TY - THES A1 - Lyutova, Radostina T1 - Functional dissection of recurrent feedback signaling within the mushroom body network of the Drosophila larva T1 - Funktionelle Analyse einer Rückkopplungsschleife innerhalb der Pilzkörper von Drosophila Larven N2 - Behavioral adaptation to environmental changes is crucial for animals’ survival. The prediction of the outcome of one owns action, like finding reward or avoiding punishment, requires recollection of past experiences and comparison with current situation, and adjustment of behavioral responses. The process of memory acquisition is called learning, and the Drosophila larva came up to be an excellent model organism for studying the neural mechanisms of memory formation. In Drosophila, associative memories are formed, stored and expressed in the mushroom bodies. In the last years, great progress has been made in uncovering the anatomical architecture of these brain structures, however there is still a lack of knowledge about the functional connectivity. Dopamine plays essential roles in learning processes, as dopaminergic neurons mediate information about the presence of rewarding and punishing stimuli to the mushroom bodies. In the following work, the function of a newly identified anatomical connection from the mushroom bodies to rewarding dopaminergic neurons was dissected. A recurrent feedback signaling within the neuronal network was analyzed by simultaneous genetic manipulation of the mushroom body Kenyon cells and dopaminergic neurons from the primary protocerebral anterior (pPAM) cluster, and learning assays were performed in order to unravel the impact of the Kenyon cells-to-pPAM neurons feedback loop on larval memory formation. In a substitution learning assay, simultaneous odor exposure paired with optogenetic activation of Kenyon cells in fruit fly larvae in absence of a rewarding stimulus resulted in formation of an appetitive memory, whereas no learning behavior was observed when pPAM neurons were ablated in addition to the KC activation. I argue that the activation of Kenyon cells may induce an internal signal that mimics reward exposure by feedback activation of the rewarding dopaminergic neurons. My data further suggests that the Kenyon cells-to-pPAM communication relies on peptidergic signaling via short neuropeptide F and underlies memory stabilization. N2 - Eine Anpassung des eigenen Verhaltens an Veränderungen der Umwelt ist unerlässlich für das Überleben der Tiere. Vorhersage über die Konsequenzen der eigenen Handlungen, z.B. belohnt oder bestraft zu werden, erfordert den Vergleich von gemachten Erfahrungen und der aktuellen Situation. Eine solche Vorhersage kann zu einer Verhaltensanpassung führen. Der Prozess der Gedächtnisbildung ist auch bekannt als Lernen. Als hervorragender Modellorganismus zum Erforschen der Lernverhaltensmechanismen hat sich die Drosophila Larve etabliert. In Drosophila werden olfaktorische Gedächtnisse in einer bilateralen Struktur des Protozerebrums gespeichert, den Pilzkörpern. In den letzten Jahren sind erhebliche Fortschritte in der Beschreibung der anatomischen Strukturen der Pilzkörper gemacht worden. Allerdings ist die funktionelle Konnektivität dieser Gehirnstrukturen noch unzureichend verstanden. Dopamin spielt eine essentielle Rolle in Lernprozessen. Dopaminerge Neurone vermitteln Informationen über das Vorliegen belohnender oder bestrafender Stimuli. Die Funktion einer vor kurzem beschriebenen anatomischen Verbindung von den Pilzkörpern zu belohnenden dopaminergen pPAM Neuronen wurde in der folgenden Arbeit untersucht, und der rückläufige Signalweg innerhalb des neuronalen Netzwerks wurde mittels simultaner genetischer Manipulation der Pilzkörperneurone, die sog. Kenyon Zellen, und der pPAM Neuronen analysiert. Der Einfluss der Rückkopplungsschleife zwischen Kenyon Zellen und pPAM Neuronen auf das larvale Verhalten wurde durch verschiedene Verhaltensexperimente getestet. In dieser Arbeit wurden Drosophila Larven darauf trainiert, einen Duft mit optogenetischer Aktivierung der Pilzkörper Neurone zu assoziieren. Dabei konnte die Ausbildung eines positiven Gedächtnisses in Abwesenheit einer physischen Belohnung beobachtet werden. Wurden aber zusätzlich die dopaminergen Neurone des pPAM Clusters ablatiert, so zeigten die Larven keine Expression des Gedächtnisses mehr. Meine Daten zeigten, dass die Aktivierung der Kenyon Zellen in einer Aktivierung der dopaminergen Neurone über der Rückkopplungsschleife resultiert, und dementsprechend einen internen Belohnungssignalweg einleitet. Dadurch wird das Vorhandensein einer „echten“ Belohnung nachgeahmt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Rückkopplung von den Kenyon Zellen zu den pPAM Neurone von peptiderger Natur ist. Die Kenyon Zellen exprimieren das Neuropeptid short neuropeptide F, das an Rezeptoren in den pPAM Neurone bindet und das Lernverhalten beeinflusst. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der Rückkopplungsschleife eine Auswirkung auf die Stabilität des positiven Gedächtnisses in Richtung nachhaltiger Erinnerungen hat. KW - Lernen KW - Lernverhalten KW - Gedächtnis KW - Dopamin KW - Drosophila KW - learning KW - memory KW - Drosophila KW - dopamine KW - short neuropeptide F Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187281 ER - TY - THES A1 - Mekala, SubbaRao T1 - Generation of cardiomyocytes from vessel wall-resident stem cells T1 - Erzeugung von Kardiomyozyten aus Gefäßwand-residenten Stammzellen N2 - Myocardial infarction (MI) is a major cause of health problems and is among the leading deadly ending diseases. Accordingly, regenerating functional myocardial tissue and/or cardiac repair by stem cells is one of the most desired aims worldwide. Indeed, the human heart serves as an ideal target for regenerative intervention, because the capacity of the adult myocardium to restore itself after injury or infarct is limited. Thus, identifying new sources of tissue resident adult stem or progenitor cells with cardiovascular potential would help to establish more sophisticated therapies in order to either prevent cardiac failure or to achieve a functional repair. Ongoing research worldwide in this field is focusing on a) induced pluripotent stem (iPS) cells, b) embryonic stem (ES) cells and c) adult stem cells (e. g. mesenchymal stem cells) as well as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, thus far, these efforts did not result in therapeutic strategies that were transferable into the clinical management of MI and heart failure. Hence, identifying endogenous and more cardiac-related sources of stem cells capable of differentiating into mature cardiomyocytes would open promising new therapeutic opportunities. The working hypothesis of this thesis is that the vascular wall serves as a niche for cardiogenic stem cells. In recent years, various groups have identified different types of progenitors or mesenchymal stem cell-like cells in the adventitia and sub-endothelial zone of the adult vessel wall, the so called vessel wall-resident stem cells (VW-SCs). Considering the fact that heart muscle tissue contains blood vessels in very high density, the physiological relevance of VW-SCs for the myocardium can as yet only be assumed. The aim of the present work is to study whether a subset of VW-SCs might have the capacity to differentiate into cardiomyocyte-like cells. This assumption was challenged using adult mouse aorta-derived cells cultivated in different media and treated with selected factors. The presented results reveal the generation of spontaneously beating cardiomyocyte-like cells using specific media conditions without any genetic manipulation. The cells reproducibly started beating at culture days 8-10. Further analyses revealed that in contrast to several publications reporting the Sca-1+ cells as cardiac progenitors the Sca-1- fraction of aortic wall-derived VW-SCs reproducibly delivered beating cells in culture. Similar to mature cardiomyocytes the beating cells developed sarcomeric structures indicated by the typical cross striated staining pattern upon immunofluorescence analysis detecting α-sarcomeric actinin (α-SRA) and electron microscopic analysis. These analyses also showed the formation of sarcoplasmic reticulum which serves as calcium store. Correspondingly, the aortic wall-derived beating cardiomyocyte-like cells (Ao-bCMs) exhibited calcium oscillations. This differentiation seems to be dependent on an inflammatory microenvironment since depletion of VW-SC-derived macrophages by treatment with clodronate liposomes in vitro stopped the generation of Ao bCMs. These locally generated F4/80+ macrophages exhibit high levels of VEGF (vascular endothelial growth factor). To a great majority, VW-SCs were found to be positive for VEGFR-2 and blocking this receptor also stopped the generation VW-SC-derived beating cells in vitro. Furthermore, the treatment of aortic wall-derived cells with the ß-receptor agonist isoproterenol or the antagonist propranolol resulted in a significant increase or decrease of beating frequency. Finally, fluorescently labeled aortic wall-derived cells were implanted into the developing chick embryo heart field where they became positive for α-SRA two days after implantation. The current data strongly suggest that VW-SCs resident in the vascular adventitia deliver both progenitors for an inflammatory microenvironment and beating cells. The present study identifies that the Sca-1- rather than Sca-1+ fraction of mouse aortic wall-derived cells harbors VW-SCs differentiating into cardiomyocyte-like cells and reveals an essential role of VW-SCs-derived inflammatory macrophages and VEGF-signaling in this process. Furthermore, this study demonstrates the cardiogenic capacity of aortic VW-SCs in vivo using a chimeric chick embryonic model. N2 - Der Myokardinfarkt (MI) ist einer der Hauptgründe für gesundheitliche Probleme und zählt zu einer der am häufigsten tödlich verlaufenden Krankheiten weltweit. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Regeneration von funktionellem Myokardgewebe und/oder die kardiale Reparatur durch Stammzellen eines der weltweit am meisten angestrebten Ziele darstellt. Das adulte menschliche Herz stellt aufgrund seiner äußerst eingeschränkten endogenen Regenerationskapazität, die bei weitem nicht ausreicht, das geschädigte Gewebe zu erneuern, ein ideales Zielorgan für regenerative Therapieverfahren dar. Folglich könnte die Identifizierung neuer Quellen adulter Stamm- oder Vorläuferzellen mit kardiovaskulärem Differenzierungspotential dabei helfen, verfeinerte Therapien zu entwickeln, um entweder kardiale Fehlfunktionen zu verhindern oder eine deutlich verbesserte myokardiale Reparatur zu erreichen. Die aktuelle weltweite Forschung auf diesem Gebiet fokussiert sich auf: a) induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), b) embryonale Stammzellen (ES) und c) adulte Stammzellen, wie z. B. mesenchymale Stammzellen, kardiale Fibroblasten und Mesangioblasten sowie Myofibroblasten. Bisher haben jedoch alle Bemühungen noch zu keinem Durchbruch geführt, so dass die teilweise vielversprechenden experimentellen Ergebnisse nicht in die klinische Therapie des MI und der kardialen Defekte mittels Stammzellen transferiert werden können. Abgesehen davon, ob und wie stark so ein endogenes herzeigenes Potential wäre, würde die Identifizierung neuer endogener Stammzellen mit kardiogenem Potential, die genaue Charakterisierung ihrer Nischen und der Mechanismen ihrer Differenzierung einen Meilenstein in der kardioregenerativen Stammzelltherapie darstellen. Die Arbeitshypothese der hier vorgelegten Dissertation besagt, dass die Gefäßwand als Nische solcher Zellen dienen könnte. Innerhalb der letzten Jahre konnte die Adventitia und die subendotheliale Zone der adulten Gefäßwand als Nische für unterschiedliche Typen von Vorläuferzellen und multipotenten Stammzellen, die sogenannten Gefäßwand-residenten Stammzellen (VW-SCs) identifiziert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass die Blutgefäße aufgrund ihrer hohen Dichte im Herzen eine essentielle stromale Komponente des Herzgewebes darstellen, kann die mögliche klinische Relevanz von VW-SCs für das Myokardium im Moment nur erahnt werden. Ausgehend von der Annahme, dass eine Subpopulation dieser VW-SCs die Fähigkeit besitzt, sich in Kardiomyozyten-ähnliche Zellen zu differenzieren, sollte im Rahmen dieser Dissertationsarbeit das myokardiale Potential der Gefäßwand-residenten Stammzellen aus der Aorta adulter Mäuse studiert werden, indem die Zellen unter unterschiedlichen definierten Bedingungen kultiviert und dann sowohl morphologisch als auch funktionell charakterisiert werden. Erstaunlicherweise zeigten die ersten Ergebnisse die Generierung spontan schlagender Kardiomyozyten-ähnlicher Zellen, nur durch Verwendung eines speziellen Nährmediums und ohne jegliche genetische Manipulation. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen belegen zudem, dass die Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen reproduzierbar nach ca. 9-11 Tagen in der Kultur anfangen, spontan zu schlagen. In immunzytochemischen Analysen zeigten die schlagenden Zellen ein quergestreiftes Färbemuster für α sarkomeres Actinin. Passend dazu wiesen diese spontan schlagenden Zellen, wie reife Kardiomyozyten, Sarkomerstrukturen mit Komponenten des sarkoplasmatischen Retikulums in elektronenmikroskopischen Analysen auf. Sie zeigten dementsprechend eine mit dem spontanen Schlag assoziierte Kalzium-Oszillation. Erstaunlicherweise zeigten die hier vorgelegten Befunde erstmalig, dass es nicht die Sca-1+ (stem cell antigen-1) Zellen waren, denen seit Jahren eine kardiomyozytäre Kapazität zugeschrieben wird, sondern es waren die Sca-1- Zellen der Mausaorta, die sich zu den spontan schlagenden Zellen differenzierten. Des Weiteren scheint diese Differenzierung von einer endogen generierten inflammatorischen Mikroumgebung abhängig zu sein. Die hier vorgelegten Ergebnisse legen daher den Schluss nahe, dass die VW-SCs in der vaskulären Adventitia sowohl die inflammatorische Mikroumgebung als auch die spontan schlagenden Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen bereitstellten. So entstanden in der Kultur aortaler Zellen unter anderem auch Makrophagen, die hohe Mengen des Gefäßwachstumsfaktors VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) aufweisen. Wurden die Makrophagen in der Zellkultur durch Zugabe von Clodtronat-Liposomen depletiert, so wurde damit auch die Generierung spontan schlagender Zellen aus den aortalen VW-SCs unterbunden. Um zu testen, ob und inwieweit dieser Einfluss der Makrophagen auf die Entstehung spontan schlagender Zellen aus den VW-SCs auf den VEGF zurückzuführen ist, wurden kultivierte Zellen der Mausaorta mit dem VEGF-Rezeptor-2-Blocker (E7080) behandelt. Auch diese Behandlung resultierte wie bei der Depletion von Makrophagen darin, dass keine spontan schlagenden Zellen entstanden. Um die von VW-SCs generierten spontan schlagenden Zellen funktionell zu charakterisieren, wurden die kultivierten Zellen der Mausaorta mit Isoproterenol (ß-Sympathomimetikum) und Propranolol (ß-Blocker) behandelt. Eine signifikante Steigerung der Schlagfrequenz unter Isoproterenol und eine Reduzierung bei Zugabe von Propranolol unterstreichen ebenfalls die Kardiomyozyten-ähnliche Eigenschaft der spontan schlagenden Zellen. Schließlich wurden die aus der Mausaorta isolierten Zellen Fluoreszenz-markiert und dann in das kardiale Feld des sich entwickelnden Hühnerembryos (am fünften Tag der Entwicklung) implantiert. Zwei Tage später wurden die Herzen entnommen. Immunfärbungen zeigten, dass ein Teil der implantierten Zellen auch unter diesen in vivo-Bedingungen für α-sarkomeres Actinin positiv wurde und somit einen kardiomyozytären Phänotyp aufwies. KW - vessel wall resident stem cells KW - cardiomyocytes KW - Herzmuskelzelle KW - Stammzelle Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146046 N1 - My PhD research work has been published in Circ Res. 2018 Aug 31;123(6):686-699. ER - TY - THES A1 - Kreß, Sebastian T1 - Development and proof of concept of a biological vascularized cell‐based drug delivery system T1 - Entwicklung und Proof of Concept eines biologischen, vaskularisierten, zellbasierten Drug‐Delivery‐Systems N2 - A major therapeutic challenge is the increasing incidence of chronic disorders. The persistent impairment or loss of tissue function requires constitutive on‐demand drug availability optimally achieved by a drug delivery system ideally directly connected to the blood circulation of the patient. However, despite the efforts and achievements in cell‐based therapies and the generation of complex and customized cell‐specific microenvironments, the generation of functional tissue is still unaccomplished. This study demonstrates the capability to generate a vascularized platform technology to potentially overcome the supply restraints for graft development and clinical application with immediate anastomosis to the blood circulation. The ability to decellularize segments of the rat intestine while preserving the ECM for subsequent reendothelialization was proven. The reestablishment of a functional arteriovenous perfusion circuit enabled the supply of co‐cultured cells capable to replace the function of damaged tissue or to serve as a drug delivery system. During in vitro studies, the applicability of the developed miniaturized biological vascularized scaffold (mBioVaSc‐TERM®) was demonstrated. While indicating promising results in short term in vivo studies, long term implantations revealed current limitations for the translation into clinical application. The gained insights will impact further improvements of quality and performance of this promising platform technology for future regenerative therapies. N2 - Eine kontinuierlich steigende Inzidenz chronischer Krankheiten stellt eine immer größer werdende therapeutische Herausforderung dar. Der anhaltende Funktionsverlust von Geweben erfordert die bedarfsgerechte Verfügbarkeit von Wirkstoffen, deren kontinuierliche Bereitstellung und Verteilung über die Blutzirkulation von implantierbaren Pharmakotherapie‐Produkten gelöst werden kann. Trotz der Fortschritte und Erfolge mit Zelltherapien sowie der Nachbildung der Zell‐eigenen Nischen konnten bisher noch keine funktionellen Gewebe für die medizinische Anwendbarkeit hergestellt werden. Diese Studie zeigt die Möglichkeit zur Herstellung einer vaskularisierten Plattform‐ Technologie um die Beschränkung der Nährstoff‐Versorgung zu überwinden für die Entwicklung von Transplantaten für die klinische Anwendung und deren sofortige Anastomose an die Blutzirkulation. Die Möglichkeit Rattendarmsegmente zu dezellularisieren, die Extrazellulärmatrix und das interne Gefäßsystem dabei jedoch zu erhalten um diese Strukturen wiederzubesiedeln wurde bewiesen. Das Wiederherstellen des funktionellen arteriovenösen Perfusionskreislaufs ermöglichte die Versorgung von Ko‐kultivierten Zellen um damit funktionalen Gewebeersatz bzw. ‐modelle aufzubauen oder als Medizin‐ Produkt Einsatz zu finden. In vitro‐Studien zeigten eindrucksvoll Reife und Anwendbarkeit des hier entwickelten miniaturisierten, biologischen, vaskularisierten Scaffold (mBioVaSc‐TERM®). Während in in vivo‐Studien zunächst vielversprechende Ergebnisse erzielt wurden, zeigten Langzeit Implantationen die aktuellen Grenzen zur Translation in die klinische Anwendung. Die gewonnenen Erkenntnisse werden dazu dienen Qualität und Funktionalität dieser vielversprechenden Plattform‐Technologie zu verbessern um zukünftige regenerative Therapien zu ermöglichen. KW - Vaskularisation KW - Dezellularisierung KW - Tissue Engineering KW - Therapeutisches System KW - Implantat KW - Vascularized KW - drug delivery Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178650 ER - TY - THES A1 - Rücker, Christoph T1 - Development of a prevascularized bone implant T1 - Entwicklung eines prävaskularisierten Knochenimplantats N2 - The skeletal system forms the mechanical structure of the body and consists of bone, which is hard connective tissue. The tasks the skeleton and bones take over are of mechanical, metabolic and synthetic nature. Lastly, bones enable the production of blood cells by housing the bone marrow. Bone has a scarless self-healing capacity to a certain degree. Injuries exceeding this capacity caused by trauma, surgical removal of infected or tumoral bone or as a result from treatment-related osteonecrosis, will not heal. Critical size bone defects that will not heal by themselves are still object of comprehensive clinical investigation. The conventional treatments often result in therapies including burdening methods as for example the harvesting of autologous bone material. The aim of this thesis was the creation of a prevascularized bone implant employing minimally invasive methods in order to minimize inconvenience for patients and surgical site morbidity. The basis for the implant was a decellularized, naturally derived vascular scaffold (BioVaSc-TERM®) providing functional vessel structures after reseeding with autologous endothelial cells. The bone compartment was built by the combination of the aforementioned scaffold with synthetic β-tricalcium phosphate. In vitro culture for tissue maturation was performed using bioreactor technology before the testing of the regenerative potential of the implant in large animal experiments in sheep. A tibia defect was treated without the anastomosis of the implant’s innate vasculature to the host’s circulatory system and in a second study, with anastomosis of the vessel system in a mandibular defect. While the non-anastomosed implant revealed a mostly osteoconductive effect, the implants that were anastomosed achieved formation of bony islands evenly distributed over the defect. In order to prepare preconditions for a rapid approval of an implant making use of this vascularization strategy, the manufacturing of the BioVaSc-TERM® as vascularizing scaffold was adjusted to GMP requirements. N2 - Das Skelett bildet die mechanische Struktur des Körpers und besteht aus Knochen, einem harten Bindegewebe. Knochen übernehmen mechanische, metabolische und synthetische Aufgaben. Schlussendlich ermöglichen Knochen die Synthese von Blutzellen durch die Beherbergung des Knochenmarks. Wird die Heilungskapazität von Knochen durch Trauma, operative Entfernung von infiziertem oder tumorösem Knochen oder als Ergebnis behandlungsbedingter Osteonekrose, überschritten, findet keine vollständige Heilung statt. Knochendefekte, die eine kritische Größe überschreiten, sind daher immer noch Gegenstand umfangreicher, klinischer Forschung. Bei herkömmlichen Behandlungsmethoden können Eingriffe notwendig werden, die den Patienten belasten, wie bei der Gewinnung von autologem Knochenmaterial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines prävaskularisierten Implantats unter Verwendung minimalinvasiver Methoden, um die Belastung von Patienten und die Morbidität an der Entnahmestelle, zu verringern. Zur Herstellung eines vaskularisierten Implantats bildete ein dezellularisiertes Darmsegment (Jejunum) porcinen Ursprungs die Grundlage (BioVasc-TERM®). Diese Trägerstruktur stellte ein funktionales Blutgefäßsystem nach Wiederbesiedelung mit autologen Endothelzellen bereit. Der Knochenanteil des Implantats wurde durch die Kombination der genannten Trägerstruktur mit dem synthetischen Knochenersatzmaterial β-Tricalciumphosphat gebildet. In-vitro-Kultivierung in einem Bioreaktor führte zur Reifung des Implantats vor der Testung seines Potenzials zur Knochenregeneration in Großtierversuchen bei Schafen. Ein Tibiadefekt wurde behandelt ohne die Anastomose des implantateigenen Gefäßsystems an den Blutkreislauf und ein Mandibeldefekt wurde mit Gefäßanschluss behandelt. Das Implantat ohne Gefäßanschluss hatte einen osteokonduktiven Effekt, während das anastomosierte Implantat zur Bildung zahlreicher Knocheninseln, gleichmäßig über den Defekt verteilt, führte. Um eine zügige Zulassung eines Implantats, das diese Strategie zur Vaskularisierung von Knochen nutzt, zu ermöglichen, wurde die Herstellung der BioVaSc-TERM® an die Vorgaben der Guten Herstellungspraxis angepasst. KW - Tissue Engineering KW - Knochenregeneration KW - Regenerative Medizin KW - Angiogenese KW - Implantat KW - bone KW - implant KW - Knochenimplantat KW - Vaskularisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178869 ER - TY - THES A1 - Njovu, Henry Kenneth T1 - Patterns and drivers of herbivore diversity and invertebrate herbivory along elevational and land use gradients at Mt. Kilimanjaro, Tanzania T1 - Muster und Determinanten von Herbivorendiversität, von Herbivorieraten durch Invertebraten sowie die Diversität und Gesamtbiomasse von Säugetieren entlang von Höhen- und Landnutzungsgradienten am Kilimandscharo (Tansania) untersucht N2 - This thesis elucidates patterns and drivers of invertebrate herbivory, herbivore diversity, and community-level biomass along elevational and land use gradients at Mt. Kilimanjaro, Tanzania. Chapter I provides background information on the response and predictor variables, study system, and the study design. First, I give an overview of the elevational patterns of species diversity/richness and herbivory published in the literature. The overview illuminates existing debates on elevational patterns of species diversity/richness and herbivory. In connection to these patterns, I also introduce several hypotheses and mechanisms put forward to explain macroecological patterns of species richness. Furthermore, I explain the main variables used to test hypotheses. Finally, I describe the study system and the study design used. Chapter II explores the patterns of invertebrate herbivory and their underlying drivers along extensive elevational and land use gradients on the southern slopes of Mt. Kilimanjaro. I recorded standing leaf herbivory from leaf chewers, leaf miners and gall-inducing insects on 55 study sites located in natural and anthropogenic habitats distributed from 866 to 3060 meters above sea level (m asl) on Mt. Kilimanjaro. Standing leaf herbivory was related to climatic variables [mean annual temperature - (MAT) and mean annual precipitation - (MAP)], net primary productivity (NPP) and plant functional traits (leaf traits) [specific leaf area (SLA), carbon to nitrogen ratio (CN), and nitrogen to phosphorous ratio (NP)]. Results revealed an unimodal pattern of total leaf herbivory along the elevation gradient in natural habitats. Findings also revealed differences in the levels and patterns of herbivory among feeding guilds and between anthropogenic and natural habitats. Changes in NP and CN ratios which were closely linked to NPP were the strongest predictors of leaf herbivory. Our study uncovers the role of leaf nutrient stoichiometry and its linkages to climate in explaining the variation in leaf herbivory along climatic gradients. Chapter III presents patterns and unravels direct and indirect effects of resource (food) abundance (NPP), resource (food) diversity [Functional Dispersion (FDis)], resource quality (SLA, NP, and CN rations), and climate variables (MAT and MAP) on species diversity of phytophagous beetles. Data were collected from 65 study sites located in natural and anthropogenic habitats distributed from 866 to 4550 m asl on the southern slopes of Mt. Kilimanjaro. Sweep net and beating methods were used to collect a total of 3,186 phytophagous beetles representing 21 families and 304 morphospecies. Two groups, weevils (Curculionidae) and leaf beetles (Chrysomelidae) were the largest and most diverse families represented with 898 and 1566 individuals, respectively. Results revealed complex (bimodal) and dissimilar patterns of Chao1-estimated species richness (hereafter referred to as species diversity) along elevation and land use gradients. Results from path analysis showed that temperature and climate-mediated changes in NPP had a significant positive direct and indirect effect on species diversity of phytophagous beetles, respectively. The results also revealed that the effect of NPP (via beetles abundance and diversity of food resources) on species diversity is stronger than that of temperature. Since we found that factors affecting species diversity were intimately linked to climate, I concluded that predicted climatic changes over the coming decades will likely alter the species diversity patterns which we observe today. Chapter IV presents patterns and unravels the direct and indirect effects of climate, NPP and anthropogenic disturbances on species richness and community-level biomass of wild large mammals which represent endothermic organisms and the most important group of vertebrate herbivores. Data were collected from 66 study sites located in natural and anthropogenic habitats distributed from 870 to 4550 m asl on the southern slopes of Mt. Kilimanjaro. Mammals were collected using camera traps and used path analysis to disentangle the direct and indirect effects of climatic variables, NPP, land use, land area, levels of habitat protection and occurrence of domesticated mammals on the patterns of richness and community-level biomass of wild mammals, respectively. Results showed unimodal patterns for species richness and community-level biomass of wild mammals along elevation gradients and that the patterns differed depending on the type of feeding guild. Findings from path analysis showed