TY - THES A1 - Potabattula, Ramya Sri Krishna T1 - Male aging and obesity effects on sperm methylome and consequences for the next generation T1 - Alters- und Adipositas-Effekte auf das Spermien-Methylom und die Konsequenzen für die nächste Generation N2 - Besides a growing tendency for delayed parenthood, sedentary lifestyle coupled with overnutrition has dramatically increased worldwide over the last few decades. Epigenetic mechanisms can help us understand the epidemics and heritability of complex traits like obesity to a significant extent. Majority of the research till now has focused on determining the impact of maternal factors on health and disease risk in the offspring(s). This doctoral thesis is focused on deciphering the potential effects of male aging and obesity on sperm methylome, and consequences/transmission via germline to the next generation. In humans, this was assessed in a unique cohort of ~300 sperm samples, collected after in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection, as well as in conceived fetal cord blood samples of the children. Furthermore, aging effect on sperm samples derived from a bovine cohort was analyzed. The study identified that human male aging significantly increased the DNA methylation levels of the promoter, the upstream core element, the 18S, and the 28S regions of ribosomal DNA (rDNA) in sperm. Prediction models were developed to anticipate an individual’s age based on the methylation status of rDNA regions in his sperm. Hypermethylation of alpha satellite and LINE1 repeats in human sperm was also observed with aging. Epimutations, which are aberrantly methylated CpG sites, were significantly higher in sperm of older males compared to the younger ones. These effects on the male germline had a negative impact on embryo quality of the next generation. Consistent with these results, DNA methylation of rDNA regions, bovine alpha satellite, and testis satellite repeats displayed a significant positive correlation with aging sperm samples within the same individual and across different age-grouped bulls. A positive association between human male obesity/body mass index (BMI) and DNA methylation of the imprinted MEG3 gene and the obesity-related HIF3A gene was detected in sperm. These BMI-induced sperm DNA methylation signatures were transmitted to next generation fetal cord blood (FCB) samples in a gender-specific manner. Males, but not female offsprings exhibited a significant positive correlation between father’s BMI and FCB DNA methylation in the two above-mentioned amplicons. Additionally, hypomethylation of IGF2 with increased paternal BMI was observed in female FCB samples. Parental allele-specific in-depth methylation analysis of imprinted genes using next generation sequencing technology also revealed significant correlations between paternal factors like age and BMI, and the corresponding father’s allele DNA methylation in FCB samples. Deep bisulphite sequencing of imprinted genes in diploid somatic cord blood cells of offspring detected that the levels of DNA methylation signatures largely depended on the underlying genetic variant, i.e. sequence haplotypes. Allele-specific epimutations were observed in PEG1, PEG5, MEG3, H19, and IGF2 amplicons. For the former three genes, the non-imprinted unmethylated allele displayed more epimutations than the imprinted methylated allele. On the other hand, for the latter two genes, the imprinted allele exhibited higher epimutation rate than that of the non-imprinted allele. In summary, the present study proved that male aging and obesity impacts the DNA methylome of repetitive elements and imprinted genes respectively in sperm, and also has considerable consequences on the next generation. Nevertheless, longitudinal follow-up studies are highly encouraged to elucidate if these effects can influence the risk of developing abnormal phenotype in the offspring during adulthood. N2 - Weltweit kann ein Trend zur späteren Elternschaft sowie die dramatische Zunahme eines bewegungsarmen Lebensstils in Kombination mit einer Überernährung beobachtet werden. Die Verbreitung sowie die Vererbung derartig komplexer Merkmale oder Erkrankungen lassen sich oftmals unter Berücksichtigung epigenetischer Mechanismen besser verstehen. Vorangegangene Studien untersuchten hierbei jedoch primär den Einfluss maternaler Faktoren auf die Gesundheit und das Krankheitsrisiko der nächsten Generation. Diese Doktorarbeit hat das Ziel potentielle Altersinduzierte sowie Adipositas-bedingte Effekte auf das Methylom von Spermien sowie die damit einhergehenden Konsequenzen für die nächste Generation zu identifizieren. Hierfür stand eine humane Kohorte bestehend aus ~300 Spermienproben, welche nach einer in vitro Fertilisation bzw. Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion gesammelt wurden, und das entsprechende Nabelschnurblut der mit Hilfe dieser Behandlungen gezeugten Kinder zur Verfügung. Ergänzend dazu wurde der Alterseffekt in bovinen Spermienproben analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine signifikante Korrelation des männlichen Alterungsprozesses mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA (rDNA) in der Promotorregion, dem strangaufwärts gelegenen Promotorelement (Upstream Core Element), der 18S- sowie der 28S-Region von Keimzellen aufgezeigt werden. Hierauf basierend wurde ein Vorhersageprogramm entwickelt, welches es ermöglicht anhand des Methylierungslevels der rDNA in den Spermien das Alter des entsprechenden Mannes zu berechnen. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass mit dem Alterungsprozess in Spermien eine Hypermethylierung der Long Interspersed Nuclear Elements (LINE-1) und der Alpha-Satelliten-DNA einhergeht. Des Weiteren zeigte der Vergleich von Spermien alter und junger Männer auf, dass Epimutationen, welche als fehlerhaft methylierte CpG-Stellen definiert werden, signifikant häufiger in Spermien alter Männer detektierbar sind. Allgemein zeigte sich zudem, dass diese altersabhängigen Effekte auf die Keimzellen sich negativ auf die Qualität der Embryonen auswirken. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen konnte auch in Spermien von Rindern dieser Alterseffekt nachgewiesen werden. Es zeigte sich mit zunehmendem Alter eine signifikant erhöhte Methylierung der rDNA-Regionen und der Alpha-/ Testis-Satelliten-DNAs sowohl innerhalb eines Individuums, als auch zwischen verschiedenen altersgruppierten Individuen. Weiterhin konnte eine positive Korrelation des Body-Mass-Index (engl. body mass index; kurz: BMI) eines Mannes und der Methylierung in MEG3 und HIF3A in dessen Spermien detektiert werden. Anhand der untersuchten Nabelschnurblute konnte aufgezeigt werden, dass diese BMI-induzierten Methylierungsveränderungen in einem geschlechter-spezifischen Kontext an die nächste Generation weitergegeben werden. So war ausschließlich bei männlichen Nachkommen eine signifikant positive Assoziation des väterlichen BMIs und der DNA-Methylierung dieser beiden Gene im Nabelschnurblut nachweisbar. Eine mit dem väterlichen BMI einhergehende Hypomethylierung des Gens IGF2 war hingegen ausschließlich in den Nabelschnurblut-Proben weiblicher Nachkommen messbar. Die Auftrennung der Allele nach ihrer parentalen Herkunft, zeigte eine signifikante Korrelation zwischen den paternalen Faktoren, wie Alter und BMI, und dem Methylierungslevel des korrespondierenden paternalen Allels im Nabelschnurblut. Mit Hilfe der Deep Bisulfite Sequenzierung diploider Zellen aus dem Nabelschnurblut der Nachkommen wurde die DNA-Methylierung geprägte Gene untersucht. Hierbei konnte aufgezeigt werden, dass das Methylierungslevel stark von der zu Grunde liegenden genetischen Variante (Haplotyp) abhängt. Allel-spezifische Epimutationen wurden in den untersuchten Amplikons der Gene PEG1, PEG5, MEG3, H19 und IGF2 nachgewiesen. Bei PEG1, PEG5 und MEG3 waren mehr Epimutationen der nicht-geprägten unmethylierten Allele, als der geprägten methylierten Allele detektierbar. Konträr hierzu war bei den Genen H19 und IGF2 eine erhöhte Epimutationsrate der geprägten und somit methylierten Allele nachweisbar. Diese Doktorarbeit offenbart altersinduzierte sowie Adipositas-bedingte Einflüsse auf die DNA-Methylierung repetitiver Elemente und geprägter Gene in männlichen Keimzellen, sowie damit einhergehende potentielle Konsequenzen für die nächste Generation. Um schlussendlich jedoch eine Aussage treffen zu können, ob aufgrund dieser Effekte eine