TY - JOUR A1 - Schlegel, Jan A1 - Peters, Simon A1 - Doose, Sören A1 - Schubert-Unkmeir, Alexandra A1 - Sauer, Markus T1 - Super-resolution microscopy reveals local accumulation of plasma membrane gangliosides at Neisseria meningitidis Invasion Sites JF - Frontiers in Cell and Developmental Biology N2 - Neisseria meningitidis (meningococcus) is a Gram-negative bacterium responsible for epidemic meningitis and sepsis worldwide. A critical step in the development of meningitis is the interaction of bacteria with cells forming the blood-cerebrospinal fluid barrier, which requires tight adhesion of the pathogen to highly specialized brain endothelial cells. Two endothelial receptors, CD147 and the β2-adrenergic receptor, have been found to be sequentially recruited by meningococci involving the interaction with type IV pilus. Despite the identification of cellular key players in bacterial adhesion the detailed mechanism of invasion is still poorly understood. Here, we investigated cellular dynamics and mobility of the type IV pilus receptor CD147 upon treatment with pili enriched fractions and specific antibodies directed against two extracellular Ig-like domains in living human brain microvascular endothelial cells. Modulation of CD147 mobility after ligand binding revealed by single-molecule tracking experiments demonstrates receptor activation and indicates plasma membrane rearrangements. Exploiting the binding of Shiga (STxB) and Cholera toxin B (CTxB) subunits to the two native plasma membrane sphingolipids globotriaosylceramide (Gb3) and raft-associated monosialotetrahexosylganglioside GM1, respectively, we investigated their involvement in bacterial invasion by super-resolution microscopy. Structured illumination microscopy (SIM) and direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) unraveled accumulation and coating of meningococci with GM1 upon cellular uptake. Blocking of CTxB binding sites did not impair bacterial adhesion but dramatically reduced bacterial invasion efficiency. In addition, cell cycle arrest in G1 phase induced by serum starvation led to an overall increase of GM1 molecules in the plasma membrane and consequently also in bacterial invasion efficiency. Our results will help to understand downstream signaling events after initial type IV pilus-host cell interactions and thus have general impact on the development of new therapeutics targeting key molecules involved in infection. KW - Neisseria meningitidis KW - sphingolipids KW - gangliosides and lipid rafts KW - super-resolution microscopy KW - single-molecule tracking Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201639 VL - 7 IS - 194 ER - TY - JOUR A1 - Schmidt, Thomas S. B. A1 - Hayward, Matthew R. A1 - Coelho, Luiis P. A1 - Li, Simone S. A1 - Costea, Paul I. A1 - Voigt, Anita Y. A1 - Wirbel, Jakob A1 - Maistrenko, Oleksandr M. A1 - Alves, Renato J. C. A1 - Bergsten, Emma A1 - de Beaufort, Carine A1 - Sobhani, Iradj A1 - Heintz-Buschart, Anna A1 - Sunagawa, Shinichi A1 - Zeller, Georg A1 - Wilmes, Paul A1 - Bork, Peer T1 - Extensive transmission of microbes along the gastrointestinal tract JF - eLife N2 - The gastrointestinal tract is abundantly colonized by microbes, yet the translocation of oral species to the intestine is considered a rare aberrant event, and a hallmark of disease. By studying salivary and fecal microbial strain populations of 310 species in 470 individuals from five countries, we found that transmission to, and subsequent colonization of, the large intestine by oral microbes is common and extensive among healthy individuals. We found evidence for a vast majority of oral species to be transferable, with increased levels of transmission in colorectal cancer and rheumatoid arthritis patients and, more generally, for species described as opportunistic pathogens. This establishes the oral cavity as an endogenous reservoir for gut microbial strains, and oral-fecal transmission as an important process that shapes the gastrointestinal microbiome in health and disease. KW - Colonization KW - Annotation KW - Dynamics KW - Accurate KW - Strains KW - Barrier KW - Health KW - Acids KW - Research Article KW - Computational and Systems Biology KW - Microbiology and Infectious Disease KW - microbiome KW - gastrointestinal tract KW - colorectal cancer KW - rheumatoid arthritis KW - metagenomics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-228954 VL - 8 ER - TY - THES A1 - Schmitt [geb. Wolf], Karen T1 - Studies on the role of platelet serotonin in platelet function, hemostasis, thrombosis and stroke T1 - Studien zur Rolle des Serotonins aus Thrombozyten für die Thrombozytenfunktion, Hämostase, Thrombose und Schlaganfall N2 - Platelet activation and aggregation are important processes in hemostasis resulting in reduction of blood loss upon vessel wall injury. However, platelet activation can lead to thrombotic events causing myocardial infarction and stroke. A more detailed understanding of the regulation of platelet activation and the subsequent formation of thrombi is essential to prevent thrombosis and ischemic stroke. Cations, platelet surface receptors, cytoskeletal rearrangements, activation of the coagulation cas-cade and intracellular signaling molecules are important in platelet activation and thrombus formation. One such important molecule is serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), an indolamine platelet agonist, biochemically derived from tryptophan. 5 HT is secreted from the enterochromaffin cells into the gastrointestinal tract (GI) and blood. Blood borne 5 HT has been proposed to regulate hemostasis by acting as a vaso-constrictor and by triggering platelet signaling through 5 HT2A receptor. Although platelets do not synthetize 5 HT, they take it up from the blood and store it in their dense granules which are secreted upon platelet activation. To identify the molecu-lar composite of the 5 HT uptake system in platelets and elucidate the role of platelet released 5-HT in thrombosis and ischemic stroke, 5 HT transporter knock out mice (5Htt / ) were analyzed in different in vitro and in vivo assays and in a model of is-chemic stroke. In 5Htt / platelets, 5 HT uptake from the blood was completely abol-ished and agonist-induced Ca2+ influx through store operated Ca2+ entry (SOCE), integrin activation, degranulation and aggregation responses to glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) were reduced. These observed in vitro defects in 5Htt / platelets could be normalized by the addition of exogenous 5 HT. Moreover, reduced 5 HT levels in the plasma, an increased bleeding time and the formation of unstable thrombi were observed ex vivo under flow and in vivo in the abdominal aorta and carotid artery of 5Htt / mice. Surprisingly, in the transient middle cerebral artery occlusion model (tMCAO) of ischemic stroke 5Htt / mice showed near-ly normal infarct volumes and a neurological outcome comparable to control mice. Although secreted platelet 5 HT does not appear to play a crucial role in the devel-opment of reperfusion injury after stroke, it is essential to amplify the second phase of platelet activation through SOCE and thus plays an important role in thrombus stabilization. To further investigate the role of cations, granules and their contents and regulation of integrin activation in the process of thrombus formation, genetically modified mice were analyzed in the different in vivo thrombosis models. Whereas Tph1 / mice (lacking the enzyme responsible for the production of 5 HT in the periphery), Trpm7KI (point mu-tation in the kinase domain of Trpm7 channel, lacking kinase activity) and Unc13d / /Nbeal2 / mice (lacking α granules and the release machinery of dense granules) showed a delayed thrombus formation in vivo, MagT1y/ mice (lacking a specific Mg2+ transporter) displayed a pro thrombotic phenotype in vivo. Trpm7fl/fl Pf4Cre (lacking the non specific Mg2+ channel) and RIAM / mice (lacking a potential linker protein in integrin “inside out” signaling) showed no alterations in thrombus formation upon injury of the vessel wall. N2 - Thrombozytenaktivierung und Aggregation sind wichtige Schritte der Hämostase, die zur Reduktion des Blutverlustes bei Gefäßwandverletzung führen. Jedoch kann die Aktivierung von Thrombozyten zur Thrombose führen, wodurch Herzinfarkt und Schlaganfall entstehen kann. Ein besseres Verständnis der Regulierung der Throm-bozytenaktivierung und die darauf folgende Thrombusbildung sind notwendig, um Thrombose und Hirninfarkte zu vermeiden. Kationen, Thrombozy-ten Oberflächenrezeptoren, Zytoskelett Reorganisation, Aktivierung der Koagulati-onskaskade und intrazellulare Signalmoleküle sind wichtig in der Thrombozytenakti-vierung und Thrombusbildung. Solch ein wichtiges Molekül ist Serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), ein Indolamin Thrombozyten-Agonist, welcher aus Tryp-tophan synthetisiert wird. 5 HT wird aus den Enterochromaffinzellen in den Gastroin-testinaltrakt (GI) und das Blut abgegeben. 