that net primary productivity and levels of habitat protection had a strong direct effect on species richness and community-level biomass of wild mammals whereas temperature had an insignificant direct effect. Findings show the importance of climate-mediated food resources in determining patterns of species richness of large mammals. While temperature is among key predictors of species richness in several ectotherms, its direct influence in determining species richness of wild mammals was insignificant. Findings show the sensitivity of wild mammals to anthropogenic influences and underscore the importance of protected areas in conserving biodiversity. In conclusion, despite a multitude of data sets on species diversity and ecosystem functions along broad climatic gradients, there is little mechanistic understanding of the underlying causes. Findings obtained in the three studies illustrate their contribution to the scientific debates on the mechanisms underlying patterns of herbivory and diversity along elevation gradients. Results present strong evidence that plant functional traits play a key role in determining invertebrate herbivory and species diversity along elevation gradients and that, their strong interdependence with climate and anthropogenic activities will shape these patterns in future. Additionally, findings from path analysis demonstrated that herbivore diversity, community-level biomass, and herbivory are strongly influenced by climate (either directly or indirectly). Therefore, the predicted climatic changes are expected to dictate ecological patterns, biotic interactions, and energy and nutrient fluxes in terrestrial ecosystems in the coming decades with stronger impacts probably occurring in natural ecosystems. Furthermore, findings demonstrated the significance of land use effects in shaping ecological patterns. As anthropogenic pressure is advancing towards more pristine higher elevations, I advocate conservation measures which are responsive to and incorporate human dimensions to curb the situation. Although our findings emanate from observational studies which have to take several confounding factors into account, we have managed to demonstrate global change responses in real ecosystems and fully established organisms with a wide range of interactions which are unlikely to be captured in artificial experiments. Nonetheless, I recommend additional experimental studies addressing the effect of top-down control by natural enemies on herbivore diversity and invertebrate herbivory in order to deepen our understanding of the mechanisms driving macroecological patterns along elevation gradients.   N2 - In dieser Dissertation werden Muster und Determinanten von Herbivorendiversität, von Herbivorieraten durch Invertebraten sowie die Diversität und Gesamtbiomasse von Säugetieren entlang von Höhen- und Landnutzungsgradienten am Kilimandscharo (Tansania) untersucht. Kapitel I liefert Hintergrundinformationen zu den betrachteten Variablen, dem Untersuchungssystem und dem generellen Studiendesign: Zuerst fasse ich den aktuellen Kenntnisstand über die Muster des Artenreichtums und der Herbivorie entlang von Höhengradienten zusammen und erläutere in diesem Zusammenhang verschiedene Hypothesen, die zur Erklärung von Gradienten des Artenreichtum herangezogen werden. Ich erkläutere verschiedene Variablen, die zum Testen dieser Hypothesen erhoben wurden und stelle dar, wie diese den Artenreichtum, die Herbivorieraten und die Biomasse beeinflussen könnten. Anschließend beschreibe ich das Untersuchungssystem, sowie das generelle Design der Studie. In Kapitel II werden die Muster und Determinanten der Invertebratenherbivorie entlang von Höhen- und Landnutzungsgradienten an den südlichen Hängen des Kilimandscharos präsentiert. Auf insgesamt 55 Untersuchungsflächen, die sowohl natürliche als auch anthropogen genutzte Habitate am Kilimandscharo in Höhenlagen zwischen 866 und 3060 Meter über Normalnull (m ü. NN) umfassten, wurden die Herbivorieraten ektophager, minierender und gallbildener Insekten an Blättern erfasst. Die Blattherbivorie war sowohl mit klimatischen Variablen [Jahresmitteltemperatur und mittlere Jahresniederschlagsmenge], der Nettoprimärproduktivität (NPP) und mit funktionellen Blattmerkmalen von Pflanzen [spezifische Blattfläche (SLA), Kohlenstoff (C) / Stickstoff (N)-Verhältnis, sowie N / Phosphor (P)-Verhältnis] assoziiert. Die Gesamtherbivorie zeigte eine unimodale Verteilung über den Höhengradienten, wurde aber sowohl von der Herbivorengilde, als auch vom Habitattyp (natürlich versus anthropogen) beeinflusst. Das C/N-Verhältnis von Blättern war die stärkste Determinante der Blattherbivorie und wurde selbst stark durch die NPP bestimmt. Herbivorieraten sanken mit steigendem C/N-Verhältnis. Das C/N Verhältnis nahm mit steigender NPP zu.- Letztere konnte fast vollständig durch Änderungen der mittleren Jahrestemperatur (MAT) und des Jahresniederschlags (MAP) entlang des Höhengradienten erklärt werden. Damit zeigt unsere Studie, dass sich durch klimatische Faktoren und Energie, welche ihrerseits die Blattchemie beeinflussen und so Variationen in der Blattherbivorie entlang großer Klimagradienten ergeben. In Kapitel III werden die Muster im Artenreichtum phytophager Käfer entlang der Höhen- und Landnutzungsgradienten untersucht und die direkten und indirekten Effekte von klimatischen Faktoren (MAT, MAP), NPP und funktionellen Pflanzenmerkmalen (funktionelle Dispersion, SLA, C/N - und N/P - Verhältnisse) auf diese Muster analysiert. Die entsprechenden Daten wurden auf 65 Untersuchungsflächen, die sowohl natürliche als auch anthropogene Habitate entlang eines Höhengradienten am Kilimandscharo von 866 bis 4550 m ü. NN abdeckten, erhoben. Mittels Kescher wurden insgesamt 3186 phytophage Käfer aus 21 Familien gesammelt und in 304 Morphospezies eingeteilt. Der Artenreichtum phytophager Käfer zeigte eine komplexe, zweigipflige Verteilung entlang der Höhen- und Landnutzungsgradienten. Eine Pfadanalyse ergab, dass sowohl die MAT, als auch NPP positiven direkte bzw. indirekte Effekt auf die Artendiversität phytophager Käfer hatte. Die NPP war positiv mit der funktionellen Dispersion von Blattmerkmalen, ein Maß für die Diversität der Nahrungsressourcen, korreliert. Letztere hatte einen positiven Effekt auf die Diversität der Käfer. Die starken direkten und indirekten Effekte von Klima auf die Diversität und Abundanz von phytophagen Käfern, lassen vermuten dass der Klimawandel in den nächsten Dekaden großen Änderungen der Struktur von phytophagen Käfergemeinschaften bewirken wird. In Kapitel IV untersuchen wir den Effekt von Klima, NPP und anthropogener Störung auf den Artenreichtum und die Gesamtbiomasse von Großwild. Dazu wurden auf 66 Untersuchungsflächen, welche natürliche und anthropogene Habitate in Höhenstufen zwischen 870 und 4550m ü. NN umfassten, Daten zum Artenreichtum un der Abundanz von Großwild mittels Kamerafallen erfasst. Mittels einer Pfadanalyse wurden die direkten und indirekten Effekte von klimatischen Variablen, NPP, Landnutzung, Größe und Schutzstatus der Flächen, sowie der Präsenz von domestizierten Säugetieren auf den Artenreichtum und die Biomasse von Großwild untersucht. Artenreichtum und Gesamtbiomasse dieser endothermen Organismen zeigten eine unimodale Verteilung über den Höhengradienten. Verschiedene Nahrungsgilden zeigten unterschiedliche Muster. Es konnte gezeigt werden, dass NPP und der Schutzstatus der Fläche, aber nicht die Temperatur einen direkten, positiven Einfluss auf den Artenreichtum und die Gesamtbiomasse des Großwildes hatte. Die vom Klima abhängige Nahrungsressourcenverfügbarkeit ist also eine wichtige Determinante im Artenreichtum von Großwild. Die Temperatur hingegen, die den Artenreichtum verschiedener ektothermer Organismen entscheidend prägt, hatte keinen direkten Einfluss auf den Artenreichtum des Großwildes Dafür reagiert das Großwild besonders sensibel auf anthropogene Einflüsse, was wiederum die Wichtigkeit von Schutzgebieten unterstreicht. Obwohl die Muster im Artenreichtum und in Ökosystemfunktionen entlang großer klimatischer Gradienten bereits gut dokumentiert sind, ist das Wissen über die zu Grunde liegenden Prozesse nach wie vor unzureichend. Mit meinen drei Studien über die Muster und Determinanten der Herbivorendiversität, der Herbivorieraten und der Großwildbiomasse trage ich somit zur Verbesserung des mechanistischen Verständnisses solcher makroökologischer Muster bei. Wie die Pfadanalysen zeigten, wurden sowohl der Artenreichtum die Biomasse als auch ökologische Prozesse direkt oder indirekt vom Klima beeinflusst. Es ist somit zu erwarten, dass der vorhergesagte Klimawandel ökologische Muster, biotische Interaktionen, Energie- und Nährstoffkreisläufe in terrestrischen Ökosystemen wesentlich umstrukturieren wird, wobei natürliche Systeme wahrscheinlich besonders sensibel auf den Klimawandel reagieren werden. Meine Ergebnisse demonstrieren auch den Einfluss von Landnutzung auf Artenreichtum und ökologische Prozesse. Da der anthropogene Druck auf die natürlichen Ökosysteme des Kilimandscharos immer weiter zunimmt, sollten objektive Biodiversitätsmaße implementiert werden mit denen man Veränderungen in den Ökosystemen und in Ökosystemldienstleistungen schnell detektieren kann. Meine Ergebnisse basieren auf Beobachtungsdaten, die von bestimmten Nebenfaktoren im Feld beeinflusst werden können. Dennoch ist es mir gelungen mit korrelativen Methoden, Organismen in ihrem biotischen und abiotischen Interaktionsumfeld zu untersuchen – ein Szenario, welches in einem rein experimentellen Aufbau in dieser Form wahrscheinlich nicht geschaffen werden kann. Über weiterführende Experimente könnte jedoch zum Beispiel der Einfluss von Prädatoren auf die Herbivorendiversität und Herbivorieraten quantifiziert werden, welches unser Verständnis über die Determinanten makroökologischer Muster noch vertiefen würde.   KW - Species richness KW - Invertebrate herbivory KW - Leaf traits KW - drivers and patterns of diversity and herbivory KW - Patterns and drivers of invertebrate herbivory KW - Patterns and drivers of species diversity of phytophagous beetles KW - Patterns and drivers of species richness and community biomass of large mammals Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172544 ER - TY - THES A1 - Kiser, Dominik Pascal T1 - Gene x Environment Interactions in Cdh13-deficient Mice: CDH13 as a Factor for Adaptation to the Environment T1 - Gen x Umwelt-Interaktionen in Cdh13-defizienten Mäusen: CDH13 als ein Faktor für Umweltanpassung N2 - Neurodevelopmental disorders, including attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder (ASD) are disorders of mostly unknown etiopathogenesis, for which both genetic and environmental influences are expected to contribute to the phenotype observed in patients. Changes at all levels of brain function, from network connectivity between brain areas, over neuronal survival, synaptic connectivity and axonal growth, down to molecular changes and epigenetic modifications are suspected to play a key roles in these diseases, resulting in life-long behavioural changes. Genome-wide association as well as copy-number variation studies have linked cadherin-13 (CDH13) as a novel genetic risk factor to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. CDH13 is highly expressed during embryonic brain development, as well as in the adult brain, where it is present in regions including the hippocampus, striatum and thalamus (among others) and is upregulated in response to chronic stress exposure. It is however unclear how CDH13 interacts with environmentally relevant cues, including stressful triggers, in the formation of long-lasting behavioural and molecular changes. It is currently unknown how the environment influences CDH13 and which long term changes in behaviour and gene expression are caused by their interaction. This work therefore investigates the interaction between CDH13 deficiency and neonatal maternal separation (MS) in mice with the aim to elucidate the function of CDH13 and its role in the response to early-life stress (ELS). For this purpose, mixed litters of wild-type (Cdh13+/+), heterozygous (Cdh13+/-) and homozygous knockout (Cdh13-/-) mice were maternally separated from postnatal day 1 (PN1) to postnatal day 14 (PN14) for 3 hours each day (180MS; PN1-PN14). In a first series of experiments, these mice were subjected to a battery of behavioural tests starting at 8 weeks of age in order to assess motor activity, memory functions as well as measures of anxiety. Subsequently, expression of RNA in various brain regions was measured using quantitativ real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). A second cohort of mice was exposed to the same MS procedure, but was not behaviourally tested, to assess molecular changes in hippocampus using RNA sequencing. Behavioural analysis revealed that MS had an overall anxiolytic-like effect, with mice after MS spending more time in the open arms of the elevated-plus-maze (EPM) and the light compartment in the light-dark box (LDB). As a notable exception, Cdh13-/- mice did not show an increase of time spent in the light compartment after MS compared to Cdh13+/+ and Cdh13+/- MS mice. During the Barnes-maze learning task, mice of most groups showed a similar ability in learning the location of the escape hole, both in terms of primary latency and primary errors. Cdh13-/- control (CTRL) mice however committed more primary errors than Cdh13-/- MS mice. In the contextual fear conditioning (cFC) test, Cdh13-/- mice showed more freezing responses during the extinction recall, indicating a reduced extinction of fear memory. In the step-down test, an impulsivity task, Cdh13-/- mice had a tendency to wait longer before stepping down from the platform, indicative of more hesitant behaviour. In the same animals, qRT-PCR of several brain areas revealed changes in the GABAergic and glutamatergic systems, while also highlighting changes in the gatekeeper enzyme Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a), both in relation to Cdh13 deficiency and MS. Results from the RNA sequencing study and subsequent gene-set enrichment analysis revealed changes in adhesion and developmental genes due to Cdh13 deficiency, while also highlighting a strong link between CDH13 and endoplasmatic reticulum function. In addition, some results suggest that MS increased pro-survival pathways, while a gene x environment analysis showed alterations in apoptotic pathways and migration, as well as immune factors and membrane metabolism. An analysis of the overlap between gene and environment, as well as their interaction, highlighted an effect on cell adhesion factors, underscoring their