erhöhte Prädisposition der nächsten Generation zur Entwicklung anormaler Phänotypen besteht, müssen longitudinale Folgestudien durchgeführt werden. KW - Paternal age and BMI effects Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165481 ER - TY - JOUR A1 - Pütz, Stephanie M. T1 - Mbt/PAK4 together with SRC modulates N-Cadherin adherens junctions in the developing Drosophila eye JF - Biology Open N2 - Tissue morphogenesis is accompanied by changes of adherens junctions (AJ). During Drosophila eye development, AJ reorganization includes the formation of isolated N-Cadherin AJ between photoreceptors R3/R4. Little is known about how these N-Cadherin AJ are established and maintained. This study focuses on the kinases Mbt/PAK4 and SRC, both known to alter E-Cadherin AJ across phyla. Drosophila p21-activated kinase Mbt and the non-receptor tyrosine kinases Src64 and Src42 regulate proper N-Cadherin AJ. N-Cadherin AJ elongation depends on SRC kinase activity. Cell culture experiments demonstrate binding of both Drosophila SRC isoforms to N-Cadherin and its subsequent tyrosine phosphorylation. In contrast, Mbt stabilizes but does not bind N-Cadherin in vitro. Mbt is required in R3/R4 for zipping the N-Cadherin AJ between these cells, independent of its kinase activity and Cdc42-binding. The mbt phenotype can be reverted by mutations in Src64 and Src42. Because Mbt neither directly binds to SRC proteins nor has a reproducible influence on their kinase activity, the conclusion is that Mbt and SRC signaling converge on N-Cadherin. N-Cadherin AJ formation during eye development requires a proper balance between the promoting effects of Mbt and the inhibiting influences of SRC kinases. KW - Drosophila KW - Eye development KW - p21-activated kinase Mbt/PAK4 KW - Adherens junction Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200898 VL - 8 ER - TY - JOUR A1 - Raheem, Dotsha J. A1 - Tawfike, Ahmed F. A1 - Abdelmohsen, Usama R. A1 - Edrada-Ebel, RuAngelie A1 - Fitzsimmons-Thoss, Vera T1 - Application of metabolomics and molecular networking in investigating the chemical profile and antitrypanosomal activity of British bluebells (\(Hyacinthoides\) \(non-scripta\)) JF - Scientific Reports N2 - Bulb, leaf, scape and flower samples of British bluebells (Hyacinthoides non-scripta) were collected regularly for one growth period. Methanolic extracts of freeze-dried and ground samples showed antitrypanosomal activity, giving more than 50% inhibition, for 20 out of 41 samples. High-resolution mass spectrometry was used in the dereplication of the methanolic extracts of the different plant parts. The results revealed differences in the chemical profile with bulb samples being distinctly different from all aerial parts. High molecular weight metabolites were more abundant in the flowers, shoots and leaves compared to smaller molecular weight ones in the bulbs. The anti-trypanosomal activity of the extracts was linked to the accumulation of high molecular weight compounds, which were matched with saponin glycosides, while triterpenoids and steroids occurred in the inactive extracts. Dereplication studies were employed to identify the significant metabolites via chemotaxonomic filtration and considering their previously reported bioactivities. Molecular networking was implemented to look for similarities in fragmentation patterns between the isolated saponin glycoside at m/z 1445.64 [M + formic-H](-) equivalent to C64H104O33 and the putatively found active metabolite at m/z 1283.58 [M + formic-H](-) corresponding to scillanoside L-1. A combination of metabolomics and bioactivity-guided approaches resulted in the isolation of a norlanostane-type saponin glycoside with antitrypanosoma I activity of 98.9% inhibition at 20 mu M. KW - Drug discovery KW - Metabolomics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-224935 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Requier, Fabrice A1 - Paillet, Yoan A1 - Laroche, Fabienne A1 - Rutschmann, Benjamin A1 - Zhang, Jie A1 - Lombardi, Fabio A1 - Svoboda, Miroslav A1 - Steffan-Dewenter, Ingolf T1 - Contribution of European forests to safeguard wild honeybee populations JF - Conservation Letters N2 - Abstract Recent studies reveal the use of tree cavities by wild honeybee colonies in European forests. This highlights the conservation potential of forests for a highly threatened component of the native entomofauna in Europe, but currently no estimate of potential wild honeybee population sizes exists. Here, we analyzed the tree cavity densities of 106 forest areas across Europe and inferred an expected population size of wild honeybees. Both forest and management types affected the density of tree cavities. Accordingly, we estimated that more than 80,000 wild honeybee colonies could be sustained in European forests. As expected, potential conservation hotspots were identified in unmanaged forests, and, surprisingly, also in other large forest areas across Europe. Our results contribute to the EU policy strategy to halt pollinator declines and reveal the potential of forest areas for the conservation of so far neglected wild honeybee populations in Europe. KW - Apis mellifera KW - Conservation KW - forest management KW - honeybees KW - native populations KW - protected forests KW - tree cavities KW - unmanaged broadleaved forests Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204407 VL - 13 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Reuter, Isabel A1 - Jäckels, Jana A1 - Kneitz, Susanne A1 - Kuper, Jochen A1 - Lesch, Klaus-Peter A1 - Lillesaar, Christina T1 - Fgf3 is crucial for the generation of monoaminergic cerebrospinal fluid contacting cells in zebrafish JF - Biology Open N2 - In most vertebrates, including zebrafish, the hypothalamic serotonergic cerebrospinal fluid-contacting (CSF-c) cells constitute a prominent population. In contrast to the hindbrain serotonergic neurons, little is known about the development and function of these cells. Here, we identify fibroblast growth factor (Fgf)3 as the main Fgf ligand controlling the ontogeny of serotonergic CSF-c cells. We show that fgf3 positively regulates the number of serotonergic CSF-c cells, as well as a subset of dopaminergic and neuroendocrine cells in the posterior hypothalamus via control of proliferation and cell survival. Further, expression of the ETS-domain transcription factor etv5b is downregulated after fgf3 impairment. Previous findings identified etv5b as critical for the proliferation of serotonergic progenitors in the hypothalamus, and therefore we now suggest that Fgf3 acts via etv5b during early development to ultimately control the number of mature serotonergic CSF-c cells. Moreover, our analysis of the developing hypothalamic transcriptome shows that the expression of fgf3 is upregulated upon fgf3 loss-of-function, suggesting activation of a self-compensatory mechanism. Together, these results highlight Fgf3 in a novel context as part of a signalling pathway of critical importance for hypothalamic development. KW - Fgf-signalling KW - Serotonin KW - Dopamine KW - Hypothalamus KW - Central nervous system Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200749 VL - 8 ER - TY - JOUR A1 - Ries, Lena K. A1 - Sander, Bodo A1 - Deol, Kirandeep K. A1 - Letzelter, Marie-Annick A1 - Strieter, Eric Robert A1 - Lorenz, Sonja T1 - Analysis of ubiquitin recognition by the HECT ligase E6AP provides insight into its linkage specificity JF - Journal of Biological Chemistry N2 - Deregulation of the HECT-type ubiquitin ligase E6AP (UBE3A) is implicated in human papilloma virus-induced cervical tumorigenesis and several neurodevelopmental disorders. Yet the structural underpinnings of activity and specificity in this crucial ligase are incompletely understood. Here, we unravel the determinants of ubiquitin recognition by the catalytic domain of E6AP and assign them to particular steps in the catalytic cycle. We identify a functionally critical interface that is specifically required during the initial formation of a thioester-linked intermediate between the C terminus of ubiquitin and the ligase-active site. This interface resembles the one utilized by NEDD4-type enzymes, indicating that it is widely conserved across HECT ligases, independent of their linkage specificities. Moreover, we uncover surface regions in ubiquitin and E6AP, both in the N- and C-terminal portions of the catalytic domain, that are important for the subsequent