5 HT aus dem Blut wirkt als Regulator der Hämostase durch die Wirkung als Vasokonstriktor und die Auslösung der Throm-bozyten-Signalwege durch den 5 HT2A Rezeptor. Thrombozyten synthetisieren kein 5 HT, sondern nehmen es aus dem Blut auf und speichern es in den dichten Granu-la, die nach der Thrombozyten-Aktivierung freigesetzt werden. Um die molekulare Zusammensetzung des 5 HT Aufnahmesystems in Thrombozyten zu identifizieren und die Rolle des 5 HT aus Thrombozyten in Thrombose und ischämischem Schlag-anfalls zu klären, wurde eine 5 HT Transporter-defiziente Mauslinie (5Htt / ) in ver-schiedenen in vitro und in vivo Untersuchungen und im Model des ischämischen Schlaganfalls analysiert. In 5Htt / Thrombozyten ist die Aufnahme von 5 HT aus dem Blut vollständig geblockt und Agonisten-induzierter Ca2+ Fluss durch Speicher-abhängigen Ca2+ Einstrom (SOCE), Integrinaktivierung, Degranulierung und Aggre-gation abhängig von Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) waren reduziert. Diese in vitro beobachteten Defekte in 5Htt / Thrombozyten konnten durch Zugabe von 5 HT normalisiert werden. Zudem wurden reduzierte 5 HT Werte im Plasma, eine erhöhte Blutungszeit und die Bildung von instabilen Thromben ex vivo unter Fluss und in vivo in der abdominalen Aorta und der Carotis von 5Htt / Mäusen beobachtet. Überraschenderweise zeigten die 5Htt / Mäuse nach transientem Verschluss der A. cerebri media (tMCAO), einem Modell des ischämi-schen Schlaganfalls, ein normales Infarktvolumen und einen unveränderten neurolo-gischen Endzustand im Vergleich zu Kontrollmäusen. Obwohl sekretiertes 5 HT aus Thrombozyten keine wesentliche Rolle in der Entwicklung eines Reperfusionsscha-dens nach einem Schlaganfall spielt, ist es essentiell in der Verstärkung der zweiten Phase der Thrombozytenaktivierung durch SOCE und spielt eine wichtige Rolle in der Thrombusstabilität. Um die Rolle von Kationen, Granula und deren Bestandteile und der Regulierung in der Integrinaktivierung im Prozess der Thrombusbildung zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse in den verschiedenen in vivo Thrombosemodellen ge-testet. Während Tph1 / Mäuse (denen das Enzym zur Produktion von 5 HT in der Peripherie fehlt), Trpm7KI (Punktmutation in der Kinasedomäne des Trpm7 Kanals, Fehlen der Kinase Aktivität) und Unc13d / /Nbeal2 / Mäuse (denen die α Granula und die Freisetzungsmaschinerie der dichten Granula fehlt) und keine oder eine verlang-samte Thrombusbildung zeigten, wiesen MagT1y/ Mäuse (denen der spezifische Mg2+ Transporter fehlt) einen prothrombotischen Phänotyp auf. Trpm7fl/fl Pf4Cre Mäuse (denen der nicht spezifische Mg2+ Kanal fehlt) und RIAM / Mäuse (denen ein potenti-elles Linker Protein im Integrin “inside out” Signal fehlt) zeigten keine Veränderung in der Thrombus Bildung nach Verletzung der Gefäßwand. KW - Biomedicine KW - Serotonin KW - Blutgerinnung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134711 ER - TY - JOUR A1 - Schurr, Yvonne A1 - Spindler, Markus A1 - Kurz, Hendrikje A1 - Bender, Markus T1 - The cytoskeletal crosslinking protein MACF1 is dispensable for thrombus formation and hemostasis JF - Scientific Reports N2 - Coordinated reorganization of cytoskeletal structures is critical for key aspects of platelet physiology. While several studies have addressed the role of microtubules and filamentous actin in platelet production and function, the significance of their crosstalk in these processes has been poorly investigated. The microtubule-actin cross-linking factor 1 (MACF1; synonym: Actin cross-linking factor 7, ACF7) is a member of the spectraplakin family, and one of the few proteins expressed in platelets, which possess actin and microtubule binding domains thereby facilitating actin-microtubule interaction and regulation. We used megakaryocyte- and platelet-specific Macf1 knockout (Macf1fl/fl, Pf4-Cre) mice to study the role of MACF1 in platelet production and function. MACF1 deficient mice displayed comparable platelet counts to control mice. Analysis of the platelet cytoskeletal ultrastructure revealed a normal marginal band and actin network. Platelet spreading on fibrinogen was slightly delayed but platelet activation and clot traction was unaffected. Ex vivo thrombus formation and mouse tail bleeding responses were similar between control and