importance for adaptation to the environment. Overall, the stress model resulted in increased stress resilience in Cdh13+/+ and Cdh13+/- mice, a change absent in Cdh13-/- mice, suggesting a role of CDH13 during programming and adaptation to early-life experiences, that can results in long-lasting consequences on brain functions and associated behaviours. These changes were also visible in the RNA sequencing, where key pathways for cell-cell adhesion, neuronal survival and cell-stress adaptation were altered. In conclusion, these findings further highlight the role of CDH13 during brain development, while also shedding light on its function in the adaptation and response during (early life) environmental challenges. N2 - Neuronale Entwicklungsstörungen (NES), wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) oder Autismus Spektrums Störung (ASS), haben eine größtenteils unbekannte Krankheitsentwicklung, deren klinisches Erscheinungsbild bei dem Patienten durch die individuelle Genetik und Umwelt beieinflusst wird. Veränderungen in allen funktionellen Ebenen des Gehirns, von Netzwerkaktivität zwischen unterschiedlichen Gehirnregionen, über synaptischer Verschaltung, axonalem Wachstum und den Überlebenschancen einzelner Neuronen, bis hin zu molekularen und epigenetischen Modifikationen werden als Schlüsselrollen in NES betrachtet, welche schlussendlich zu langfristigen Verhaltensauffälligkeiten führen. Genome-weite-Assoziations und genomische Kopiezahlvariations Studien haben Cadherin 13 (CDH13) als neuartiges Risikogen für neuropsychiatrische und neuronale Entwicklungsstörungen identifizieren können. CDH13 wird sowohl während der embryonalen Entwicklung, als auch im adulten Gehirn, stark exprimiert und kann dort in Regionen wie dem Hippocampus, Striatum und Thalamus gefunden werden. Darüber hinaus wird es als Reaktion auf akuten (physiologischen und psychologischen) Stress exprimiert. Gegenwärtig ist jedoch nicht bekannt, wie Umwelteinflüsse mit CDH13 interagieren und langanhaltende Veränderungen im Verhalten und der Gene Expression im Gehirn herbeiführen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die Interaktion zwischen CDH13 und Stress während eines frühen Lebensabschnitts. Hierfür wurden Würfe mit wildtyp (Cdh13+/+), heterozygoten (Cdh13+/-) und homozygoten knockout (Cdh13-/-) Mäusen zwischen dem ersten und vierzehnten Tag nach der Geburt für jeweils 3 Stunden von ihren Müttern getrennt (englisch: maternal separation, MS). In einem ersten Experiment wurden diese Mäuse dann im Alter von 8 Wochen in einer Reihe von Verhaltensversuchen auf ihre motorischen Fähigkeiten und Gedächtnisleistung getestet. Im Anschluss daran wurde mittels der quantitativen Polymerase Kettenreaktion (qPCR) verschiedene Gehirnregionen dieser Tiere auf Expressionsunterschiede in Faktoren für Neurotransmittersysteme, Neurogenese und DNA Methylierungsmechanismen hin analysiert. Das Hippocampus-Gewebe einer zweiten gleich aufgebauten Versuchsgruppe wurde mittels RNA Sequenzierung untersucht. Die Verhaltensanalyse zeigt das MS einen überwiegend angst-lindernden Einfluss auf die Mäuse hatte. Im Vergleich zu Mäusen ohne MS verbrachten MS-Mäuse mehr Zeit auf dem offenen Arm eines erhöhten Plus-Labyrinths, so wie in der hell-erleuchteten Seite einer Hell-Dunkel Box (HDB). Eine auffallende Ausnahme stellten jedoch die Cdh13-/- Mäuse dar, welche in der HDB keinen Zeitanstieg wie ihre Cdh13+/+ und Cdh13+/- MS Geschwister auf der hell-erleuchteten Seite aufwiesen. In dem Barnes Labyrinth (einem Test für räumliches Lernen) zeigte sich, dass alle Tiere, gemessen an den Fehlern und der Zeit die sie brauchten bis sie den Ausgang fanden, zunächst ähnliche Lernerfolge hatten. Im zweiten Teil des Experiments, in dem der Ausgang auf eine neue Position gelegt wurde, begangen Cdh13-/- Mäuse ohne MS hingegen mehr Fehler als Cdh13-/- MS Mäusee. In der Kontext-Angst-Konditionierung (KAK) zeigten männliche Cdh13-/- Mäuse mehr Angst-Starre während der Extinktions-Wiederholung; ein Befund der eine reduzierte Angst-Auslöschung impliziert. Im Abstiegs-Test, einem Impulsivitätstest, blieben Cdh13-/- Mäuse länger auf einem Podest stehen. Mittels qPCR konnte außerdem gezeigt werden dass sowohl ein Cdh13-/- Defizit, als auch MS, Veränderungen von GABAergen und glutamatergen Faktoren, so wie Änderungen in dem wichtigen Signalmolekühl Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a) verursacht haben. Die Ergebnisse der RNA Sequenzierung zeigten eine Anreicherung von Veränderungen in Adhesions-, Entwicklungs- und Endoplasmatischen Reticulumgenen in Cdh13-/- defiziten Tieren im Vergleich zu Cdh13+/+ Mäusen. Im selben Versuch trug MS zu einer erhöhten Aktivierung von Anti-Apoptotischen Signalwegen im Hippocampus bei, während Zell-Adhesionsmoleküle maßgeblich von der Wechselwirkung beider Faktoren betroffen waren. Zusammenfassend waren Cdh13+/+ und Cdh13+/- Mäuse im Gegensatz zu Cdh13-/- Tieren größtenteils stressresitenter, während die RNA Sequenzierung aufzeigte, dass CDH13 Schlüsselkomponenten von Zell-Zell-Adhesions, Überlebens und Zell-Stress-Signalwegen reguiert. Dies suggeriert, dass CDH13 die Programmierung und Anpassung an Umwelteinflüsse steuert, was wiederum lang anhaltende Auswirkungen auf molekularer Ebene und auf das Verhalten der Mäuse zur Folge hat. Abschließend legen die Befunde eine Rolle von CDH13 in der Umgebungsanpassung während der Entwicklung nahe. KW - Cadherine KW - Genexpression KW - Tiermodell KW - Animales Nervensystem KW - Verhalten KW - Cdh13 KW - RNA Sequencing KW - Gene by Environment KW - Neurodevelopmental Disorder KW - ADHD KW - Hippocampus KW - Prefrontal cortex KW - Amygdala KW - Raphe KW - Adaptation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179591 ER - TY - THES A1 - Letschert, Sebastian T1 - Quantitative Analysis of Membrane Components using Super-Resolution Microscopy T1 - Quantitative Analyse von Membrankomponenten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie N2 - The plasma membrane is one of the most thoroughly studied and at the same time most complex, diverse, and least understood cellular structures. Its function is determined by the molecular composition as well as the spatial arrangement of its components. Even after decades of extensive membrane research and the proposal of dozens of models and theories, the structural organization of plasma membranes remains largely unknown. Modern imaging tools such as super-resolution fluorescence microscopy are one of the most efficient techniques in life sciences and are widely used to study the spatial arrangement and quantitative behavior of biomolecules in fixed and living cells. In this work, direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) was used to investigate the structural distribution of mem-brane components with virtually molecular resolution. Key issues are different preparation and staining strategies for membrane imaging as well as localization-based quantitative analyses of membrane molecules. An essential precondition for the spatial and quantitative analysis of membrane components is the prevention of photoswitching artifacts in reconstructed localization microscopy images. Therefore, the impact of irradiation intensity, label density and photoswitching behavior on the distribution of plasma membrane and mitochondrial membrane proteins in dSTORM images was investigated. It is demonstrated that the combination of densely labeled plasma membranes and inappropriate photoswitching rates induces artificial membrane clusters. Moreover, inhomogeneous localization distributions induced by projections of three-dimensional membrane structures such as microvilli and vesicles are prone to generate artifacts in images of biological membranes. Alternative imaging techniques and ways to prevent artifacts in single-molecule localization microscopy are presented and extensively discussed. Another central topic addresses the spatial organization of glycosylated components covering the cell membrane. It is shown that a bioorthogonal chemical reporter system consisting of modified monosaccharide precursors and organic fluorophores can be used for specific labeling of membrane-associated glycoproteins and –lipids. The distribution of glycans was visualized by dSTORM showing a homogeneous molecule distribution on different mammalian cell lines without the presence of clusters. An absolute number of around five million glycans per cell was estimated and the results show that the combination of metabolic labeling, click chemistry, and single-molecule localization microscopy can be efficiently used to study cell surface glycoconjugates. In a third project, dSTORM was performed to investigate low-expressing receptors on cancer cells which can act as targets in personalized immunotherapy. Primary multiple myeloma cells derived from the bone marrow of several patients were analyzed for CD19 expression as potential target for chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells. Depending on the patient, 60–1,600 CD19 molecules per cell were quantified and functional in vitro tests demonstrate that the threshold for CD19 CAR T recognition is below 100 CD19 molecules per target cell. Results are compared with flow cytometry data, and the important roles of efficient labeling and appropriate control experiments are discussed. N2 - Die Plasmamembran gehört zu den am meisten untersuchten, gleichzeitig aber auch zu den komplexesten, vielfältigsten und am wenigsten verstandenen biologischen Strukturen. Ihre Funktion wird nicht nur durch die molekulare Zusammensetzung bestimmt, sondern auch durch die räumliche Anordnung ihrer Bestandteile. Selbst nach Jahrzehnten intensiver Forschung und der Veröffentlichung dutzender Membranmodelle und Theorien bleibt die genaue strukturelle Organisation der Plasmamembran ein Rätsel. Moderne Bildgebungsverfahren wie etwa die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie gehören mittlerweile zu den effizientesten Techniken der Lebenswissenschaften und werden immer öfter verwendet, um die räumliche Anordnung als auch die Anzahl von Biomolekülen in fixierten und lebenden Zellen zu studieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die hochauflösende Mikroskopie-Methode dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) angewendet, um die räumliche Verteilung von Membranmolekülen mit annähernd molekularer Auflösung zu untersuchen. Schwerpunkte dieser Arbeit sind dabei verschiedene Präparations- und Färbemethoden für die mikroskopische Untersuchung von Zellmembranen sowie lokalisationsbasierte quantitative Analysemethoden von Membranmolekülen. Eine Voraussetzung für die räumliche als auch quantitative Analyse von Membranmolekülen ist die Vermeidung von Photoschalt-Artefakten in rekonstruierten Lokalisationsmikroskopie-Bildern. Um dies genauer zu demonstrieren, wurden die Auswirkungen von Anregungsintensität, Markierungsdichte und verändertem Photoschalten auf die räumliche Verteilung von Proteinen der Plasma- und Mitochondrienmembran in dSTORM-Bildern analysiert. Es wird gezeigt, dass eine dicht markierte Plasmamembran in Kombination mit ungeeigneten Photoschaltraten zu artifiziellen Clustern in der Membran führt. Es sind vor Allem oft die Projektionen dreidimensionaler Membranstrukturen wie etwa Mikrovilli und Vesikel dafür verantwortlich, dass lokale Unterschiede in der Lokalisationsdichte entstehen, wodurch unter Umständen Bildartefakte generiert werden können. Darüber hinaus werden alternative Mikroskopie-Methoden und Möglichkeiten, Artefakte in Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Bildern zu verhindern, präsentiert und ausführlich diskutiert. Ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit ist die räumliche Anordnung von glykosylierten Membranmolekülen. Es wird demonstriert, wie ein bioorthogonales chemisches Reportersystem bestehend aus modifizierten Monosacchariden und organischen Fluorophoren für die spezifische Markierung von Membran-assoziierten Glykoproteinen und –lipiden eingesetzt werden kann. Mittels dSTORM wird gezeigt, dass die Verteilung von Glykanen in der Plasmamembran unterschiedlicher Zelllinien homogen und frei von Clustern ist. Des Weiteren zeigt eine quantitative Analyse, dass sich in etwa fünf Millionen Glykane auf einer einzigen Zelle befinden. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Kombination aus metabolisch markierten Zielmolekülen, Click-Chemie und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie effizient genutzt werden kann, um Glykokonjugate auf Zelloberflächen zu untersuchen. In einem dritten Projekt wurde dSTORM zur Untersuchung von Rezeptormolekülen auf Krebszellen verwendet. Die Expression dieser Oberflächenproteine ist so gering, dass sich nur wenige Moleküle auf einer Zelle befinden, die jedoch als Zielmoleküle in der personalisierten Immuntherapie dienen könnten. Dafür wurden primäre Tumorzellen aus dem Knochenmark von Patienten, die am Multiplen Myelom erkrankt sind, auf die Expression des CD19-Oberflächenproteins als potentielles Ziel für CAR-modifizierte T-Zellen (chimeric antigen receptor) untersucht. Es wird gezeigt, dass sich, abhängig vom untersuchten Patienten, auf einer Zelle 60 bis 1600 CD19-Moleküle befinden. Funktionale in-vitro-Experimente demonstrieren, dass weniger als 100 CD19 Moleküle ausreichen, um CD19-CAR-T-Zellen zu aktivieren. Diese Ergebnisse werden mit Durchflusszytometrie-Daten verglichen und die wichtige Rolle von Lebendzellfärbung und geeigneten Kontrollexperimenten wird diskutiert. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Quantifizierung KW - Polysaccharide KW - Immuntherapie KW - Antigen CD19 KW - super-resolution fluorescence microscopy KW - dSTORM KW - click chemistry KW - plasma membrane organization KW - localization microscopy KW - artifacts KW - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie KW - Plasmamembranorganisation KW - Click Chemie KW - Glykane Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162139 ER - TY - THES A1 - Schwedhelm, Ivo Peter T1 - A non-invasive microscopy platform for the online monitoring of hiPSC aggregation in suspension cultures in small-scale stirred tank bioreactors T1 - Entwicklung und Etablierung einer Mikroskopieplattform zur zerstörungsfreien Messung der Aggregierung von hiPSCs in kleinmaßstäbigen Bioreaktor-Suspensionskulturen N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large-scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Suspension cul- tures of hiPSCs are characterized by the self-aggregation of single cells into macroscopic cell aggre- gates that increase in size over time. The development of these free-floating aggregates is dependent on the culture vessel and thus represents a novel process parameter that is of particular interest for hiPSC suspension culture scaling. Further, aggregates surpassing a critical size are prone to spon- taneous differentiation or cell viability loss. In this regard, and, for the first time, a hiPSC-specific suspension culture unit was developed that utilizes in situ microscope imaging to monitor and to characterize hiPSC aggregation in one specific CSTR setup to a statistically significant degree while omitting the need for error-prone and time-intensive sampling. For this purpose, a small-scale CSTR system was designed and fabricated by fused deposition modeling (FDM) using an in-house 3D- printer. To provide a suitable cell culture environment for the CSTR system and in situ microscope, a custom-built incubator was constructed to accommodate all culture vessels and process control devices. Prior to manufacture, the CSTR design was characterized in silico for standard engineering parameters such as the specific power input, mixing time, and shear stress using computational fluid dynamics (CFD) simulations. The established computational model was successfully validated by comparing CFD-derived mixing time data to manual measurements. Proof for system functionality was provided in the context of long-term expansion (4 passages) of hiPSCs. Thereby, hiPSC aggregate size development was successfully tracked by in situ imaging of CSTR suspensions and subsequent automated image processing. Further, the suitability of the developed hiPSC culture unit was proven by demonstrating the preservation of CSTR-cultured hiPSC pluripotency on RNA level by qRT-PCR and PluriTest, and on protein level by flow cytometry. N2 - Die Vermehrung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) im Indus- triemaßstab wird durch skalierbare Bioprozesse in aktiv durchmischten Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) ermöglicht. Hierbei zeichnet sich das Wachstum von hiPSCs durch die charakteristische Bildung von sphäroidischen Zellaggregaten aus, deren Durchmesser sich im Laufe der Kultivierung vergrößert. Die Agglomeration von hiPSCs ist sowohl abhängig vom Grad der Durchmischung als auch vom jeweiligen Kulturgefäß, und stellt somit einen wichtigen Prozessparameter dar, welcher während der Prozessskalierung berücksichtigt werden muss. Weiterhin weisen hiPSCs in Aggregaten, welche eine kritische Größe überschreiten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, ihre Pluripotenz zu verlieren oder hinsichtlich ihrer Viabilität beeinträchtigt zu werden. Auf Grundlage dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Plattform für die Durchführung von hiPSCs-Suspensionskulturen en- twickelt, welche die zerstörungsfreie Überwachung des hiPSC-Aggregatwachstums in Echtzeit durch den Einsatz von in situ-Mikroskopie ermöglicht. Neben den eigens entworfenen Bioreaktoren, welche zum Großteil aus 3D-gedruckten Komponenten bestehen, wurde eine Peripherie in Form eines Inkubator-Prototyps entwickelt und konstruiert, welcher die Unterbringung der Bioreaktoren, der Systemkomponenten zur Erzeugung von Zellkulturbedingungen sowie einer in situ-Mikroskop- Spezialanfertigung gewährleistet. Als Ausgangspunkt der Entwicklung des CSTR Systems diente ein Strömungssimulationsmodell, welches dazu verwendet wurde, prozesstechnische Kennzahlen zu er- mitteln um das CSTR System hinsichtlich des spezifischen Leistungseintrags, der Mischzeit und der Scherbelastung zu charakterisieren. Das erstellte Simulationsmodell wurde zudem erfolgreich an- hand eines Messdatenabgleichs der Mischzeit hinsichtlich seiner Aussagekraft validiert. Des Weit- eren wurde die Funktionsfähigkeit des gesamten Systems durch Langzeitversuche belegt. Hierbei wurden hiPSCs in den entwickelten Bioreaktoren über einen Zeitraum von vier Passagen expandiert und das Aggregatwachstum mittels in situ-Mikroskopie in Kombination mit einer automatisierten Bildauswertung beschrieben. Überdies hinaus wurde die Qualität der kultivierten hiPSCs hinsichtlich ihrer Differenzierungskapazität durch den Nachweis von Pluripotenzmarkern auf RNA (qRT-PCR und PluriTest) sowie Proteinebene (Durchflusszytometrie) untersucht. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Mikroskopie KW - Suspensionskultur KW - Aggregation KW - in situ microscopy KW - bioreactor KW - hiPSC aggregation KW - Bioreaktor KW - iPSC Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192989 ER - TY - THES A1 - Weinstock [geb. Pattschull], Grit T1 - Crosstalk between the MMB complex and YAP in transcriptional regulation of cell cycle genes T1 - Interaktion zwischen dem MMB-Komplex und YAP bei der transkriptionellen Regulation von Zellzyklusgenen N2 - The Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex is a master regulator of cell cycle-dependent gene expression. Target genes of MMB are expressed at elevated levels in several different cancer types and are included in the chromosomal instability (CIN) signature of lung, brain, and breast tumors. This doctoral thesis showed that the complete loss of the MMB core subunit LIN9 leads to strong proliferation defects and nuclear abnormalities in primary lung adenocarcinoma cells. Transcriptome profiling and genome-wide DNA-binding analyses of MMB in lung adenocarcinoma cells revealed that MMB drives the expression of genes linked to cell cycle progression, mitosis, and chromosome segregation by direct binding to promoters of these genes. Unexpectedly, a previously unknown overlap between MMB-dependent genes and several signatures of YAP-regulated genes was identified. YAP is a transcriptional co-activator acting downstream of the Hippo signaling pathway, which is deregulated in many tumor types. Here, MMB and YAP were found to physically interact and co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes, which are important in cancer. Furthermore, the activation of mitotic genes and the induction of entry into mitosis by YAP were strongly dependent on MMB. By ChIP-seq and 4C-seq, the genome-wide binding of MMB upon YAP overexpression was analyzed and long-range chromatin interaction sites of selected MMB target gene promoters were identified. Strikingly, YAP strongly promoted chromatin-association of B-MYB through binding to distal enhancer elements that interact with MMB-regulated promoters through chromatin looping. Together, the findings of this thesis provide a so far unknown molecular mechanism by which YAP and MMB cooperate to regulate mitotic gene expression and suggest a link between two cancer-relevant signaling pathways. N2 - Der Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex spielt eine wichtige Rolle in der Expression Zellzyklus abhängiger Gene, welche erhöhte Expressionsraten in verschiedenen Krebsarten aufweisen und Teil der sogenannten chromosomalen Instabilitätssignatur (CIN) von Lungen-, Gehirn- und Brusttumoren sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion von LIN9, einer zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, in primären Lungenkarzinomzellen der Maus zu starken Proliferationsdefekten und Anomalitäten des Zellkerns führt. Analysen des gesamten Transkriptoms mit Hilfe von RNA-Seq ergaben, dass der MMB-Komplex die Expression einer Gruppe von Genen reguliert, die mit dem Voranschreiten des Zellzyklus, der Mitose und der Trennung der Chromosomen in Verbindung stehen. Die Regulation dieser Gene erfolgt durch direkte Bindung des MMB-Komplexes an die dazugehörigen Promotoren, wie die Analyse der genomweiten DNA-Bindung des MMB-Komplexes durch ChIP-Seq erkennbar werden ließ. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine neuartige Interaktion zwischen MMB und YAP, einem transkriptionellen Co-Aktivator und Effektorprotein des Hippo-Signalweges, gefunden. Die Dysregulation von Hippo/YAP ist an der Entstehung verschiedener Tumorentitäten beteiligt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass YAP mit Untereinheiten von MMB interagiert und dass beide Signalwege ein überlappendes Set von Zielgenen, die für die Entstehung von Tumoren relevant sind, regulieren. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass YAP den MMB-Komplex benötigt, um die Expression mitotischer Gene zu aktivieren und dass der durch YAP induzierte Eintritt in die Mitose vom MMB-Komplex abhängig ist. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden mittels ChIP-Seq und 4C-Seq Chromatin-Interaktionen von Promotoren der MMB-Zielgene mit weiter entfernt liegenden Bereichen des Genoms identifiziert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass YAP die Bindung der MMB-Untereinheit B-MYB an die Promotoren der MMB-Zielgene verstärkt, indem es an weiter entfernte Enhancer bindet. Diese von YAP gebundenen Enhancer interagieren über Schleifenbildung des Chromatins mit den Promotoren MMB-regulierter Gene. Zusammengefasst konnten die Ergebnisse dieser Arbeit einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus für die gemeinsame Regulation von Genen durch den MMB Komplex und YAP enthüllen und somit einen Zusammenhang zwischen zwei krebsrelevanten Signalwegen aufdecken. KW - Krebs KW - Zellteilung KW - Genexpression KW - MMB complex KW - Hippo pathway KW - mitosis KW - cytokinesis KW - mitotic gene expression KW - Lungenkrebs KW - Mitose Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170866 ER - TY - THES A1 - Griffoni, Chiara T1 - Towards advanced immunocompetent skin wound models for in vitro drug evaluation T1 - Auf dem Weg zu fortschrittlichen immunkompetenten Hautwundmodellen für die in vitro-Medikamentenbewertung N2 - Current preclinical models used to evaluate novel therapies for improved healing include both in vitro and in vivo methods. However, ethical concerns related to the use of animals as well as the poor physiological translation between animal and human skin wound healing designate in vitro models as a highly relevant and promising platforms for healing investigation. While current in vitro 3D skin models recapitulate a mature tissue with healing properties, they still represent a simplification of the in vivo conditions, where for example the inflammatory response originating after wound formation involves the contribution of immune cells. Macrophages are among the main contributors to the inflammatory response and regulate its course thanks to their plasticity. Therefore, their implementation into in vitro skin could greatly increase the physiological relevance of the models. As no full-thickness immunocompetent skin model containing macrophages has been reported so far, the parameters necessary for a successful triple co-culture of fibroblasts, keratinocytes and macrophages were here investigated. At first, cell source and culture timed but also an implementation strategy for macrophages were deter-mined. The implementation of macrophages into the skin model focused on the minimization of the culture time to preserve immune cell viability and phenotype, as the environment has a major influence on cell polarization and cytokine production. To this end, incorporation of macrophages in 3D gels prior to the combination with skin models was selected to better mimic the in vivo environment. Em-bedded in collagen hydrogels, macrophages displayed a homogeneous cell distribution within the gel, preserving cell viability, their ability to respond to stimuli and their capability to migrate through the matrix, which are all needed during the involvement of macrophages in the inflammatory response. Once established how to introduce macrophages into skin models, different culture media were evaluated for their effects on primary fibroblasts, keratinocytes and macrophages, to identify a suitable medium composition for the culture of immunocompetent skin. The present work confirmed that each cell type requires a different supplement combination for maintaining functional features and showed for the first time that media that promote and maintain a mature skin structure have negative effects on primary macrophages. Skin differentiation media negatively affected macrophages in terms of viability, morphology, ability to respond to pro- and anti-inflammatory stimuli and to migrate through a collagen gel. The combination of wounded skin equivalents and macrophage-containing gels con-firmed that culture medium inhibits macrophage participation in the inflammatory response that oc-curs after wounding. The described macrophage inclusion method for immunocompetent skin creation is a promising approach for generating more relevant skin models. Further optimization of the co-cul-ture medium will potentially allow mimicking a physiological inflammatory response, enabling to eval-uate the effects novel drugs designed for improved healing on improved in vitro models. N2 - Aktuelle präklinische Modelle zur Bewertung neuartiger Therapien für eine verbesserte Heilung um- fassen sowohl in vitro als auch in vivo Methoden. Ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Ver- wendung von Tieren sowie die schlechte physiologische Übersetzung zwischen tierischer und mensch- licher Hautwundheilung bezeichnen In-vitro-Modelle jedoch als hochrelevante und vielversprechende Plattformen für die Heilungsforschung. Während die aktuellen in vitro 3D-Hautmodelle ein reifes Ge- webe mit heilenden Eigenschaften rekapitulieren, stellen sie dennoch eine Vereinfachung der in vivo- Bedingungen dar, bei denen beispielsweise die nach der Wundbildung entstehende Entzündungsreak- tion den Beitrag von Immunzellen beinhaltet. Makrophagen gehören zu den Hauptverursachern der Entzündungsreaktion und regulieren ihren Verlauf durch ihre Plastizität. Daher könnte ihre Implemen- tierung in die in vitro Haut die physiologische Relevanz der Modelle deutlich erhöhen. Da bisher kein volldickes, immunkompetentes Hautmodell mit Makrophagen berichtet wurde, wurden hier die für eine erfolgreiche Dreifach-Cokultur von Fibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen notwendigen Parameter untersucht. Zuerst wurden die Zellquelle und die Kultur zeitlich festgelegt, aber auch eine Implementierungsstrategie für Makrophagen festgelegt. Die Implementierung von Makrophagen in das Hautmodell konzentrierte sich auf die Minimierung der Kultivierungszeit, um die Lebensfähigkeit und den Phänotyp der Immunzellen zu erhalten, da die Umgebung einen großen Einfluss auf die Zell- polarisation und Zytokinproduktion hat. Zu diesem Zweck wurde die Integration von Makrophagen in 3D-Gelen vor der Kombination mit Hautmodellen ausgewählt, um die in vivo-Umgebung besser nach- ahmen zu können. Eingebettet in Kollagenhydrogele zeigten Makrophagen eine homogene Zellvertei- lung im Gel, die die Zelllebensfähigkeit bewahrt, auf Reize reagiert und durch die Matrix wandert, die alle bei der Beteiligung von Makrophagen an der Entzündungsreaktion benötigt werden. Nachdem festgestellt worden war, wie Makrophagen in Hautmodelle eingeführt werden können, wurden ver- schiedene Kulturmedien hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Primärfibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen untersucht, um eine geeignete Medienzusammensetzung für die Kultur immunkompe- tenter Haut zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit bestätigte, dass jeder Zelltyp eine andere Supple- mentkombination zur Aufrechterhaltung der Funktionsmerkmale benötigt und zeigte erstmals, dass Medien, die eine reife Hautstruktur fördern und aufrechterhalten, negative Auswirkungen auf die pri- mären Makrophagen haben. Hautdifferenzierungsmedien wirkten sich negativ auf die Makrophagen in Bezug auf Lebensfähigkeit, Morphologie, Fähigkeit, auf pro- und antiinflammatorische Reize zu rea- gieren und durch ein Kollagengel zu wandern aus. Die Kombination aus verwundeten Hautäquivalen- ten und makrophagenhaltigen Gelen bestätigte, dass das Kulturmedium die Teilnahme der Makro- phage an der Entzündungsreaktion, die nach der Wunde auftritt, hemmt. Die beschriebene Makrophagen-Einschlussmethode zur immunkompetenten Hautbildung ist ein vielversprechender An- satz zur Generierung relevanterer Hautmodelle. Eine weitere Optimierung des Co-Kulturmediums wird es möglicherweise ermöglichen, eine physiologische Entzündungsreaktion nachzuahmen und die Aus- wirkungen neuartiger Medikamente zur verbesserten Heilung auf verbesserte In-vitro-Modelle zu be- werten. KW - skin model KW - macrophages KW - wound healing KW - immunocompetent skin KW - Haut KW - In vitro KW - Wundheilung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192125 ER - TY - THES A1 - Baur, Florentin Philipp T1 - Establishment of a 3D tumour model and targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer T1 - Entwicklung eines 3D Tumormodells und zielgerichtete Behandlung von BRAF-mutiertem kolorektalen Karzinom N2 - Cancer remains after cardiovascular diseases the leading cause of death worldwide and an estimated 8.2 million people died of it in 2012. By 2030, 13 million cancer deaths are expected due to the growth and ageing of the population. Hereof, colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men and the second in women with a wide geographical variation across the world. Usually, CRC begins as a non-cancerous growth leading to an adenomatous polyp, or adenoma, arising from glandular cells. Since research has brought about better understanding of the mechanisms of cancer development, novel treatments such as targeted therapy have emerged in the past decades. Despite that, up to 95% of anticancer drugs tested in clinical phase I trials do not attain a market authorisation and hence these high attrition rates remain a key challenge for the pharmaceutical industry, making drug development processes enormously costly and inefficient. Therefore, new preclinical in vitro models which can predict drug responses in vivo more precisely are urgently needed. Tissue engineering not only provides the possibility of creating artificial three-dimensional (3D) in vitro tissues, such as functional organs, but also enables the investigation of drug responses in pathological tissue models, that is, in 3D cancer models which are superior to conventional two-dimensional (2D) cell cultures on petri dishes and can overcome the limitations of animal models, thereby reducing the need for preclinical in vivo models. In this thesis, novel 3D CRC models on the basis of a decellularised intestinal matrix were established. In the first part, it could be shown that the cell line SW480 exhibited different characteristics when grown in a 3D environment from those in conventional 2D culture. While the cells showed a mesenchymal phenotype in 2D culture, they displayed a more pronounced epithelial character in the 3D model. By adding stromal cells (fibroblasts), the cancer cells changed their growth pattern and built tumour-like structures together with the fibroblasts, thereby remodelling the natural mucosal structures of the scaffold. Additionally, the established 3D tumour model was used as a test system for treatment with standard chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU). The second part of the thesis focused on the establishment of a 3D in vitro test system for targeted therapy. The US Food and Drug Administration has already approved of a number of drugs for targeted therapy of specific types of cancer. For instance, the small molecule vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™) which demonstrated impressive response rates of 50–80% in melanoma patients with a mutation of the rapidly accelerated fibrosarcoma oncogene type B (BRAF) kinase which belongs to the mitogen active protein kinase (MAPK) signalling pathway. However, only 5% of CRC patients harbouring the same BRAF mutation respond to treatment with vemurafenib. An explanation for this unresponsiveness could be a feedback activation of the upstream EGFR, reactivating the MAPK pathway which sustains a proliferative signalling. To test this hypothesis, the two early passage cell lines HROC24 and HROC87, both presenting the mutation BRAF V600E but differing in other mutations, were used and their drug response to vemurafenib and/or gefitinib was assessed in conventional 2D cell culture and compared to the more advanced 3D model. Under 3D culture conditions, both cell lines showed a reduction of the proliferation rate only in the combination therapy approach. Furthermore, no significant differences between the various treatment approaches and the untreated control regarding apoptosis rate and viability for both cell lines could be found in the 3D tumour model which conferred an enhanced chemoresistance to the cancer cells. Because of the observed unresponsiveness to BRAF inhibition by vemurafenib as can be seen in the clinic for patients with BRAF mutations in CRC, the cell line HROC87 was used for further xenografting experiments and analysis of activation changes in the MAPK signalling pathway. It could be shown that the cells presented a reactivation of Akt in the 3D model when treated with both inhibitors, suggesting an escape mechanism for apoptosis which was not present in cells cultured under conventional 2D conditions. Moreover, the cells exhibited an activation of the hepatocyte growth factor receptor (HGFR, c-Met) in 2D and 3D culture, but this was not detectable in the xenograft model. This shows the limitations of in vivo models. The results suggest another feedback activation loop than that to the EGFR which might not primarily be involved in the resistance mechanism. This reflects the before mentioned high attrition rates in the preclinical drug testing. N2 - Krebs ist nach Herz- und Kreislauferkrankungen die führende Todesursache weltweit und 2012 starben daran geschätzt 8,2 Millionen Menschen. Für das Jahr 2030 werden 13 Millionen Krebstote erwartet, was auf das Bevölkerungswachstum und deren Überalterung zurückzuführen ist. Dabei ist das kolorektale Karzinom (engl. colorectal cancer, CRC) der dritthäufigste Krebs bei Männern und der zweithäufigste bei Frauen. Für gewöhnlich entwickelt sich CRC aus einem nicht-kanzerösen Wachstum, das zu einem adenomatösen Polyp bzw. Adenom führt, welches aus Drüsenzellen hervorgeht. Da die Forschung in den vergangenen Jahrzehnten ein besseres Verständnis für die Mechanistik der Krebsentstehung hervorgebracht hat, entstanden neuartige Behandlungsformen, wie die zielgerichtete Krebstherapie. Hohe Versagensraten, welche den Medikamentenentwicklungsprozess sehr kostenaufwendig und ineffizient machen, bleiben eine entscheidende Herausforderung für die pharmazeutische Industrie. Deshalb werden dringend neue präklinische in vitro Modelle, die bessere in vivo Wirkungsvorhersagen liefern, benötigt. Das Tissue Engineering bietet die Möglichkeit künstliche dreidimensionale (3D) in vitro Gewebe herzustellen, z.B. funktionelle Organe, aber es ermöglicht auch, die Reaktion auf ein Medikament in pathologischen Gewebemodellen, wie beispielsweise Krebsmodelle, zu untersuchen. Diese sind der konventionellen zweidimensionalen (2D) Zellkultur in Petrischalen überlegen und können die begrenzten Möglichkeiten von Tiermodellen erweitern, was zudem die Notwendigkeit für präklinische in vivo Modelle vermindert. In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige 3D CRC Modelle auf Basis einer dezellularisierten intestinalen Matrix entwickelt. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass die Zelllinie SW480 verschiedene Charakteristika bezüglich des Wachstums in der konventionellen 2D Zellkultur oder der 3D Umgebung aufwies. Im Gegensatz zu den mesenchymalen Eigenschaften der Zellen in der 2D Zellkultur, zeigten sie im 3D Modell einen betonteren epithelialen Charakter. Durch das Hinzufügen von Fibroblasten änderten die Krebszellen ihr Wachstumsverhalten und sie bildeten zusammen tumorartige Strukturen aus, wobei die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, Krypten und Villi, umgebaut wurden. Zusätzlich wurde das entwickelte 3D Tumormodell als Testsystem für das Standardchemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) herangezogen. Der zweite Teil der Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung eines 3D in vitro Testsystems für die zielgerichtete Behandlung. Es gibt schon eine Reihe von der US Food and Drug Administration zugelassenen Medikamente für die zielgerichtete Behandlung spezifischer Tumorentitäten, wie z.B. Vemurafenib (PLX4032, Zelboraf™), das eindrucksvolle Ansprechraten von 50–80% bei Melanompatienten mit BRAF-Mutation erzielt. Trotzdem sprechen nur 5% der CRC-Patienten mit der gleichen BRAF-Mutation auf die Behandlung mit Vemurafenib an. Gründe für diese Unempfindlichkeit könnte eine Rückkoppelung zum aufwärtsgelegenen EGFR sein, der das Signal zur Proliferation aufrecht erhält. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die zwei Zelllinien HROC24 und HROC87, die beide die BRAF V600E-Mutation tragen aber sich in anderen Mutationen unterscheiden, mit Vemurafenib und/oder Gefitinib behandelt und das Ansprechen auf die Substanzen in der herkömmlichen 2D Zellkultur sowie im fortschrittlicheren 3D Modell verglichen. In 3D Kulturbedingungen zeigten beide Zelllinien eine Senkung der Proliferation nur im Kombinationstherapie-Ansatz. Außerdem wurden bei den 3D Modellen keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsansätzen und der unbehandelten Kontrolle, hinsichtlich der Apoptoserate und Viabilität, gefunden. Das deutet auf eine erhöhte Chemoresistenz der Krebszellen in der 3D Umgebung hin. Wegen der vorhandenen Unempfindlichkeit der Zelllinie HROC87 gegenüber der BRAF-Inhibierung mit Vemurafenib, wie es auch in der Klinik im Fall von Patienten mit BRAF-Mutation des CRC beobachtet werden kann, wurden diese Zellen für weitere Xenograft-Experimente und Analysen von Aktivierungsunterschieden im MAPK-Signaltransduktionsweg herangezogen. Weiterhin zeigten die Zellen eine Aktivierung des „hepatocyte growth factor receptor“ (HGFR, c-Met) in 2D und 3D Zellkultur, der jedoch nicht im Xenograft-Modell zu sehen war, was die limitierte Übertragbarkeit von Ergebnissen des Tiermodells auf den Menschen verdeutlicht. Dies spiegelt wiederum die obenstehend erwähnten hohen Versagensraten in der präklinischen Medikamententestung wider. Zusammengefasst kann das Tissue Engineering Möglichkeiten zur Herstellung und Entwicklung neuartiger 3D Testsysteme bieten, welche besser die in vivo Situation abbilden. Für eine Medikamententestung in Übereinstimmung mit personalisierter Medizin eröffnet das 3D Tumormodell vielversprechende Wege, welche in Zukunft das präklinische Screening verbessern sowie die hohen Versagensraten und Tierversuche vermindern könnten. KW - Dickdarmtumor KW - Therapie KW - BRAF-mutant KW - colorectal cancer KW - targeted therapy KW - 3D tumour model KW - BRAF-mutiert KW - kolorektales Karzinom KW - zielgerichtete Behandlung KW - 3D Tumormodell KW - In vitro KW - 3D KW - tumour Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174129 ER - TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER - TY - JOUR A1 - Thölken, Clemens A1 - Thamm, Markus A1 - Erbacher, Christoph A1 - Lechner, Marcus T1 - Sequence and structural properties of circular RNAs in the brain of nurse and forager honeybees (Apis mellifera) JF - BMC Genomics N2 - Background The honeybee (Apis mellifera) represents a model organism for social insects displaying behavioral plasticity. This is reflected by an age-dependent task allocation. The most protruding tasks are performed by young nurse bees and older forager bees that take care of the brood inside the hive and collect food from outside the hive, respectively. The molecular mechanism leading to the transition from nurse bees to foragers is currently under intense research. Circular RNAs, however, were not considered in this context so far. As of today, this group of non-coding RNAs was only known to exist in two other insects, Drosophila melanogaster and Bombyx mori. Here we complement the state of circular RNA research with the first characterization in a social insect. Results We identified numerous circular RNAs in the brain of A. mellifera nurse bees and forager bees using RNA-Seq with exonuclease enrichment. Presence and circularity were verified for the most abundant representatives. Back-splicing in honeybee occurs further towards the end of transcripts and in transcripts with a high number of exons. The occurrence of circularized exons is correlated with length and CpG-content of their flanking introns. The latter coincides with increased DNA-methylation in the respective loci. For two prominent circular RNAs the abundance in worker bee brains was quantified in TaqMan assays. In line with previous findings of circular RNAs in Drosophila, circAmrsmep2 accumulates with increasing age of the insect. In contrast, the levels of circAmrad appear age-independent and correlate with the bee's task. Its parental gene is related to amnesia-resistant memory. Conclusions We provide the first characterization of circRNAs in a social insect. Many of the RNAs identified here show homologies to circular RNAs found in Drosophila and Bombyx, indicating that circular RNAs are a common feature among insects. We find that exon circularization is correlated to DNA-methylation at the flanking introns. The levels of circAmrad suggest a task-dependent abundance that is decoupled from age. Moreover, a GO term analysis shows an enrichment of task-related functions. We conclude that circular RNAs could be relevant for task allocation in honeybee and should be investigated further in this context. KW - circRNA KW - circular transcriptome sequencing KW - honeybee KW - brain KW - neuronal KW - Methylation KW - CpG KW - alternative splicing KW - behavioral plasticity Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241302 VL - 20 ER - TY - THES A1 - Schmitt [geb. Wolf], Karen T1 - Studies on the role of platelet serotonin in platelet function, hemostasis, thrombosis and stroke T1 - Studien zur Rolle des Serotonins aus Thrombozyten für die Thrombozytenfunktion, Hämostase, Thrombose und Schlaganfall N2 - Platelet activation and aggregation are important processes in hemostasis resulting in reduction of blood loss upon vessel wall injury. However, platelet activation can lead to thrombotic events causing myocardial infarction and stroke. A more detailed understanding of the regulation of platelet activation and the subsequent formation of thrombi is essential to prevent thrombosis and ischemic stroke. Cations, platelet surface receptors, cytoskeletal rearrangements, activation of the coagulation cas-cade and intracellular signaling molecules are important in platelet activation and thrombus formation. One such important molecule is serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), an indolamine platelet agonist, biochemically derived from tryptophan. 