reaction step of isopeptide bond formation between two ubiquitin molecules. We decipher key elements of linkage specificity, including the C-terminal tail of E6AP and a hydrophilic surface region of ubiquitin in proximity to the acceptor site Lys-48. Intriguingly, mutation of Glu-51, a single residue within this region, permits formation of alternative chain types, thus pointing to a key role of ubiquitin in conferring linkage specificity to E6AP. We speculate that substrate-assisted catalysis, as described previously for certain RING-associated ubiquitin-conjugating enzymes, constitutes a common principle during linkage-specific ubiquitin chain assembly by diverse classes of ubiquitination enzymes, including HECT ligases. KW - ubiquitin KW - ubiquitin ligase KW - ubiquitylation (ubiquitination) KW - post-translational modification KW - enzyme mechanism Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226207 VL - 294 IS - 15 ER - TY - THES A1 - Romanov, Natalie T1 - Characterizing Variation of Protein Complexes and Functional Modules on a Temporal Scale and across Individuals T1 - Charakterisierung der Variation von Proteinkomplexen und funktionellen Modulen im zeitlichen Kontext und zwischen Individuen N2 - A fundamental question in current biology concerns the translational mechanisms leading from genetic variability to phenotypes. Technologies have evolved to the extent that they can efficiently and economically determine an individual’s genomic composition, while at the same time big data on clinical profiles and diagnostics have substantially accumulated. Genome-wide association studies linking genomic loci to certain traits, however, remain limited in their capacity to explain the cellular mechanisms that underlie the given association. For most associations, gene expression has been blamed; yet given that transcript and protein abundance oftentimes do not correlate, that finding does not necessarily decrypt the underlying mechanism. Thus, the integration of further information is crucial to establish a model that could prove more accurate in predicting genotypic effects on the human organism. In this work we describe the so-called proteotype as a feature of the cell that could provide a substantial link between genotype and phenotype. Rather than looking at the proteome as a set of independent molecules, we demonstrate a consistent modular architecture of the proteome that is driven by molecular cooperativity. Functional modules, especially protein complexes, can be further interrogated for differences between individuals and tackled as imprints of genetic and environmental variability. We also show that subtle stoichiometric changes of protein modules could have broader effects on the cellular system, such as the transport of specific molecular cargos. The presented work also delineates to what extent temporal events and processes influence the stoichiometry of protein complexes and functional modules. The re-wiring of the glycolytic pathway for example is illustrated as a potential cause for an increased Warburg effect during the ageing of the human bone marrow. On top of analyzing protein abundances we also interrogate proteome dynamics in terms of stability and solubility transitions during the short temporal progression of the cell cycle. One of our main observations in the thesis encompass the delineation of protein complexes into respective sub-complexes according to distinct stability patterns during the cell cycle. This has never been demonstrated before, and is functionally relevant for our understanding of the dis- and assembly of large protein modules. The insights presented in this work imply that the proteome is more than the sum of its parts, and primarily driven by variability in entire protein ensembles and their cooperative nature. Analyzing protein complexes and functional modules as molecular reflections of genetic and environmental variations could indeed prove to be a stepping stone in closing the gap between genotype and phenotype and customizing clinical treatments in the future. N2 - Eine fundamentale Frage in der heutigen biologischen Forschung ist durch welche Mechanismen eine gebenene genetische Variation sich in einem Phänotyp äußert. Etliche Technologien können heutzutage effizient und ökonomisch die genomische Komposition eines Individuals mit beispielloser Genaugikeit aufschlüsseln. Gleichzeitig gibt es wesentliche Erfolge und Bemühungen, große Datenmengen von Patienten zu sammeln, sowohl klinische Profile, als auch Diagnosen. Es gibt bereits mehrere genomweite Assoziationsstudien, die auf spezifische genomische Loci hinweisen, die womöglich einem bestimmenten phänotypischen Merkmalen zugrunde liegen. Obwohl für die meisten genetischen Assoziationen, eine veränderte Genexpression oftmals als Ursache diskutiert wird, ist dies wahrscheinlich nur ein Teil des zugrundeliegenden Mechanismus. Wir können dies annehmen, da RNA-Transkripte nicht unbedingt mit ihrem Protein-Produkt korrelieren aufgrund von post-transkriptioneller und translationeller Regulation. Um dementsprechend ein Modell zu etablieren, das die genotypischen Effekte auf den human Organismus akkurat vorhersagen kann, ist eine Integration von mehreren zellulären Informationsschichten notwendig. In der folgenden Arbeit beschreiben wir den sogenannten Proteotyp als ein zelluläres Merkmal, das eine substanzielle Verknüpfung zwischen dem Genotyp und dem Phänotyp eines Individuums schaffen könnte. Statt das Proteom als ein Set unabhängiger Moleküle zu betrachten, zeigen wir eine konsistent moduläre Architektur des Proteoms auf, das durch die molekulare Kooperativität zustande kommt. Funktionelle Module, v.a. Proteinkomplexe, können weiters auf Unterschiede zwischen Individuen untersucht werden, sowie deren Variabilität aufgrund genetischer oder umweltbedingter Ursachen. Wir demonstrieren u.a. auch, dass leichte stöchiometrische Veränderungen in solchen Modulen zu weitläufigen Effekten im zellulären Haushalt führen können, z.B. im Transport von spezifischen Molekülen. Die vorgestellte Arbeit beschreibt allerdings auch inwieweit temporäre Ereignisse und Prozesse die Stöchiometrie von Proteinkomplexen und funktionellen Modulen beeinflussen. Wir zeigen z.B. auf, dass eine Veränderung in der glycolytischen Enzym-Stöchiometrie die Ursache für den Warburgeffekt in gealterten Zellen des humanen Knochenmarks darstellen könnte. Neben der Analyse von Protein-Abundanzen untersucht die vorliegende Arbeit Proteomdynamik auch in Hinblick auf Stabilitäts- und Löslichkeitsveränderungen von Proteine in kürzeren Zeitabläufen wie den Zellzyklus. Wir können dabei feststellen, dass Untereinheiten von größeren Proteinkomplexen verschiedene Stabilitätsmuster aufweisen. Dies ist durchaus eine neue Erkennis, die weittragende Folgen für unser Verständnis des Ab- und Aufbauprozesses von Proteinkomplexen haben könnte. Die Einblicke, die aus dieser Arbeit gewonnen werden können, implizieren in jedem Falle, dass das Proteom mehr als die Summe der Einzelteile darstellt, und hauptsächlich durch die Variabilität von gesamten Proteinensembls und deren Kooperativität bestimmt wird. Proteinkomplexe und funktionelle Module sollten daher als molekulare Reflektionen von genetisch- und umweltbedingter Variation betrachtet werden. Solch ein Perspektivenwechsel könnte damit die Möglichkeit bieten eine mechanistische Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp zu gewährleisten, und ein Fundament für zukünftige individuell angepasste klinische Behandlungen darstellen. KW - Proteotype KW - Proteomics Analysis of Complexes Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168139 ER - TY - JOUR A1 - Roth, Nicolas A1 - Doerfler, Inken A1 - Bässler, Claus A1 - Blaschke, Markus A1 - Bussler, Heinz A1 - Gossner, Martin M. A1 - Heideroth, Antje A1 - Thorn, Simon A1 - Weisser, Wolfgang W. A1 - Müller, Jörg T1 - Decadal effects of landscape-wide enrichment of dead wood on saproxylic organisms in beech forests of different historic management intensity JF - Diversity and Distributions N2 - Aim: European temperate forests have lost dead wood and the associated biodiversity owing to intensive management over centuries. Nowadays, some of these forests are being restored by enrichment with dead wood, but mostly only at stand scales. Here, we investigated effects of a seminal dead-wood enrichment strategy on saproxylic organisms at the landscape scale. Location: Temperate European beech forest