-phosphate Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189182 ER - TY - THES A1 - Diegmann [geb. Weißbach], Susann T1 - Identifizierung des Mutationsspektrums und Charakterisierung relevanter Mutationen im Multiplen Myelom T1 - Identification of Mutation Spectrum and Characterization of relevant Mutations in Multiple Myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne B-Zell-Erkrankung, welche von einer großen Heterogenität auf der biologischen und klinischen Ebene sowie in der Therapieantwort geprägt ist. Durch die biologische Interpretation von whole exome sequencing (WES)-Daten der Tumor- und Normalproben von fünf MM-Patienten und sechs MM-Zelllinien (ZL) sowie dem Einbezug von publizierten next generation sequencing (NGS)-Daten von 38 MM-Patienten konnten in dieser Dissertation sowohl somatische tumorrelevante Mutationen identifiziert als auch ein MM-spezifisches Signaltransduktionsnetzwerk definiert werden. Interessanterweise wurde in fast 100 % der MM-Patienten mindestens eine Mutation und in ~50 % der MM-Patienten sogar mehr als eine Mutation innerhalb dieses Netzwerkes beobachtet, was auf eine inter- und intra-individuelle Signalweg-Redundanz hinweist, die für die individuelle Therapieentscheidung möglicherweise von Bedeutung sein könnte. Außerdem konnte bestätigt werden, dass identische, positionsspezifische und genspezifische Mutationen im MM selten wiederholt auftreten. Als häufig mutierte Gene im MM konnten KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 und PKHD1 identifiziert werden. Interessanterweise wurde die DIS3-Mutation in der MM-ZL OPM2 gemeinsam mit einer copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) im DIS3-Lokus detektiert, und in der MM-ZL AMO1 wurde eine noch nicht näher charakterisierte KRAS-Mutation in Exon 4 in Verbindung mit einem copy number (CN)-Zugewinn und einer erhöhten KRAS-Genexpression gefunden. DIS3 ist ein enzymatisch aktiver Teil des humanen RNA-Exosom-Komplexes und KRAS ein zentrales Protein im RTK-Signalweg, wodurch genetische Aberrationen in diesen Genen möglicherweise in der Entstehung oder Progression des MMs eine zentrale Rolle spielen. Daher wurde die gesamte coding sequence (CDS) der Gene DIS3 und KRAS an Tumorproben eines einheitlich behandelten Patientensets der DSMM-XI-Studie mit einem Amplikon-Tiefen-Sequenzierungsansatz untersucht. Das Patientenset bestand aus 81 MM-Patienten mit verfügbaren zytogenetischen und klinischen Daten. Dies ergab Aufschluss über die Verteilung der Mutationen innerhalb der Gene und dem Vorkommen der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen des Tumors. Des Weiteren wurde die Assoziation der Mutationen mit weiteren klassischen zytogenetischen Alterationen (z.B. Deletion von Chr 13q14, t(4;14)-Translokation) untersucht und der Einfluss der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen auf den klinischen Verlauf und die Therapieantwort bestimmt. Besonders hervorzuheben war dabei die Entdeckung von sieben neuen Mutationen sowie drei zuvor unbeschriebenen hot spot-Mutationen an den Aminosäure (AS)-Positionen p.D488, p.E665 und p.R780 in DIS3. Es wurde des Weiteren die Assoziation von DIS3-Mutationen mit einer Chr 13q14-Deletion und mit IGH-Translokationen bestätigt. Interessanterweise wurde ein niedrigeres medianes overall survival (OS) für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation sowie auch eine schlechtere Therapieantwort für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation im Nebenklon im Vergleich zum Hauptklon beobachtet. In KRAS konnten die bereits publizierten Mutationen bestätigt und keine Auswirkungen der KRAS-Mutationen in Haupt- oder Nebenklon auf den klinischen Verlauf oder die Therapieantwort erkannt werden. Erste siRNA vermittelte knockdown-Experimente von KRAS und Überexpressionsexperimente von KRAS-Wildtyp (WT) und der KRAS-Mutationen p.G12A, p.A146T und p.A146V mittels lentiviraler Transfektion zeigten eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 von dem KRAS-Mutationsstatus. Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation einen detaillierten Einblick in die molekularen Strukturen des MMs, vor allem im Hinblick auf die Rolle von DIS3 und KRAS bei der Tumorentwicklung und dem klinischen Verlauf. N2 - Multiple Myeloma (MM) is a malignant B-cell neoplasm that is characterized by a great heterogeneity on the biological and clinical level as well as by a heterogeneous response to therapeutic approaches. Biological interpretation of whole exome sequencing (WES) data of tumor and normal samples of five MM patients and six MM cell lines (CL), as well as the inclusion of published next generation sequencing (NGS) data of 38 MM patients, identified somatic tumor relevant mutations as well as a signal transduction network that was commonly affected in MM. Interestingly, almost 100 % of the MM patients harbored one mutation and ~50 % of the MM patients harbored more than one mutation in different genes of this defined network, which predicted an inter- and intra-individual pathway redundancy that might be of particular importance for individual therapeutic approaches. Furthermore, it was confirmed that the recurrent occurrence of point-specific mutations and even gene specific mutations are rare events in MM. KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 and PKHD1 were among the most recurrently mutated genes in MM. Of note, one of the DIS3 mutations was accompanied by a copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) in the CL OPM2 and a so far undefined exon 4 mutation in KRAS was associated with an increased copy number (CN) and gene expression level of KRAS in the CL AMO1. DIS3 is one of the active parts of the human RNA exosome complex and KRAS is a central protein in the RTK pathway leading to the hypothesis that one or more genetic abberations within these genes may play an important role in the development and progression of MM. To further investigate this hypothesis the whole coding sequence (CDS) of DIS3 and KRAS of tumor samples of a uniquely treated patient set of the DSMM XI was sequenced using an amplicon deep sequencing approach. The study included 81 MM patients for whom cytogenetic and clinical data were available. This approach revealed information about the mutational landscape within DIS3 and KRAS and the occurrence of mutations in major and minor clones. In addition, we were able to investigate the association of the DIS3 and KRAS mutations with additional cytogenetic alterations (such as deletion of chr 13q14, translocation t(4;14)) and we studied the impact of mutations in major and minor clones on the clinical outcome and response to therapy. In particular, we discovered seven unknown mutations and three previously undescribed hot spot mutations at amino acid positions p.D488, p.E665 and p.R780 in DIS3. An association of DIS3 mutations with deletion of chr 13q14 and IGH-translocations, that was described previously, was confirmed. Interestingly, a trend towards a lower median overall survival of MM patients with a DIS3 mutation was observed. Patients with a DIS3 mutation in the minor clone also showed a worse response to therapy as compared to patients with a mutation in the major clone. Published mutations in KRAS were confirmed. Moreover, we revealed no impact of these mutations (in major or minor clones) on the clinical outcome or response to therapy. First siRNA mediated knockdown experiments on KRAS and lentivirus mediated overexpression of KRAS WT and mutated KRAS (p.G12A, p.A146T and p.A146V) showed that the phosphorylation status of MEK1/2 and ERK1/2 is dependent on the mutation status of KRAS. In summary, this present doctoral thesis allowed more detailed insights into the molecular structure of MM, specifically with regard to the role of DIS3 and KRAS in tumor development and outcome. KW - Plasmozytom KW - Multiples Myelom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114800 ER - TY - JOUR A1 - Draganov, Dobrin D. A1 - Santidrian, Antonio F. A1 - Minev, Ivelina A1 - Duong, Nguyen A1 - Kilinc, Mehmet Okyay A1 - Petrov, Ivan A1 - Vyalkova, Anna A1 - Lander, Elliot A1 - Berman, Mark A1 - Minev, Boris A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Delivery of oncolytic vaccinia virus by matched allogeneic stem cells overcomes critical innate and adaptive immune barriers JF - Journal of Translational Medicine N2 - Background Previous studies have identified IFNγ as an important early barrier to oncolytic viruses including vaccinia. The existing innate and adaptive immune barriers restricting oncolytic virotherapy, however, can be overcome using autologous or allogeneic mesenchymal stem cells as carrier cells with unique immunosuppressive properties. Methods To test the ability of mesenchymal stem cells to overcome innate and adaptive immune barriers and to successfully deliver oncolytic vaccinia virus to tumor cells, we performed flow cytometry and virus plaque assay analysis of ex vivo co-cultures of stem cells infected with vaccinia virus in the presence of peripheral blood mononuclear cells from healthy donors. Comparative analysis was performed to establish statistically significant correlations and to evaluate the effect of stem cells on the activity of key immune cell populations. Results Here, we demonstrate that adipose-derived stem cells (ADSCs) have the potential to eradicate resistant tumor cells through a combination of potent virus amplification and sensitization of the tumor cells to virus infection. Moreover, the ADSCs demonstrate ability to function as a virus-amplifying Trojan horse in the presence of both autologous and allogeneic human PBMCs, which can be linked to the intrinsic immunosuppressive properties of stem cells and their unique potential to overcome innate and adaptive immune barriers. The clinical application of ready-to-use ex vivo expanded allogeneic stem cell lines, however, appears significantly restricted by patient-specific allogeneic differences associated with the induction of potent anti-stem cell cytotoxic and IFNγ responses. These allogeneic responses originate from both innate (NK)- and adaptive (T)- immune cells and might compromise therapeutic efficacy through direct elimination of the stem cells or the induction of an anti-viral state, which can block the potential of the Trojan horse to amplify and deliver vaccinia virus to the tumor. Conclusions Overall, our findings and data indicate the feasibility to establish simple and informative assays that capture critically important patient-specific differences in the immune responses to the virus and stem cells, which allows for proper patient-stem cell matching and enables the effective use of off-the-shelf allogeneic cell-based delivery platforms, thus providing a more practical and commercially viable alternative to the autologous stem cell approach. KW - vaccinia KW - cancer KW - stem Cells KW - oncolysis KW - oncolytic virus KW - virotherapy KW - immunity KW - immunotherapy Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226312 SN - 100 VL - 17 ER - TY - JOUR A1 - Duan, Xiaodong A1 - Nagel, Georg A1 - Gao, Shiqiang T1 - Mutated channelrhodopsins with increased sodium and calcium permeability JF - Applied Sciences N2 - (1) Background: After the discovery and application of Chlamydomonas reinhardtii channelrhodopsins, the optogenetic toolbox has been greatly expanded with engineered and newly discovered natural channelrhodopsins. However, channelrhodopsins of higher Ca\(^{2+}\) conductance or more specific ion permeability are in demand. (2) Methods: In this study, we mutated the conserved aspartate of the transmembrane helix 4 (TM4) within Chronos and PsChR and compared them with published ChR2 aspartate mutants. (3) Results: We found that the ChR2 D156H mutant (XXM) showed enhanced Na\(^+\) and Ca\(^{2+}\) conductance, which was not noticed before, while the D156C mutation (XXL) influenced the Na\(^+\) and Ca\(^{2+}\) conductance only slightly. The aspartate to histidine and cysteine mutations of Chronos and PsChR also influenced their photocurrent, ion permeability, kinetics, and light sensitivity. Most interestingly, PsChR D139H showed a much-improved photocurrent, compared to wild type, and even higher Na+ selectivity to H\(^+\) than XXM. PsChR D139H also showed a strongly enhanced Ca\(^{2+}\) conductance, more than two-fold that of the CatCh. (4) Conclusions: We found that mutating the aspartate of the TM4 influences the ion selectivity of channelrhodopsins. With the large photocurrent and enhanced Na\(^+\) selectivity and Ca\(^{2+}\) conductance, XXM and PsChR D139H are promising powerful optogenetic tools, especially for Ca\(^{2+}\) manipulation. KW - optogenetics KW - channelrhodopsins KW - sodium KW - calcium KW - DC gate Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-197435 SN - 2076-3417 VL - 9 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Duque, Laura A1 - Poelman, Erik H. A1 - Steffan-Dewenter, Ingolf T1 - Plant-mediated effects of ozone on herbivores depend on exposure duration and temperature JF - Scientific Reports N2 - Abiotic stress by elevated tropospheric ozone and temperature can alter plants’ metabolism, growth, and nutritional value and modify the life cycle of their herbivores. We investigated how the duration of exposure of Sinapis arvensis plants to high ozone and temperature levels affect the life cycle of the large cabbage white, Pieris brassicae. Plants were exposed to ozone-clean (control) or ozone-enriched conditions (120 ppb) for either 1 or 5 days and were afterwards kept in a greenhouse with variable temperature conditions. When given the choice, P. brassicae butterflies laid 49% fewer eggs on ozone-exposed than on control plants when the exposure lasted for 5 days, but showed no preference when exposure lasted for 1 day. The caterpillars took longer to hatch on ozone-exposed plants and at lower ambient temperatures. The ozone treatment had a positive effect on the survival of the eggs. Ozone decreased the growth of caterpillars reared at higher temperatures on plants exposed for 5 days, but not on plants exposed for 1 day. Overall, longer exposure of the plants to ozone and higher temperatures affected the life cycle of the herbivore more strongly. With global warming, the indirect impacts of ozone on herbivores are likely to become more common. KW - Ecology KW - Environmental impact Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202805 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Dörk, Thilo A1 - Peterlongo, Peter A1 - Mannermaa, Arto A1 - Bolla, Manjeet K. A1 - Wang, Qin A1 - Dennis, Joe A1 - Ahearn, Thomas A1 - Andrulis, Irene L. A1 - Anton-Culver, Hoda A1 - Arndt, Volker A1 - Aronson, Kristan J. A1 - Augustinsson, Annelie A1 - Beane Freeman, Laura E. A1 - Beckmann, Matthias W. A1 - Beeghly-Fadiel, Alicia A1 - Behrens, Sabine A1 - Bermisheva, Marina A1 - Blomqvist, Carl A1 - Bogdanova, Natalia V. A1 - Bojesen, Stig E. A1 - Brauch, Hiltrud A1 - Brenner, Hermann A1 - Burwinkel, Barbara A1 - Canzian, Federico A1 - Chan, Tsun L. A1 - Chang-Claude, Jenny A1 - Chanock, Stephen J. A1 - Choi, Ji-Yeob A1 - Christiansen, Hans A1 - Clarke, Christine L. A1 - Couch, Fergus J. A1 - Czene, Kamila A1 - Daly, Mary B. A1 - dos-Santos-Silva, Isabel A1 - Dwek, Miriam A1 - Eccles, Diana M. A1 - Ekici, Arif B. A1 - Eriksson, Mikael A1 - Evans, D. Gareth A1 - Fasching, Peter A. A1 - Figueroa, Jonine A1 - Flyger, Henrik A1 - Fritschi, Lin A1 - Gabrielson, Marike A1 - Gago-Dominguez, Manuela A1 - Gao, Chi A1 - Gapstur, Susan M. A1 - García-Closas, Montserrat