mutant mice. These results suggest that MACF1 is dispensable for thrombopoiesis, platelet activation, thrombus formation and the hemostatic function in mice. KW - actin KW - microtubules Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234966 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Schwedhelm, Ivo Peter T1 - A non-invasive microscopy platform for the online monitoring of hiPSC aggregation in suspension cultures in small-scale stirred tank bioreactors T1 - Entwicklung und Etablierung einer Mikroskopieplattform zur zerstörungsfreien Messung der Aggregierung von hiPSCs in kleinmaßstäbigen Bioreaktor-Suspensionskulturen N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large-scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Suspension cul- tures of hiPSCs are characterized by the self-aggregation of single cells into macroscopic cell aggre- gates that increase in size over time. The development of these free-floating aggregates is dependent on the culture vessel and thus represents a novel process parameter that is of particular interest for hiPSC suspension culture scaling. Further, aggregates surpassing a critical size are prone to spon- taneous differentiation or cell viability loss. In this regard, and, for the first time, a hiPSC-specific suspension culture unit was developed that utilizes in situ microscope imaging to monitor and to characterize hiPSC aggregation in one specific CSTR setup to a statistically significant degree while omitting the need for error-prone and time-intensive sampling. For this purpose, a small-scale CSTR system was designed and fabricated by fused deposition modeling (FDM) using an in-house 3D- printer. To provide a suitable cell culture environment for the CSTR system and in situ microscope, a custom-built incubator was constructed to accommodate all culture vessels and process control devices. Prior to manufacture, the CSTR design was characterized in silico for standard engineering parameters such as the specific power input, mixing time, and shear stress using computational fluid dynamics (CFD) simulations. The established computational model was successfully validated by comparing CFD-derived mixing time data to manual measurements. Proof for system functionality was provided in the context of long-term expansion (4 passages) of hiPSCs. Thereby, hiPSC aggregate size development was successfully tracked by in situ imaging of CSTR suspensions and subsequent automated image processing. Further, the suitability of the developed hiPSC culture unit was proven by demonstrating the preservation of CSTR-cultured hiPSC pluripotency on RNA level by qRT-PCR and PluriTest, and on protein level by flow cytometry. N2 - Die Vermehrung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) im Indus- triemaßstab wird durch skalierbare Bioprozesse in aktiv durchmischten Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) ermöglicht. Hierbei zeichnet sich das Wachstum von hiPSCs durch die charakteristische Bildung von sphäroidischen Zellaggregaten aus, deren Durchmesser sich im Laufe der Kultivierung vergrößert. Die Agglomeration von hiPSCs ist sowohl abhängig vom Grad der Durchmischung als auch vom jeweiligen Kulturgefäß, und stellt somit einen wichtigen Prozessparameter dar, welcher während der Prozessskalierung berücksichtigt werden muss. Weiterhin weisen hiPSCs in Aggregaten, welche eine kritische Größe überschreiten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, ihre Pluripotenz zu verlieren oder hinsichtlich ihrer Viabilität beeinträchtigt zu werden. Auf Grundlage dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Plattform für die Durchführung von hiPSCs-Suspensionskulturen en- twickelt, welche die zerstörungsfreie Überwachung des hiPSC-Aggregatwachstums in Echtzeit durch den Einsatz von in situ-Mikroskopie ermöglicht. Neben den eigens entworfenen Bioreaktoren, welche zum Großteil aus 3D-gedruckten Komponenten bestehen, wurde eine Peripherie in Form eines Inkubator-Prototyps entwickelt und konstruiert, welcher die Unterbringung der Bioreaktoren, der Systemkomponenten zur Erzeugung von Zellkulturbedingungen sowie einer in situ-Mikroskop- Spezialanfertigung gewährleistet. Als Ausgangspunkt der Entwicklung des CSTR Systems diente ein Strömungssimulationsmodell, welches dazu verwendet wurde, prozesstechnische Kennzahlen zu er- mitteln um das CSTR System hinsichtlich des spezifischen Leistungseintrags, der Mischzeit und der