in southern Germany. Methods: In a before-after control-impact design, we compared assemblages and gamma diversities of saproxylic organisms in strictly protected old-growth forest areas (reserves) and historically moderately and intensively managed forest areas before and a decade after starting a landscape-wide strategy of dead-wood enrichment. Results: Before enrichment with dead wood, the gamma diversity of saproxylic organisms in historically intensively managed forest stands was significantly lower than in reserves and historically moderately managed forest stands; this difference disappeared after 10 years of dead-wood enrichment. The species composition of beetles in forest stands of the three historical management intensities differed before the enrichment strategy, but a decade thereafter, the species compositions of previously intensively logged and forest reserve plots were similar. However, the differences in fungal species composition between historical management categories before and after 10 years of enrichment persisted. Main conclusions: Our results demonstrate that intentional enrichment of dead wood at the landscape scale is a powerful tool for rapidly restoring saproxylic beetle communities and for restoring wood-inhabiting fungal communities, which need longer than a decade for complete restoration. We propose that a strategy of area-wide active restoration combined with some permanent strict refuges is a promising means of promoting the biodiversity of age-long intensively managed Central European beech forests. KW - dead-wood enrichment KW - integrative management strategy KW - land sharing KW - lowland beech forests KW - saproxylic organisms Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227061 VL - 25 IS - 3 ER - TY - THES A1 - Röser [geb. Aßmus], Benjamin T1 - SPRED2 (Sprouty-related EVH1 domain containing 2) reguliert die Autophagie in Kardiomyozyten T1 - SPRED2 (Sprouty-related EVH1 domain containing 2) regulates autophagy in cardiomyocytes N2 - Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs, welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2- defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie, sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2- Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle, sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen der Mitochondrien gekennzeichnet. Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende (E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2- KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5- Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht. Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt. Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der Vesikel in Einklang bringt. Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2- defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt. N2 - The Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) is a MAP kinase signaling inhibitor working downstream of Ras. It has a critical influence on regulating proliferation, differentiation, expression of proteins and cellular hemostasis. The cardiac phenotype of SPRED2 deficient mice not only shows a significant left ventricular hypertrophy but also a hightened fibrosis of the heart tissue. On the cellular level the SPRED2 deficiency is marked by an accumulation of ventricular structures within the cell, as well as a decisive number of vesicles along the longitudinal rows of mitochondria. The aim of this work was to elucidate the properties of these vesicular structures and to determine in which context the subcellularly modified architecture and the hypertrophy of the SPRED2 deficient animals stand to each other. To answer this question, a protein degradation mechanism that could be changed within the SPRED2 deficient cardiomyocytes was identified. Macroautophagy, further called autophagy, is such a degradation mechanism, which degrades long-lived proteins and cell organelles. This work identified significant changes made to the protein level of key regulators of autophagy. The ubiquitin-activating (E1) enzyme homolog Atg7 as well as the cystein protease Atg4B are reduced in the SPRED2 KO. Similarly, Atg16L, which acts as an essential part of the Atg5-Atg12-Atg16 conjugation system in the process of conjugating MAPLC3 to the phospholipid phosphatidylethanolamine. The autophagic flux, as the relation between conjugated and unconjugated MAPLC3, is reduced in the knockout as well. The accumulation of autophagic vesicles is in accordance with the elevated protein levels of the cargo receptors SQSTM1 and NBR1 as well as the lysosomal marker CathepsinD. Besides the reduced autophagic flux there is an elevated protein level of activated caspase-3 as a marker of apoptosis. To further elucidate the mitochondrial integrity, the endogenous levels of reactive oxygen species were determined in wildtype and knockout individuals. It was shown that the SPRED2 knockout contains an elevated level of ROS which could be a sign of reduced mitochondrial survival. Finally, it was investigated whether the disturbed transport of vesicles was due to impaired motor protein efficiency. It was shown that the activity of the dynein ATPase was reduced when SPRED2 was absent. This observation is supported by the elevated levels of the vSNARE protein VTI1b, which connects the accumulation of autophagic vesicles with the reduced ability to membrane fusion and a less efficient transport of vesicles. The experiments of this work were conducted in a global SPRED2-KO system. Possible effects of the changed hormonal situation of the SPRED2 deficient animals to the heart phenotype cannot be excluded. For that reason a conditional SPRED2 knockout mouse line with conditional potential was created capable of further elucidating the effect of a SPRED2 deficiency to the heart. KW - Spred-Proteine KW - Autophagie KW - Herzmuskelzelle KW - Autophagozytose KW - Autophagosom KW - autophagocytosis KW - autophagosome KW - Kardiomyozyt KW - Vesikel KW - Lysosom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182700 ER - TY - THES A1 - Rücker, Christoph T1 - Development of a prevascularized bone implant T1 - Entwicklung eines prävaskularisierten Knochenimplantats N2 - The skeletal system forms the mechanical structure of the body and consists of bone, which is hard connective tissue. The tasks the skeleton and bones take over are of mechanical, metabolic and synthetic nature. Lastly, bones enable the production of blood cells by housing the bone marrow. Bone has a scarless self-healing capacity to a certain degree. Injuries exceeding this capacity caused by trauma, surgical removal of infected or tumoral bone or as a result from treatment-related osteonecrosis, will not heal. Critical size bone defects that will not heal by themselves are still object of comprehensive clinical investigation. The conventional treatments often result in therapies including burdening methods as for example the harvesting of autologous bone material. The aim of this thesis was the creation of a prevascularized bone implant employing minimally invasive methods in order to minimize inconvenience for patients and surgical site morbidity. The basis for the implant was a decellularized, naturally derived vascular scaffold (BioVaSc-TERM®) providing functional vessel structures after reseeding with autologous endothelial cells. The bone compartment was built by the combination of the aforementioned scaffold with synthetic β-tricalcium phosphate. In vitro culture for tissue maturation was performed using bioreactor technology before the testing of the regenerative potential of the implant in large animal experiments in sheep. A tibia defect was treated without the anastomosis of the implant’s innate vasculature to the host’s circulatory system and in a second study, with anastomosis of the vessel system in a mandibular defect. While the non-anastomosed implant revealed a mostly osteoconductive effect, the implants that were anastomosed achieved formation of bony islands evenly distributed over the defect. In order to prepare preconditions for a rapid approval of an implant making use of this vascularization strategy, the manufacturing of the BioVaSc-TERM® as vascularizing scaffold was adjusted to GMP requirements. N2 - Das Skelett bildet die mechanische Struktur des Körpers und besteht aus Knochen, einem harten Bindegewebe. Knochen übernehmen mechanische, metabolische und synthetische