A1 - García-Sáenz, José A. A1 - Gaudet, Mia M. A1 - Giles, Graham G. A1 - Goldberg, Mark S. A1 - Goldgar, David E. A1 - Guenél, Pascal A1 - Haeberle, Lothar A1 - Haimann, Christopher A. A1 - Håkansson, Niclas A1 - Hall, Per A1 - Hamann, Ute A1 - Hartman, Mikael A1 - Hauke, Jan A1 - Hein, Alexander A1 - Hillemanns, Peter A1 - Hogervorst, Frans B. L. A1 - Hooning, Maartje J. A1 - Hopper, John L. A1 - Howell, Tony A1 - Huo, Dezheng A1 - Ito, Hidemi A1 - Iwasaki, Motoki A1 - Jakubowska, Anna A1 - Janni, Wolfgang A1 - John, Esther M. A1 - Jung, Audrey A1 - Kaaks, Rudolf A1 - Kang, Daehee A1 - Kapoor, Pooja Middha A1 - Khusnutdinova, Elza A1 - Kim, Sung-Won A1 - Kitahara, Cari M. A1 - Koutros, Stella A1 - Kraft, Peter A1 - Kristensen, Vessela N. A1 - Kwong, Ava A1 - Lambrechts, Diether A1 - Le Marchand, Loic A1 - Li, Jingmei A1 - Lindström, Sara A1 - Linet, Martha A1 - Lo, Wing-Yee A1 - Long, Jirong A1 - Lophatananon, Artitaya A1 - Lubiński, Jan A1 - Manoochehri, Mehdi A1 - Manoukian, Siranoush A1 - Margolin, Sara A1 - Martinez, Elena A1 - Matsuo, Keitaro A1 - Mavroudis, Dimitris A1 - Meindl, Alfons A1 - Menon, Usha A1 - Milne, Roger L. A1 - Mohd Taib, Nur Aishah A1 - Muir, Kenneth A1 - Mulligan, Anna Marie A1 - Neuhausen, Susan L. A1 - Nevanlinna, Heli A1 - Neven, Patrick A1 - Newman, William G. A1 - Offit, Kenneth A1 - Olopade, Olufunmilayo I. A1 - Olshan, Andrew F. A1 - Olson, Janet E. A1 - Olsson, Håkan A1 - Park, Sue K. A1 - Park-Simon, Tjoung-Won A1 - Peto, Julian A1 - Plaseska-Karanfilska, Dijana A1 - Pohl-Rescigno, Esther A1 - Presneau, Nadege A1 - Rack, Brigitte A1 - Radice, Paolo A1 - Rashid, Muhammad U. A1 - Rennert, Gad A1 - Rennert, Hedy S. A1 - Romero, Atocha A1 - Ruebner, Matthias A1 - Saloustros, Emmanouil A1 - Schmidt, Marjanka K. A1 - Schmutzler, Rita K. A1 - Schneider, Michael O. A1 - Schoemaker, Minouk J. A1 - Scott, Christopher A1 - Shen, Chen-Yang A1 - Shu, Xiao-Ou A1 - Simard, Jaques A1 - Slager, Susan A1 - Smichkoska, Snezhana A1 - Southey, Melissa C. A1 - Spinelli, John J. A1 - Stone, Jennifer A1 - Surowy, Harald A1 - Swerdlow, Anthony J. A1 - Tamimi, Rulla M. A1 - Tapper, William J. A1 - Teo, Soo H. A1 - Terry, Mary Beth A1 - Toland, Amanda E. A1 - Tollenaar, Rob A. E. M. A1 - Torres, Diana A1 - Torres-Mejía, Gabriela A1 - Troester, Melissa A. A1 - Truong, Thérèse A1 - Tsugane, Shoichiro A1 - Untch, Michael A1 - Vachon, Celine M. A1 - van den Ouweland, Ans M. W. A1 - van Veen, Elke M. A1 - Vijai, Joseph A1 - Wendt, Camilla A1 - Wolk, Alicja A1 - Yu, Jyh-Cherng A1 - Zheng, Wei A1 - Ziogas, Argyrios A1 - Ziv, Elad A1 - Dunnig, Alison A1 - Pharaoh, Paul D. P. A1 - Schindler, Detlev A1 - Devilee, Peter A1 - Easton, Douglas F. T1 - Two truncating variants in FANCC and breast cancer risk JF - Scientific Reports N2 - Fanconi anemia (FA) is a genetically heterogeneous disorder with 22 disease-causing genes reported to date. In some FA genes, monoallelic mutations have been found to be associated with breast cancer risk, while the risk associations of others remain unknown. The gene for FA type C, FANCC, has been proposed as a breast cancer susceptibility gene based on epidemiological and sequencing studies. We used the Oncoarray project to genotype two truncating FANCC variants (p.R185X and p.R548X) in 64,760 breast cancer cases and 49,793 controls of European descent. FANCC mutations were observed in 25 cases (14 with p.R185X, 11 with p.R548X) and 26 controls (18 with p.R185X, 8 with p.R548X). There was no evidence of an association with the risk of breast cancer, neither overall (odds ratio 0.77, 95%CI 0.44–1.33, p = 0.4) nor by histology, hormone receptor status, age or family history. We conclude that the breast cancer risk association of these two FANCC variants, if any, is much smaller than for BRCA1, BRCA2 or PALB2 mutations. If this applies to all truncating variants in FANCC it would suggest there are differences between FA genes in their roles on breast cancer risk and demonstrates the merit of large consortia for clarifying risk associations of rare variants. KW - oncology KW - risk factors Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-222838 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - El-Hawary, Seham S. A1 - Sayed, Ahmed M. A1 - Mohammed, Rabab A1 - Hassan, Hossam M. A1 - Rateb, Mostafa E. A1 - Amin, Elham A1 - Mohammed, Tarek A. A1 - El-Mesery, Mohamed A1 - Bin Muhsinah, Abdullatif A1 - Alsayari, Abdulrhman A1 - Wajant, Harald A1 - Anany, Mohamed A. A1 - Abdelmohsen, Usama Ramadan T1 - Bioactive brominated oxindole alkaloids from the Red Sea sponge Callyspongia siphonella JF - Marine Drugs N2 - In the present study, LC-HRESIMS-assisted dereplication along with bioactivity-guided isolation led to targeting two brominated oxindole alkaloids (compounds 1 and 2) which probably play a key role in the previously reported antibacterial, antibiofilm, and cytotoxicity of Callyspongia siphonella crude extracts. Both metabolites showed potent antibacterial activity against Gram-positive bacteria, Staphylococcus aureus (minimum inhibitory concentration (MIC) = 8 and 4 µg/mL) and Bacillus subtilis (MIC = 16 and 4 µg/mL), respectively. Furthermore, they displayed moderate biofilm inhibitory activity in Pseudomonas aeruginosa (49.32% and 41.76% inhibition, respectively), and moderate in vitro antitrypanosomal activity (13.47 and 10.27 µM, respectively). In addition, they revealed a strong cytotoxic effect toward different human cancer cell lines, supposedly through induction of necrosis. This study sheds light on the possible role of these metabolites (compounds 1 and 2) in keeping fouling organisms away from the sponge outer surface, and the possible applications of these defensive molecules in the development of new anti-infective agents. KW - Callyspongia siphonella KW - LC-HRESIMS KW - metabolomic profiling KW - oxindole alkaloids KW - tisindoline KW - antibacterial KW - antibiofilm KW - antitrypanosomal KW - anticancer Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201485 VL - 17 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - El-Mesery, Mohamed A1 - Rosenthal, Tina A1 - Rauert-Wunderlich, Hilka A1 - Schreder, Martin A1 - Stühmer, Thorsten A1 - Leich, Ellen A1 - Schlosser, Andreas A1 - Ehrenschwender, Martin A1 - Wajant, Harald A1 - Siegmund, Daniela T1 - The NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924 sensitizes a TNFR1+ subgroup of multiple myeloma cells for TNF-induced cell death JF - Cell Death & Disease N2 - The NEDD8-activating enzyme (NAE) inhibitor MLN4924 inhibits cullin-RING ubiquitin ligase complexes including the SKP1-cullin-F-box E3 ligase βTrCP. MLN4924 therefore inhibits also the βTrCP-dependent activation of the classical and the alternative NFĸB pathway. In this work, we found that a subgroup of multiple myeloma cell lines (e.g., RPMI-8226, MM.1S, KMS-12BM) and about half of the primary myeloma samples tested are sensitized to TNF-induced cell death by MLN4924. This correlated with MLN4924-mediated inhibition of TNF-induced activation of the classical NFκB pathway and reduced the efficacy of TNF-induced TNFR1 signaling complex formation. Interestingly, binding studies revealed a straightforward correlation between cell surface TNFR1 expression in multiple myeloma cell lines and their sensitivity for MLN4924/TNF-induced cell death. The cell surface expression levels of TNFR1 in the investigated MM cell lines largely correlated with TNFR1 mRNA expression. This suggests that the variable levels of cell surface expression of TNFR1 in myeloma cell lines are decisive for TNF/MLN4924 sensitivity. Indeed, introduction of TNFR1 into TNFR1-negative TNF/MLN4924-resistant KMS-11BM cells, was sufficient to sensitize this cell line for TNF/MLN4924-induced cell death. Thus, MLN4924 might be especially effective in myeloma patients with TNFR1+ myeloma cells and a TNFhigh tumor microenvironment. KW - cancer therapy KW - tumour-necrosis factors Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226666 VL - 10 ER - TY - JOUR A1 - Elmaidomy, Abeer H. A1 - Mohammed, Rabab A1 - Hassan, Hossam M. A1 - Owis, Asmaa I. A1 - Rateb, Mostafa E. A1 - Khanfar, Mohammad A. A1 - Krischke, Markus A1 - Mueller, Martin J. A1 - Abdelmohsen, Usama Ramadan T1 - Metabolomic profiling and cytotoxic tetrahydrofurofuran lignans investigations from Premna odorata Blanco JF - Metabolites N2 - Metabolomic profiling of different Premna odorata Blanco (Lamiaceae) organs, bark, wood, young stems, flowers, and fruits dereplicated 20, 20, 10, 20, and 20 compounds, respectively, using LC–HRESIMS. The identified metabolites (1–34) belonged to different chemical classes, including iridoids, flavones, phenyl ethanoids, and lignans. A phytochemical investigation of P. odorata bark afforded one new tetrahydrofurofuran lignan, 4β-hydroxyasarinin 35, along with fourteen known compounds. The structure of the new compound was confirmed using extensive 1D and 2D NMR, and HRESIMS analyses. A cytotoxic investigation of compounds 35–38 against the HL-60, HT-29, and MCF-7 cancer cell lines, using the MTT assay showed that compound 35 had cytotoxic effects against HL-60 and MCF-7 with IC50 values of 2.7 and 4.2 µg/mL, respectively. A pharmacophore map of compounds 35 showed two hydrogen bond acceptor (HBA) aligning the phenoxy oxygen atoms of benzodioxole moieties, two aromatic ring features vectored on the two phenyl rings, one hydrogen bond donor (HBD) feature aligning the central hydroxyl group and thirteen exclusion spheres which limit the boundaries of sterically inaccessible regions of the target’s active site. KW - Premna KW - lignan KW - metabolomic KW - cytotoxic KW - pharmacophore map Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193187 SN - 2218-1989 VL - 9 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Figueiredo, Ludmilla A1 - Krauss, Jochen A1 - Steffan-Dewenter, Ingolf A1 - Cabral, Juliano Sarmento T1 - Understanding extinction debts: spatio-temporal scales, mechanisms and a roadmap for future research JF - Ecography N2 - Extinction debt refers to delayed species extinctions expected as a consequence of ecosystem perturbation. Quantifying such extinctions and investigating long‐term consequences of perturbations has proven challenging, because perturbations are not isolated and occur across various spatial and temporal scales, from local habitat losses to global warming. Additionally, the relative importance of eco‐evolutionary processes varies across scales, because levels of ecological organization, i.e. individuals, (meta)populations and (meta)communities, respond hierarchically to perturbations. To summarize our current knowledge of the scales and mechanisms influencing extinction debts, we reviewed recent empirical, theoretical and methodological studies addressing either the spatio–temporal scales of extinction debts or the eco‐evolutionary mechanisms delaying extinctions. Extinction debts were detected across a range of ecosystems and taxonomic groups, with estimates ranging from 9 to 90% of current species richness. The duration over which debts have been sustained varies from 5 to 570 yr, and projections of the total period required to settle a debt can extend to 1000 yr. Reported causes of delayed extinctions are 1) life‐history traits that prolong individual survival, and 2) population and metapopulation dynamics that maintain populations under deteriorated conditions. Other potential factors that may extend survival time such as microevolutionary dynamics, or delayed extinctions of interaction partners, have rarely been analyzed. Therefore, we propose a roadmap for future research with three key avenues: 1) the microevolutionary dynamics of extinction processes, 2) the disjunctive loss of interacting species and 3) the impact of multiple regimes of perturbation on the payment of debts. For their ability to integrate processes occurring at different levels of ecological organization, we highlight mechanistic simulation models as tools to address these knowledge gaps and to deepen our understanding of extinction dynamics. KW - Anthropocene KW - biotic interaction KW - extinction dynamics KW - mechanistic modelling KW - time lag KW - transient dynamics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204859 VL - 42 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Frank, Erik Thomas T1 - Behavioral adaptations in the foraging behaviour of \(Megaponera\) \(analis\) T1 - Verhaltensanpassungen im Furagierverhalten von \(Megaponera\) \(analis\) N2 - An efficient foraging strategy is one of the most important traits for the fitness of animals. The theory of optimal foraging tries to predict foraging behaviour through the overarching question: how animals should forage so as to minimize costs while maximizing profits? Social insects, having occupied nearly every natural niche through widely different strategies, offer themselves as an ideal group to study how well optimal foraging theory can explain their behaviour and success. Specialization often leads to unique adaptations in morphology and behaviour. I therefore decided to investigate the behaviour of Megaponera analis. This ponerine ant species is specialized on hunting only termites of the subfamily Macrotermitinae at their foraging sites. Their foraging behaviour is regulated by a handful of individual scouts (10-20) that search for termite foraging sites before returning to the nest to recruit a large number of nestmates (200-500 ants). These ants then follow the scout in a column formation to the termites and after the hunt return together to the nest, these raids occur two to five times per day. Predators of highly defensive prey likely develop cost reducing adaptations. The evolutionary arms race between termites and ants led to various defensive mechanisms in termites, e.g. a caste specialized in fighting predators. As M. analis incurs high injury/mortality risks when preying on termites, some risk mitigating adaptations have evolved. I show that a unique rescue behaviour in M. analis, consisting of injured nestmates being carried back to the nest, reduces combat mortality. These injured ants “call for help” with pheromones present in their mandibular gland reservoirs. A model accounting for this rescue behaviour identifies the drivers favouring its evolution and estimates that rescuing allows for maintaining a 29% larger colony size. Heavily injured ants that lost too many legs during the fight on the other hand are not helped. Interestingly, this was regulated not by the helper but by the uncooperativeness of the injured ant. I further observed treatment of the injury by nestmates inside the nest through intense allogrooming directly at the wound. Lack of treatment increased mortality from 10% to 80% within 24 hours, with the cause of death most likely being infections. Collective decision-making is one of the main mechanisms in social insects through which foraging is regulated. However, individual decision-making can also play an important role, depending on the type of foraging behaviour. In M. analis only a handful of individuals (the scouts) hold all the valuable information about foraging sites. I therefore looked at predictions made by optimal foraging theory to better understand the interplay between collective and individual decision-making in this obligate group-raiding predator. I found a clear positive relation between raid size and termite abundance at the foraging site. Furthermore, selectivity of the food source increased with distance. The confirmation of optimal foraging theory