Scherbelastung zu charakterisieren. Das erstellte Simulationsmodell wurde zudem erfolgreich an- hand eines Messdatenabgleichs der Mischzeit hinsichtlich seiner Aussagekraft validiert. Des Weit- eren wurde die Funktionsfähigkeit des gesamten Systems durch Langzeitversuche belegt. Hierbei wurden hiPSCs in den entwickelten Bioreaktoren über einen Zeitraum von vier Passagen expandiert und das Aggregatwachstum mittels in situ-Mikroskopie in Kombination mit einer automatisierten Bildauswertung beschrieben. Überdies hinaus wurde die Qualität der kultivierten hiPSCs hinsichtlich ihrer Differenzierungskapazität durch den Nachweis von Pluripotenzmarkern auf RNA (qRT-PCR und PluriTest) sowie Proteinebene (Durchflusszytometrie) untersucht. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Mikroskopie KW - Suspensionskultur KW - Aggregation KW - in situ microscopy KW - bioreactor KW - hiPSC aggregation KW - Bioreaktor KW - iPSC Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192989 ER - TY - JOUR A1 - Schwedhelm, Ivo A1 - Zdzieblo, Daniela A1 - Appelt-Menzel, Antje A1 - Berger, Constantin A1 - Schmitz, Tobias A1 - Schuldt, Bernhard A1 - Franke, Andre A1 - Müller, Franz-Josef A1 - Pless, Ole A1 - Schwarz, Thomas A1 - Wiedemann, Philipp A1 - Walles, Heike A1 - Hansmann, Jan T1 - Automated real-time monitoring of human pluripotent stem cell aggregation in stirred tank reactors JF - Scientific Reports N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Innovative monitoring options and emerging automated process control strategies allow for the necessary highly defined culture conditions. Next to standard process characteristics such as oxygen consumption, pH, and metabolite turnover, a reproducible and steady formation of hiPSC aggregates is vital for process scalability. In this regard, we developed a hiPSC-specific suspension culture unit consisting of a fully monitored CSTR system integrated into a custom-designed and fully automated incubator. As a step towards cost-effective hiPSC suspension culture and to pave the way for flexibility at a large scale, we constructed and utilized tailored miniature CSTRs that are largely made from three-dimensional (3D) printed polylactic acid (PLA) filament, which is a low-cost material used in fused deposition modelling. Further, the monitoring tool for hiPSC suspension cultures utilizes in situ microscopic imaging to visualize hiPSC aggregation in real-time to a statistically significant degree while omitting the need for time-intensive sampling. Suitability of our culture unit, especially concerning the developed hiPSC-specific CSTR system, was proven by demonstrating pluripotency of CSTR-cultured hiPSCs at RNA (including PluriTest) and protein level. KW - Biomedical engineering KW - Stem-cell biotechnology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202649 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER - TY - JOUR A1 - Seitz, Nicola A1 - vanEngelsdorp, Dennis A1 - Leonhardt, Sara D. T1 - Conserving bees in destroyed landscapes: The potentials of reclaimed sand mines JF - Global Ecology and Conservation N2 - Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats. KW - bee conservation KW - bee decline KW - habitat restoration KW - land use KW - wild bees KW - ground nesters Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235877 VL - 19 ER - TY - THES A1 - Soares Machado, Jéssica T1 - Dosimetry-based Assessment of Radiation-associated Cancer risk for \(^9\)\(^9\)\(^m\)Tc-MAG3 Scans in Infants and Optimization of Administered Activities for \(^6\)\(^8\)Ga-labelled Peptides in Children and Adolescents T1 - Dosimetrie-basierte Abschätzung des strahlungsassoziierten Krebsrisikos für \(^9\)\(^9\)\(^m\)Tc-MAG3-Scans bei Säuglingen und Optimierung der verabreichten Aktivitäten für \(^6\)\(^8\)Ga-markierte Peptide bei Kindern und Jugendlichen N2 - In 2006, 0.18 Mio pediatric nuclear medicine diagnostic exams were performed worldwide. However, for most of the radiopharmaceuticals used data on biokinetics and, as a consequence on dosimetry, are missing or have not been made publicly available. Therefore, most of the dosimetry assessments presented today for diagnostic agents in children and adolescents rely on the biokinetics data of adults. Even for one of the most common nuclear medicine exams for this patient group, renal scintigraphy with 99mTc-MAG3 for assessing renal function measured data on biokinetics is available only from a