Aufgaben. Schlussendlich ermöglichen Knochen die Synthese von Blutzellen durch die Beherbergung des Knochenmarks. Wird die Heilungskapazität von Knochen durch Trauma, operative Entfernung von infiziertem oder tumorösem Knochen oder als Ergebnis behandlungsbedingter Osteonekrose, überschritten, findet keine vollständige Heilung statt. Knochendefekte, die eine kritische Größe überschreiten, sind daher immer noch Gegenstand umfangreicher, klinischer Forschung. Bei herkömmlichen Behandlungsmethoden können Eingriffe notwendig werden, die den Patienten belasten, wie bei der Gewinnung von autologem Knochenmaterial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines prävaskularisierten Implantats unter Verwendung minimalinvasiver Methoden, um die Belastung von Patienten und die Morbidität an der Entnahmestelle, zu verringern. Zur Herstellung eines vaskularisierten Implantats bildete ein dezellularisiertes Darmsegment (Jejunum) porcinen Ursprungs die Grundlage (BioVasc-TERM®). Diese Trägerstruktur stellte ein funktionales Blutgefäßsystem nach Wiederbesiedelung mit autologen Endothelzellen bereit. Der Knochenanteil des Implantats wurde durch die Kombination der genannten Trägerstruktur mit dem synthetischen Knochenersatzmaterial β-Tricalciumphosphat gebildet. In-vitro-Kultivierung in einem Bioreaktor führte zur Reifung des Implantats vor der Testung seines Potenzials zur Knochenregeneration in Großtierversuchen bei Schafen. Ein Tibiadefekt wurde behandelt ohne die Anastomose des implantateigenen Gefäßsystems an den Blutkreislauf und ein Mandibeldefekt wurde mit Gefäßanschluss behandelt. Das Implantat ohne Gefäßanschluss hatte einen osteokonduktiven Effekt, während das anastomosierte Implantat zur Bildung zahlreicher Knocheninseln, gleichmäßig über den Defekt verteilt, führte. Um eine zügige Zulassung eines Implantats, das diese Strategie zur Vaskularisierung von Knochen nutzt, zu ermöglichen, wurde die Herstellung der BioVaSc-TERM® an die Vorgaben der Guten Herstellungspraxis angepasst. KW - Tissue Engineering KW - Knochenregeneration KW - Regenerative Medizin KW - Angiogenese KW - Implantat KW - bone KW - implant KW - Knochenimplantat KW - Vaskularisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178869 ER - TY - THES A1 - Sauer, Mark T1 - Die microRNA-26 Familie kontrolliert über den REST-Komplex ein für die Neurogenese essentielles regulatorisches RNA Netzwerk T1 - The microRNA-26 family controls a regulatory RNA network which is essential for neurogenesis via the REST-complex N2 - In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert. Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt. N2 - The spatio-temporal control of gene expression in a developing multicellular organism is a key determinant for the formation, cellular identity and function of cells. The REST (repressor element silencing transcription factor) complex plays a crucial role in the process of neuronal differentiation and the maintenance of the neuronal status by suppressing neuronal genes which contain a RE1 (repressor element 1) recognition sequence within their promotor region in non-neuronal cells or in neural progenitors. During neuronal differentiation, the REST complex is gradually inactivated, leading to the initiation of a neuronal gene expression program. It is therefore assumed that the regulation of the REST complex is an essential component for the initiation of neurogenesis. Critical effector proteins of the REST complex are small phosphatases (CTDSPs = C-terminal domain small phosphatases), which reduces the polymerase II activity on target genes. In zebrafish it was shown that the REST complex-associated phosphatase ctdsp2 is negatively regulated by miR-26b. All miR-26 family members are evolutionarily conserved in vertebrates and located in introns of Ctdsp genes. Furthermore the miR-26 family members repress their own host genes through an intrinsic autoregulatory negative feedback loop. In this study, a murine embryonic stem cell (ESC) -based neural differentiation paradigm was used as a model system for neurogenesis. To analyze the function of the miR-26 family, the CRISPR/Cas9 technology was employed to generate various miR-26 knockout (KO) ESC lines, with deletions of individual family members and the entire miR-26 family in the genome of ESCs. These miR-26-deficient ESCs retained their pluripotency and did not show altered proliferation, morphology, or cell identity during neural differentiation up to the neural progenitor cell (NPC) stage. However, deletion of the entire miR-26 family as well as of single members disrupted the terminal differentiation and led to a specific developmental arrest at the NPC stage and consequently a strong reduction of neuron and astroglia cell frequencies. Global gene expression analyses in differentiated miR-26-KO ESCs further revealed that genes, which are associated with neurogenesis, neuronal differentiation, but also gliogenesis, were downregulated. The absence of the miR-26 familiy resulted in the selective reduction of a specific set of miRNAs (REST-miRs), which on the one hand suppress the expression of REST complex components and on the other hand are themselves under the transcriptional control of the REST complex. Among others, several miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 and miR-218), which play an important role in various processes of neuronal development, belong to this REST-miR network. Moreover, the miR-26-KO led to the derepression of REST and CTDSP2 protein levels during terminal differentiation. Functional analyses with miRNA mimics showed that increased miR-26 levels resulted in an upregulation of REST-miRs. Further experiments aimed at elucidating the hierarchy of REST-miR regulation revealed that the miR-26 family act upstream to regulate RESTmiR expression and presumably has an initial function in the regulation of this network. Taken together, the data presented in this work suggest that the miR-26 family act as an initiator for the stepwise inactivation of the REST complex during neural differentiation. Therefore, these findings are consistent with the notion that the miR-26 family represents a central regulator for neural progenitor cell differentiation into postmitotic neurons. KW - Neurogenese KW - miR-26 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184008 ER - TY - THES A1 - Sauer, Markus T1 - DHX36 function in RNA G-quadruplex-mediated posttranscriptional gene regulation T1 - Funktion von DHX36 in RNA G-Quadruplex-vermittelter posttranskriptioneller Genregulierung N2 - The expression of genetic information into proteins is a key aspect of life. The efficient and exact regulation of this process is essential for the cell to produce the correct amounts of these effector molecules to a given situation. For this purpose, eukaryotic cells have developed many different levels of transcriptional and posttranscriptional gene regulation. These mechanisms themselves heavily rely on interactions of proteins with associated nucleic acids. In the case of posttranscriptional gene regulation an orchestrated interplay between RNA-binding proteins, messenger RNAs (mRNA), and non-coding RNAs is compulsory to achieve this important function. A pivotal factor hereby are RNA secondary structures. One of the most stable and diverse representatives is the G-quadruplex structure (G4) implicated in many cellular mechanisms, such as mRNA processing and translation. In protein biosynthesis, G4s often act as obstacles but can also assist in this process. However, their presence has to be tightly regulated, a task which is often fulfilled by helicases. One of the best characterized G4-resolving factors is the DEAH-box protein DHX36. The in vitro function of this helicase is extensively described and individual reports aimed to address diverse cellular functions as well. Nevertheless, a comprehensive and systems-wide study on the function of this specific helicase was missing, so far. The here-presented doctoral thesis provides a detailed view on the global cellular function of DHX36. The binding sites of this helicase were defined in a transcriptome-wide manner, a consensus binding motif was deviated, and RNA targets as well as the effect this helicase exerts on them were examined. In human embryonic kidney cells, DHX36 is a mainly cytoplasmic protein preferentially binding to G-rich and G4-forming sequence motifs on more than 4,500 mRNAs. Loss of DHX36 leads to increased