suggests that individual scouts must be the main driver behind raid size, choice and raiding behaviour. Therefore most central place foraging behaviours in M. analis were not achieved by collective decisions but rather by individual decisions of scout ants. Thus, 1% of the colony (10–20 scouts) decided the fate and foraging efficiency of the remaining 99%. Division of labour is one of the main reasons for the success of social insects. Worker polymorphism, age polyethism and work division in more primitive ants, like the ponerines, remain mostly unexplored though. Since M. analis specializes on a defensive prey, adaptations to reduce their foraging costs can be expected. I found that the work division, task allocation and column-formation during the hunt were much more sophisticated than was previously thought. The column-formation was remarkably stable, with the same ants resuming similar positions in subsequent raids and front ants even returning to their positions if displaced in the same raid. Most of the raid tasks were not executed by predetermined members of the raid but were filled out as need arose during the hunt, with a clear preference for larger ants to conduct most tasks. I show that specialization towards a highly defensive prey can lead to very unique adaptations in the foraging behaviour of a species. I explored experimentally the adaptive value of rescue behaviour focused on injured nestmates in social insects. This was not only limited to selective rescuing of lightly injured individuals by carrying them back (thus reducing predation risk) but moreover includes a differentiated treatment inside the nest. These observations will help to improve our understanding of the evolution of rescue behaviour in animals. I further show that most optimal foraging predictions are fulfilled and regulated by a handful of individuals in M. analis. Lastly, I propose that the continuous allometric size polymorphism in M. analis allows for greater flexibility in task allocation, necessary due to the unpredictability of task requirements in an irregular system such as hunting termites in groups. All of my observations help to further understand how a group-hunting predator should forage so as to minimize costs while maximizing profits. N2 - Ein effizientes Furagierverhalten ist eine der wesentlichsten Voraussetzungen für die Überlebensfähigkeit von Tieren. Die Theorie des „Optimal Foraging“ versucht, das Furagierverhalten durch die übergreifende Frage zu verstehen: Wie sollten Tiere nach Futter suchen/jagen, um die Kosten zu minimieren und gleichzeitig die Gewinne zu maximieren? Soziale Insekten, die fast jede natürliche Nische durch diverse Strategien besetzt haben, bieten sich als ideale Gruppe an, um zu untersuchen, wie gut „Optimal Foraging“ ihr Verhalten und ihren Erfolg erklären kann. Da Spezialisierung oft zu einzigartigen Anpassungen in Morphologie und Verhalten führt, war das Jagdverhalten von Megaponera analis diesbezüglich sehr vielversprechend. Diese Ponerinae Ameisenart ist spezialisiert auf die Jagd von Termiten der Unterfamilie Macrotermitinae an ihren Futterstellen. Ihr Jagdverhalten wird durch eine Handvoll von einzelner Späher (10-20) geregelt, die nach Termiten-Futterstellen suchen, bevor sie zum Nest zurückkehren, um eine große Anzahl von Nestgenossinnen (200-500 Ameisen) zu rekrutieren. Die Ameisen folgen dann dem Späher in einer Kolonne zu den Termiten und zurück, diese Überfälle finden zwei bis fünf Mal am Tag statt. Es ist wahrscheinlich, dass Prädatoren von defensiver Beute kostenreduzierende Anpassungen entwickeln. Das evolutionäre Wettrüsten zwischen Termiten und Ameisen führte zu verschiedenen Abwehrmechanismen bei Termiten, z.B. eine Soldaten-Kaste, die sich auf die Bekämpfung von Raubtieren spezialisiert hat. Da M. analis ein hohes Verletzungsrisiko durch Termitensoldaten hat, haben sich bei ihr einige kostenreduzierende Anpassungen entwickelt. Ich zeige, dass ein einzigartiges Rettungsverhalten bei M. analis, bestehend aus verletzten Nestgenossinnen, die zum Nest zurückgetragen werden, die Mortalität reduziert. Diese verletzten Ameisen „rufen“ um Hilfe mit Pheromonen, die in ihren mandibularen Drüsenreservoirs vorhanden sind. Ein Modell, das dieses Rettungsverhalten berücksichtigt, hilft dabei die wichtigsten Faktoren zu identifizieren, welche die Evolution dieses Rettungsverhaltens begünstigen. Ferner wird schwerverletzten Ameisen, die während des Kampfes zu viele Beine verloren haben, nicht geholfen. Interessanterweise wird dies nicht durch den Helfer reguliert, sondern durch die mangelnde Kooperation der verletzten Ameise. Des Weiteren beobachtete ich die Behandlung der Verletzten durch Nestgenossinnen im Nest durch intensives „Allogrooming“/lecken direkt an der Wunde. Eine Unterbindung der Behandlung erhöhte die Mortalität von 10% auf 80% innerhalb von 24 Stunden, höchstwahrscheinlich aufgrund von Infektionen. Die kollektive Entscheidungsfindung ist einer der Hauptmechanismen bei sozialen Insekten, durch die die Futtersuche reguliert wird. Allerdings spielt die individuelle Entscheidungsfindung, je nach Art des Furagierverhaltens, auch eine wichtige Rolle. In M. analis haben nur eine Handvoll von Individuen (die Späher) alle Informationen über die Futterstellen. Ich betrachtete daher die Vorhersagen, die durch „Optimal Foraging“ gemacht werden, um das Zusammenspiel von kollektiver und individueller Entscheidungsfindung bei diesem obligaten Gruppenjäger besser zu verstehen. Ich fand eine klare positive Beziehung zwischen Raubzugsgröße und Termitenabundanz an der Futterstelle. Außerdem erhöhte sich die Selektivität der Futterstelle mit der Entfernung zum Nest. Die Bestätigung der „Optimalen Foraging“ Theorie deutet darauf hin, dass einzelne Späher der Haupttreiber hinter Raubzugsgröße, Wahl und Raubzugsverhalten sein müssen. Dies bedeutet, dass in M. analis das Furagierverhalten nicht durch kollektive Entscheidungen, sondern durch individuelle Entscheidungen der Späher reguliert wird. So entschied 1% der Kolonie (10-20 Späher) das Schicksal und die Furagier-Effizienz der restlichen 99%. Die Arbeitsteilung ist einer der Hauptgründe des Erfolgs sozialer Insekten. Arbeiterpolymorphismus, Alterspolyethismus und Arbeitsteilung bei primitiveren Ameisen, wie den Ponerinen, blieben bisher jedoch meist unerforscht. Da M. analis sich auf eine defensive Beute spezialisiert hat, sind Anpassungen zur Reduzierung ihrer Furagierkosten zu erwarten. Ich zeige, dass die Arbeitsteilung und Kolonnenformation während der Jagd viel anspruchsvoller ist, als bisher angenommen. Die Kolonnenformation war bemerkenswert stabil: dieselben Ameisen nahmen ähnliche Positionen in späteren Raubzügen ein und die vorderen Ameisen kehrten sogar zu ihrer Position zurück, wenn diese absichtlich verändert wurde. Dies weist auf unbekannte Regulationsmechanismen für die Bildung der Kolonne hin. Darüber hinaus wurden die meisten der Raubzugsaufgaben nicht von vorgegebenen Mitgliedern des Raubzugs ausgeführt, sondern wurden je nach Bedarf während der Jagd verteilt. Meine Versuche zeigen, dass die Spezialisierung auf eine hoch defensive Beute zu sehr einzigartigen Anpassungen im Furagierverhalten einer Art führen kann. Ich erforschte experimentell den adaptiven Wert eines Rettungsverhaltens, das auf verletzte Nestgenossinnen bei sozialen Insekten fokussiert war. Dies beschränkte sich nicht nur auf die selektive Rettung von leicht verletzten Individuen, welche zurückgetragen wurden (wodurch das Prädationsrisiko reduziert wurde), sondern umfasst darüber hinaus eine differenzierte Behandlung im Nest. Ich zeige weiter, dass die meisten „Optimal Foraging“ Vorhersagen von einer Handvoll Individuen in M. analis erfüllt und reguliert werden. Schließlich postuliere ich die Hypothese, dass der kontinuierliche allometrische Größenpolymorphismus in M. analis eine größere Flexibilität bei der Aufgabenverteilung ermöglicht, die aufgrund der Unberechenbarkeit der Aufgabenanforderungen in einem unregelmäßigen System wie dem Jagen von Termiten in Gruppen Erforderlich ist. Alle meine Beobachtungen verbessern unser Verständnis des Verhaltens eines Gruppenjägers, das während der Jagd die Kosten zu minimieren und die Gewinne zu maximieren hat. KW - Stechameisen KW - Nahrungserwerb KW - Verhalten KW - Optimal foraging KW - Rescue behaviour KW - Myrmecology KW - Behaviour KW - Ecology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156544 ER - TY - THES A1 - Franke, Christian T1 - Advancing Single-Molecule Localization Microscopy: Quantitative Analyses and Photometric Three-Dimensional Imaging T1 - Weiterentwicklung von Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie: Quantitative Analysen und photometrische drei-dimensionale Bildgebung N2 - Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\ Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\ Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\ The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\ During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\ In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\ This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\ The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\ In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\ Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\ Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\ With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\ Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\ Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research. N2 - Seit ihrer ersten experimentellen Umsetzung in 2005 hat sich die Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie (\textit{engl.} single-molecule localization microscopy (SMLM)) als vielseitig einsetzbares Verfahren in der biologischen Bildgebung etabliert, vor allem aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens im Nanometer Bereich. Bis heute wurde eine Reihe neuer Erkenntnisse bezüglich der sub- und inter- zellulären Organisation durch den Einsatz der SMLM erlangt.\\ Aufgrund der Tatsache, dass alle SMLM Techniken auf dem Prinzip basieren, isolierte Fluorophore zu detektieren und zu analysieren, beinhalten SMLM Daten $per$ $definitionem$ molekulare Informationen.\\ Folgerichtig entwickelte sich das Feld der SMLM vom reinen Bildgebungsinstrument mit Nanometer-Auflösung hin zu quantitativer Mikroskopie, bei welcher der Fokus nicht länger vornehmlich auf dem hochaufgelöstem Bild, sondern vielmehr auf den Lokalisationsdaten liegt.\\ Die vorliegende Arbeit ist als Teil der anhaltenden Bestrebungen zu sehen, aus den $per$ $se$ molekularen Informationen der SMLM weiterführende Erkenntnisse über die strukturelle Organisation der markierten Proteine zu gewinnen. Obwohl mit der gleichen prinzipiellen Zielsetzung versehen, unterscheiden sich hierbei globale oder Segmentierungs- Clusteranalysen von Lokalisations-Meta-Analysen oder so genannten \textit{particle averaging} Ansätzen.\\ Während meiner Doktorarbeit habe ich verschiedene Quantifizierungs Ansätze entworfen, implementiert und angewendet, mit unterschiedlichen Graden an Komplexität und Breite des Anwendungsgebietes.\\ \\ In meinem ersten wesentlichem Projekt analysierte ich mit einem iterativen \textit{k}-means Algorithmus die Lokalisationsverteilung des integralen Proteins gp210, welches Teil des Kernporenkomplexes ist (\textit{engl.} nuclear pore complex (NPC)). Durch den Vergleich der charakteristischen Lokalisations-Statistik von separierten gp210 Domänen mit isolierten Fluoreszenzmarkern konnte unter anderem festgestellt werden, dass der Verankerungsring des NPC aus acht gp210 Homodimeren bestehen muss.\\ Diese Erkenntnis beantwortet zum einen eine jahrzehntealte Frage nach der Zusammensetzung des gp210 Rings und zum anderen liefert sie ein Beispiel dafür, dass durch eine geschickte Analyse der Lokalisationsstatistik strukturelle Informationen erlangt werden können, die jenseits des räumlichen Auflösungsvermögens von SMLM liegen.\\ \\ Das zweite hier vorgestellte wesentliche Projekt beinhaltet eine umfassende Studie des Synaptonemalen Komplexes (\textit{engl.} synaptonemal complex (SNC)) und damit verbundenen Cohesin Komplexen. Um die molekulare Organisation des SNC zu untersuchen, implementierte ich eine multi-level Meta-Analyse der Lokalisationsdaten mehrerer SNC Komponenten. Aus dessen Ergebnissen konnte ein neues drei dimensionales molekulares Modell des SNC erstellt werden.\\ Nachfolgend wurden die beiden murinen Cohesine SMC3 und STAG3 mit adaptierter Methodik untersucht. Hierbei musste die starke intrinsische Dispersion der Cohesin-Signale berücksichtigt werden. Die Analyse ergab deutliche Hinweise auf eine Polarisation der Cohesine innerhalb des SNC. Zudem zeigte sich eine mögliche Substruktur in der Organisation von STAG3, die unterhalb der Auflösungsgrenze von SMLM liegt.\\ \\ Weitere Nebenprojekte im Zusammenhang mit quantitativer Lokalisationsanalyse umfassten die Untersuchung der Lokalisationsverteilung von Plasma-Membran Glykanen, sowie zweier Flotillin Proteine in den Membranen von Bakterien, welche Cluster unterschiedlicher Form und Größe aufzeigten.\\ \\ Schließlich wird ein neuartiger Ansatz für dreidimensionale SMLM vorge-stellt, die auf der genauen Bestimmung von Einzel-Molekül Intensitäten basiert. Diese Methode, genannt TRABI, stützt sich auf die Prinzipien der Apertur Photometrie, welche für die SMLM angepasst und verbessert wurden.\\ Mit TRABI konnte gezeigt werden, dass weit verbreitete Lokalisations-Software, die auf $Gaussian-Fitting$ basiert, die Photonenzahl von Emittern oftmals stark unterschätzt. Diese Diskrepanz kann als $z$-abhängiger Parameter verwendet werden um z.B. einen 2D SMLM Datenatz in einen virtuellen 3D Raum zu überführen. Außerdem wird gezeigt, dass TRABI vorteilhaft mit einem multi-plane Detektionsschema kombiniert werden kann und dabei höhere axiale Lokalisationsgenauigkeiten und Auflösungen er-reicht.\\ Zudem wurde TRABI eingesetzt, um einen neuen Fluoreszenzfarbstoff für SMLM zu charakterisieren und dessen verbesserte photo-physikalische Eigenschaften auf Einzel-Molekül Basis zu demonstrieren.