5 HT is secreted from the enterochromaffin cells into the gastrointestinal tract (GI) and blood. Blood borne 5 HT has been proposed to regulate hemostasis by acting as a vaso-constrictor and by triggering platelet signaling through 5 HT2A receptor. Although platelets do not synthetize 5 HT, they take it up from the blood and store it in their dense granules which are secreted upon platelet activation. To identify the molecu-lar composite of the 5 HT uptake system in platelets and elucidate the role of platelet released 5-HT in thrombosis and ischemic stroke, 5 HT transporter knock out mice (5Htt / ) were analyzed in different in vitro and in vivo assays and in a model of is-chemic stroke. In 5Htt / platelets, 5 HT uptake from the blood was completely abol-ished and agonist-induced Ca2+ influx through store operated Ca2+ entry (SOCE), integrin activation, degranulation and aggregation responses to glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) were reduced. These observed in vitro defects in 5Htt / platelets could be normalized by the addition of exogenous 5 HT. Moreover, reduced 5 HT levels in the plasma, an increased bleeding time and the formation of unstable thrombi were observed ex vivo under flow and in vivo in the abdominal aorta and carotid artery of 5Htt / mice. Surprisingly, in the transient middle cerebral artery occlusion model (tMCAO) of ischemic stroke 5Htt / mice showed near-ly normal infarct volumes and a neurological outcome comparable to control mice. Although secreted platelet 5 HT does not appear to play a crucial role in the devel-opment of reperfusion injury after stroke, it is essential to amplify the second phase of platelet activation through SOCE and thus plays an important role in thrombus stabilization. To further investigate the role of cations, granules and their contents and regulation of integrin activation in the process of thrombus formation, genetically modified mice were analyzed in the different in vivo thrombosis models. Whereas Tph1 / mice (lacking the enzyme responsible for the production of 5 HT in the periphery), Trpm7KI (point mu-tation in the kinase domain of Trpm7 channel, lacking kinase activity) and Unc13d / /Nbeal2 / mice (lacking α granules and the release machinery of dense granules) showed a delayed thrombus formation in vivo, MagT1y/ mice (lacking a specific Mg2+ transporter) displayed a pro thrombotic phenotype in vivo. Trpm7fl/fl Pf4Cre (lacking the non specific Mg2+ channel) and RIAM / mice (lacking a potential linker protein in integrin “inside out” signaling) showed no alterations in thrombus formation upon injury of the vessel wall. N2 - Thrombozytenaktivierung und Aggregation sind wichtige Schritte der Hämostase, die zur Reduktion des Blutverlustes bei Gefäßwandverletzung führen. Jedoch kann die Aktivierung von Thrombozyten zur Thrombose führen, wodurch Herzinfarkt und Schlaganfall entstehen kann. Ein besseres Verständnis der Regulierung der Throm-bozytenaktivierung und die darauf folgende Thrombusbildung sind notwendig, um Thrombose und Hirninfarkte zu vermeiden. Kationen, Thrombozy-ten Oberflächenrezeptoren, Zytoskelett Reorganisation, Aktivierung der Koagulati-onskaskade und intrazellulare Signalmoleküle sind wichtig in der Thrombozytenakti-vierung und Thrombusbildung. Solch ein wichtiges Molekül ist Serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), ein Indolamin Thrombozyten-Agonist, welcher aus Tryp-tophan synthetisiert wird. 5 HT wird aus den Enterochromaffinzellen in den Gastroin-testinaltrakt (GI) und das Blut abgegeben. 5 HT aus dem Blut wirkt als Regulator der Hämostase durch die Wirkung als Vasokonstriktor und die Auslösung der Throm-bozyten-Signalwege durch den 5 HT2A Rezeptor. Thrombozyten synthetisieren kein 5 HT, sondern nehmen es aus dem Blut auf und speichern es in den dichten Granu-la, die nach der Thrombozyten-Aktivierung freigesetzt werden. Um die molekulare Zusammensetzung des 5 HT Aufnahmesystems in Thrombozyten zu identifizieren und die Rolle des 5 HT aus Thrombozyten in Thrombose und ischämischem Schlag-anfalls zu klären, wurde eine 5 HT Transporter-defiziente Mauslinie (5Htt / ) in ver-schiedenen in vitro und in vivo Untersuchungen und im Model des ischämischen Schlaganfalls analysiert. In 5Htt / Thrombozyten ist die Aufnahme von 5 HT aus dem Blut vollständig geblockt und Agonisten-induzierter Ca2+ Fluss durch Speicher-abhängigen Ca2+ Einstrom (SOCE), Integrinaktivierung, Degranulierung und Aggre-gation abhängig von Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) waren reduziert. Diese in vitro beobachteten Defekte in 5Htt / Thrombozyten konnten durch Zugabe von 5 HT normalisiert werden. Zudem wurden reduzierte 5 HT Werte im Plasma, eine erhöhte Blutungszeit und die Bildung von instabilen Thromben ex vivo unter Fluss und in vivo in der abdominalen Aorta und der Carotis von 5Htt / Mäusen beobachtet. Überraschenderweise zeigten die 5Htt / Mäuse nach transientem Verschluss der A. cerebri media (tMCAO), einem Modell des ischämi-schen Schlaganfalls, ein normales Infarktvolumen und einen unveränderten neurolo-gischen Endzustand im Vergleich zu Kontrollmäusen. Obwohl sekretiertes 5 HT aus Thrombozyten keine wesentliche Rolle in der Entwicklung eines Reperfusionsscha-dens nach einem Schlaganfall spielt, ist es essentiell in der Verstärkung der zweiten Phase der Thrombozytenaktivierung durch SOCE und spielt eine wichtige Rolle in der Thrombusstabilität. Um die Rolle von Kationen, Granula und deren Bestandteile und der Regulierung in der Integrinaktivierung im Prozess der Thrombusbildung zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse in den verschiedenen in vivo Thrombosemodellen ge-testet. Während Tph1 / Mäuse (denen das Enzym zur Produktion von 5 HT in der Peripherie fehlt), Trpm7KI (Punktmutation in der Kinasedomäne des Trpm7 Kanals, Fehlen der Kinase Aktivität) und Unc13d / /Nbeal2 / Mäuse (denen die α Granula und die Freisetzungsmaschinerie der dichten Granula fehlt) und keine oder eine verlang-samte Thrombusbildung zeigten, wiesen MagT1y/ Mäuse (denen der spezifische Mg2+ Transporter fehlt) einen prothrombotischen Phänotyp auf. Trpm7fl/fl Pf4Cre Mäuse (denen der nicht spezifische Mg2+ Kanal fehlt) und RIAM / Mäuse (denen ein potenti-elles Linker Protein im Integrin “inside out” Signal fehlt) zeigten keine Veränderung in der Thrombus Bildung nach Verletzung der Gefäßwand. KW - Biomedicine KW - Serotonin KW - Blutgerinnung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134711 ER - TY - THES A1 - Wollny, Claudia T1 - Der p97-Kofaktor UBXD1 ist ein neuer Regulator des NF-kB-Signalweges T1 - The p97-cofactor UBXD1 is a new regulator of NF-kB-signaling N2 - Die essenzielle, Ubiquitin-selektive ATPase p97 reguliert eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse in Eukaryoten. Dazu zählen Proteinqualitätskontrolle, DNA-Reparatur, Signaltransduktion, Zellzykluskontrolle, Autophagie sowie das endolysosomale System. Diese unterschiedlichen Funktionen von p97 werden durch die Bindung von Kofaktoren engmaschig gesteuert und kontrolliert. Die größte und am besten untersuchte Gruppe von p97-Kofaktoren sind die Proteine der UBX Familie. Diese zeichnen sich durch den Besitz einer UBX-Domäne aus, welche die Bindung an p97 vermittelt. Das in höheren Eukaryoten konservierte Familienmitglied UBXD1 besitzt darüber hinaus mit einer PUB-Domäne und einem VIM-Motiv noch mindestens zwei weitere p97-Bindemodule. UBXD1 kann an Vesikel des endolysosomalen Degradationssytems lokalisieren, seine genauen zellulären Funktionen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von humanem UBXD1. Dafür wurden Kandidaten eines zuvor durchgeführten Yeast-Two-Hybrid-Screens auf ihre Two Hybrid-Interaktion mit unterschiedlichen UBXD1-Varianten getestet. Darüber hinaus wurde durch Immunpräzipitationsexperimente untersucht, ob die Kandidatenproteine auch in Säugerzellen mit UBXD1 interagieren. Als vielversprechende neue Bindungspartner von UBXD1 wurden so die Ubiquitin-Ligase TRIAD3A und das Ubiquitin-editierende Protein A20 identifiziert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen UBXD1 und A20 von einer funktionellen PUB Domäne und dem siebten Zinkfinger Motiv von A20 abhängig ist. Da sowohl TRIAD3A als auch A20 negative Regulatoren des NF B Signalweges sind, wurde daraufhin untersucht, ob auch UBXD1 eine Funktion in diesem Signalweg besitzt. Tatsächlich war in UBXD1-depletierten HeLa 57A-Zellen die NF B-abhängige Expression eines Reportgens nach Aktivierung des Signalweges durch TNF, IL-1, Doxorubicin und H2O2 stark reduziert. Dabei spricht die verringerte Aktivierung nach unterschiedlichen Stimuli für eine generelle Rolle von UBXD1 im NF B Signalweg. Durch quantitative Echtzeit-PCR konnte gezeigt werden, dass in HeLa- und HEK293T-Zellen nach UBXD1-Depletion auch die Expression endogener NF B Zielgene verringert ist. Da in UBXD1-depletierten Zellen nach Stimulation mit TNF oder IL-1 bereits die Kerntranslokation des NF B-Transkriptionsfaktor p65 reduziert ist, ist davon auszugehen, dass UBXD1 an einer früheren Phase der Aktivierung des Signalweges beteiligt ist. Möglicherweise ist dies darauf zurückzuführen, dass UBXD1 bekannte Funktionen von A20 reguliert und etwa die Bindung von A20 an Vesikel des endolysosomalen Systems oder an lineare Ubiquitinketten beeinflusst. Diese Arbeit beschreibt somit eine neue Funktion des p97-Kofaktors UBXD1 im NF B-Signalweg. N2 - The essential, ubiquitin-selective ATPase p97 regulates a variety of cellular processes in eukaryotes. Among others, these include protein quality control, DNA repair, signal-transduction, cell cycle control, autophagy and the endolysosomal system. The distinct functions of p97 are tightly controlled by regulatory cofactors. UBX domain-containing proteins are the largest and best studied group of p97 cofactors . They are characterized by a UBX domain, which mediates binding to p97. The family-member UBXD1 is highly conserved in higher eukaryotes and possesses at least two additional p97 binding modules, a PUB domain and a VIM motif. While UBXD1 can localize to vesicles of the endolysosomal degradation system, its exact cellular function is still poorly understood. The aim of this study was the functional characterisation of human UBXD1. To that end, candidates of a previous yeast two-hybrid screen were tested for their two-hybrid interaction with different UBXD1 variants. Immunoprecipitation experiments were used to analyse if the candidates also interact with UBXD1 in mammalian cells. This led to the identification of the ubiquitin-ligase TRIAD3A and the ubiquitin-editing protein A20 as promising new binding partners of UBXD1. Moreover, it could be demonstrated that the interaction between UBXD1 and A20 depends on a functional PUB domain and the seventh zinc finger motif of A20. Because both TRIAD3A and A20 are negative regulators of the NF-B signaling pathway, it was subsequently tested if UBXD1 also has a function in NF-B signaling. Indeed, UBXD1-depleted HeLa 57A cells showed a strongly reduced NF B dependent expression of a reporter gene after activation of the signaling pathway by TNF, IL-1, Doxorubicin and H2O2. The reduced activity observed after various stimuli argues for a general role of UBXD1 in the NF-B signaling pathway. Quantitative real-time PCR demonstrated that the expression of endogenous NF-B target genes in HeLa and HEK293T cells was also reduced upon UBXD1-depletion. Since the nuclear translocation of the NF-B subunit p65 upon stimulation with TNF or IL-1was also reduced in UBXD1-depleted cells, UBXD1 is likely to participate in an earlier phase of NF-B activation. It is possible that UBXD1 regulates a known function of A20 and influences for example the binding of A20 to endocytic vesicles or to linear ubiquitin chains. In summary, this work describes a novel function of the p97 cofactor UBXD1 as a positive regulator of the NF-B signaling pathway. KW - Ubiquitin KW - UBXD1 KW - Signaltransduktion KW - Cofaktor KW - p97 KW - Signalweg KW - Zellbiologie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132430 ER - TY - THES A1 - Diegmann [geb. Weißbach], Susann T1 - Identifizierung des Mutationsspektrums und Charakterisierung relevanter Mutationen im Multiplen Myelom T1 - Identification of Mutation Spectrum and Characterization of relevant Mutations in Multiple Myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne B-Zell-Erkrankung, welche von einer großen Heterogenität auf der biologischen und klinischen Ebene sowie in der Therapieantwort geprägt ist. Durch die biologische Interpretation von whole exome sequencing (WES)-Daten der Tumor- und Normalproben von fünf MM-Patienten und sechs MM-Zelllinien (ZL) sowie dem Einbezug von publizierten next generation sequencing (NGS)-Daten von 38 MM-Patienten konnten in dieser Dissertation sowohl somatische tumorrelevante Mutationen identifiziert als auch ein MM-spezifisches Signaltransduktionsnetzwerk definiert werden. Interessanterweise wurde in fast 100 % der MM-Patienten mindestens eine Mutation und in ~50 % der MM-Patienten sogar mehr als eine Mutation innerhalb dieses Netzwerkes beobachtet, was auf eine inter- und intra-individuelle Signalweg-Redundanz hinweist, die für die individuelle Therapieentscheidung möglicherweise von Bedeutung sein könnte. Außerdem konnte bestätigt werden, dass identische, positionsspezifische und genspezifische Mutationen im MM selten wiederholt auftreten. Als häufig mutierte Gene im MM konnten KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 und PKHD1 identifiziert werden. Interessanterweise wurde die DIS3-Mutation in der MM-ZL OPM2 gemeinsam mit einer copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) im DIS3-Lokus detektiert, und in der MM-ZL AMO1 wurde eine noch nicht näher charakterisierte KRAS-Mutation in Exon 4 in Verbindung mit einem copy number (CN)-Zugewinn und einer erhöhten KRAS-Genexpression gefunden. DIS3 ist ein enzymatisch aktiver Teil des humanen RNA-Exosom-Komplexes und KRAS ein zentrales Protein im RTK-Signalweg, wodurch genetische Aberrationen in diesen Genen möglicherweise in der Entstehung oder Progression des MMs eine zentrale Rolle spielen. Daher wurde die gesamte coding sequence (CDS) der Gene DIS3 und KRAS an Tumorproben eines einheitlich behandelten Patientensets der DSMM-XI-Studie mit einem Amplikon-Tiefen-Sequenzierungsansatz untersucht. Das Patientenset bestand aus 81 MM-Patienten mit verfügbaren zytogenetischen und klinischen Daten. Dies ergab Aufschluss über die Verteilung der Mutationen innerhalb der Gene und dem Vorkommen der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen des Tumors. Des Weiteren wurde die Assoziation der Mutationen mit weiteren klassischen zytogenetischen Alterationen (z.B. Deletion von Chr 13q14, t(4;14)-Translokation) untersucht und der Einfluss der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen auf den klinischen Verlauf und die Therapieantwort bestimmt. Besonders hervorzuheben war dabei die Entdeckung von sieben neuen Mutationen sowie drei zuvor unbeschriebenen hot spot-Mutationen an den Aminosäure (AS)-Positionen p.D488, p.E665 und p.R780 in DIS3. Es wurde des Weiteren die Assoziation von DIS3-Mutationen mit einer Chr 13q14-Deletion und mit IGH-Translokationen bestätigt. Interessanterweise wurde ein niedrigeres medianes overall survival (OS) für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation sowie auch eine schlechtere Therapieantwort für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation im Nebenklon im Vergleich zum Hauptklon beobachtet. In KRAS konnten die bereits publizierten Mutationen bestätigt und keine Auswirkungen der KRAS-Mutationen in Haupt- oder Nebenklon auf den klinischen Verlauf oder die Therapieantwort erkannt werden. Erste siRNA vermittelte knockdown-Experimente von KRAS und Überexpressionsexperimente von KRAS-Wildtyp (WT) und der KRAS-Mutationen p.G12A, p.A146T und p.A146V mittels lentiviraler Transfektion zeigten eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 von dem KRAS-Mutationsstatus. Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation einen detaillierten Einblick in die molekularen Strukturen des MMs, vor allem im Hinblick auf die Rolle von DIS3 und KRAS bei der Tumorentwicklung und dem klinischen Verlauf. N2 - Multiple Myeloma (MM) is a malignant B-cell neoplasm that is characterized by a great heterogeneity on the biological and clinical level as well as by a heterogeneous response to therapeutic approaches. Biological interpretation of whole exome sequencing (WES) data of tumor and normal samples of five MM patients and six MM cell lines (CL), as well as the inclusion of published next generation sequencing (NGS) data of 38 MM patients, identified somatic tumor relevant mutations as well as a signal transduction network that was commonly affected in MM. Interestingly, almost 100 % of the MM patients harbored one mutation and ~50 % of the MM patients harbored more than one mutation in different genes of this defined network, which predicted an inter- and intra-individual pathway redundancy that might be of particular importance for individual therapeutic approaches. Furthermore, it was confirmed that the recurrent occurrence of point-specific mutations and even gene specific mutations are rare events in MM. KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 and PKHD1 were among the most recurrently mutated genes in MM. Of note, one of the DIS3 mutations was accompanied by a copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) in the CL OPM2 and a so far undefined exon 4 mutation in KRAS was associated with an increased copy number (CN) and gene expression level of KRAS in the CL AMO1. DIS3 is one of the active parts of the human RNA exosome complex and KRAS is a central protein in the RTK pathway leading to the hypothesis that one or more genetic abberations within these genes may play an important role in the development and progression of MM. To further investigate this hypothesis the whole coding sequence (CDS) of DIS3 and KRAS of tumor samples of a uniquely treated patient set of the DSMM XI was sequenced using an amplicon deep sequencing approach. The study included 81 MM patients for whom cytogenetic and clinical data were available. This approach revealed information about the mutational landscape within DIS3 and KRAS and the occurrence of mutations in major and minor clones. In addition, we were able to investigate the association of the DIS3 and KRAS mutations with additional cytogenetic alterations (such as deletion of chr 13q14, translocation t(4;14)) and we studied the impact of mutations in major and minor clones on the clinical outcome and response to therapy. In particular, we discovered seven unknown mutations and three previously undescribed hot spot mutations at amino acid positions p.D488, p.E665 and p.R780 in DIS3. An association of DIS3 mutations with deletion of chr 13q14 and IGH-translocations, that was described previously, was confirmed. Interestingly, a trend towards a lower median overall survival of MM patients with a DIS3 mutation was observed. Patients with a DIS3 mutation in the minor clone also showed a worse response to therapy as compared to patients with a mutation in the major clone. Published mutations in KRAS were confirmed. Moreover, we revealed no impact of these mutations (in major or minor clones) on the clinical outcome or response to therapy. First siRNA mediated knockdown experiments on KRAS and lentivirus mediated overexpression of KRAS WT and mutated KRAS (p.G12A, p.A146T and p.A146V) showed that the phosphorylation status of MEK1/2 and ERK1/2 is dependent on the mutation status of KRAS. In summary, this present doctoral thesis allowed more detailed insights into the molecular structure of MM, specifically with regard to the role of DIS3 and KRAS in tumor development and outcome. KW - Plasmozytom KW - Multiples Myelom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114800 ER - TY - JOUR A1 - Groll, J A1 - Burdick, J A A1 - Cho, D-W A1 - Derby, B A1 - Gelinsky, M A1 - Heilshorn, S C A1 - Jüngst, T A1 - Malda, J A1 - Mironov, V A A1 - Nakayama, K A1 - Ovsianikov, A A1 - Sun, W A1 - Takeuchi, S A1 - Yoo, J J A1 - Woodfield, T B F T1 - A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks JF - Biofabrication N2 - Biofabrication aims to fabricate biologically functional products through bioprinting or bioassembly (Groll et al 2016 Biofabrication 8 013001). In biofabrication processes, cells are positioned at defined coordinates in three-dimensional space using automated and computer controlled techniques (Moroni et al 2018 Trends Biotechnol. 36 384–402), usually with the aid of biomaterials that are either (i) directly processed with the cells as suspensions/dispersions, (ii) deposited simultaneously in a separate printing process, or (iii) used as a transient support material. Materials that are suited for biofabrication are often referred to as bioinks and have become an important area of research within the field. In view of this special issue on bioinks, we aim herein to briefly summarize the historic evolution of this term within the field of biofabrication. Furthermore, we propose a simple but general definition of bioinks, and clarify its distinction from biomaterial inks. KW - bioink KW - biomaterial ink KW - definition Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-253993 VL - 11 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Schwedhelm, Ivo A1 - Zdzieblo, Daniela A1 - Appelt-Menzel, Antje A1 - Berger, Constantin A1 - Schmitz, Tobias A1 - Schuldt, Bernhard A1 - Franke, Andre A1 - Müller, Franz-Josef A1 - Pless, Ole A1 - Schwarz, Thomas A1 - Wiedemann, Philipp A1 - Walles, Heike A1 - Hansmann, Jan T1 - Automated real-time monitoring of human pluripotent stem cell aggregation in stirred tank reactors JF - Scientific Reports N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Innovative monitoring options and emerging automated process control strategies allow for the necessary highly defined culture conditions. Next to standard process characteristics such as oxygen consumption, pH, and metabolite turnover, a reproducible and steady formation of hiPSC aggregates is vital for process scalability. In this regard, we developed a hiPSC-specific suspension culture unit consisting of a fully monitored CSTR system integrated into a custom-designed and fully automated incubator. As a step towards cost-effective hiPSC suspension culture and to pave the way for flexibility at a large scale, we constructed and utilized tailored miniature CSTRs that are largely made from three-dimensional (3D) printed polylactic acid (PLA) filament, which is a low-cost material used in fused deposition modelling. Further, the monitoring tool for hiPSC suspension cultures utilizes in situ microscopic imaging to visualize hiPSC aggregation in real-time to a statistically significant degree while omitting the need for time-intensive sampling. Suitability of our culture unit, especially concerning the developed hiPSC-specific CSTR system, was proven by demonstrating pluripotency of CSTR-cultured hiPSCs at RNA (including PluriTest) and protein level. KW - Biomedical engineering KW - Stem-cell biotechnology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202649 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Elmaidomy, Abeer H. A1 - Mohammed, Rabab A1 - Hassan, Hossam M. A1 - Owis, Asmaa I. A1 - Rateb, Mostafa E. A1 - Khanfar, Mohammad A. A1 - Krischke, Markus A1 - Mueller, Martin J. A1 - Abdelmohsen, Usama Ramadan T1 - Metabolomic profiling and cytotoxic tetrahydrofurofuran lignans investigations from Premna odorata Blanco JF - Metabolites N2 - Metabolomic profiling of different Premna odorata Blanco (Lamiaceae) organs, bark, wood, young stems, flowers, and fruits dereplicated 20, 20, 10, 20, and 20 compounds, respectively, using LC–HRESIMS. The identified metabolites (1–34) belonged to different chemical classes, including iridoids, flavones, phenyl ethanoids, and lignans. A phytochemical investigation of P. odorata bark afforded one new tetrahydrofurofuran lignan, 4β-hydroxyasarinin 35, along with fourteen known compounds. The structure of the new compound was confirmed using extensive 1D and 2D NMR, and HRESIMS analyses. A cytotoxic investigation of compounds 35–38 against the HL-60, HT-29, and MCF-7 cancer cell lines, using the MTT assay showed that compound 35 had cytotoxic effects against HL-60 and MCF-7 with IC50 values of 2.7 and 4.2 µg/mL, respectively. A pharmacophore map of compounds 35 showed two hydrogen bond acceptor (HBA) aligning the phenoxy oxygen atoms of benzodioxole moieties, two aromatic ring features vectored on the two phenyl rings, one hydrogen bond donor (HBD) feature aligning the central hydroxyl group and thirteen exclusion spheres which limit the boundaries of sterically inaccessible regions of the target’s active site. KW - Premna KW - lignan KW - metabolomic KW - cytotoxic KW - pharmacophore map Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193187 SN - 2218-1989 VL - 9 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Draganov, Dobrin D. A1 - Santidrian, Antonio F. A1 - Minev, Ivelina A1 - Duong, Nguyen A1 - Kilinc, Mehmet Okyay A1 - Petrov, Ivan A1 - Vyalkova, Anna A1 - Lander, Elliot A1 - Berman, Mark A1 - Minev, Boris A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Delivery of oncolytic vaccinia virus by matched allogeneic stem cells overcomes critical innate and adaptive immune barriers JF - Journal of Translational Medicine N2 - Background Previous studies have identified IFNγ as an important early barrier to oncolytic viruses including vaccinia. The existing innate and adaptive immune barriers restricting oncolytic virotherapy, however, can be overcome using autologous or allogeneic mesenchymal stem cells as carrier cells with unique immunosuppressive properties. Methods To test the ability of mesenchymal stem cells to overcome innate and adaptive immune barriers and to successfully deliver oncolytic vaccinia virus to tumor cells, we performed flow cytometry and virus plaque assay analysis of ex vivo co-cultures of stem cells infected with vaccinia virus in the presence of peripheral blood mononuclear cells from healthy donors. Comparative analysis was performed to establish statistically significant correlations and to evaluate the effect of stem cells on the activity of key immune cell populations. Results Here, we demonstrate that adipose-derived stem cells (ADSCs) have the potential to eradicate resistant tumor cells through a combination of potent virus amplification and sensitization of the tumor cells to virus infection. Moreover, the ADSCs demonstrate ability to function as a virus-amplifying Trojan horse in the presence of both autologous and allogeneic human PBMCs, which can be linked to the intrinsic immunosuppressive properties of stem cells and their unique potential to overcome innate and adaptive immune barriers. The clinical application of ready-to-use ex vivo expanded allogeneic stem cell lines, however, appears significantly restricted by patient-specific allogeneic differences associated with the induction of potent anti-stem cell cytotoxic and IFNγ responses. These allogeneic responses originate from both innate (NK)- and adaptive (T)- immune cells and might compromise therapeutic efficacy through direct elimination of the stem cells or the induction of an anti-viral state, which can block the potential of the Trojan horse to amplify and deliver vaccinia virus to the tumor. Conclusions Overall, our findings and data indicate the feasibility to establish simple and informative assays that capture critically important patient-specific differences in the immune responses to the virus and stem cells, which allows for proper patient-stem cell matching and enables the effective use of off-the-shelf allogeneic cell-based delivery platforms, thus providing a more practical and commercially viable alternative to the autologous stem cell approach. KW - vaccinia KW - cancer KW - stem Cells KW - oncolysis KW - oncolytic virus KW - virotherapy KW - immunity KW - immunotherapy Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226312 SN - 100 VL - 17 ER -