target mRNA levels whereas ribosome occupancy on and protein output of these transcripts are reduced. Furthermore, DHX36 knockout leads to higher RNA G4 levels and concomitant stress reactions in the cell. I hypothesize that, upon loss of this helicase, translationally-incompetent structured DHX36 target mRNAs, prone to localize in stress granules, accumulate in the cell. The cell reacts with basal stress to avoid cytotoxic effects produced by these mis-regulated and structured transcripts. N2 - Die Umsetzung genetischer Information in Proteine stellt einen Schlüsselaspekt des Lebens dar. Dabei ist die effiziente und exakte Regulierung dieses Prozesses für die Zelle essentiell, um die korrekte Menge dieser Effektormoleküle in einer gegebenen Situation zu produzieren. Zu diesem Zweck haben eukaryotische Zellen viele verschiedene Ebenen der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation entwickelt. Diese Mechanismen wiederum beruhen insbesondere auf den Interaktionen von Proteinen mit assoziierten Nukleinsäuren. Im Fall der posttranskriptionellen Genregulation ist ein abgestimmtes Wechselspiel zwischen RNA-bindenden Proteinen, Boten-RNAs und nicht-kodierenden RNAs zwingend erforderlich um diese wichtige Funktion zu erfüllen. Ein zentrales Element hierbei bilden RNA-Sekundärstrukturen. Einer der stabilsten und variantenreichsten Vertreter dieser Strukturen ist die G-Quadruplexstruktur (G4), die in vielen zellulären Mechanismen, wie zum Beispiel Prozessierung und Translation der Boten-RNA, involviert ist. Während der Proteinbiosynthese agieren G4s häufig als Hindernisse, können diesen Prozess allerdings auch unterstützen. In beiden Fällen muss deren Präsenz genau reguliert werden, was häufig durch Helikasen erfolgt. Einer der bestcharakterisiertesten, G4-entwindenden Faktoren ist das DEAH-Box Protein DHX36. Die in vitro Funktion dieser Helikase wurde bereits ausführlich beschrieben und einzelne Berichte haben darüber hinaus versucht, ihr verschiedene Funktionen in der Zelle zuzuweisen. Nichtsdestotrotz fehlt bislang eine umfassende und systemweite Studie zur Funktion dieser speziellen Helikase. Die hier präsentierte Doktorarbeit liefert einen detaillierten Blick auf die globale Funktion von DHX36 in der Zelle. Bindestellen dieser Helikase im Transkriptom wurden definiert, ein allgemeines Bindemotiv abgeleitet und RNA-Bindeziele sowie der Effekt, den diese Helikase auf jene ausübt, untersucht. In humanen embryonalen Nierenzellen ist DHX36 ein vorwiegend zytoplasmatisches Protein, das bevorzugt G-reiche und G4-bildende Sequenzmotive auf über 4.500 Boten-RNAs bindet. Verlust von DHX36 führt zu einem erhöhten Level dieser Boten-RNAs in der Zelle, wobei deren Besetzung mit Ribosomen und die damit verbundene Proteinproduktion reduziert ist. Weiterhin führt der Verlust von DHX36 zu einem höheren RNA G4 Level und zu gleichzeitigen Stressreaktionen in der Zelle. Meine Vermutung ist, dass sich bei einem Verlust von DHX36 translationsinkompetente, strukturierte und leicht akkumulierende Ziel-Boten-RNAs in der Zelle anreichern. Die Zelle reagiert darauf mit basalem Stress um zytotoxische Effekte dieser miss-regulierten und strukturierten Transkripte zu vermeiden. KW - RNS KW - Helicasen KW - Genexpression KW - RNA secondary structures KW - G-quadruplex KW - RNA protein interactions Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183954 ER - TY - JOUR A1 - Sauer, Markus A1 - Juranek, Stefan A. A1 - Marks, James A1 - De Magis, Alessio A1 - Kazemier, Hinke G A1 - Hilbig, Daniel A1 - Benhalevy, Daniel A1 - Wang, Xiantao A1 - Hafner, Markus A1 - Paeschke, Katrin T1 - DHX36 prevents the accumulation of translationally inactive mRNAs with G4-structures in untranslated regions JF - Nature Communications N2 - Translation efficiency can be affected by mRNA stability and secondary structures, including G-quadruplex structures (G4s). The highly conserved DEAH-box helicase DHX36/RHAU resolves G4s on DNA and RNA in vitro, however a systems-wide analysis of DHX36 targets and function is lacking. We map globally DHX36 binding to RNA in human cell lines and find it preferentially interacting with G-rich and G4-forming sequences on more than 4500 mRNAs. While DHX36 knockout (KO) results in a significant increase in target mRNA abundance, ribosome occupancy and protein output from these targets decrease, suggesting that they were rendered translationally incompetent. Considering that DHX36 targets, harboring G4s, preferentially localize in stress granules, and that DHX36 KO results in increased SG formation and protein kinase R (PKR/EIF2AK2) phosphorylation, we speculate that DHX36 is involved in resolution of rG4 induced cellular stress. KW - RNA metabolism KW - Translation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227486 VL - 10 IS - 2421 ER - TY - JOUR A1 - Schartl, Manfred A1 - Kneitz, Susanne A1 - Volkoff, Helene A1 - Adolfi, Mateus A1 - Schmidt, Cornelia A1 - Fischer, Petra A1 - Minx, Patrick A1 - Tomlinson, Chad A1 - Meyer, Axel A1 - Warren, Wesley C. T1 - The piranha genome provides molecular insight associated to its unique feeding behavior JF - Genome Biology and Evolution N2 - The piranha enjoys notoriety due to its infamous predatory behavior but much is still not understood about its evolutionary origins and the underlying molecular mechanisms for its unusual feeding biology. We sequenced and assembled the red-bellied piranha (Pygocentrus nattereri) genome to aid future phenotypic and genetic investigations. The assembled draft genome is similar to other related fishes in repeat composition and gene count. Our evaluation of genes under positive selection suggests candidates for adaptations of piranhas’ feeding behavior in neural functions, behavior, and regulation of energy metabolism. In the fasted brain, we find genes differentially expressed that are involved in lipid metabolism and appetite regulation as well as genes that may control the aggression/boldness behavior of hungry piranhas. Our first analysis of the piranha genome offers new insight and resources for the study of piranha biology and for feeding motivation and starvation in other organisms. KW - whole-genome sequencing KW - genome annotation KW - comparative genomics KW - RNA-seq transcriptome KW - energy homeostasis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202218 VL - 11 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Schlegel, Jan A1 - Peters, Simon A1 - Doose, Sören A1 - Schubert-Unkmeir, Alexandra A1 - Sauer, Markus T1 - Super-resolution microscopy reveals local accumulation of plasma membrane gangliosides at Neisseria meningitidis Invasion Sites JF - Frontiers in Cell and Developmental Biology N2 - Neisseria meningitidis (meningococcus) is a Gram-negative bacterium responsible for epidemic meningitis and sepsis worldwide. A critical step in the development of meningitis is the interaction of bacteria with cells forming the blood-cerebrospinal fluid barrier, which requires tight adhesion of the pathogen to highly specialized brain endothelial cells. Two endothelial receptors, CD147 and the β2-adrenergic receptor, have been found to be sequentially recruited by meningococci involving the interaction with type IV pilus. Despite the identification of cellular key players in bacterial adhesion the detailed mechanism of invasion is still poorly understood. Here, we investigated cellular dynamics and mobility of the type IV pilus receptor CD147 upon treatment with pili enriched fractions and specific antibodies directed against two extracellular Ig-like domains in living human brain microvascular endothelial cells. Modulation of CD147 mobility after ligand binding revealed by single-molecule tracking experiments demonstrates receptor activation and indicates plasma membrane rearrangements. Exploiting the binding of Shiga (STxB) and Cholera toxin B (CTxB) subunits to the two native plasma membrane sphingolipids globotriaosylceramide (Gb3) and raft-associated monosialotetrahexosylganglioside GM1, respectively, we investigated their involvement in bacterial invasion by super-resolution microscopy. Structured illumination microscopy (SIM) and direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) unraveled accumulation and coating of meningococci with GM1 upon cellular uptake. Blocking of CTxB binding sites did not impair bacterial adhesion but dramatically reduced bacterial invasion efficiency. In addition, cell cycle arrest in G1 phase induced by serum