\\ Auch nach Abschluss dieser Arbeit ist die TRABI Methode und deren Anwendung weiterhin Gegenstand diverser Forschungen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - dSTORM Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156355 ER - TY - THES A1 - Fröschel, Christian T1 - Genomweite Analyse der zellschichtspezifischen Expression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit pathogenen und mutualistischen Mikroorganismen T1 - Genome-wide analysis of cell-type specific expressed genes in the Arabidopsis-root after inoculation with pathogenic and mutualistic microorganisms N2 - Obwohl Pflanzenwurzeln mit einer Vielzahl von Pathogenen in Kontakt kommen, sind induzierbare Abwehrreaktionen der Wurzel bisher kaum beschrieben. Aufgrund der konzentrischen Zellschicht-Organisation der Wurzel wird angenommen, dass bei einer Immunantwort in jeder Zellschicht ein spezifisches genetisches Programm aktiviert wird. Eine Überprüfung dieser Hypothese war bisher wegen methodischen Limitierungen nicht möglich. Die zellschichtspezifische Expression Epitop-markierter ribosomaler Proteine erlaubt eine Affinitätsaufreinigung von Ribosomen und der assoziierten mRNA. Diese Methodik, als TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) bezeichnet, ermöglicht die Analyse des Translatoms und wurde dahingehend optimiert, pflanzliche Antworten auf Befall durch bodenbürtige Mikroorganismen in Rhizodermis, Cortex, Endodermis sowie Zentralzylinder spezifisch zu lokalisieren. Die Genexpression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit drei Bodenorganismen mit unterschiedlichen Lebensweisen wurde vergleichend betrachtet: Piriformospora indica kann als mutualistischer Pilz pflanzliches Wachstum und Erträge positiv beeinflussen, wohingegen der vaskuläre Pilz Verticillium longisporum für erhebliche Verluste im Rapsanbau verantwortlich ist und der hemibiotrophe Oomycet Phytophthora parasitica ein breites Spektrum an Kulturpflanzen befällt und Ernten zerstört. Für die Interaktionsstudien zwischen Arabidopsis und den Mikroorganismen während ihrer biotrophen Lebensphase wurden sterile in vitro-Infektionssysteme etabliert und mittels TRAP und anschließender RNA-Sequenzierung eine zellschichtspezifische, genomweite Translatomanalyse durchgeführt (Inf-TRAP-Seq). Dabei zeigten sich massive Unterschiede in der differentiellen Genexpression zwischen den Zellschichten, was die Hypothese der zellschichtspezifischen Antworten unterstützt. Die Antworten nach Inokulation mit pathogenen bzw. mutualistischen Mikroorganismen unterschieden sich ebenfalls deutlich, was durch die ungleichen Lebensweisen begründbar ist. Durch die Inf-TRAP-Seq Methodik konnte z.B. im Zentralzylinder der Pathogen-infizierten Wurzeln eine expressionelle Repression von positiven Regulatoren des Zellzyklus nachgewiesen werden, dagegen in den mit P. indica besiedelten Wurzeln nicht. Dies korrelierte mit einer Pathogen-induzierten Inhibition des Wurzelwachstums, welche nicht nach Inokulation mit P. indica zu beobachten war. Obwohl keines der drei Mikroorganismen in der Lage ist, den Zentralzylinder direkt zu penetrieren, konnte hier eine differentielle Genexpression detektiert werden. Demzufolge ist ein Signalaustausch zu postulieren, über den äußere und innere Zellschichten miteinander kommunizieren. In der Endodermis konnten Genexpressionsmuster identifiziert werden, die zu einer Verstärkung der Barriere-Funktionen dieser Zellschicht führen. So könnte etwa durch Lignifizierungsprozesse die Ausbreitung der Mikroorganismen begrenzt werden. Alle drei Mikroorganismen lösten besonders im Cortex die Induktion von Genen für die Biosynthese Trp-abhängiger, antimikrobieller Sekundärmetaboliten aus. Die biologische Relevanz dieser Verteilungen kann nun geklärt werden. Zusammenfassend konnten in dieser Dissertation erstmals die durch Mikroorganismen hervorgerufenen zellschichtspezifischen Antworten der pflanzlichen Wurzel aufgelöst werden. Vergleichende bioinformatische Analyse dieses umfangreichen Datensatzes ermöglicht nun, gezielt testbare Hypothesen zu generieren. Ein Verständnis der zellschichtspezifischen Abwehrmaßnahmen der Wurzel ist essentiell für die Entwicklung neuer Strategien zur Ertragssteigerung und zum Schutz von Nutzpflanzen gegen Pathogene in der Landwirtschaft. N2 - Although plant roots are surrounded by a plethora of microorganisms, their interactions are poorly characterized on a molecular level. Due to the concentric organization of the root cell-layers, it is anticipated that these layers contribute to pathogen defense by providing specific genetically defined programs, which build up barriers to restrict infection. Because of methodical limitations, this theory was not confirmed, yet. Immunoprecipitation of cell-layer specific expressed epitope-tagged ribosomes allows an isolation of ribosome/mRNA complexes that subsequently can be analyzed. This approach is called “Translating Ribosome Affinity Purification” (TRAP). It was optimized to identify cell-layer specific induced defenses and to be combined with a system to inoculate plant roots directly with soil-born microorganisms. Hence, this method enables molecular dissection of infected Arabidopsis-roots to unravel expression patterns found in rhizodermis, cortex, endodermis and central cylinder, respectively. Comparative studies were performed with three species of microorganisms having different life-styles: On the one hand the beneficial fungus Piriformospora indica, that can promote plant growth and crop yield and on the other hand two pathogens with the vascular fungus Verticillium longisporum, causing damage in oilseed rape production and the hemibiotrophic Oomycet Phytophthora parasitica, which causes plant damage on many crop plants. After performing TRAP with infected roots, the cell-type specific mRNA was analyzed via RNA-Sequencing resulting in a genome-wide impression of differentially expressed genes (Inf-TRAP-Seq). Massive differences occurred among the cell-layers approving the theory of cell-type specific immune responses. Moreover the defense responses varied according to inoculation with pathogenic or beneficial microorganisms probably due to their life-style. For example by using the newly established Inf-TRAP-Seq approach it was shown that positive regulators of cell proliferation were expressionally repressed in central cylinder of pathogen-infected roots but not in P. indica colonized roots. This correlates with the observation that root growth is suppressed after inoculation with pathogens but not after inoculation with P. indica. Although none of the three microorganisms is able to penetrate the central cylinder, differentially expressed genes were detected in this layer suggesting an exchange of signals to enable communication between inner and outer layers. Expression patterns were identified in the endodermis, that could lead to reinforcement of barrier functions of this cell-layer for example by lignification-processes. By this means the propagation of the microorganisms is restricted. All three microorganisms elicited induction of genes involved in biosynthesis of Trp-derived secondary metabolites, especially in the cortex. Now the biological relevance of these distributions can be investigated additionally. Hence, within this thesis for the first time a cell-type specific resolution was obtained regarding defense responses in the Arabidopsis-root triggered by microorganisms. A huge dataset was generated. This can be analyzed extensively by bioinformatics and its applications to set up new hypotheses, which can be tested by further approaches. An understanding of cell-type defined root defense responses is essential to facilitate new strategies for protecting crop plants against pathogens and to increase crop yield in agriculture. KW - Schmalwand KW - Wurzel KW - Phytophthora KW - Piriformospora indica KW - Verticillium KW - Wurzelzellschichten KW - Zellschichtspezifische Expression KW - Zentralzylinder KW - Cortex KW - Rhizodermis KW - Endodermis KW - cell-type specific KW - Inf-TRAP-Seq Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146439 ER - TY - THES A1 - Füllsack, Simone Alexandra T1 - Die Bedeutung von Todesdomäne Adapterproteinen für die Signaltransduktion des TNFR1 und der TRAIL Todesrezeptoren T1 - The meaning of death domain adaptor proteins in the signal transduction of TNFR1 and TRAIL death receptors N2 - Die NFκB-Signalwege, Apoptose und Nekroptose sind essentielle Prozesse in der Immunantwort. Außerdem sind diese Signalwege Teil der Regulation von Zelldifferenzierung, -proliferation, -tod und Entzündungsreaktionen. Dabei wird zuerst der Rezeptor (TNFR1 oder TRAILR 1/2) aktiviert, die rekrutierten DD-Adapterproteine TRADD, FADD und RIPK1 leiten dann die entsprechende Signalkaskade weiter und bestimmen durch ihre Zusammenwirkung, ob der NFκB-Signalweg, Apoptose oder Nekroptose induziert wird. TNFR1 und TRAILR 1/2 benötigen die DD-Adapterproteine TRADD, FADD und RIPK1 für die Zelltodinduktion, deren konkrete Bedeutung in Bezug auf Rezeptor-Spezifität, Zusammenwirken und Relevanz allerdings noch unklar ist. Um das Zusammenspiel dieser Proteine besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit Nekroptose-kompetente RIPK3-exprimierende HeLa-Zellen verwendet, bei denen die DD-Adapterproteine FADD, TRADD und RIPK1 einzeln oder in Kombination von zweien ausgeknockt wurden. Es stellte sich heraus, dass RIPK1 essentiell für die TNFR1- und TRAILR 1/2-vermittelte Nekroptose-Induktion ist, doch RIPK1 alleine, d.h. ohne FADD- oder TRADD-Mitbeteiligung, nur bei der TNFR1-Nekroptose-Induktion ausreicht. Wiederum inhibiert TRADD die TNFR1- und TRAILR 1/2-induzierte Nekroptose. RIPK1 und TRADD sind aber unverzichtbar für die NFκB-Aktivierung durch TNFR1 oder TRAILR 1/2 und spielen eine wichtige Rolle bei TNFR1-induzierter Apoptose. Andererseits ist FADD alleine ausreichend für die TRAILR 1/2-bezogene Caspase-8 Aktivierung. Zudem ist FADD notwendig für die TRAIL-induzierte NFκB-Signalaktivierung. In Abwesenheit von FADD und TRADD vermittelt RIPK1 die TNF-induzierte Caspase-8 Aktivierung. FADD wird für die TRAIL-induzierte Nekroptose benötigt, aber gegenläufig wirkt die TNF-induzierte Nektroptose in einer Caspase-8 abhängigen und unabhängigen Weise. Zudem sensitiviert TWEAK die TNF- und TRAIL-induzierte Nekroptose. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Auswirkung von TNFR1 und TRAILR 1/2 auf die Aktivierung der unterschiedlichen Signalkaskaden untersucht. Des Weiteren wurde gezeigt, in welcher Weise sich das Zusammenspiel von TRADD, FADD und RIPK1 auf die Induktion von NFκB, Apoptose und Nekroptose auswirkt. N2 - The NFκB-pathways, apoptosis and necroptosis are basic components of the immune response. Furthermore, they are involved in the regulation of cell differentiation, proliferation, cell death and inflammation. After the receptor (TNFR1 or TRAILR1/2) is activated, the recruited DD-adapter proteins TRADD, FADD and RIPK1 transmit the signal thereby determining whether NFκB-pathways, apoptosis and necroptosis are induced. TNFR1 and TRAIL 1/2 depend on the DD-adapter proteins TRADD, FADD and RIPK1 for cell death induction and inflammatory signaling. However, the precise role of these molecules is poorly understood, especially with respect to receptor-specific, cooperative and redundant activities. In order to elucidate the interdependencies of these proteins, variants of the necroptosis competent RIPK3-expressing HeLa transfectant lacking expression of TRADD, RIPK1 and FADD or any combination of two of these molecules were generated and evaluated with respect to TNF- and TRAIL-induced signaling. It turned out that RIPK1 is essential for necroptosis induction by TNFR1 and TRAILR 1/2, RIPK1 alone, in the absence of FADD and TRADD, is only sufficient for the induction of TNFR1 dependent necroptosis. Otherwise, TRADD inhibits TNFR1- and TRAILR 1/2-induced necroptosis. RIPK1 and TRADD are indispensable for TNFR1- and TRAILR 1/2-induced NFκB activation and play a decisive role in TNFR1-induced apoptosis. On the contrary, FADD alone is enough for TRAILR 1/2-induced caspase-8 activation. Furthermore, FADD is required for TRAIL-induced NFκB activation. In absence of FADD and TRADD, RIPK1 alone mediates TNF-induced caspase-8 activation. FADD is necessary for TRAIL-induced necroptosis, but antagonizes TNF-induced necroptosis in a caspase-8 dependent and independent manner. Besides TWEAK sensitizes for both a TNF- and TRAIL-induced necroptosis. To summarize, in the scope of this work, we were able to analyze the effects of TNFR1 and TRAIL 1/2 on the activation of the respective signaling cascades. Moreover, we showed how the interaction of TRADD, FADD and RIPK1 influence the activation of NFκB, apoptosis and necroptosis. KW - Signaltransduktion KW - TNFR1 KW - adapterprotein KW - TRAIL KW - Todesdomäne KW - Rezeptoren Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184518 ER - TY - JOUR A1 - Gebert, Friederike A1 - Steffan-Dewenter, Ingolf A1 - Moretto, Philippe A1 - Peters, Marcell K. T1 - Climate rather than dung resources predict dung beetle abundance and diversity along elevational and land use gradients on Mt. Kilimanjaro JF - Journal of Biogeography N2 - Aim: While elevational gradients in species richness constitute some of the best depicted patterns in ecology, there is a large uncertainty concerning the role of food resource availability for the establishment of diversity gradients in insects. Here, we analysed the importance of climate, area, land use and food resources for determining diversity gradients of dung beetles along extensive elevation and land use gradients on Mt. Kilimanjaro, Tanzania. Location: Mt. Kilimanjaro, Tanzania. Taxon: Scarabaeidae (Coleoptera). Methods: Dung beetles were recorded with baited pitfall traps at 66 study plots along a 3.6 km elevational gradient. In order to quantify food resources for the dung beetle community in form of mammal defecation rates, we assessed mammalian diversity and biomass with camera traps. Using a multi‐model inference framework and path analysis, we tested the direct and indirect links between climate, area, land use and mammal defecation rates on the species richness and abundance of dung beetles. Results: We found that the species richness of dung beetles declined exponentially with increasing elevation. Human land use diminished the species richness of functional groups exhibiting complex behaviour but did not have a significant influence on total species richness. Path analysis suggested that climate, in particular temperature and to a lesser degree precipitation, were the most important predictors of dung beetle species richness while mammal defecation rate was not supported as a predictor variable. Main conclusions: Along broad climatic gradients, dung beetle diversity is mainly limited by climatic factors rather than by food resources. Our study points to a predominant role of temperature‐driven processes for the maintenance and origination of species diversity of ectothermic organisms, which will consequently be subject to ongoing climatic changes. KW - altitudinal gradients KW - diversity gradients KW - enercy-richness hypothesis KW - food resources KW - insect abundance KW - land use KW - Scarabaeidae KW - temperature‐richness hypothesis KW - temperature‐mediated resource exploitation hypothesis KW - species‐area hypothesis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204701 VL - 47 IS - 2 SP - 371 EP - 381 ER - TY - THES A1 - Glenz, René T1 - Die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion T1 - The role of sphingobases in plant cell death reaction N2 - Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert. In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei. N2 - Sphingobases are the building blocks for the biosynthesis of sphingolipids. While complex sphingolipids form a major part of eukaryotic membranes, sphingobases, which are also called long-chain bases (LCBs), are well-known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes. In the animal system, antagonistic effects of nonphosphorylated sphingobases (LCBs) and their phosphorylated counterparts (LCB-Ps) have been reported in many cell functions, with a particular focus on apoptosis, and the underlying signaling pathways have been elucidated in detail. In contrast, few records of an antagonistic effect and the potential signal transduction mechanisms have been established in plants. Several lines of evidence point to a regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Mutations in genes related to sphingobase metabolism may cause spontaneous PCD and altered cell death reactions. (ii) Levels of LCBs are increased under different cell death conditions. (iii) Necrotrophic pathogens produce toxins, like fumonisin B1 (FB1), interfering with sphingolipid metabolism of the host plant and, thus, causing PCD. (iv) Treatment of plants with LCBs, but not LCB-Ps, induces cell death. In the present study the