study performed on four children of different ages. In particular, renal scans are among the most frequent exams performed on infants and toddlers. Due to the young age, this patient group can be classified as a risk group with a higher probability of developing stochastic radiation effects compared to adults. As there are only limited data on biokinetics and dosimetry in this patient group, the aim of this study is to reassess the dosimetry and the associated radiation risk for a larger number of infants undergoing 99mTc-MAG3 renal scans based on a retrospective analysis of existing patient data. Data were collected retrospectively from 34 patients younger than 20 months with normal (20 patients) and abnormal renal function (14 patients) undergoing 99mTc-MAG3 scans. The patient-specific organ activity was estimated based on a retrospective calibration which was performed based on a set of two 3D-printed infant kidneys (newborns: 8.6 ml; 1-year-old: 23.4 ml) filled with known activities. Both phantoms were scanned at different positions along the anteroposterior axis inside a water phantom, providing depth- and size-dependent attenuation correction factors for planar imaging. Time-activity curves were determined by drawing kidney, bladder, and whole body regions-of-interest for each patient, and subsequently applying the calibration factor for conversion of counts to activity. Patient-specific time-integrated activity coefficients were obtained by integrating the organ-specific time-activity curves. Absorbed and effective dose coefficients for each patient were assessed with OLINDA/EXM for the provided newborn and 1-year-old phantom. Based on absorbed dose values, the radiation risk estimation was performed individually for each of the 34 patients with the National Cancer Institute’s Radiation Risk Assessment Tool. The patients’ organ-specific mean absorbed dose coefficients for the patients with normal renal function were 0.04±0.03 mGy/MBq for the kidneys and 0.27±0.24 mGy/MBq for the bladder. This resulted in a mean effective dose coefficient of 0.02±0.02 mSv/MBq. Based on the dosimetry results, the evaluation of the excess lifetime risk (ELR) for the development of radiation-induced cancer showed that the group of newborns has an ELR of 16.8 per 100,000 persons, which is higher in comparison with the 1-year-old group with an ELR of 14.7 per 100,000 persons. With regard to the 14 patients with abnormal renal function, the mean values for the organ absorbed dose coefficients for the patients were: 0.40±0.34 mGy/MBq for the kidneys and 0.46±0.37 mGy/MBq for the bladder. The corresponding effective dose coefficients (mSv/MBq) was: 0.05±0.02 mSv/MBq. The mean ELR (per 100,000 persons) for developing cancer from radiation exposure for patients with abnormal renal function was 29.2±18.7 per 100,000 persons. As a result, the radiation-associated stochastic risk increases with the organ doses, taking age- and gender-specific influences into account. Overall, the lifetime radiation risk associated with the 99mTc-MAG3 scans is very low in comparison to the general population risk for developing cancer. Furthermore, due to the increasing demand for PET-scans in children and adolescents with 68Ga-labelled peptides, in this work published data sets for those compounds were analyzed to derive recommendations for the administered activities in children and adolescents. The recommendation for the activities to be administered were based on the weight-independent effective dose model, proposed by the EANM Pediatric Dosage Card for application in pediatric nuclear medicine. The aim was to derive recommendations on administered activities for obtaining age-independent effective doses. Consequently, the corresponding weight-dependent effective dose coefficients were rescaled according to the formalism of the EANM dosage card, to determine the radiopharmaceutical class of 68Ga-labeled peptides (“multiples”), and to calculate the baseline activities based on the biokinetics of these compounds and an upper limit of the administered activity of 185 MBq for an adult. Analogous to 18F-fluoride, a minimum activity of 14 MBq is recommended. As a result, for those pediatric nuclear medicine applications involving 68Ga-labeled peptides, new values for the EANM dosage card were proposed and implemented based on the results derived in this work. Overall, despite the low additional radiation-related cancer