starvation led to an overall increase of GM1 molecules in the plasma membrane and consequently also in bacterial invasion efficiency. Our results will help to understand downstream signaling events after initial type IV pilus-host cell interactions and thus have general impact on the development of new therapeutics targeting key molecules involved in infection. KW - Neisseria meningitidis KW - sphingolipids KW - gangliosides and lipid rafts KW - super-resolution microscopy KW - single-molecule tracking Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201639 VL - 7 IS - 194 ER - TY - JOUR A1 - Schmidt, Thomas S. B. A1 - Hayward, Matthew R. A1 - Coelho, Luiis P. A1 - Li, Simone S. A1 - Costea, Paul I. A1 - Voigt, Anita Y. A1 - Wirbel, Jakob A1 - Maistrenko, Oleksandr M. A1 - Alves, Renato J. C. A1 - Bergsten, Emma A1 - de Beaufort, Carine A1 - Sobhani, Iradj A1 - Heintz-Buschart, Anna A1 - Sunagawa, Shinichi A1 - Zeller, Georg A1 - Wilmes, Paul A1 - Bork, Peer T1 - Extensive transmission of microbes along the gastrointestinal tract JF - eLife N2 - The gastrointestinal tract is abundantly colonized by microbes, yet the translocation of oral species to the intestine is considered a rare aberrant event, and a hallmark of disease. By studying salivary and fecal microbial strain populations of 310 species in 470 individuals from five countries, we found that transmission to, and subsequent colonization of, the large intestine by oral microbes is common and extensive among healthy individuals. We found evidence for a vast majority of oral species to be transferable, with increased levels of transmission in colorectal cancer and rheumatoid arthritis patients and, more generally, for species described as opportunistic pathogens. This establishes the oral cavity as an endogenous reservoir for gut microbial strains, and oral-fecal transmission as an important process that shapes the gastrointestinal microbiome in health and disease. KW - Colonization KW - Annotation KW - Dynamics KW - Accurate KW - Strains KW - Barrier KW - Health KW - Acids KW - Research Article KW - Computational and Systems Biology KW - Microbiology and Infectious Disease KW - microbiome KW - gastrointestinal tract KW - colorectal cancer KW - rheumatoid arthritis KW - metagenomics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-228954 VL - 8 ER - TY - THES A1 - Schmitt [geb. Wolf], Karen T1 - Studies on the role of platelet serotonin in platelet function, hemostasis, thrombosis and stroke T1 - Studien zur Rolle des Serotonins aus Thrombozyten für die Thrombozytenfunktion, Hämostase, Thrombose und Schlaganfall N2 - Platelet activation and aggregation are important processes in hemostasis resulting in reduction of blood loss upon vessel wall injury. However, platelet activation can lead to thrombotic events causing myocardial infarction and stroke. A more detailed understanding of the regulation of platelet activation and the subsequent formation of thrombi is essential to prevent thrombosis and ischemic stroke. Cations, platelet surface receptors, cytoskeletal rearrangements, activation of the coagulation cas-cade and intracellular signaling molecules are important in platelet activation and thrombus formation. One such important molecule is serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), an indolamine platelet agonist, biochemically derived from tryptophan. 5 HT is secreted from the enterochromaffin cells into the gastrointestinal tract (GI) and blood. Blood borne 5 HT has been proposed to regulate hemostasis by acting as a vaso-constrictor and by triggering platelet signaling through 5 HT2A receptor. Although platelets do not synthetize 5 HT, they take it up from the blood and store it in their dense granules which are secreted upon platelet activation. To identify the molecu-lar composite of the 5 HT uptake system in platelets and elucidate the role of platelet released 5-HT in thrombosis and ischemic stroke, 5 HT transporter knock out mice (5Htt / ) were analyzed in different in vitro and in vivo assays and in a model of is-chemic stroke. In 5Htt / platelets, 5 HT uptake from the blood was completely abol-ished and agonist-induced Ca2+ influx through store operated Ca2+ entry (SOCE), integrin activation, degranulation and aggregation responses to glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) were reduced. These observed in vitro defects in 5Htt / platelets could be normalized by the addition of exogenous 5 HT. Moreover, reduced 5 HT levels in the plasma, an increased bleeding time and the formation of unstable thrombi were observed ex vivo under flow and in vivo in the abdominal aorta and carotid artery of 5Htt / mice. Surprisingly, in the transient middle cerebral artery occlusion model (tMCAO) of ischemic stroke 5Htt / mice showed near-ly normal infarct volumes and a neurological outcome comparable to control mice. Although secreted platelet 5 HT does not appear to play a crucial role in the devel-opment of reperfusion injury after stroke, it is essential to amplify the second phase of platelet activation through SOCE and thus plays an important role in thrombus stabilization. To further investigate the role of cations, granules and their contents and regulation of integrin activation in the process of thrombus formation, genetically modified mice were analyzed in the different in vivo thrombosis models. Whereas Tph1 / mice (lacking the enzyme responsible for the production of 5 HT in the periphery), Trpm7KI (point mu-tation in the kinase domain of Trpm7 channel, lacking kinase activity) and Unc13d / /Nbeal2 / mice (lacking α granules and the release machinery of dense granules) showed a delayed thrombus formation in vivo, MagT1y/ mice (lacking a specific Mg2+ transporter) displayed a pro thrombotic phenotype in vivo. Trpm7fl/fl Pf4Cre (lacking the non specific Mg2+ channel) and RIAM / mice (lacking a potential linker protein in integrin “inside out” signaling) showed no alterations in thrombus formation upon injury of the vessel wall. N2 - Thrombozytenaktivierung und Aggregation sind wichtige Schritte der Hämostase, die zur Reduktion des Blutverlustes bei Gefäßwandverletzung führen. Jedoch kann die Aktivierung von Thrombozyten zur Thrombose führen, wodurch Herzinfarkt und Schlaganfall entstehen kann. Ein besseres Verständnis der Regulierung der Throm-bozytenaktivierung und die darauf folgende Thrombusbildung sind notwendig, um Thrombose und Hirninfarkte zu vermeiden. Kationen, Thrombozy-ten Oberflächenrezeptoren, Zytoskelett Reorganisation, Aktivierung der Koagulati-onskaskade und intrazellulare Signalmoleküle sind wichtig in der Thrombozytenakti-vierung und Thrombusbildung. Solch ein wichtiges Molekül ist Serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), ein Indolamin Thrombozyten-Agonist, welcher aus Tryp-tophan synthetisiert wird. 5 HT wird aus den Enterochromaffinzellen in den Gastroin-testinaltrakt (GI) und das Blut abgegeben. 5 HT aus dem Blut wirkt als Regulator der Hämostase durch die Wirkung als Vasokonstriktor und die Auslösung der Throm-bozyten-Signalwege durch den 5 HT2A Rezeptor. Thrombozyten synthetisieren kein 5 HT, sondern nehmen es aus dem Blut auf und speichern es in den dichten Granu-la, die nach der Thrombozyten-Aktivierung freigesetzt werden. Um die molekulare Zusammensetzung des 5 HT Aufnahmesystems in Thrombozyten zu identifizieren und die Rolle des 5 HT aus Thrombozyten in Thrombose und ischämischem Schlag-anfalls zu klären, wurde eine 5 HT Transporter-defiziente Mauslinie (5Htt / ) in ver-schiedenen in vitro und in vivo Untersuchungen und im Model des ischämischen Schlaganfalls analysiert. In 5Htt / Thrombozyten ist die Aufnahme von 5 HT aus dem Blut vollständig geblockt und Agonisten-induzierter Ca2+ Fluss durch Speicher-abhängigen Ca2+ Einstrom (SOCE), Integrinaktivierung, Degranulierung und Aggre-gation abhängig von Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) waren reduziert. Diese in vitro beobachteten Defekte in 5Htt / Thrombozyten konnten durch Zugabe von 5 HT normalisiert werden. Zudem wurden reduzierte 5 HT Werte im Plasma, eine erhöhte Blutungszeit und die Bildung von instabilen Thromben ex vivo unter Fluss und in vivo in der abdominalen Aorta und der Carotis von 5Htt / Mäusen beobachtet. Überraschenderweise zeigten die 5Htt / Mäuse nach transientem Verschluss der A. cerebri media (tMCAO), einem Modell des ischämi-schen Schlaganfalls, ein normales Infarktvolumen und einen unveränderten