role of sphingobases in plant cell death reactions, with a focus on the examination of the hypothesis of an antagonistic cell death-inhibitory effect of LCB-Ps, has been investigated. Using conductivity-based measurements of Arabidopsis thaliana leaf discs, cell death induced by treatment with LCBs and separated or combined feeding of LCB-Ps was determined. That kind of quantification allowed the verification of an inhibitory effect of LCB-Ps on LCB-induced cell death, which was published elsewhere. However, by simultaneous measurement of the applied sphingobase levels in the tissue with HPLC-MS/MS, this antagonism could be explained by a reduced uptake of the LCB in the presence of the LCB-P, which was also confirmed by a separated treatment with the sphingobases. In addition to that an impact of exogenous applied LCBs and LCB-Ps on cell death in A. thaliana induced by Pseudomonas syringae has been investigated. For LCB-Ps no cell death inhibitory effect was observed. Similarly, there was no impact for LCB-Ps on the cell death induced by recombinant expression of an avirulence protein in Arabidopsis. For LCBs, a direct antibacterial effect against P. syringae was shown in this work. This puts previous findings of an inhibitory effect of LCBs on pathogen-induced cell death in plants into a new perspective. In further approaches, Arabidopsis mutants of enzymes of the sphingobase metabolism (LCB kinase, LCB-P phosphatase, LCB-P lyase) were functionally characterized with regard to altered in situ levels of LCBs/LCB-Ps. The phenotype of the mutants in response to fumonisin B1 was determined in a growth assay with seedlings, and by cell death measurements in leaf discs, which were accompanied by quantification of sphingobase levels. The sensitivity of different lines to FB1 was closely correlated with the levels of LCBs, while high contents of LCB-Ps alone were not able to reduce cell death. Some mutants even showed a correlation of highly enhanced LCB-P levels with a pronounced sensitivity to FB1. The results of the present study challenge the hypothesis of an antagonistic effect of phosphorylated sphingobases on plant cell death. Instead, a detailed analysis of sphingobase levels revealed a positive correlation of LCB contents with cell death. The conducted experiments not only provide further evidence for a cell death-promoting effect of nonphosphorylated sphingobases, but also contribute to the comprehension of sphingobase homeostasis, as well as of the sphingobase-induced PCD in plants. KW - Sphingolipide KW - Phytosphingosine KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Zelltod KW - Sphingobasen (LCB, LCB-P) KW - Ackerschmalwand KW - programmierter Zelltod KW - Sphingobases KW - Arabidopsis KW - programmed cell death Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187903 ER - TY - JOUR A1 - Goos, Carina A1 - Dejung, Mario A1 - Wehman, Ann M. A1 - M-Natus, Elisabeth A1 - Schmidt, Johannes A1 - Sunter, Jack A1 - Engstler, Markus A1 - Butter, Falk A1 - Kramer, Susanne T1 - Trypanosomes can initiate nuclear export co-transcriptionally JF - Nucleic Acids Research N2 - The nuclear envelope serves as important messenger RNA (mRNA) surveillance system. In yeast and human, several control systems act in parallel to prevent nuclear export of unprocessed mRNAs. Trypanosomes lack homologues to most of the involved proteins and their nuclear mRNA metabolism is non-conventional exemplified by polycistronic transcription and mRNA processing by trans-splicing. We here visualized nuclear export in trypanosomes by intra- and intermolecular multi-colour single molecule FISH. We found that, in striking contrast to other eukaryotes, the initiation of nuclear export requires neither the completion of transcription nor splicing. Nevertheless, we show that unspliced mRNAs are mostly prevented from reaching the nucleus-distant cytoplasm and instead accumulate at the nuclear periphery in cytoplasmic nuclear periphery granules (NPGs). Further characterization of NPGs by electron microscopy and proteomics revealed that the granules are located at the cytoplasmic site of the nuclear pores and contain most cytoplasmic RNA-binding proteins but none of the major translation initiation factors, consistent with a function in preventing faulty mRNAs from reaching translation. Our data indicate that trypanosomes regulate the completion of nuclear export, rather than the initiation. Nuclear export control remains poorly understood, in any organism, and the described way of control may not be restricted to trypanosomes. KW - molecular biology KW - nuclear export KW - trypanosomes KW - mRNA KW - nuclear envelope Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177709 VL - 47 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Gorelashvili, Maximilian Georg T1 - Investigation of megakaryopoiesis and the acute phase of ischemic stroke by advanced fluorescence microscopy T1 - Untersuchungen der Megakaryopoese und der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls mit Hilfe von hochentwickelter Fluoreszenzmikroskopie N2 - In mammals, anucleate platelets circulate in the blood flow and are primarily responsible for maintaining functional hemostasis. Platelets are generated in the bone marrow (BM) by megakaryocytes (MKs), which mainly reside directly next to the BM sinusoids to release proplatelets into the blood. MKs originate from hematopoietic stem cells and are thought to migrate from the endosteal to the vascular niche during their maturation, a process, which is, despite being intensively investigated, still not fully understood. Long-term intravital two photon microscopy (2PM) of MKs and vasculature in murine bone marrow was performed and mean squared displacement analysis of cell migration was performed. The MKs exhibited no migration, but wobbling-like movement on time scales of 3 h. Directed cell migration always results in non-random spatial distribution. Thus, a computational modelling algorithm simulating random MK distribution using real 3D light-sheet fluorescence microscopy data sets was developed. Direct comparison of real and simulated random MK distributions showed, that MKs exhibit a strong bias to vessel-contact. However, this bias is not caused by cell migration, as non-vessel-associated MKs were randomly distributed in the intervascular space. Furthermore, simulation studies revealed that MKs strongly impair migration of other cells in the bone marrow by acting as large-sized obstacles. MKs are thought to migrate from the regions close to the endosteum towards the vasculature during their maturation process. MK distribution as a function of their localization relative to the endosteal regions of the bones was investigated by light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The results show no bone-region dependent distribution of MKs. Taken together, the newly established methods and obtained results refute the model of MK migration during their maturation. Ischemia reperfusion (I/R) injury is a frequent complication of cerebral ischemic stroke, where brain tissue damage occurs despite successful recanalization. Platelets, endothelial cells and immune cells have been demonstrated to affect the progression of I/R injury in experimental mouse models 24 h after recanalization. However, the underlying Pathomechanisms, especially in the first hours after recanalization, are poorly understood. Here, LSFM, 2PM and complemental advanced image analysis workflows were established for investigation of platelets, the vasculature and neutrophils in ischemic brains. Quantitative analysis of thrombus formation in the ipsilateral and contralateral hemispheres at different time points revealed that platelet aggregate formation is minimal during the first 8 h after recanalization and occurs in both hemispheres. Considering that maximal tissue damage already is present at this time point, it can be concluded that infarct progression and neurological damage do not result from platelet aggregated formation. Furthermore, LSFM allowed to confirm neutrophil infiltration into the infarcted hemisphere and, here, the levels of endothelial cell marker PECAM1 were strongly reduced. However, further investigations must be carried out to clearly identify the role of neutrophils and the endothelial cells in I/R injury. N2 - In Säugetieren zirkulieren kernlose Thrombozyten im Blutstrom und sind primär für die Aufrechterhaltung der funktionellen Hämostase verantwortlich. Thrombozyten werden im Knochenmark durch Megakaryozyten gebildet, die sich hauptsächlich in direkter Nähe zu Knochenmarkssinusoiden befinden, um Proplättchen in das Blut freizusetzen. Megakaryo-zyten stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab und man glaubt, dass sie während ihres Reifungspro¬zesses von der endostalen in die vaskuläre Nische wandern – ein Prozess, der trotz intensiver Forschung noch nicht vollständig verstanden ist. Langzeit-Zwei-Photonen-Mikroskopie von Megakaryozyten und des Gefäßbaums wurde in murinem Knochenmark von lebenden Tieren in Kombination mit der Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung der Zellmigration durchgeführt. Die Megakaryozyten zeigten keine Migration, sondern eine wackelartige Bewegung auf Zeitskalen von 3 Stunden. Die gerichtete Zellmigration führt stets zu einer nicht zufälligen räumlichen Verteilung der Zellen. Daher wurde ein Computermodellierungsalgorithmus entwickelt, der eine zufällige Megakaryo¬zytenverteilung unter Verwendung von realen 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Datensätzen simuliert. Der direkte Vergleich realer und simuliert zufälliger Megakaryozyten¬verteilungen zeigte, dass MKs stark mit Knochenmarksgefäßen assoziiert sind. Dieses wird jedoch nicht durch Zellmigration verursacht, da nicht-Gefäß-assoziierte MKs zufällig im intervaskulären Raum verteilt waren. Darüber hinaus zeigten Simulationsstudien, dass Megakaryozyten die Migration anderer Zellen im Knochenmark stark beeinträchtigen, da sie als sterische Hindernisse wirken. Es wird angenommen, dass MKs während ihres Reife¬prozesses von den Regionen in der Nähe des Endosteums in Richtung des Gefäßsystems wandern. Die Megakaryozytenverteilung als Funktion ihrer Lokalisierung relativ zu den endo¬stalen Regionen des Knochens wurde durch Lichtblattmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigen keine knochenregionabhängige Verteilung von Megakaryozyten. Zusammenge¬nommen widerlegen die neu etablierten Methoden und erzielten Ergebnisse das Modell der Megakaryozyten¬migration während ihrer Reifung. Ischämie-Reperfusionsschaden (I/R) ist eine häufige Komplikation des zerebralen ischämischen Schlaganfalls, bei dem trotz erfolgreicher Rekanalisierung eine Schädigung des Hirngewebes auftritt. Es wurde gezeigt, dass Thrombozyten, Endothelzellen und Immunzellen das Fortschreiten der I/R-Verletzung in experimentellen Mausmodellen 24 Stunden nach der Rekanalisierung beeinflussen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen, insbesondere in den ersten Stunden nach der Rekanalisierung, sind jedoch kaum verstanden. Hier wurden Lichtblattmikroskopie, Zwei-Photonen-Mikroskopie und ergänzende hochkom-plexe Bildanalyse-Workflows zur Untersuchung von Thrombozyten, der Gefäße und Neutro-philen in ischämischen Gehirnen etabliert. Die quantitative Analyse der Thrombusbildung in der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphäre zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass die Thrombozytenaggregationsbildung während der ersten 8 Stunden nach der Rekanalisierung minimal ist und in beiden Hemisphären auftritt. In Anbetracht dessen, dass zu diesem Zeitpunkt bereits eine maximale Gewebeschädigung vorliegt, kann geschlossen werden, dass die Infarkt¬progression und der neurologische Schaden nicht aus der Bildung von Thrombozytenaggre¬gaten resultieren. Darüber hinaus erlaubte Lichtblattmikroskopie die Neutrophileninfiltration in die infarzierte Hemisphäre zu bestätigen und hier waren die Spiegel des Endothelzellmarkers PECAM1 stark reduziert. Es müssen jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Rolle von Neutrophilen und Endothelzellen bei I/R-Verletzungen klar zu identifizieren. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Schlaganfall KW - Megakaryozyt KW - Computersimulation KW - Light sheet microscopy KW - ischemic stroke KW - megakaryopoiesis KW - multi-photon microscopy Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186002 ER - TY - JOUR A1 - Gotru, Sanjeev Kiran A1 - van Geffen, Johanna P. A1 - Nagy, Magdolna A1 - Mammadova-Bach, Elmina A1 - Eilenberger, Julia A1 - Volz, Julia A1 - Manukjan, Georgi A1 - Schulze, Harald A1 - Wagner, Leonard A1 - Eber, Stefan A1 - Schambeck, Christian A1 - Deppermann, Carsten A1 - Brouns, Sanne A1 - Nurden, Paquita A1 - Greinacher, Andreas A1 - Sachs, Ulrich A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Hermanns, Heike M. A1 - Heemskerk, Johan W. M. A1 - Braun, Attila T1 - Defective Zn2+ homeostasis in mouse and human platelets with α- and δ-storage pool diseases JF - Scientific Reports N2 - Zinc (Zn2+) can modulate platelet and coagulation activation pathways, including fibrin formation. Here, we studied the (patho)physiological consequences of abnormal platelet Zn2+ storage and release. To visualize Zn2+ storage in human and mouse platelets, the Zn2+ specific fluorescent dye FluoZin3 was used. In resting platelets, the dye transiently accumulated into distinct cytosolic puncta, which were lost upon platelet activation. Platelets isolated from Unc13d−/− mice, characterized by combined defects of α/δ granular release, showed a markedly impaired Zn2+ release upon activation. Platelets from Nbeal2−/− mice mimicking Gray platelet syndrome (GPS), characterized by primarily loss of the α-granule content, had strongly reduced Zn2+ levels, which was also confirmed in primary megakaryocytes. In human platelets isolated from patients with GPS, Hermansky-Pudlak Syndrome (HPS) and Storage Pool Disease (SPD) altered Zn2+ homeostasis was detected. In turbidity and flow based assays, platelet-dependent fibrin formation was impaired in both Nbeal2−/− and Unc13d−/− mice, and the impairment could be partially restored by extracellular Zn2+. Altogether, we conclude that the release of ionic Zn2+ store from secretory granules upon platelet activation contributes to the procoagulant role of Zn2+ in platelet-dependent fibrin formation. KW - coagulation system KW - metals Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227455 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Grebinyk, Anna A1 - Prylutska, Svitlana A1 - Buchelnikov, Anatoliy A1 - Tverdokhleb, Nina A1 - Grebinyk, Sergii A1 - Evstigneev, Maxim A1 - Matyshevska, Olga A1 - Cherepanov, Vsevolod A1 - Prylutskyy, Yuriy A1 - Yashchuk, Valeriy A1 - Naumovets, Anton A1 - Ritter, Uwe A1 - Dandekar, Thomas A1 - Frohme, Marcus T1 - C60 fullerene as an effective nanoplatform of alkaloid Berberine delivery into leukemic cells JF - Pharmaceutics N2 - A herbal alkaloid Berberine (Ber), used for centuries in Ayurvedic, Chinese, Middle-Eastern, and native American folk medicines, is nowadays proved to function as a safe anticancer agent. Yet, its poor water solubility, stability, and bioavailability hinder clinical application. In this study, we have explored a nanosized carbon nanoparticle—C60 fullerene (C60)—for optimized Ber delivery into leukemic cells. Water dispersions of noncovalent C60-Ber nanocomplexes in the 1:2, 1:1, and 2:1 molar ratios were prepared. UV–Vis spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), and atomic force microscopy (AFM) evidenced a complexation of the Ber cation with the negatively charged C60 molecule. The computer simulation showed that π-stacking dominates in Ber and C\(_{60}\) binding in an aqueous solution. Complexation with C\(_{60}\) was found to promote Ber intracellular uptake. By increasing C\(_{60}\) concentration, the C\(_{60}\)-Ber nanocomplexes exhibited higher antiproliferative potential towards CCRF-CEM cells, in accordance with the following order: free Ber < 1:2 < 1:1 < 2:1 (the most toxic). The activation of caspase 3/7 and accumulation in the sub-G1 phase of CCRF-CEM cells treated with C\(_{60}\)-Ber nanocomplexes evidenced apoptosis induction. Thus, this study indicates that the fast and easy noncovalent complexation of alkaloid Ber with C\(_{60}\) improved its in vitro efficiency against cancer cells. KW - C60 fullerene KW - Berberine KW - noncovalent nanocomplex KW - UV–Vis KW - DLS and AFM measurements KW - drug release KW - leukemic cells KW - uptake KW - cytotoxicity KW - apoptosis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193216 SN - 1999-4923 VL - 11 IS - 11 ER - TY - JOUR A1 - Grebinyk, Anna A1 - Prylutska, Svitlana A1 - Chepurna, Oksana A1 - Grebinyk, Sergii A1 - Prylutskyy, Yuriy A1 - Ritter, Uwe A1 - Ohulchanskyy, Tymish Y. A1 - Matyshevska, Olga A1 - Dandekar, Thomas A1 - Frohme, Marcus T1 - Synergy of chemo- and photodynamic therapies with C\(_{60}\) Fullerene-Doxorubicin nanocomplex JF - Nanomaterials N2 - A nanosized drug complex was explored to improve the efficiency of cancer chemotherapy, complementing it with nanodelivery and photodynamic therapy. For this, nanomolar amounts of a non-covalent nanocomplex of Doxorubicin (Dox) with carbon nanoparticle C\(_{60}\) fullerene (C\(_{60}\)) were applied in 1:1 and 2:1 molar ratio, exploiting C\(_{60}\) both as a drug-carrier and as a photosensitizer. The fluorescence microscopy analysis of human leukemic CCRF-CEM cells, in vitro cancer model, treated with nanocomplexes showed Dox’s nuclear and C\(_{60}\)'s extranuclear localization. It gave an opportunity to realize a double hit strategy against cancer cells based on Dox's antiproliferative activity and C\(_{60}\)'s photoinduced pro-oxidant activity. When cells were treated with 2:1 C\(_{60}\)-Dox and irradiated at 405 nm the high cytotoxicity of photo-irradiated C\(_{60}\)-Dox enabled a nanomolar concentration of Dox and C\(_{60}\) to efficiently kill cancer cells in vitro. The high pro-oxidant and pro-apoptotic efficiency decreased IC\(_{50}\) 16, 9 and 7 × 10\(^3\)-fold, if compared with the action of Dox, non-irradiated nanocomplex, and C\(_{60}\)'s photodynamic effect, correspondingly. Hereafter, a strong synergy of therapy arising from the combination of C\(_{60}\)-mediated Dox delivery and C\(_{60}\) photoexcitation was revealed. Our data indicate that a combination of chemo- and photodynamic therapies with C\(_{60}\)-Dox nanoformulation provides a promising synergetic approach for cancer treatment. KW - photodynamic chemotherapy KW - synergistic effect KW - C\(_{60}\) fullerene KW - Doxorubicin KW - nanocomplex KW - leukemic cells KW - apoptosis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193140 SN - 2079-4991 VL - 9 IS - 11 ER - TY - JOUR A1 - Grebinyk, Anna A1 - Prylutska, Svitlana A1 - Grebinyk, Sergii A1 - Prylutskyy, Yuriy A1 - Ritter, Uwe A1 - Matyshevska, Olga A1 - Dandekar, Thomas A1 - Frohme, Marcus T1 - Complexation with C\(_{60}\) fullerene increases doxorubicin efficiency against leukemic cells in vitro JF - Nanoscale Research Letters N2 - Conventional anticancer chemotherapy is limited because of severe side effects as well as a quickly evolving multidrug resistance of the tumor cells. To address this problem, we have explored a C\(_{60}\) fullerene-based nanosized system as a carrier for anticancer drugs for an optimized drug delivery to leukemic cells.Here, we studied the physicochemical properties and anticancer activity of C\(_{60}\) fullerene noncovalent complexes with the commonly used anticancer drug doxorubicin. C\(_{60}\)-Doxorubicin complexes in a ratio 1:1 and 2:1 were characterized with UV/Vis spectrometry, dynamic light scattering, and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The obtained analytical data indicated that the 140-nm complexes were stable and could be used for biological applications. In leukemic cell lines (CCRF-CEM, Jurkat, THP1 and Molt-16), the nanocomplexes revealed 3.5 higher cytotoxic potential in comparison with the free drug in a range of nanomolar concentrations. Also, the intracellular drug's level evidenced C\(_{60}\) fullerene considerable nanocarrier function.The results of this study indicated that C\(_{60}\) fullerene-based delivery nanocomplexes had a potential value for optimization of doxorubicin efficiency against leukemic cells. KW - C-60 fullerene KW - doxorubicin KW - noncovalent complex KW - leukemic cells KW - cytotoxicity KW - accumulation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-228257 VL - 14 IS - 61 ER - TY - THES A1 - Griffoni, Chiara T1 - Towards advanced immunocompetent skin wound models for in vitro drug evaluation T1 - Auf dem Weg zu fortschrittlichen immunkompetenten Hautwundmodellen für die in vitro-Medikamentenbewertung N2 - Current preclinical models used to evaluate novel therapies for improved healing include both in vitro and in vivo methods. However, ethical concerns related to the use of animals as well as the poor physiological translation between animal and human skin wound healing designate in vitro models as a highly relevant and promising platforms for healing investigation. While current in vitro 3D skin models recapitulate a mature tissue with healing properties, they still represent a simplification of the in vivo conditions, where for example the inflammatory response originating after wound formation involves the contribution of immune cells. Macrophages are among the main contributors to the inflammatory response and regulate its course thanks to their plasticity. Therefore, their implementation into in vitro skin could greatly increase the physiological relevance of the models. As no full-thickness immunocompetent skin model containing macrophages has been reported so far, the parameters necessary for a successful triple co-culture of fibroblasts, keratinocytes and macrophages were here investigated. At first, cell source and culture timed but also an implementation strategy for macrophages were deter-mined. The implementation of macrophages into the skin model focused on the minimization of the culture time to preserve immune cell viability and phenotype, as the environment has a major influence on cell polarization and cytokine production. To this end, incorporation of macrophages in 3D gels prior to the combination with skin models was selected to better mimic the in vivo environment. Em-bedded in collagen hydrogels, macrophages displayed a homogeneous cell distribution within the gel, preserving cell viability, their ability to respond to stimuli and their capability to migrate through the matrix, which are all needed during the involvement of macrophages in the inflammatory response. Once established how to introduce macrophages into skin models, different culture media were evaluated for their effects on primary fibroblasts, keratinocytes and macrophages, to identify a suitable medium composition for the culture of immunocompetent skin. The present work confirmed that each cell type requires a different supplement combination for maintaining functional features and showed for the first time that media that promote and maintain a mature skin structure have negative effects on primary macrophages. Skin differentiation media negatively affected macrophages in terms of viability, morphology, ability to respond to pro- and anti-inflammatory stimuli and to migrate through a collagen gel. The combination of wounded skin equivalents and macrophage-containing gels con-firmed that culture medium inhibits macrophage participation in the inflammatory response that oc-curs after wounding. The described macrophage inclusion method for immunocompetent skin creation is a promising approach for generating more relevant skin models. Further optimization of the co-cul-ture medium will potentially allow mimicking a physiological inflammatory response, enabling to eval-uate the effects novel drugs designed for improved healing on improved in vitro models. N2 - Aktuelle präklinische Modelle zur Bewertung neuartiger Therapien für eine verbesserte Heilung um- fassen sowohl in vitro als auch in vivo Methoden. Ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Ver- wendung von Tieren sowie die schlechte physiologische Übersetzung zwischen tierischer und mensch- licher Hautwundheilung bezeichnen In-vitro-Modelle jedoch als hochrelevante und vielversprechende Plattformen für die Heilungsforschung. Während die aktuellen in vitro 3D-Hautmodelle ein reifes Ge- webe mit heilenden Eigenschaften rekapitulieren, stellen sie dennoch eine Vereinfachung der in vivo- Bedingungen dar, bei denen beispielsweise die nach der Wundbildung entstehende Entzündungsreak- tion den Beitrag von Immunzellen beinhaltet. Makrophagen gehören zu den Hauptverursachern der Entzündungsreaktion und regulieren ihren Verlauf durch ihre Plastizität. Daher könnte ihre Implemen- tierung in die in vitro Haut die physiologische Relevanz der Modelle deutlich erhöhen. Da bisher kein volldickes, immunkompetentes Hautmodell mit Makrophagen berichtet wurde, wurden hier die für eine erfolgreiche Dreifach-Cokultur von Fibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen notwendigen Parameter untersucht. Zuerst wurden die Zellquelle und die Kultur zeitlich festgelegt, aber auch eine Implementierungsstrategie für Makrophagen festgelegt. Die Implementierung von Makrophagen in das Hautmodell konzentrierte sich auf die Minimierung der Kultivierungszeit, um die Lebensfähigkeit und den Phänotyp der Immunzellen zu erhalten, da die Umgebung einen großen Einfluss auf die Zell- polarisation und Zytokinproduktion hat. Zu diesem Zweck wurde die Integration von Makrophagen in 3D-Gelen vor der Kombination mit Hautmodellen ausgewählt, um die in vivo-Umgebung besser nach- ahmen zu können. Eingebettet in Kollagenhydrogele zeigten Makrophagen eine homogene Zellvertei- lung im Gel, die die Zelllebensfähigkeit bewahrt, auf Reize reagiert und durch die Matrix wandert, die alle bei der Beteiligung von Makrophagen an der Entzündungsreaktion benötigt werden. Nachdem festgestellt worden war, wie Makrophagen in Hautmodelle eingeführt werden können, wurden ver- schiedene Kulturmedien hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Primärfibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen untersucht, um eine geeignete Medienzusammensetzung für die Kultur immunkompe- tenter Haut zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit bestätigte, dass jeder Zelltyp eine andere Supple- mentkombination zur Aufrechterhaltung der Funktionsmerkmale benötigt und zeigte erstmals, dass Medien, die eine reife Hautstruktur fördern und aufrechterhalten, negative Auswirkungen auf die pri- mären Makrophagen haben. Hautdifferenzierungsmedien wirkten sich negativ auf die Makrophagen in Bezug auf Lebensfähigkeit, Morphologie, Fähigkeit, auf pro- und antiinflammatorische Reize zu rea- gieren und durch ein Kollagengel zu wandern aus. Die Kombination aus verwundeten Hautäquivalen- ten und makrophagenhaltigen Gelen bestätigte, dass das Kulturmedium die Teilnahme der Makro- phage an der Entzündungsreaktion, die nach der Wunde auftritt, hemmt. Die beschriebene Makrophagen-Einschlussmethode zur immunkompetenten Hautbildung ist ein vielversprechender An- satz zur Generierung relevanterer Hautmodelle. Eine weitere Optimierung des Co-Kulturmediums wird es möglicherweise ermöglichen, eine physiologische Entzündungsreaktion nachzuahmen und die Aus- wirkungen neuartiger Medikamente zur verbesserten Heilung auf verbesserte In-vitro-Modelle zu be- werten. KW - skin model KW - macrophages KW - wound healing KW - immunocompetent skin KW - Haut KW - In vitro KW - Wundheilung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192125 ER - TY - THES A1 - Grimm, Johannes T1 - Autocrine and paracrine effects of BRAF inhibitor induced senescence in melanoma T1 - Autokrine und parakrine Effekte BRAF-Inhibitor-induzierter Seneszenz im Melanom N2 - The FDA approval of targeted therapy with BRAFV600E inhibitors like vemurafenib and dabrafenib in 2011 has been the first major breakthrough in the treatment of metastatic melanoma since almost three decades. Despite increased progression free survival and elevated overall survival rates, complete responses are scarce due to resistance development approximately six months after the initial drug treatment. It was previously shown in our group that melanoma cells under vemurafenib pressure in vitro and in vivo exhibit features of drug-induced senescence. It is known that some cell types, which undergo this cell cycle arrest, develop a so-called senescence associated secretome and it has been reported that melanoma cell lines also upregulate the expression of different factors after senescence induction. This work describes the effect of the vemurafenib-induced secretome on cells. Conditioned supernatants of vemurafenib-treated cells increased the viability of naive fibroblast and melanoma cell lines. RNA analysis of donor melanoma cells revealed elevated transcriptional levels of FGF1, MMP2 and CCL2 in the majority of tested cell lines under vemurafenib pressure, and I could confirm the secretion of functional proteins. Similar observations were also done after MEK inhibition as well as in a combined BRAF and MEK inhibitor treatment situation. Interestingly, the transcription of other FGF ligands (FGF7, FGF17) was also elevated after MEK/ERK1/2 inhibition. As FGF receptors are therapeutically relevant, I focused on the analysis of FGFR-dependent processes in response to BRAF inhibition. Recombinant FGF1 increased the survival rate of melanoma cells under vemurafenib pressure, while inhibition of the FGFR pathway diminished the viability of melanoma cells in combination with vemurafenib and blocked the stimulatory effect of vemurafenib conditioned medium. The BRAF inhibitor induced secretome is regulated by active PI3K/AKT signaling, and the joint inhibition of mTor and BRAFV600E led to decreased senescence induction and to a diminished induction of the secretome-associated genes. In parallel, combined inhibition of MEK and PI3K also drastically decreased mRNA levels of the relevant secretome components back to basal levels. In summary, I could demonstrate that BRAF inhibitor treated melanoma cell lines acquire a specific PI3K/AKT dependent secretome, which is characterized by FGF1, CCL2 and MMP2. This secretome is able to stimulate other cells such as naive melanoma cells and fibroblasts and contributes to a better survival under drug pressure. These data are therapeutically highly relevant, as they imply the usage of novel drug combinations, especially specific FGFR inhibitors, with BRAF inhibitors in the clinic. N2 - Die Zulassung der spezifischen BRAFV600E Inhibitoren Vemurafenib und Dabrafenib im Jahr 2011 war der erste wirksame Schritt nach Jahrzehnten der Stagnation in der Behandlung des metastasierenden Melanoms. Allerdings zeigte sich, dass trotz erhöhter Gesamtüberlebensrate und gestiegenem progressionsfreien Überleben komplette Remissionen selten waren. Wir konnten in vorangegangenen Versuchen zeigen, dass eine Behandlung BRAFV600E-mutierter Melanom Zelllinien mit Vemurafenib mit der Induktion von Seneszenz-assoziierten Merkmalen einhergeht. Da bekannt ist, dass seneszente Zellen, darunter auch Melanom Zellen, ein sogenanntes Sekretom ausbilden können, welches andere Zellen beeinflussen kann, war die Identifizierung und Charakterisierung von Vemurafenib-induzierten sezernierten Faktoren das Ziel meiner Arbeit. Initiale Versuche zeigten, dass konditionierter Überstand von Vemurafenib behandelten Zellen das Wachstum naiver Zelllinien erhöhen kann. Ich konnte in weiteren Versuchen zeigen, dass sich die Transkription und Expression des Cytokins CCL2, der Matrixmetalloprotease MMP2 und des Wachstumsfaktors FGF1 nach Vemurafenib Behandlung erhöht. Darüber hinaus konnte ich interessanterweise auch eine gesteigerte Transkription anderer FGF Liganden (FGF7, FGF17) feststellen, was meinen Fokus auf die Analyse von FGFR abhängigen Prozessen als Antwort auf die BRAF Inhibition gelenkt hat. Es zeigte sich, dass sich Melanomzellen mittels Zugabe von FGF1 besser gegen die Vemurafenib-induzierte MEK/ERK1/2 Hemmung behaupten können. Darüber hinaus konnte durch den Einsatz eines spezifischen FGFR Inhibitors die Viabilität von Melanomzellen unter Vemurafenib Behandlung vermindert werden. Auch der stimulierende Effekt des Vemurafenib konditionierten Überstandes konnte dadurch teilweise aufgehoben werden. Die Induktion des BRAF Inhibitor assoziierten Sekretoms ist auf einen aktiven PI3K/AKT Signalweg angewiesen. So führt eine gleichzeitige Hemmung des MEK/ERK1/2 und PI3K/AKT Signalwegs zu einer verminderten Seneszenzinduktion und einer niedrigeren Transkription der Seneszenz-assoziierten Gene. Zudem konnte ich feststellen, dass auch eine gemeinsame Hemmung von BRAF und MEK Seneszenz und das damit einhergehende Sekretom unter Beteiligung von CCL2, MMP2 und den FGFs induziert. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass BRAFV600E-mutierte Melanomzellen nach Vemurafenib Behandlung ein Sekretom ausbilden, welches potentiell wachstumsfördernde und matrix-modellierende Faktoren beinhaltet. Dies ist abhängig vom PI3K/AKT Signalweg und charakterisiert durch die Sekretion von FGF1, CCL2 und MMP2. Klinische Relevanz erlangen diese Erkenntnisse durch die Möglichkeit, diese Faktoren im Rahmen einer Kombinationstherapie, z.B. mit einem spezifischen FGFR Inhibitor, zu inaktivieren. KW - Melanoma KW - Inhibitor KW - Melanom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181161 ER - TY - JOUR A1 - Groll, J A1 - Burdick, J A A1 - Cho, D-W A1 - Derby, B A1 - Gelinsky, M A1 - Heilshorn, S C A1 - Jüngst, T A1 - Malda, J A1 - Mironov, V A A1 - Nakayama, K A1 - Ovsianikov, A A1 - Sun, W A1 - Takeuchi, S A1 - Yoo, J J A1 - Woodfield, T B F T1 - A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks JF - Biofabrication N2 - Biofabrication aims to fabricate biologically functional products through bioprinting or bioassembly (Groll et al 2016 Biofabrication 8 013001). In biofabrication processes, cells are positioned at defined coordinates in three-dimensional space using automated and computer controlled techniques (Moroni et al 2018 Trends Biotechnol. 36 384–402), usually with the aid of biomaterials that are either (i) directly processed with the cells as suspensions/dispersions, (ii) deposited simultaneously in a separate printing process, or (iii) used as a transient support material. Materials that are suited for biofabrication are often referred to as bioinks and have become an important area of research within the field. In view of this special issue on bioinks, we aim herein to briefly summarize the historic evolution of this term within the field of biofabrication. Furthermore, we propose a simple but general definition of bioinks, and clarify its distinction from biomaterial inks. KW - bioink KW - biomaterial ink KW - definition Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-253993 VL - 11 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Grubisic, Maja A1 - Haim, Abraham A1 - Bhusal, Pramod A1 - Dominoni, Davide M. A1 - Gabriel, Katharina M. A. A1 - Jechow, Andreas A1 - Kupprat, Franziska A1 - Lerner, Amit A1 - Marchant, Paul A1 - Riley, William A1 - Stebelova, Katarina A1 - van Grunsven, Roy H. A. A1 - Zeman, Michal A1 - Zubidat, Abed E. A1 - Hölker, Franz T1 - Light Pollution, Circadian Photoreception, and Melatonin in Vertebrates JF - Sustainability N2 - Artificial light at night (ALAN) is increasing exponentially worldwide, accelerated by the transition to new efficient lighting technologies. However, ALAN and resulting light pollution can cause unintended physiological consequences. In vertebrates, production of melatonin—the “hormone of darkness” and a key player in circadian regulation—can be suppressed by ALAN. In this paper, we provide an overview of research on melatonin and ALAN in vertebrates. We discuss how ALAN disrupts natural photic environments, its effect on melatonin and circadian rhythms, and different photoreceptor systems across vertebrate taxa. We then present the results of a systematic review in which we identified studies on melatonin under typical light-polluted conditions in fishes, amphibians, reptiles, birds, and mammals, including humans. Melatonin is suppressed by extremely low light intensities in many vertebrates, ranging from 0.01–0.03 lx for fishes and rodents to 6 lx for sensitive humans. Even lower, wavelength-dependent intensities are implied by some studies and require rigorous testing in ecological contexts. In many studies, melatonin suppression occurs at the minimum light levels tested, and, in better-studied groups, melatonin suppression is reported to occur at lower light levels. We identify major research gaps and conclude that, for most groups, crucial information is lacking. No studies were identified for amphibians and reptiles and long-term impacts of low-level ALAN exposure are unknown. Given the high sensitivity of vertebrate melatonin production to ALAN and the paucity of available information, it is crucial to research impacts of ALAN further in order to inform effective mitigation strategies for human health and the wellbeing and fitness of vertebrates in natural ecosystems. KW - ALAN KW - artificial light at night KW - biological rhythm KW - circadian rhythm KW - melatonin Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193095 SN - 2071-1050 VL - 11 IS - 22 ER - TY - THES A1 - Gulve, Nitish T1 - Subversion of Host Genome Integrity by Human Herpesvirus 6 and \(Chlamydia\) \(trachomatis\) T1 - Störung der Integrität des Wirts Genoms durch das Human Herpesvirus 6 und \(Chlamydia\) \(trachomatis\) N2 - Ovarian cancer is one of the most common gynecological malignancies in the world. The prevalence of a microbial signature in ovarian cancer has been reported by several studies till date. In these microorganisms, Human herpesvirus 6 (HHV-6) and Chlamydia trachomatis (C.tr) are especially important as they have significantly high prevalence rate. Moreover, these pathogens are directly involved in causing DNA damage and thereby disrupting the integrity of host genome which is the underlying cause of any cancer. This study focuses on how the two pathogens, HHV-6 and C. trachomatis can affect the genome integrity in their individual capacities and thereby may drive ovarian epithelial cells towards transformation. HHV-6 has unique tendency to integrate its genome into the host genome at subtelomeric regions and achieve a state of latency. This latent virus may get reactivated during the course of life by stress, drugs such as steroids, during transplantation, pregnancy etc. The study presented here began with an interesting observation wherein the direct repeat (DR) sequences flanking the ends of double stranded viral genome were found in unusually high numbers in human blood samples as opposed to normal ratio of two DR copies per viral genome. This study was corroborated with in vitro data where cell lines were generated to mimic the HHV-6 status in human samples. The same observation of unusually high DR copies was found in these cell lines as well. Interestingly, fluorescence in situ hybridization (FISH) and inverse polymerase chain reaction followed by southern blotting showed that DR sequences were found to be integrated in nontelomeric regions as opposed to the usual sub-telomeric integration sites in both human samples and in cell lines. Sanger sequencing confirmed the non-telomeric integration of viral DR sequences in the host genome. Several studies have shown that C. trachomatis causes DNA damage and inhibits the signaling cascade of DNA damage response. However, the effect of C. trachomatis infection on process of DNA repair itself was not addressed. In this study, the effect of C. trachomatis infection on host base excision repair (BER) has been addressed. Base excision repair is a pathway which is responsible for replacing the oxidized bases with new undamaged ones. Interestingly, it was found that C. trachomatis infection downregulated polymerase β expression and attenuated polymerase β- mediated BER in vitro. The mechanism of the polymerase β downregulation was found to be associated with the changes in the host microRNAs and downregulation of tumor suppressor, p53. MicroRNA-499 which has a binding site in the polymerase β 3’UTR was shown to be upregulated during C. trachomatis infection. Inhibition of miR-499 using synthetic miR-499 inhibitor indeed improved the repair efficiency during C. trachomatis infection in the in vitro repair assay. Moreover, p53 transcriptionally regulates polymerase β and stabilizing p53 during C. trachomatis infection enhanced the repair efficiency. Previous studies have shown that C. trachomatis can reactivate latent HHV-6. Therefore, genomic instability due to insertions of unstable ‘transposon-like’ HHV-6 DR followed by compromised BER during C. trachomatis infection cumulatively support the hypothesis of pathogenic infections as a probable cause of ovarian cancer N2 - Diese Studie fokussiert sich darauf, wie die beiden Pathogene HHV-6 und C. trachomatis die Genom Integrität beeinflussen und dadurch die Transformation ovarialer Epithelzellen zu Tumorzellen antreiben können. Das latente Virus HHV-6 kann sich in Subtelomer-Regionen des Genoms integrieren und zu jeder Lebensphase (z.B. durch Stress oder Pharmaka) reaktiviert werden. Zu Beginn dieser Studie wurde die Beobachtung gemacht, dass in menschlichen Blutproben eine ungewöhnlich hohe Anzahl an sogenannten direct repeat Sequnzen, die die Enden des doppelsträngigen Virus Genoms flankieren, aufwiesen. Bestätigt wurde diese Beobachtung durch in vitro Daten, wofür Zelllinien generiert wurden, um den HHV-6 Wert in menschlichen Proben zu imitieren. Außerdem konnte durch Sanger Sequenzierung die Integration der viralen DR Sequenzen außerhalb von Telomer Regionen in das Genom nachgewiesen werden. Verschiedene Studien konnten zeigen, dass C. trachomatis DNA Schäden verursacht und die Signal Kaskade von Antworten auf DNA-Schäden inhibiert. Bisher wurde die Auswirkung einer C. trachomatis Infektion auf den Prozess der DNA Reparatur selbst noch nicht behandelt. In dieser Studie wird die Auswirkung einer C. trachomatis Infektion auf Basen-Exzisionsreparatur (BER) thematisiert. Interessanterweise wurde herausgefunden, dass während einer C. trachomatis Infektion die Expression von Polymerase β herunterreguliert ist und dadurch die Polymerase β-vermittelte Basen-Exzisionsreparatur in vitro gestoppt wird. Diese Herunterregulierung konnte mit einer verminderten Expression des Tumorsuppressor p53 assoziiert werden. Darüber hinaus reguliert p53 auf transkriptioneller Ebene Polymerase β und eine Stabilisierung von p53 während einer C. trachomatis Infektion verbesserte die Reparatur-Effizienz. Vorangegangene Studien haben außerdem gezeigt, dass C. trachomatis die latente Form von HHV-6 reaktivieren kann. Deshalb unterstützt die genomische Instabilität aufgrund einer Insertion von HHV-6 DR, gefolgt von komprimierter BER während einer C. trachomatis Infektion, zunehmend die Hypothese, dass eine pathogene Infektion ein vermutlicher Auslöser von Eierstockkrebs sein könnte. KW - Chlamydia trachomatis KW - Host Genome Integrity KW - Chlamydia trachomatis KW - Human Herpesvirus 6 KW - Humanes Herpesvirus 6 KW - Eierstockkrebs KW - Molekulargenetik Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162026 ER - TY - THES A1 - Göttlich, Claudia T1 - Etablierung eines humanen 3D Lungentumor-Testsystems zur Analyse von Behandlungseffekten T1 - Establishment of a human 3D lung tumor test system for the analysis of treatment effects N2 - Lungenkrebs ist weltweit für die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache dafür ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht übertragbarer Ergebnisse aus der Präklinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle benötigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, für welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert. In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und für verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl für die Herstellung als auch für die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zunächst beobachtet, dass die Auswerteparameter für die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist. Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. Für die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zunächst bestätigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verstärkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D führt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen über Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage für bioinformatische Vorhersagen für Medikamente. Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die möglicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zunächst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums führen. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgelöst. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine veränderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verstärkt die Basalmembran der Matrix überquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegenüber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer ursprünglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als ursächlich für die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Veränderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Dafür wurden T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer Färbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zusätzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinausschüttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegenüber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem für die Anwendung in der präklinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern. N2 - Lung cancer is the most common cause of cancer related deaths worldwide. One reason for this is that many drugs fail in the clinical application due to inefficient transferability of preclinical results. Consequently, for the development of new treatment strategies tumor models that better reflect the in vivo situation are required. It is of special significance to show for which questions a new test system provides valid results. In the here presented work, a human 3D in vitro lung tumor test system was refined and validated for different interrogations using tissue engineering methods. The generation of the model as well as its treatment were defined in SOPs. First, it was shown that the variance of the analysis parameters was low, demonstrating the 3D model to be suitable as a test system. A comparison of the morphology, the EMT status and the differentiation of the tumor cell lines in the 3D model with tumor biopsies from adenocarcinoma patients revealed that the 3D tumor models exhibit tumor relevant characteristics. The cells on the matrix had a lower proliferation rate compared to the respective 2D culture that better mimic the in vivo situation. For the establishment and validation of the test system, clinically relevant therapies were applied and the results of the treatment in vitro were compared to those in patients. By doing so, it was confirmed that a targeted therapy against the EGFR led to an increased apoptosis induction in the 3D system compared to 2D. This resembles clinical observations, in which EGFR-mutated patients respond to the therapy with tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Next, it was shown for the first time in vitro in the 3D model that the treatment with a HSP90 inhibitor in the context of a KRAS mutation has no clear advantages as observed in patients, but which had been predicted in 2D cell culture. The results from the in vitro model match several clinical studies and emphasize the potential of the 3D lung tumor test system to predict the effect of targeted treatments. By measuring the activation of signal transduction pathways using phospho-arrays and western blots, differences between 2D and 3D after treatment were shown. These provided the basis for bioinformatic drug predictions. With the progress of the disease and the development of invasive tumors that might form metastases, the prognosis of patients worsens. Additionally, patients that initially respond to a therapy with TKIs develop resistances that also lead to the progression of tumor growth. To evaluate the effect of substances in these life-threatening disease stages, the existing test system was enhanced. On the one hand EMT was induced by addition of the growth factor TGF-β1. Here, it was observed that the expression of several EMT- and invasion-associated genes and proteins changed and the cells crossed the basement membrane to a higher extent, especially in the dynamic culture. On the other hand, the development of resistances against TKIs was represented by the generation of resistant subpopulations from an initial sensitive cell line and subsequent culture on the matrix. In the course of this experiment, none of the known mutations could be attributed to the resistance, so that other potential mechanisms were investigated. Here, changes in the signal transduction as well as in the expression of EMT-associated proteins were found. In the last part of the thesis, a new treatment strategy in the field of immune therapies was successfully tested in the 3D model. For that, T cells bearing a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 were added to the tumor cells in static and dynamic culture. The therapy effect was determined by histological staining and apoptosis meas-urement. Moreover, the characteristics of the T cells, such as proliferation or cytokine release, were quantified and exhibited a specific effect of the CAR transduced T cells compared to the control T cells. In summary, in this thesis a human 3D lung tumor test system was established for the application in preclinical testing of cancer drugs as well as for basic research in tumor biology. It was shown that the test system can provide relevant data on biomarker-driven therapies, the treatment of advanced tumor stages and the improvement of new treatment strategies. KW - Tissue Engineering KW - Lungentumor KW - 3D Tumormodell KW - zielgerichtete Therapien KW - Resistenz KW - EMT KW - CAR T-Zelltherapie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164132 ER - TY - JOUR A1 - Harnoš, Jakub A1 - Cañizal, Maria Consuelo Alonso A1 - Jurásek, Miroslav A1 - Kumar, Jitender A1 - Holler, Cornelia A1 - Schambony, Alexandra A1 - Hanáková, Kateřina A1 - Bernatík, Ondřej A1 - Zdráhal, Zbynêk A1 - Gömöryová, Kristína A1 - Gybeľ, Tomáš A1 - Radaszkiewicz, Tomasz Witold A1 - Kravec, Marek A1 - Trantírek, Lukáš A1 - Ryneš, Jan A1 - Dave, Zankruti A1 - Fernández-Llamazares, Ana Iris A1 - Vácha, Robert A1 - Tripsianes, Konstantinos A1 - Hoffmann, Carsten A1 - Bryja, Vítězslav T1 - Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based biosensors reveals a key role of casein kinase 1 JF - Nature Communications N2 - Dishevelled (DVL) is the key component of the Wnt signaling pathway. Currently, DVL conformational dynamics under native conditions is unknown. To overcome this limitation, we develop the Fluorescein Arsenical Hairpin Binder- (FlAsH-) based FRET in vivo approach to study DVL conformation in living cells. Using this single-cell FRET approach, we demonstrate that (i) Wnt ligands induce open DVL conformation, (ii) DVL variants that are predominantly open, show more even subcellular localization and more efficient membrane recruitment by Frizzled (FZD) and (iii) Casein kinase 1 ɛ (CK1ɛ) has a key regulatory function in DVL conformational dynamics. In silico modeling and in vitro biophysical methods explain how CK1ɛ-specific phosphorylation events control DVL conformations via modulation of the PDZ domain and its interaction with DVL C-terminus. In summary, our study describes an experimental tool for DVL conformational sampling in living cells and elucidates the essential regulatory role of CK1ɛ in DVL conformational dynamics. KW - biological techniques KW - cell signalling KW - phosphorylation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227837 VL - 10 ER - TY - JOUR A1 - Heiby, Julia C. A1 - Goretzki, Benedikt A1 - Johnson, Christopher M. A1 - Hellmich, Ute A. A1 - Neuweiler, Hannes T1 - Methionine in a protein hydrophobic core drives tight interactions required for assembly of spider silk JF - Nature Communications N2 - Web spiders connect silk proteins, so-called spidroins, into fibers of extraordinary toughness. The spidroin N-terminal domain (NTD) plays a pivotal role in this process: it polymerizes spidroins through a complex mechanism of dimerization. Here we analyze sequences of spidroin NTDs and find an unusually high content of the amino acid methionine. We simultaneously mutate all methionines present in the hydrophobic core of a spidroin NTD from a nursery web spider’s dragline silk to leucine. The mutated NTD is strongly stabilized and folds at the theoretical speed limit. The structure of the mutant is preserved, yet its ability to dimerize is substantially impaired. We find that side chains of core methionines serve to mobilize the fold, which can thereby access various conformations and adapt the association interface for tight binding. Methionine in a hydrophobic core equips a protein with the capacity to dynamically change shape and thus to optimize its function. KW - Circular dichroism KW - Fluorescence spectroscopy KW - Protein folding KW - Solution-state NMR Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202539 VL - 10 ER - TY - THES A1 - Hell, Dennis T1 - Development of self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system of anti-inflammatory biologicals T1 - Entwicklung von selbstregulierenden Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anti-inflammatorischen Biologikals N2 - The current treatment strategies for diseases are assessed on the basis of diagnosed phenotypic changes due to an accumulation of asymptomatic events in physiological processes. Since a diagnosis can only be established at advanced stages of the disease, mainly due to insufficient early detection possibilities of physiological disorders, doctors are forced to treat diseases rather than prevent them. Therefore, it is desirable to link future therapeutic interventions to the early detection of physiological changes. So-called sensor-effector systems are designed to recognise disease-specific biomarkers and coordinate the production and delivery of therapeutic factors in an autonomous and automated manner. Such approaches and their development are being researched and promoted by the discipline of synthetic biology, among others. Against this background, this paper focuses on the in vitro design of cytokine-neutralizing sensor-effector cells designed for the potential treatment of recurrent autoimmune diseases, especially rheumatoid arthritis. The precise control of inducible gene expression was successfully generated in human cells. At first, a NF-κB-dependent promoter was developed, based on HIV-1 derived DNA-binding motives. The activation of this triggerable promoter was investigated using several inducers including the physiologically important NF-κB inducers tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1 beta (IL-1β). The activation strength of the NF-κB-triggered promoter was doubled by integrating a non-coding RNA. The latter combined expressed RNA structures, which mimic DNA by double stranded RNAs and have been demonstrated to bind to p50 or p65 by previous publications. The sensitivity was investigated for TNFα and IL-1β. The detection limit and the EC50 values were in in the lower picomolar range. Besides the sensitivity, the reversibility and dynamic of the inducible system were characterized. Hereby a close correlation between pulse times and expression profile was shown. The optimized NF-κB-dependent promoter was then coupled to established TNFα- and IL-1-blocking biologicals to develop sensor-effector systems with anti-inflammatory activity, and thus potential use against autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. The biologicals were differentiated between ligand-blocking and receptor-blocking biologicals and different variants were selected: Adalimumab, etanercept and anakinra. The non-coding RNA improved again the activation strength of NF-κB-dependent expressed biologicals, indicating its universal benefit. Furthermore, it was shown that the TNFα-induced expression of NF-κB-regulated TNFα-blocking biologics led to an extracellular negative feedback loop. Interestingly, the integration of the non-coding RNA and this negative feedback loop has increased the dynamics and reversibility of the NF-κB-regulated gene expression. The controllability of drug release can also be extended by the use of inhibitors of classical NF-κB signalling such as TPCA-1. The efficacy of the expressed biologicals was detected through neutralization of the cytokines using different experiments. For future in vivo trials, first alginate encapsulations of the cells were performed. Furthermore, the activation of NF-κB-dependent promoter was demonstrated using co-cultures with human plasma samples or using synovial liquids. With this generated sensor-effector system we have developed self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system for anit-inflammatory biologics. N2 - Die derzeitig üblichen Behandlungsstrategien von Krankheiten werden auf Basis diagnostizierter phänotypischer Veränderungen erhoben, die auf eine Ansammlung asymptomatischer Ereignisse in physiologischen Vorgängen zurückzuführen sind. Da die Feststellung einer Diagnose bislang erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien, vor allem aufgrund unzureichender Früherkennungsmöglichkeiten von physiologischen Störungen, erfolgen kann, sehen sich Ärzte gezwungen, Krankheiten vornehmlich zu behandeln anstatt ihnen vorzubeugen. Daher ist es erstrebenswert, wenn zukünftige therapeutische Interventionen bereits an die Früherkennung von physiologischen Veränderungen gekoppelt werden könnten. Sogenannte Sensor-Effektor Systeme sollen krankheitsspezifische Biomarker erkennen und die Produktion und Bereitstellung von therapeutischen Faktoren in einer selbstständigen und automatisierten Art und Weise koordinieren. Solche Ansätze und deren Entwicklung werden unter anderem durch die Disziplin der synthetischen Biologie erforscht und vorangetrieben. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich vor diesem Hintergrund auf das in vitro Design von Zytokin-neutralisierenden Sensor-Effektor Zellen, die für die potentielle Behandlung wiederkehrender Autoimmunerkrankungen, insbesondere der rheumatoiden Arthritis, konstruiert wurden. Die gezielte Ansteuerung zur induzierbaren Genexpression konnte in humanen Zellen erfolgreich generiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein NF-κB abhängiger Promoter zur induzierbaren Genexpression auf der Grundlage von HIV-1 abgleitenden DNA-Bindemotiven entwickelt. Die Aktivierbarkeit dieses Promoters wurde durch verschiedene Induktoren, insbesondere auch durch die physiologisch wichtigen NF-κB Aktivatoren Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Interleukin 1 beta (IL-1β) überprüft. Die Aktivierungsstärke des NF-κB abhängigen Promoters wurde durch die Integration einer nicht-kodierenden RNA verdoppelt. Diese RNA kombiniert Strukturelemente, die im RNA-Doppelstrang DNA-Strukturen imitieren, und für die in Vorarbeiten die Bindung an p50 oder p65 nachgewiesen werden konnten. Für TNFα und IL-1β lagen das Detektionslimit und die EC50 Werte der NF-κB getriggerten Genexpression im unteren pikomolaren Bereich. Neben der Sensitivität wurde das induzierbare System bezüglich seiner Reversibilität und Dynamik charakterisiert. Dabei konnte eine enge Korrelation zwischen Pulszeiten und Expressionsmustern aufgezeigt werden. Ferner wurde der NF-κB abhängige Promoter an etablierte TNFα- und IL-1-blockierende Biologicals gekoppelt, um Sensor-Effektor Systeme mit anti-entzündlicher Aktivität zu erhalten, die potentiell zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, eingesetzt werden könnten. Bei den Biologicals wurde zwischen Ligand-blockierenden und Rezeptor-blockierenden Biologicals differenziert und unterschiedliche Varianten ausgewählt: Adalimumab, Etanercept und Anakinra. Erneut verbesserte die zusätzliche Integration der nicht-kodierenden RNA die Aktivierungsstärke der NF-κB abhängig exprimierten Biologicals, das die universelle Nutzbarkeit des hier entwickelten optimierten NF-κB-Promoters unterstreicht. Ferner wurde gezeigt, dass die TNFα-induzierte Expression von NF-κB-regulierten TNFα-blockierenden Biologika zu einem extrazellulären negativen Feedback Loop führte. Interessanterweise hat die Integration der nicht-kodierender RNA und dieser negative Feedback Loop die Dynamik und Reversibilität der NF-κB-regulierten Genexpression erhöht. Die Kontrollierbarkeit der Wirkstoffabgabe kann zudem durch den Einsatz von Inhibitoren der klassischen NF-κB-Signalisierung wie z.B. TPCA-1 erweitert werden. Die Wirksamkeit der exprimierten Biologicals wurde durch Neutralisation der Zytokine in verschiedenen Experimenten nachgewiesen. Für zukünftige in vivo Versuche konnten erste Alginat-Verkapselungen der Zellen durchgeführt werden. Die Aktivierbarkeit des NF-κB abhängigen Promoters wurde ferner durch Ko-Kultivierung mit humanen Plasmaproben und Synovialflüssigkeiten nachgewiesen. Mit diesem generierten Sensor-Effektor-System haben wir selbstregulierende Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anit-inflammatorischen Biologikals entwickelt. KW - cell therapy KW - synthetic biology KW - designer cell KW - suppressor cells KW - closed-loop systems KW - autoimmune disease KW - rheumatoid arthritis KW - gene network KW - adalimumab KW - enbrel KW - etanercept KW - anakinra KW - Biologika KW - Autoaggressionskrankheit KW - Cytokine KW - in vitro Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175381 ER -