risk, all efforts should be undertaken to optimize administered activities in children and adolescents for obtaining sufficient diagnostic information with minimal associated radiation risk. N2 - Im Jahr 2006 wurden weltweit 0,18 Mio. nuklearmedizinische Diagnostikuntersuchungen bei Kindern durchgeführt. Für die meisten Radiopharmazeutika fehlen jedoch Daten zur Biokinetik und damit zur Dosimetrie oder diese wurden nicht öffentlich zugänglich gemacht. Daher basieren die meisten der heute vorgestellten Dosimetriedaten für Diagnostika bei Kindern und Jugendlichen auf den biokinetischen Daten von Erwachsenen. Selbst für eine der häufigsten nuklearmedizinischen Untersuchungen für diese Patientengruppe, die Nierenszintigraphie mit 99mTc-MAG3 für Bestimmung der Nierenfunktion, wurden Daten zur Biokinetik bisher nur für vier Kinder unterschiedlichen Alters erhoben. Insbesondere Nierenuntersuchungen gehören zu den häufigsten Untersuchungen bei Säuglingen und Kleinkindern. Aufgrund des jungen Alters kann diese Patientengruppe als Hochrisikogruppe mit einer höheren Wahrscheinlichkeit für das Eintreten stochastischer Strahlenwirkungen im Vergleich zu Erwachsenen eingestuft werden. Da es in dieser Patientengruppe nur begrenzte Daten zur Biokinetik und Dosimetrie gibt, ist das Ziel dieser Arbeit, die Dosimetrie und das damit verbundene Strahlenrisiko für eine größere Anzahl von Kleinkindern, die sich 99mTc-MAG3-Nierenscans unterziehen, auf der Grundlage einer retrospektiven Analyse bestehender Patientendaten neu zu bewerten. Die Daten wurden retrospektiv von 34 Patienten unter 20 Monaten mit normaler (20 Patienten) und eingeschränkter Nierenfunktion (14 Patienten) erhoben, bei denen 99mTc-MAG3-Scans durchgeführt wurden. Die patientenspezifische Organaktivität wurde basierend auf einer retrospektiven Kalibrierung abgeschätzt. Diese Kalibrierung basiert auf einem Satz von zwei 3D-gedruckten Säuglingsnieren, die mit bekannten Aktivitäten gefüllt wurden. Beide Phantome wurden an verschiedenen Positionen entlang der anteroposterioren Achse innerhalb eines Wasserphantoms gescannt und lieferten tiefen- und größenabhängige Schwächungskorrekturfaktoren für die planare Bildgebung. Die Zeit-Aktivitäts-Kurven wurden bestimmt, indem für jeden Patienten Nieren-, Blasen- und Ganzkörperregionen eingezeichnet und anschließend der entsprechende Kalibrierfaktor für die Umwandlung der Zählraten in Aktivität angewendet wurde. Patientenspezifische zeitintegrierte Aktivitätskoeffizienten wurden durch Integration der organspezifischen Zeit-Aktivitätskurven ermittelt. Die Energie- und effektiven Dosiskoeffizienten für jeden Patienten wurden mit OLINDA/EXM für das bereitgestellte Neugeborenen- und 1-Jahres-Phantom ermittelt. Basierend auf diesen Werten für die Energiedosen wurde eine individuelle Abschätzung des Strahlenrisikos für jeden der 34 Patienten mit dem Radiation Risk Assessment Tool des National Cancer Institute durchgeführt. Die organspezifischen mittleren Energiedosiskoeffizienten der Patienten mit normaler Nierenfunktion lagen bei 0,04±0,03 mGy/MBq für die Nieren und 0,27±0,24 mGy/MBq für die Blase, was in einem mittleren effektiven Dosiskoeffizienten von 0,02±0,02 mSv/MBq resultiert. Basierend auf den Ergebnissen der Dosimetrie, zeigte die Auswertung des zusätzlichen Lebenszeitrisikos ("excess lifetime risk", ELR) für die Entwicklung von strahleninduziertem Krebs, dass die Gruppe der Neugeborenen ein ELR von 16,8 pro 100.000 Personen aufweist, was höher ist als das der Gruppe der 1-jährigen mit 14,7 pro 100.000 Personen. Bei den 14 Patienten mit abnormaler Nierenfunktion waren die Mittelwerte für die Koeffizienten der organspezifischen Energiedosen für die Patienten: 0,40±0,34 mGy/MBq für die Nieren; 0,46±0,37 mGy/MBq für die Blase. Der effektivendosiskoeffizienten (mSv/MBq) waren: 0,05±0,02 mSv/MBq. Der mittlere ELR (pro 100.000 Personen) für die Entstehung von Krebs durch die Strahlenexposition von Patienten mit abnormaler Nierenfunktion betrug 29,2±18,7 pro 100.000 Personen. Das mit der Strahlung verbundene stochastische Risiko steigt mit den Organdosen unter Berücksichtigung alters- und geschlechtsspezifischer Einflüsse. Im Allgemeinen ist das mit den 99mTc-MAG3-Scans verbundene lebenslange Strahlenrisiko im Vergleich zum allgemeinen Bevölkerungsrisiko für die Entstehung von Krebs sehr gering. Aufgrund der steigenden Nachfrage nach PET-Scans bei Kindern und Jugendlichen mit 68Ga-markierten Peptiden wurden zusätzlich publizierte Datensätze für diese Verbindungen analysiert, um Empfehlungen für zu verabreichende Aktivitäten bei Kindern und Jugendlichen abzuleiten. Die Dosisberechnungen dazu basierten auf dem Modell einer gewichtsunabhängigen effektiven Dosis, das von der EANM Pediatric Dosage Card für den Einsatz in der pädiatrischen Nuklearmedizin vorgeschlagen wurde. Ziel war es, Empfehlungen zu verabreichenden Aktivitäten so aufzuteilen, dass sich altersunabhängige effektive Dosen ergeben. Dazu wurden die entsprechenden gewichtsabhängigen effektiven Dosiskoeffizienten gemäß dem Formalismus der EANM-Dosierungsempfehlung neu berechnet, um die radiopharmazeutische Klasse der 68Ga-markierten Peptide ("Multiples") zu bestimmen und die Werte für Basisaktivität zu berechnen. Diese basierend auf den Biokinetiken dieser Verbindungen und einer Obergrenze der verabreichten Aktivität von 185 MBq für einen Erwachsenen. Analog zu 18F-Fluorid, wird eine Mindestaktivität von 14 MBq empfohlen. Darauf basierend wurden für die pädiatrischen nuklearmedizinischen Anwendungen mit 68Ga-markierten Peptiden neue Werte für die EANM-Dosierungsempfehlung vorgeschlagen. Insgesamt sollten, trotz des geringen zusätzlichen strahlenbedingten Krebsrisikos, alle Anstrengungen unternommen werden, um die verabreichten Aktivitäten bei Kindern und Jugendlichen zu optimieren, um ausreichende diagnostische Informationen bei minimalem zusätzlichem Strahlenrisiko zu erhalten. KW - Biokinetics KW - Absorbed Doses KW - Risk Assessment KW - Pediatric Patients KW - Dosimetry KW - Nuclear Medicine KW - Pediatric Nuclear Medicine KW - Diagnostic Imaging Exams KW - Radiation Protection KW - Administered Activities KW - Radiation-associated Cancer Risk KW - Ga-68-labelled Peptides KW - Tc-99m-MAG3 Scans Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192640 ER - TY - JOUR A1 - Srivastava, Mugdha A1 - Bencurova, Elena A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Weiss, Esther A1 - Löffler, Jürgen A1 - Dandekar, Thomas T1 - Aspergillus fumigatus challenged by human dendritic cells: metabolic and regulatory pathway responses testify a tight battle JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells which serve as a passage between the innate and the acquired immunity. Aspergillosis is a major lethal condition in immunocompromised patients caused by the adaptable saprophytic fungus Aspergillus fumigatus. The healthy human immune system is capable to ward off A. fumigatus infections however immune-deficient patients are highly vulnerable to invasive aspergillosis. A. fumigatus can persist during infection due to its ability to survive the immune response of human DCs. Therefore, the study of the metabolism specific to the context of infection may allow us to gain insight into the adaptation strategies of both the pathogen and the immune cells. We established a metabolic model of A. fumigatus central metabolism during infection of DCs and calculated the metabolic pathway (elementary modes; EMs). Transcriptome data were used to identify pathways activated when A. fumigatus is challenged with DCs. In particular, amino acid metabolic pathways, alternative carbon metabolic pathways and stress regulating enzymes were found to be active. Metabolic flux modeling identified further active enzymes such as alcohol dehydrogenase, inositol oxygenase and GTP cyclohydrolase participating in different stress responses in A. fumigatus. These were further validated by qRT-PCR from RNA extracted under these different conditions. For DCs, we outlined the activation of metabolic pathways in response to the confrontation with A. fumigatus. We found the fatty acid metabolism plays a crucial role, along with other metabolic changes. The gene expression data and their analysis illuminate additional regulatory pathways activated in the DCs apart from interleukin regulation. In particular, Toll-like receptor signaling, NOD-like receptor signaling and RIG-I-like receptor signaling were active pathways. Moreover, we identified subnetworks and several novel key regulators such as UBC, EGFR, and CUL3 of DCs to be activated in response to A. fumigatus. In conclusion, we analyze the metabolic and regulatory responses of A. fumigatus and DCs when confronted with each other. KW - infection KW - dendritic cells KW - Aspergillus fumigalus KW - metabolic modelling KW - signalling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201368 VL - 9 ER -