neurolo-gischen Endzustand im Vergleich zu Kontrollmäusen. Obwohl sekretiertes 5 HT aus Thrombozyten keine wesentliche Rolle in der Entwicklung eines Reperfusionsscha-dens nach einem Schlaganfall spielt, ist es essentiell in der Verstärkung der zweiten Phase der Thrombozytenaktivierung durch SOCE und spielt eine wichtige Rolle in der Thrombusstabilität. Um die Rolle von Kationen, Granula und deren Bestandteile und der Regulierung in der Integrinaktivierung im Prozess der Thrombusbildung zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse in den verschiedenen in vivo Thrombosemodellen ge-testet. Während Tph1 / Mäuse (denen das Enzym zur Produktion von 5 HT in der Peripherie fehlt), Trpm7KI (Punktmutation in der Kinasedomäne des Trpm7 Kanals, Fehlen der Kinase Aktivität) und Unc13d / /Nbeal2 / Mäuse (denen die α Granula und die Freisetzungsmaschinerie der dichten Granula fehlt) und keine oder eine verlang-samte Thrombusbildung zeigten, wiesen MagT1y/ Mäuse (denen der spezifische Mg2+ Transporter fehlt) einen prothrombotischen Phänotyp auf. Trpm7fl/fl Pf4Cre Mäuse (denen der nicht spezifische Mg2+ Kanal fehlt) und RIAM / Mäuse (denen ein potenti-elles Linker Protein im Integrin “inside out” Signal fehlt) zeigten keine Veränderung in der Thrombus Bildung nach Verletzung der Gefäßwand. KW - Biomedicine KW - Serotonin KW - Blutgerinnung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134711 ER - TY - THES A1 - Schwedhelm, Ivo Peter T1 - A non-invasive microscopy platform for the online monitoring of hiPSC aggregation in suspension cultures in small-scale stirred tank bioreactors T1 - Entwicklung und Etablierung einer Mikroskopieplattform zur zerstörungsfreien Messung der Aggregierung von hiPSCs in kleinmaßstäbigen Bioreaktor-Suspensionskulturen N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large-scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Suspension cul- tures of hiPSCs are characterized by the self-aggregation of single cells into macroscopic cell aggre- gates that increase in size over time. The development of these free-floating aggregates is dependent on the culture vessel and thus represents a novel process parameter that is of particular interest for hiPSC suspension culture scaling. Further, aggregates surpassing a critical size are prone to spon- taneous differentiation or cell viability loss. In this regard, and, for the first time, a hiPSC-specific suspension culture unit was developed that utilizes in situ microscope imaging to monitor and to characterize hiPSC aggregation in one specific CSTR setup to a statistically significant degree while omitting the need for error-prone and time-intensive sampling. For this purpose, a small-scale CSTR system was designed and fabricated by fused deposition modeling (FDM) using an in-house 3D- printer. To provide a suitable cell culture environment for the CSTR system and in situ microscope, a custom-built incubator was constructed to accommodate all culture vessels and process control devices. Prior to manufacture, the CSTR design was characterized in silico for standard engineering parameters such as the specific power input, mixing time, and shear stress using computational fluid dynamics (CFD) simulations. The established computational model was successfully validated by comparing CFD-derived mixing time data to manual measurements. Proof for system functionality was provided in the context of long-term expansion (4 passages) of hiPSCs. Thereby, hiPSC aggregate size development was successfully tracked by in situ imaging of CSTR suspensions and subsequent automated image processing. Further, the suitability of the developed hiPSC culture unit was proven by demonstrating the preservation of CSTR-cultured hiPSC pluripotency on RNA level by qRT-PCR and PluriTest, and on protein level by flow cytometry. N2 - Die Vermehrung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) im Indus- triemaßstab wird durch skalierbare Bioprozesse in aktiv durchmischten Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) ermöglicht. Hierbei zeichnet sich das Wachstum von hiPSCs durch die charakteristische Bildung von sphäroidischen Zellaggregaten aus, deren Durchmesser sich im Laufe der Kultivierung vergrößert. Die Agglomeration von hiPSCs ist sowohl abhängig vom Grad der Durchmischung als auch vom jeweiligen Kulturgefäß, und stellt somit einen wichtigen Prozessparameter dar, welcher während der Prozessskalierung berücksichtigt werden muss. Weiterhin weisen hiPSCs in Aggregaten, welche eine kritische Größe überschreiten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, ihre Pluripotenz zu verlieren oder hinsichtlich ihrer Viabilität beeinträchtigt zu werden. Auf Grundlage dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Plattform für die Durchführung von hiPSCs-Suspensionskulturen en- twickelt, welche die zerstörungsfreie Überwachung des hiPSC-Aggregatwachstums in Echtzeit durch den Einsatz von in situ-Mikroskopie ermöglicht. Neben den eigens entworfenen Bioreaktoren, welche zum Großteil aus 3D-gedruckten Komponenten bestehen, wurde eine Peripherie in Form eines Inkubator-Prototyps entwickelt und konstruiert, welcher die Unterbringung der Bioreaktoren, der Systemkomponenten zur Erzeugung von Zellkulturbedingungen sowie einer in situ-Mikroskop- Spezialanfertigung gewährleistet. Als Ausgangspunkt der Entwicklung des CSTR Systems diente ein Strömungssimulationsmodell, welches dazu verwendet wurde, prozesstechnische Kennzahlen zu er- mitteln um das CSTR System hinsichtlich des spezifischen Leistungseintrags, der Mischzeit und der Scherbelastung zu charakterisieren. Das erstellte Simulationsmodell wurde zudem erfolgreich an- hand eines Messdatenabgleichs der Mischzeit hinsichtlich seiner Aussagekraft validiert. Des Weit- eren wurde die Funktionsfähigkeit des gesamten Systems durch Langzeitversuche belegt. Hierbei wurden hiPSCs in den entwickelten Bioreaktoren über einen Zeitraum von vier Passagen expandiert und das Aggregatwachstum mittels in situ-Mikroskopie in Kombination mit einer automatisierten Bildauswertung beschrieben. Überdies hinaus wurde die Qualität der kultivierten hiPSCs hinsichtlich ihrer Differenzierungskapazität durch den Nachweis von Pluripotenzmarkern auf RNA (qRT-PCR und PluriTest) sowie Proteinebene (Durchflusszytometrie) untersucht. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Mikroskopie KW - Suspensionskultur KW - Aggregation KW - in situ microscopy KW - bioreactor KW - hiPSC aggregation KW - Bioreaktor KW - iPSC Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192989 ER - TY - JOUR A1 - Schwedhelm, Ivo A1 - Zdzieblo, Daniela A1 - Appelt-Menzel, Antje A1 - Berger, Constantin A1 - Schmitz, Tobias A1 - Schuldt, Bernhard A1 - Franke, Andre A1 - Müller, Franz-Josef A1 - Pless, Ole A1 - Schwarz, Thomas A1 - Wiedemann, Philipp A1 - Walles, Heike A1 - Hansmann, Jan T1 - Automated real-time monitoring of human pluripotent stem cell aggregation in stirred tank reactors JF - Scientific Reports N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Innovative monitoring options and emerging automated process control strategies allow for the necessary highly defined culture conditions. Next to standard process characteristics such as oxygen consumption, pH, and metabolite turnover, a reproducible and steady formation of hiPSC aggregates is vital for process scalability. In this regard, we developed a hiPSC-specific suspension culture unit consisting of a fully monitored CSTR system integrated into a custom-designed and fully automated incubator. As a step towards cost-effective hiPSC suspension culture and to pave the way for flexibility at a large scale, we constructed and utilized tailored miniature CSTRs that are largely made from three-dimensional (3D) printed polylactic acid (PLA) filament, which is a low-cost material used in fused deposition modelling. Further, the monitoring tool for hiPSC suspension cultures utilizes in situ microscopic imaging to visualize hiPSC aggregation in real-time to a statistically significant degree while omitting the need for time-intensive sampling. Suitability of our culture unit, especially concerning the developed hiPSC-specific CSTR system, was proven by demonstrating pluripotency of CSTR-cultured hiPSCs at RNA (including PluriTest) and protein level. KW - Biomedical engineering KW - Stem-cell biotechnology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202649 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER -